Post-transkripsiyonel ayarlı genlerin kimyasal Modülatörler için yüksek verimli tarama

Bu deney, transkriptlerin üç ana çevrilmemiş bölgesi aracılığıyla transkripsiyon sonrası kontrol mekanizmalarını modüle eden bileşikler için kimyasal kütüphaneleri tarar. İlk olarak, hedeflenen gendeki üç ana çevrilmemiş ilgi alanını tanımlayın. El lusiferaz üç asal UTR kimerik transkript oluşturmak için bu üç asal UTR'yi El lusiferaz kontrol raportörü plazmidine klonlayın.

Sonra istikrarlı bir şekilde. İki plazmiti hastalıkla ilgili bir hücre hattına entegre edin, 96'da kimerik transkripti taşıyan hücreleri tohumlayın. Kuyu plakaları onları 24 saat boyunca bir bileşik kütüphanesi ile tedavi eder ve daha sonra lusiferaz aktivitesini etkileyen molekülleri tanımlar.

Kiraz, daha fazla doğrulama taraması için seçilen molekülleri seçer ve daha sonra, hem kontrol hücrelerini hem de lusiferaz üç asal UTR kimerik transkript taşıyan hücreleri, kiraz seçilmiş bir kütüphane alt kümesi ile tedavi eder. Bir bileşiğin etkisine, çevrilmemiş üç asal bölge veya diğer vektör dizileri aracılığıyla aracılık edilirse, sonuçlar farklılaşacaktır. Çoğu muhabir temelli tarama denemelerinin aksine.

Transkripsiyon regülasyonuna odaklanan tahliller, bu rapor hücresi bazlı tahliller, mRNA transkript seviyelerini üç asal ve çevrilmiş bölge aracılığıyla modüle eden bileşiklerin tanımlanmasına odaklanır. Stabil bir şekilde transfekte edilmiş nöroblastom hücrelerini tripsin Asya ile hasat edin. Hücreleri mililitre başına 10 ila beşinci hücre arasında iki kez seyreltin.

27 plaka için %10 FBS ve %1 L-glutamin içeren RPMI'de. Sıvı işlemeyi, oluk ölü hacimleri ve tekrarlanan pipetleme adımlarını dikkate alarak en az 250 mililitre hücre süspansiyonu hazırlayın. Daha sonra hücre süspansiyonunu steril bir hazneye dökün ve robot masasının üzerine yerleştirin.

Dokuz barkodlu beyaz düz yükleyin. Robot masasında alt 96 kuyulu plaka ve 200 mikrolitrelik steril pipet ucu kutusu. Hücre süspansiyonunu karıştırın, ardından dokuz plakanın her birine 75 mikrolitre hücre dağıtın.

Plakaları örtün ve kenar etkilerini en aza indirmek için hücrelerin 30 dakika boyunca kuyu dibine çökelmesine izin verin. Ardından dokuz plakayı da 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksite yerleştirin ve 24 saat inkübe edin. Benzer şekilde, kalan plakalarla her seferinde dokuz tane devam edin.

Bileşik kitaplık plakalarını oda sıcaklığında çözdürün. PBS çözeltisinde bir çukuru steril PBS ile ve diğerini %0,5 DMSO ile doldurun ve robot masasına yerleştirin. Her kütüphane plakası için.

Buna göre hazırlayın ve etiketleyin. Bir seyreltme plakası. Şimdi her bir sütun kuyusunu, seyreltme plakalarının iki ila 11'ini 398 mikrolitre steril PBS ile doldurun.

Daha sonra birinci ve 12 numaralı sütunları steril PBS'de 50 mikrolitre% 0,5 DMSO ile doldurun. Ardından, iki seyreltme plakasını yükleyin. Robot masasında iki kütüphane plakası, iki kutu 50 mikrolitre steril uç ve altı hücreli plaka.

Şimdi hücre plakalarını açın, karşılık gelen seyreltme plakasındaki iki kitaplık plakadan birinden 10 milimolar stok çözeltisinden iki mikrolitre pipetleyin ve iyice karıştırın. Aynı ipucu setini kullanarak. 50 mikromolar seyreltmenin üç mikrolitresini, hücreleri içeren üç barkodlu beyaz 96 oyuklu plakaya aktarın.

Tüm uç setini değiştirin ve ikinci kitaplık plakası için hücre indüksiyonlarını tekrarlayın. Kültürleri örtün ve 24 saat inkübe edin. Ardından, kalan kütüphane plakaları için bileşik seyreltme ve hücre indüksiyon işlemini tekrarlayın.

Tercih edilen sulandırılmış lusiferaz reaktifini oda sıcaklığına dengeleyin. Lusiferaz haznesini robot masasına yerleştirin ve içine reaktif dökün. İnkübatörden dokuz indüklenmiş kültür plakasını çıkarın.

Onları robot masasının üzerine yerleştirin, üzerini açın ve oda sıcaklığına dengeleyin. Daha sonra plakalar arasına oyuk başına 50 mikrolitre lusiferaz reaktifi ekleyin. Bir plakanın lüminesans okuma süresine eşit bir gecikme tanıtın.

30 dakikalık bir inkübasyondan sonra. İlgili veri dosyasıyla ilişkilendirmek için önce plakanın barkodunu kaydedin. Ardından, ilk plakayı luminometreye yerleştirin ve lüminesansı ölçün.

Kısa bir çalkalama adımından sonra, tüm indüksiyon plakaları için lüminesans okumalarını tekrarlayın. Ardından kalan Lucifer yarış reaktifini toplayın ve eksi 20 santigrat derecede saklayın. Birincil taramanın deneysel verileri işlendikten sonra, bir karşı eleme kirazı ile bileşik özgüllüğü doğrulamak için isabetleri seçin.

Seçilen isabetleri seçin ve kontroller için konumlar da dahil olmak üzere yeni tarama plakası için bir düzen oluşturun. Ardından, tek 2D barkodlu tüplerde saklanan alikotlardan yeni HIIT plakaları oluşturun. Tarama için de aynı protokol izlenmektedir.

Hi plakası başına her bir kararlı hücre hattından 3 96 kuyucuklu plaka hazırlayın. Ertesi gün, hücreleri kütüphane bileşikleri ile tedavi edin. Her bir hi plakasını 24 saat içinde iki mikromolar çalışma konsantrasyonunda iki mikromolar çalışma konsantrasyonunda üç CHP 1 34 micken, üç prime UTR ve kontrol hücreli üç plakayı işlemek için kullanın.

Tüm CHP 1 34 plakalarında, üç asal çevrilmemiş ve kontrol setinde lusiferaz aktivitesini ölçün. Birincil taramadaki veri analizinde olduğu gibi, arıtılmış kuyulardan elde edilen deneysel verileri plaka üzerinde araçta tedavi edilen kontrollerin ortalamasına normalleştirin. Ardından, test edilen her bileşik hesaplama için kopyalar üzerinden ortalama ve standart sapmayı hesaplayın.

CHP 1 34 McIn'de lusiferaz aktivitesinin kat değişimi, CHP 1 34'e karşı üç asal UTR. Kontrol hücreleri, 1,5'ten büyük rastgele tam değişim kesimlerini ve 0,01'den küçük anlamlılık P değerlerini seçer. Bu deney, mikrofonun üç ana UTR'si ve onkogenin üç ana UTR'si aracılığıyla uygulanan transkripsiyon sonrası kontrol mekanizmalarının potansiyel modülatörleri için 2000 bileşik bir kütüphaneyi taradı, tedavi edilen aracın yüzdesi olarak görüntülenen 25 temsili kütüphane plakasından tek bir lusiferaz sinyallerinin sonuçları.

Kontroller, bileşiklerin çoğunun üç ana UTR üzerinde belirgin bir etki yaratmadığını göstermektedir. İsabetler, ortalama değerin ve standart sapmanın tüm tahlil değerleri üzerinden hesaplandığı yerlerde seçildi, lusiferaz aktivitesini %20'nin altına düşüren bileşikler, büyük olasılıkla bileşiğin belirgin hücresel toksisitesinin göstergesidir. Bu grafik, WX, Y ve Z olarak adlandırılan dört seçilmiş bileşiğin karşı taraması için temsili sonuçları göstermektedir.Hem W hem de X bileşikleri, kat değişim farkı ve T-testi ile gösterildiği gibi onkogen üç asal UTR raportöründen lusiferaz ekspresyonunun artmasına neden olur Hem W hem de X bileşiklerinin etkilerinin gerçekten üç asal UTR bileşiğine bağlı olmasına rağmen, W'nin hücre canlılığı üzerinde önemli bir etkisi olmadığını unutmayın.

X bileşiği, CHP 1 34 kontrol hücrelerinde normalleştirilmiş lusiferaz sinyali ile gösterildiği gibi bir miktar sitotoksik aktivite gösterirken, iki mikromolar konsantrasyonda ne bileşik Y ne de bileşik Z, lusiferaz seviyeleri üzerinde üç asal UTR'ye bağlı etki göstermez. Bileşik Y ile tedavi edildikten sonra primer taramada tespit edilen azalmış lusiferaz aktivitesi daha çok sitotoksisitenin bir sonucudur. Bileşik Z durumunda, artmış lusiferaz aktivitesi, viral promotörün üç asal UTR aktivasyonu açısından spesifik olmayan bir durumdur.

Hem kontrol hem de çevrilmemiş setlerde eşdeğer bir yukarı regülasyon gözlendiğinden, bu yüksek verimli tahlilde, kontrol hücrelerindeki birincil ısının doğrulanmasının, üç ana çevrilmemiş bölge boyunca gerçekten hareket eden bileşiklerin, promotör aracılığıyla çalışan bileşiklerden ayırt edilmesi için kritik olduğunu unutmayın.