Altın Nöronal Hücrelerde optik Uyarım Nanorod destekli

Bu protokol, nöronal hücrelerde farklılaşmayı ve hücre içi kalsiyum aktivitesini uyarmak için altın nanoçubukların optik absorpsiyonu ile ilişkili geçici ısınmanın nasıl kullanılacağını ana hatlarıyla belirtir. Bu sonuçlar potansiyel olarak nöral protezlerde ve nörobilimdeki temel çalışmalarda yeni uygulamalar açmaktadır.

Bu prosedürün genel amacı, yakın kızılötesi lazer diyot kullanılarak altın nano çubuklarla kültürlenen nöronal hücreleri uyarmaktır. Bu, önce altın nanopartiküllerin doğru optik yoğunlukta hazırlanmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım, nöronal hücreleri kültürlemek ve nanopartikülleri bunlara eklemektir.

Bir sonraki adım lazer ışınlamasıdır. Son adım, beta üç ila tübülin ekspresyonu yoluyla hücre farklılaşmasını doğrulamaktır. Sonuçta, hücre içi kalsiyum geçişini göstermek için konfokal mikroskopi kullanılır.

Bu yöntem için ilk olarak, bir hücre popülasyonu arasındaki tek nöronlarda aksiyon potansiyelini uyarmanın bir yolunu ararken aklımıza geldi. Prosedürü göstermek Jamie May ve laboratuvarımızdan lisans öğrencileri olacaktır. Bu prosedüre başlamak için, UV görünür spektrofotometreye bir veteriner altın nano çubuk çözeltisi yerleştirin.

300 nanometreden 1000 nanometreye kadar absorpsiyon değerlerini 0,5 ila iki nanometre arasında bir çözünürlükle kaydederek ilk optik yoğunluğu ölçün. İlk altın anoro örneğini bir santrifüjün optik yoğunluğuna seyrelterek bir mililitrelik bir stok çözeltisi hazırlayın. Herhangi bir kimyasal fazlalığı gidermek için bir mililitre altın nano çubuk çözeltisi iki kez.

Daha sonra süpernatanları çıkarın ve altın nano çubukları deiyonize suda yeniden süspanse edin. Hücre kültüründe kullanıma hazırlanmak için, altın Anoro çözeltisini beş dakika boyunca sonikasyon yapın ve ardından 30 dakika boyunca UV ışığı ile sterilize edin. Bu prosedürde, hücre kültürü ortamı için 500 mililitre steril dmem hazırlayın.

Daha sonra, NG 1 0 8 15 nöronal hücreleri bir T 75 şişesinde 10 mililitre hücre kültürü ortamında büyütün, daha sonra 37 santigrat derecede inkübe edin ve nemlendirilmiş atmosfer. Hücreler %70 ila %80 birleştiğinde, ortamı ılık taze ortamla değiştirin. Bundan sonra, birleşik şişenin dibini hafifçe vurarak hücreleri mekanik olarak ayırın.

Bir hücre süspansiyonunu 600 G'de beş dakika boyunca santrifüjleyin ve hücre paletini iki mililitre sıcak hücre farklılaşma ortamında yeniden süspanse edin. Daha sonra hücreleri, 200 mikrolitre hücre farklılaşma ortamı olan 96 oyuklu bir plakada görün. Numuneyi 37 santigrat derecede bir gün inkübe edin.

Ertesi gün, altın nano çubuk çözeltisini ekleyin ve 24 saat daha inkübe edin. Bu prosedürde, lazeri tek modlu bir fiber optik ile birleştirin ve bir FC konektörü ile sonlandırın. Nano çubuk inkübasyonunun üçüncü gününde standart bir güç ölçer ile çıkış lazer gücünü ölçün.

FC konektörünü kuyuya sabitleyin, numuneyi ve kontrolü oda sıcaklığında beşinci günde farklı lazer güçlerinde sürekli bir dalga halinde bir dakika boyunca ışınlayın, hücre farklılaşma ortamını numuneden çıkarın ve 10 dakika boyunca hacim başına %3,7 hacim formaldehit çözeltisi ile sabitleyin. Daha sonra hücreleri hacim başına% 0.1 hacim ile geçirgen Triton X 100 20 dakika boyunca. Daha sonra, numuneye 60 dakika boyunca hacim başına %3 ağırlık BSA ekleyin.

Reaktif olmayan protein bağlanma bölgelerini bloke etmek için, numuneyi gece boyunca dört santigrat derecede anti beta üç tübülin ile etiketleyin. Ertesi gün, hücreleri uygun bir ikincil antikor ile karanlıkta 90 dakika inkübe edin. Daha sonra hücre çekirdeklerini 10 dakika boyunca DAP E ile etiketleyin.

Ardından, numuneyi en az 20 x objektif kullanarak epi floresan veya konfokal mikroskopi ile görüntüleyin. İkincil antikora göre mikroskop filtrelerini seçin ve bir hücre çekirdeğini görselleştirmek için bir DAPI filtresi seçin. Bu adımda, iki gram çözünen maddeyi 10 mililitre DMSO'da çözerek hacim başına ağırlıkça %20'lik bir onic F1 27 stok çözeltisi hazırlayın.

Çözünürlüğü artırmak için onic F1 27 çözeltisini 40 santigrat derecede 20 dakika ısıtın. Anaro inkübasyonunun üçüncü gününde, dengeli bir tuz çözeltisi hazırlayın. Ardından, hücre farklılaşma ortamını çıkarın ve BSS çözeltisi ile değiştirin.

Beş mikromolar grip, DMSO'da 04:00 ve onic F1 27 stok çözeltisinin hacmi başına %0,1 ağırlık ile desteklenmiştir. Daha sonra, lazeri tek modlu bir fiber optik ile birleştirin ve ucu ayırın. Standart tekniği kullanarak.

Ucun düz ve fiber eksenine dik olduğundan emin olmak için ortaya çıkan ucu optik mikroskop altında gözlemleyin. Ardından çıkış lazer gücünü standart güç ölçer ile ölçün. Ardından, ışık dağıtım fiberini bir fiber optik tutucuya yerleştirin ve mikro konumlandırıcıya yapıştırın.

Bundan sonra, sinyal üretecine bir osiloskop bağlayın. Optik modülasyonu izlemek için. Değişken frekanslara ve darbe uzunluklarına sahip bir ikili sinyal kullanın.

Ardından lazeri bağlayın ve modülasyon sinyalini mikroskop için TTL girişi olarak kullanın. İçselleştirilmiş grip oh 4:00 boyasını ve senkronize lazer dde'yi uyarmak için bir argon iyon lazeri kullanın. Endositoz nano çubukların uyarılması için, hücreleri ters çevrilmiş bir konfokal mikroskop altına yerleştirin ve ışık dağıtım fiberini iletim aydınlatma modunda hedef hücreden uzağa yerleştirin.

Ardından hedefteki ışın yarıçapını hesaplayın. Numunenin görüntülemesini gerçekleştirin ve 40 x objektif kullanarak oda sıcaklığında kontrol edin ve gidiş dönüş modunda kare başına 256 x 256 piksel çözünürlükte zaman serisi taramalarını toplayın. Ardından, herhangi bir temel argon iyonu lazer girişimini tanımlamak için herhangi bir lazer DIO uyarımı olmadan kayıt yapın, burada gösterilen, tek başına kültürlenen ve 7.5 watt santimetre karelik lazer gücüyle ışınlanan farklılaşmış NG 1 0 8 15 roal hücrelerinin bir epi floresan görüntüsüdür.

Ve bu, 1.25 watt santimetre karelik lazer gücüyle ışınlanmış altın nano çubuklarla kültürlenmiş hücrelerin bir görüntüsüdür. İşte grip oh 04:00 kalsiyum göstergesi ile yüklü farklılaşmış NG 1 0 8 15 nöronal hücrelerine bir örnek. Görüntü, 40 x yağa daldırma objektifi olan ters konfokal bir mikroskop kullanılarak çekildi.

Bu şekil, zamanın bir fonksiyonu olarak lazerle indüklenen kalsiyum varyasyonlarının temsili örneklerini göstermektedir. NG 1 0 8 15'te, nöronal hücreler üç gün boyunca polistiren sülfonat altın nano çubuklar, altın nano çubuklar ve nano çubuklar olmadan serum serbest koşullarda kültürlendi. F sıfırın üzerindeki F maksimumu, NG 1 0 8 15 nöronal hücrelerde tespit edilen maksimum floresan artışını gösterir.

Bu teknik, nöronal hücrelerin optik simülasyonunda gelecekteki uygulamaların yolunu açtı.