Post-transkripsiyonel ayarlı genlerin kimyasal Modülatörler için yüksek verimli tarama
March 3rd, 2015
Burada, hücre bazlı bir raportör gen tahlilini, 3' UTR aracılığıyla uygulanan transkripsiyon sonrası kontrol mekanizmalarını modüle eden bileşikler için kimyasal kitaplıkları taramak için değerli bir araç olarak tanımlıyoruz.
Bu deney, transkriptlerin üç ana çevrilmemiş bölgesi aracılığıyla transkripsiyon sonrası kontrol mekanizmalarını modüle eden bileşikler için kimyasal kütüphaneleri tarar. İlk olarak, hedeflenen gendeki üç ana çevrilmemiş ilgi alanını tanımlayın. El lusiferaz üç asal UTR kimerik transkript oluşturmak için bu üç asal UTR'yi El lusiferaz kontrol raportörü plazmidine klonlayın.
Sonra istikrarlı bir şekilde. İki plazmiti hastalıkla ilgili bir hücre hattına entegre edin, 96'da kimerik transkripti taşıyan hücreleri tohumlayın. Kuyu plakaları onları 24 saat boyunca bir bileşik kütüphanesi ile tedavi eder ve daha sonra lusiferaz aktivitesini etkileyen molekülleri tanımlar.
Kiraz, daha fazla doğrulama taraması için seçilen molekülleri seçer ve daha sonra, hem kontrol hücrelerini hem de lusiferaz üç asal UTR kimerik transkript taşıyan hücreleri, kiraz seçilmiş bir kütüphane alt kümesi ile tedavi eder. Bir bileşiğin etkisine, çevrilmemiş üç asal bölge veya diğer vektör dizileri aracılığıyla aracılık edilirse, sonuçlar farklılaşacaktır. Çoğu muhabir temelli tarama denemelerinin aksine.
Transkripsiyon regülasyonuna odaklanan tahliller, bu rapor hücresi bazlı tahliller, mRNA transkript seviyelerini üç asal ve çevrilmiş bölge aracılığıyla modüle eden bileşiklerin tanımlanmasına odaklanır. Stabil bir şekilde transfekte edilmiş nöroblastom hücrelerini tripsin Asya ile hasat edin. Hücreleri mililitre başına 10 ila beşinci hücre arasında iki kez seyreltin.
27 plaka için %10 FBS ve %1 L-glutamin içeren RPMI'de. Sıvı işlemeyi, oluk ölü hacimleri ve tekrarlanan pipetleme adımlarını dikkate alarak en az 250 mililitre hücre süspansiyonu hazırlayın. Daha sonra hücre süspansiyonunu steril bir hazneye dökün ve robot masasının üzerine yerleştirin.
Dokuz barkodlu beyaz düz yükleyin. Robot masasında alt 96 kuyulu plaka ve 200 mikrolitrelik steril pipet ucu kutusu. Hücre süspansiyonunu karıştırın, ardından dokuz plakanın her birine 75 mikrolitre hücre dağıtın.
Plakaları örtün ve kenar etkilerini en aza indirmek için hücrelerin 30 dakika boyunca kuyu dibine çökelmesine izin verin. Ardından dokuz plakayı da 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksite yerleştirin ve 24 saat inkübe edin. Benzer şekilde, kalan plakalarla her seferinde dokuz tane devam edin.
Bileşik kitaplık plakalarını oda sıcaklığında çözdürün. PBS çözeltisinde bir çukuru steril PBS ile ve diğerini %0,5 DMSO ile doldurun ve robot masasına yerleştirin. Her kütüphane plakası için.
Buna göre hazırlayın ve etiketleyin. Bir seyreltme plakası. Şimdi her bir sütun kuyusunu, seyreltme plakalarının iki ila 11'ini 398 mikrolitre steril PBS ile doldurun.
Daha sonra birinci ve 12 numaralı sütunları steril PBS'de 50 mikrolitre% 0,5 DMSO ile doldurun. Ardından, iki seyreltme plakasını yükleyin. Robot masasında iki kütüphane plakası, iki kutu 50 mikrolitre steril uç ve altı hücreli plaka.
Şimdi hücre plakalarını açın, karşılık gelen seyreltme plakasındaki iki kitaplık plakadan birinden 10 milimolar stok çözeltisinden iki mikrolitre pipetleyin ve iyice karıştırın. Aynı ipucu setini kullanarak. 50 mikromolar seyreltmenin üç mikrolitresini, hücreleri içeren üç barkodlu beyaz 96 oyuklu plakaya aktarın.
Tüm uç setini değiştirin ve ikinci kitaplık plakası için hücre indüksiyonlarını tekrarlayın. Kültürleri örtün ve 24 saat inkübe edin. Ardından, kalan kütüphane plakaları için bileşik seyreltme ve hücre indüksiyon işlemini tekrarlayın.
Tercih edilen sulandırılmış lusiferaz reaktifini oda sıcaklığına dengeleyin. Lusiferaz haznesini robot masasına yerleştirin ve içine reaktif dökün. İnkübatörden dokuz indüklenmiş kültür plakasını çıkarın.
Onları robot masasının üzerine yerleştirin, üzerini açın ve oda sıcaklığına dengeleyin. Daha sonra plakalar arasına oyuk başına 50 mikrolitre lusiferaz reaktifi ekleyin. Bir plakanın lüminesans okuma süresine eşit bir gecikme tanıtın.
30 dakikalık bir inkübasyondan sonra. İlgili veri dosyasıyla ilişkilendirmek için önce plakanın barkodunu kaydedin. Ardından, ilk plakayı luminometreye yerleştirin ve lüminesansı ölçün.
Kısa bir çalkalama adımından sonra, tüm indüksiyon plakaları için lüminesans okumalarını tekrarlayın. Ardından kalan Lucifer yarış reaktifini toplayın ve eksi 20 santigrat derecede saklayın. Birincil taramanın deneysel verileri işlendikten sonra, bir karşı eleme kirazı ile bileşik özgüllüğü doğrulamak için isabetleri seçin.
Seçilen isabetleri seçin ve kontroller için konumlar da dahil olmak üzere yeni tarama plakası için bir düzen oluşturun. Ardından, tek 2D barkodlu tüplerde saklanan alikotlardan yeni HIIT plakaları oluşturun. Tarama için de aynı protokol izlenmektedir.
Hi plakası başına her bir kararlı hücre hattından 3 96 kuyucuklu plaka hazırlayın. Ertesi gün, hücreleri kütüphane bileşikleri ile tedavi edin. Her bir hi plakasını 24 saat içinde iki mikromolar çalışma konsantrasyonunda iki mikromolar çalışma konsantrasyonunda üç CHP 1 34 micken, üç prime UTR ve kontrol hücreli üç plakayı işlemek için kullanın.
Tüm CHP 1 34 plakalarında, üç asal çevrilmemiş ve kontrol setinde lusiferaz aktivitesini ölçün. Birincil taramadaki veri analizinde olduğu gibi, arıtılmış kuyulardan elde edilen deneysel verileri plaka üzerinde araçta tedavi edilen kontrollerin ortalamasına normalleştirin. Ardından, test edilen her bileşik hesaplama için kopyalar üzerinden ortalama ve standart sapmayı hesaplayın.
CHP 1 34 McIn'de lusiferaz aktivitesinin kat değişimi, CHP 1 34'e karşı üç asal UTR. Kontrol hücreleri, 1,5'ten büyük rastgele tam değişim kesimlerini ve 0,01'den küçük anlamlılık P değerlerini seçer. Bu deney, mikrofonun üç ana UTR'si ve onkogenin üç ana UTR'si aracılığıyla uygulanan transkripsiyon sonrası kontrol mekanizmalarının potansiyel modülatörleri için 2000 bileşik bir kütüphaneyi taradı, tedavi edilen aracın yüzdesi olarak görüntülenen 25 temsili kütüphane plakasından tek bir lusiferaz sinyallerinin sonuçları.
Kontroller, bileşiklerin çoğunun üç ana UTR üzerinde belirgin bir etki yaratmadığını göstermektedir. İsabetler, ortalama değerin ve standart sapmanın tüm tahlil değerleri üzerinden hesaplandığı yerlerde seçildi, lusiferaz aktivitesini %20'nin altına düşüren bileşikler, büyük olasılıkla bileşiğin belirgin hücresel toksisitesinin göstergesidir. Bu grafik, WX, Y ve Z olarak adlandırılan dört seçilmiş bileşiğin karşı taraması için temsili sonuçları göstermektedir.Hem W hem de X bileşikleri, kat değişim farkı ve T-testi ile gösterildiği gibi onkogen üç asal UTR raportöründen lusiferaz ekspresyonunun artmasına neden olur Hem W hem de X bileşiklerinin etkilerinin gerçekten üç asal UTR bileşiğine bağlı olmasına rağmen, W'nin hücre canlılığı üzerinde önemli bir etkisi olmadığını unutmayın.
X bileşiği, CHP 1 34 kontrol hücrelerinde normalleştirilmiş lusiferaz sinyali ile gösterildiği gibi bir miktar sitotoksik aktivite gösterirken, iki mikromolar konsantrasyonda ne bileşik Y ne de bileşik Z, lusiferaz seviyeleri üzerinde üç asal UTR'ye bağlı etki göstermez. Bileşik Y ile tedavi edildikten sonra primer taramada tespit edilen azalmış lusiferaz aktivitesi daha çok sitotoksisitenin bir sonucudur. Bileşik Z durumunda, artmış lusiferaz aktivitesi, viral promotörün üç asal UTR aktivasyonu açısından spesifik olmayan bir durumdur.
Hem kontrol hem de çevrilmemiş setlerde eşdeğer bir yukarı regülasyon gözlendiğinden, bu yüksek verimli tahlilde, kontrol hücrelerindeki birincil ısının doğrulanmasının, üç ana çevrilmemiş bölge boyunca gerçekten hareket eden bileşiklerin, promotör aracılığıyla çalışan bileşiklerden ayırt edilmesi için kritik olduğunu unutmayın.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu makale, kimyasal kütüphaneleri, transkriptlerin 3’ çevrilmemiş bölgesinden (UTR) son transkripsiyon kontrol mekanizmalarını modüle eden bileşikleri taramakta tasarlanmış, hücre tabanlı bir raporör gen tahlili tanımlamaktadır. Metodoloji, 3’ UTR'nin bir lüsifernaz kontrol raporör plazmidi üzerine klonlanmasını ve ilgili bir hücre hattına entegrasyonunu içerir.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Hücre biyolojisi
- Gen ekspresyonu
- Farmakoloji
Arka Plan
- Son transkripsiyon kontrol mekanizmaları, gen regülasyonunda önemli bir rol oynar.
- 3’ UTR, mRNA stabilitesini ve çevirisini etkileyen önemli bir bölgedir.
- Kimyasal kütüphanelerin taranması, bu mekanizmaları etkileyen yeni bileşiklerin tanımlanmasına olanak tanır.
- Raporör tahlilleri, gen regülasyonunu incelemek için değerli araçlardır.
Çalışmanın Amacı
- Son transkripsiyonel regülasyonu etkileyen bileşikleri taramakta kullanılan sağlam bir tahlili geliştirmek.
- 3’ UTR'yi gen ekspresyonunu modüle etmek için bir hedef olarak kullanmak.
- Kimyasal etkilerin gen regülasyonu üzerindeki anlayışını geliştirmek.
Kullanılan Yöntemler
- Hedeflenen gende ilgi çekici 3’ UTR'nin tanımlanması.
- 3’ UTR'nin bir lüsifernaz kontrol raporör plazmidi üzerine klonlanması.
- Plazmidlerin hastalığın ilgili hücre hattına stabil entegrasyonu.
- Hücrelerin 96 kuyucuklu plaklara ekimi ve bir bileşik kütüphanesi ile muamele edilmesi.
Ana Sonuçlar
- Lüsiferaz aktivitesini önemli ölçüde etkileyen bileşiklerin tanımlanması.
- Tahlilin kimyasal kütüphaneleri taramakta etkinliğinin gösterilmesi.
- Son transkripsiyon kontrol mekanizmalarının modülasyonu hakkında içgörüler.
- İlaç keşfi ve gen regülasyonu çalışmalarında potansiyel uygulamalar.
Sonuçlar
- Geliştirilen tahlili, bileşikleri taramakta değerli bir araçtır.
- 3’ UTR'nin gen regülasyonundaki rolü hakkında içgörüler sağlar.
- Bu yaklaşım, yeni tedavi ajanlarının keşfini kolaylaştırabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
This assay addresses a critical gap in early drug discovery by enabling the identification of compounds that modulate gene expression through post-transcriptional mechanisms, a regulatory layer often overlooked in transcriptional-focused screens. By linking 3’ UTR activity to luciferase readouts in disease-relevant cells, it provides a mechanistic de-risking step for target validation, helping prioritize compounds with specific modes of action before downstream investment. The approach supports predictive confidence in lead identification by distinguishing UTR-mediated effects from promoter-driven or cytotoxic artifacts.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses involving post-transcriptional regulation by linking 3’ UTR activity to compound treatment.
- Operational Value: Uses a luciferase reporter system to quantitatively assess mRNA fate modulation via the 3’ UTR in a stable, disease-relevant cellular context.
- Scientific Value: Supports biological de-risking by isolating compounds that specifically affect mRNA stability or translation through defined UTR sequences.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces normalized luminescence readouts that enable dose-dependent assessment of compound effects on 3’ UTR-mediated gene regulation.
- Operational Value: Employs a counter-screening strategy to discriminate true 3’ UTR modulators from compounds acting via promoter elements or general cytotoxicity.
- Scientific Value: Generates fold-change and statistical thresholds (e.g., >1.5 fold change, p<0.01) to define hit criteria for follow-up validation.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Uses disease-relevant cell lines (e.g., neuroblastoma) to ensure biological context aligns with pathophysiological mechanisms of interest.
- Operational Value: Requires stable integration of the 3’ UTR-luciferase construct, enabling consistent, long-term assay performance across screening campaigns.
- Scientific Value: Facilitates translational continuity by validating hits against endogenous target expression, connecting reporter activity to native gene regulation.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within the early discovery continuum, supporting target validation and lead identification by providing mechanistic insight into post-transcriptional gene regulation before significant investment in lead optimization.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of UTR-dependent gene regulation by measuring luciferase activity as a proxy for mRNA stability and translation.
- Screening: Enables high-throughput evaluation of chemical libraries with built-in counterscreening to reduce false positives from non-specific effects.
- Analytics: Delivers quantitative, normalized luminescence data with statistical cutoffs to prioritize compounds for secondary validation.
- Translational Research: Connects reporter-based findings to endogenous gene expression, supporting risk-adjusted advancement decisions.
- Enterprise Reuse: Establishes a modular platform where different 3’ UTRs can be swapped to screen for regulators of multiple disease-relevant genes.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by confirming compound effects are mediated through the 3’ UTR rather than transcriptional or cytotoxic mechanisms.
- Operational Value: Promotes assay reproducibility through stable cell line integration and standardized liquid handling protocols for compound delivery and detection.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by filtering out promiscuous or toxic compounds early, reducing failure rates in later-stage preclinical studies.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of hits based on mechanism-specific activity, supporting better go/no-go decisions in target-focused programs.
Implementation Considerations
- Requires molecular biology expertise to clone and validate the 3’ UTR-luciferase reporter construct.
- Depends on access to high-throughput liquid handling robots and luminometers for automated compound delivery and detection.
- Necessitates cross-team standardization between assay developers, screening technologists, and data analysts to ensure consistent hit calling.
- Involves adaptation considerations when transferring the assay to different cell lines or UTR sequences, including validation of stable integration and signal window.
- Includes practical limitations such as the need to distinguish true UTR effects from artifacts via counter-screening in control cells lacking the 3’ UTR insert.
