Name: Post-transkripsiyonel ayarlı genlerin kimyasal Modülatörler için yüksek verimli tarama (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: Keşfedin, hücre tabanlı luciferase raportör gen analizi ile post-transkripsiyonel düzenlemeyi modüle eden kimyasal bileşikleri yüksek verimli tarama yöntemini. Bu teknik, ilaç keşfi ve gen regülasyonu çalışmalarında yeni terapötik ajanların belirlenmesine yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu projeye tam finansal destek için İtalyan Nöroblastom Vakfı'na teşekkür ederiz.

NOT: Bu tür deney sistemlerinin verimi mevcut HTS laboratuar ekipmanları bağlıdır. Bu protokol, 96-kuyu formatında sıvı taşıma yapan bir Tecan Freedom EVO 200 robot ile kolaylaştırılır. 384-gözlü formata minyatürleştirme da mümkündür. Robotik sıvı taşıma sistemi tüm deneysel adımlar sırasında aseptik koşullarda korumak için bir laminer akış kaputun altında konumlandırılmış. Herhangi bir sıvı işleme otomasyon mevcut ise, protokol hali hazırda düşük verimli bir formata adapte edilebilir. Birincil Eleme 1. Gün 1: hazırlayın ve Tohum Hücreler Not: Tohum hücreleri, lusiferaz aktivitesi, tohumlama sonra, yani 48 saat tahlil zamanında% 80 izdiham elde edilir. <ol><li> Süspanse% 10 FBS ve% 1 L-glutamin ihtiva eden RPMI içinde 2 x 10 5 hücre / ml &#39;lik bir konsantrasyona kadar CHP134-mycn3UTR nöroblastoma hücreleri tripsinize. 27 plakaları için en az 250 ml hazırlamak<html> Hesap sıvı taşıma dikkate alarak hücre süspansiyonu, ölü hacimleri ve tekrarlanan pipetleme adımlarını oluklara. Steril rezervuar içine hücre süspansiyonu dökün ve robot masanın üzerine yerleştirin. </li><li> 9 barkodlu beyaz düz tabanlı 96-kuyu plakaları ve robot masasının üzerine 200 ul steril pipet uçları bir kutu yerleştirin. Yerçekimi altında yerleşen hücreleri önlemek için her muafiyet adımından önce pipetleme hücre süspansiyonu karıştırın. Oyuk başına 1.5 x 10 4 hücrelerinin nihai yoğunluk elde etmek için 9 levhaların her bir kuyunun içine hücreleri 75 ul koyun. </li><li> Kapaklı plakaları örtün ve hücreler, alt tortu olanak sağlamak için 30 dakika boyunca kuluçka dışında bırakın. Bu kenar etkilerini en aza indirmek olacaktır. </li><li> Tekrar 27 plakaları toplam sayısını hazırlamak için iki kez 1.2 ve 1.3 adımları. </li><li> 37 ° C&#39;de plakalar yerleştirin ve% 5 CO2 ve 24 saat daha inkübe edilir. </li></ol> 2. Gün 2: Kütüphane Bileşikler ile Hücreler davranın ntent &quot;&gt; Not: Spektrum Koleksiyonu küçük molekül kütüphane DMSO içinde 10 mM konsantrasyonda 25 96 oyuklu plakalar içinde 8 sıra ve 10 sütundaki düzenlenmiş 2000 bileşiklerden oluşur, ilk ve son sütun üzerine kuyu kontroller için boş bırakılır. . Bileşim tarama tahlilleri tipik olarak 1-10 uM bileşik konsantrasyonu 8 gerçekleştirilir. Burada açıklanan tarama protokolü çalışma konsantrasyonu 2 uM ve analiz edilmesi son nokta olarak 24 saat giderir. <ol><li> Oda sıcaklığında 9 bileşik kütüphane plakaları çözülme. </li><li> Steril PBS ve PBS-% 0.5 DMSO çözümleri ile iki olukları hazırlayın ve robot masanın üzerine koyun. Her bir kütüphane levha için hazırlanması ve buna uygun olarak tek bir seyreltme plakası etiket - en az 400 ul bir çalışma hacmine sahip bir polipropilen U-tabanlı 96-çukurlu plaka. Sıvı eylemci sabit ipuçlarını kullanarak steril PBS 398 ul seyreltme plakaları 11 sütun 2 Her çukurun doldurun. Dolgu sütun 1 ve steril PBS 12 50 ile ulKontrol kuyuları araç konsantrasyonu (% 0.02) yeniden üretilmesi için,% 0.5 DMSO ile. </li><li> İki kütüphane tabak, buna etiketli seyreltme plakaları, 50 ul steril pipet uçları iki kutu ve robot masasına altı hücreleri tabak yerleştirin. Hücreler plakaları ortaya çıkarın. </li><li> Pipet 2, ilgili seyreltme plakası iki kütüphane tabakalarından biri 10 mM stok çözeltisi ul ve iyice karıştırın. Bu 50 uM&#39;lik bir ara bileşikler konsantrasyonu ile sonuçlanır. Uçları aynı kümesini kullanarak hücreleri ile 3 Barkodlanan beyaz 96 gözlü plakalar içinde 50 uM seyreltme 3 ul dağıtmak. Her bir konsantrasyonunu çalışan 2 uM Bu seyreltme şeması sonuçlar bileşik olarak test edilmiştir. NOT: ipuçları ile gereksiz manipülasyonlar önlemek kütüphane plakaları sadece 80 bileşikleri içeren olsa bile, baştan 96 ipuçları tam bir set kullanın. İlk ve kütüphane plakalarının son sütunları boş olduğundan bu mümkün. </li><li> Pipet ipuçları değiştirin ve St tekrarİkinci kütüphane plaka için ep 2.4. </li><li> Hücreler plakaları örtün ve 24 saat için inkübatör onları geri. </li><li> Kalan kütüphane plakaları için 2,3-2,6 iki kez daha Adımları. </li></ol> 3. Gün 3: Lüsiferaz Testi gerçekleştirin Not: lusiferaz deneyi gerçekleştirmeden önce, her bir kuyuya 9 bir hücre canlılığı endeksi elde etmek için resazurin azalmaya dayalı olarak, bir hücre canlılığı deneyi ile multipleks mümkündür. Çoğullama lusiferaz ve canlılık testi hücreleri, lusiferaz aktivitesi yeterince yüksek düzeyde sağlamak, ancak, göz ardı edilebilir, lusiferaz sinyalinin bir azalma deneyleri sonuçları. Lusiferaz aktivitesi sabit lüminesan sinyal ticari ve ev yapımı 10,11 lusiferaz deney reaktif çeşitli saptanabilir. <ol><li> Oda sıcaklığına kadar seçim yeniden lusiferaz reaktif dengelenmesi. Hacmi, tüm tahlil plakalar için yeterli olduğundan emin olun. 27 plaka içinlusiferaz reaktifi s 170 ml hesap sıvı taşıma dikkate alınarak gerekli olacaktır, ölü hacim ve tekrarlanan pipetleme adımlarını oluklara. Bir rezervuar içine lusiferaz reaktif dökün ve robot masanın üzerine yerleştirin. </li><li> , Inkübatör hücreleri ile 9 plakaları çıkarın robot masanın üzerine koyun, ortaya çıkarmak ve oda sıcaklığına dengelendi kadar bekleyin. Plakası ile plaka başına lusiferaz reaktifi 50 ul ekle. Plakalar arasında bir plaka lüminesans okuma süresine eşit bir gecikme. Bu, tüm plakaları reaktif ek eşit zaman aralığında ölçülür güvence altına alacaktır. </li><li> 30 dakikalık bir kuluçkadan sonra, luminometrede birinci plaka yerleştirmek ve kısa bir çalkalama adımından sonra lüminesans ölçümü. Tüm plakaları için tekrarlayın. Her plaka barkod kaydedin ve ele plakaların çok sayıda kaynaklanan hataları önlemek için ilgili veri dosyasına ilişkilendirmek. </li><li> Tekrar hücreleri ile kalan 18 plakaları için iki kez 3,2-3,3 adımları. </li&gt; <li> Kalan lusiferaz reaktif toplayın ve -20 ° C&#39;de saklayın. </li></ol> 4. Gün 4: Veri Analizi <ol><li> On plaka, araçla tedavi edilen kontrollere ortalamasına tüm örneklerin normalleştirme kullanarak işlem deneysel veriler. Her kütüphane bileşik için, üçlü üzerinden ortalama değer x ve SD hesaplamak. </li><li> Seçin regülatör-yukarı ve aşağı düzenleyen ortalama değer x ve SD tüm tahlil işlenmiş değerler üzerinden hesaplanır SD, ve k × ± k X bir eşiği ayarlayarak hit tanımlı sabittir. </li><li> Rasgele bir eşik cut-off &lt;lusiferaz sinyalinin bir azalma muhtemelen bileşik toksisite ile ilişkili olan, araç ile tedavi edilen kontrol grubu% 20 seçin. Bu eşiğin altında hit atarak önemli ölçüde karşı tarama yalancı-pozitif hit bir dizi azaltacaktır. NOT: yerine denetimi tabanlı normalleştirme, deneysel veriler Z skoru ya da sağlam analog B s uygulanarak işlenebilirÇekirdek 12. Buna ek olarak, isabet seçimi için alternatif istatistiksel yaklaşımlar 12 mevcuttur. </li></ol> 5. Karşı-tarama Not: Primer taramada tespit edilen bileşikler doğruladı ve bir karşı tarama ile özgüllüğü için değerlendirilmektedir (&#39;hit &quot;etiketli). <ol><li> Kiraz ilgili düzenini tasarrufu, tek 2D barkodlu tüplerde saklanan alikotları seçilen hit almak ve yeni &quot;plakaları vurmak&quot; yaratmak. Kontroller için ücretsiz pozisyonları bırakmak unutmayın. Not: etkin kiraz toplama sisteminin yokluğunda, tek bir kontrol ve Primer taramada paralel olarak 3 &#39;UTR taşıyan hücreleri hem de test edebilir. Bu durumda, sadece kişiye 3 &#39;UTR bağlı etkileri olan bileşikler söz konusu seçimi, karşı tarama ihtiyacını ortadan kaldırarak Primer taramada sonra mümkün olacaktır. Ancak, iki hücre hatlarında paralel tarama deneyi katına çıkacakmaliyetler. </li><li> Primer tarama protokolüne (Bölüm &quot;1. Gün: hazırlayın ve Tohum hücreler&quot;) sonra, her bir &quot;hit levha&quot; her CHP134-mycn3UTR ve CHP134-CTRL kararlı üç hücre 96 oyuklu plakalar hazırlamak. </li><li> Birincil tarama için protokol (Bölüm &quot;Gün 2: Kütüphane Bileşikler ile Hücreler davranın&quot;) ardından, konsantrasyon çalışan 2 uM üç CHP134-mycn3UTR ve üç CHP134-CTRL plakaları tedavi etmek için her hit plakasını kullanın. Not: Burada tarif edilen karşı ekran 2 uM tek bir dozda, üç kez yapılır iken, standart çoğaltır yerine 2 uM 20 nM arasında değişen 10 kat seyreltik olarak 3 konsantrasyonlarda hit test etmek için faydalı olabilir. Bu yaklaşımı uygulamak sadece yanlış-pozitif oranları en aza indirerek, birincil hit üzerinde ön doz-yanıt verileri elde etmek de birincil ekran verileri teyit, ama izin vermedi. Bu durumda, başka bir analiz hattı başvurunun olmalıdıred deneysel verileri işlemek ve hit onaylamak için. </li><li> Birincil tarama için protokol (Bölüm &quot;Gün 3: Lüsiferaz Testi gerçekleştirin&quot;) ardından, tüm CHP134-mycn3UTR ve CHP134-CTRL plakaları lusiferaz aktivitesini ölçmek. </li><li> Primer tarama protokolüne (Bölüm &quot;4. Gün: Veri Analizi&quot;) sonra, on plaka, araçla tedavi edilen kontrollere ortalamasına işlenmiş olan gözeneklerden elde deneysel verileri normalleştirmek ve tekrarın ortalama ve SD hesaplar. Test edilen her bir bileşik için, CHP134-CTRL hücreleri vs CHP134-mycn3UTR lusiferaz etkinliğinin kat değişimi hesaplamak. Keyfi kat değişikliği cut-off&gt; &lt;0.01 1.5 ve önemi p-değerleri seçin. NOT: hit özgüllüğü için belirleyici parametre CHP134-CTRL hücreleri vs CHP134-mycn3UTR içinde lusiferazm önemli bir kat değişiklik açıklanan tahlil ayarlarında. Gerekirse, bir de se olarak eş zamanlı olarak, bir hücre canlılığı deneyi gerçekleştirilerek bileşik toksisitesini değerlendirmek olabilirseçilir ve bileşikler. Birincil hit bir doz yanıt analizinde karşı taranır Bu özellikle faydalı olabilir. Tek bir doz için, deneyim 6 hücre canlılığı azalmış indirgenmiş lusiferaz aktivitesinin güçlü bir korrelasyonu göstermektedir. Bu nedenle, hedef hücreleri ve kontrol hücreleri, lusiferaz aktivitesi azalmış Test edilen konsantrasyonda bileşiğin toksisitesinin bir göstergesi olarak kabul edilebilir. </li></ol>

<ol><li>Schwanhäusser, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+quantification+of+mammalian+gene+expression+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Global quantification of mammalian gene expression control.</a> Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).</li>
<li>Tebaldi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+uncoupling+between+transcriptome+and+translatome+variations+after+a+stimulus+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Widespread uncoupling between transcriptome and translatome variations after a stimulus in mammalian cells.</a> BMC Genomics. 13 (1), 220(2012).</li>
<li>Mitchell, S. F., Parker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+and+properties+of+eukaryotic+mRNPs%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Principles and properties of eukaryotic mRNPs.</a> Mol. Cell. 54 (4), 547-558 (2014).</li>
<li>Fu, Y., Dominissini, D., Rechavi, G., He, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+regulation+mediated+through+reversible+m6A+RNA+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Gene expression regulation mediated through reversible m6A RNA methylation.</a> Nat. Rev. Genet. 15 (5), 293-306 (2014).</li>
<li>Matoulkova, E., Michalova, E., Vojtesek, B., Hrstka, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+3%E2%80%99+untranslated+region+in+post-transcriptional+regulation+of+protein+expression+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biol%22%5BJournal%5D)">The role of the 3’ untranslated region in post-transcriptional regulation of protein expression in mammalian cells.</a> RNA Biol. 9 (5), 563-576 (2012).</li>
<li>Sidarovich, V., Adami, V., Quattrone, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Cell-Based+High-Throughput+Screen+Addressing+3%E2%80%99+UTR-Dependent+Regulation+of+the+MYCN+Gene%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A Cell-Based High-Throughput Screen Addressing 3’ UTR-Dependent Regulation of the MYCN Gene.</a> Mol. Biotechnol. 56 (7), 631-643 (2014).</li>
<li>Cheung, N. -K. V., Dyer, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroblastoma%3A+developmental+biology%2C+cancer+genomics+and+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Neuroblastoma: developmental biology, cancer genomics and immunotherapy.</a> Nat. Rev. Cancer. 13 (6), 397-411 (2013).</li>
<li>Hughes, J. P., Rees, S., Kalindjian, S. B., Philpott, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+early+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Principles of early drug discovery.</a> Br. J. Pharmacol. 162 (6), 1239-1249 (2011).</li>
<li>Herbst, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexing+a+high-throughput+liability+assay+to+leverage+efficiencies%5BTitle%5D)+AND+%22Assay+Drug+Dev.+Techn%22%5BJournal%5D)">Multiplexing a high-throughput liability assay to leverage efficiencies.</a> Assay Drug Dev. Techn. 7 (3), 294-303 (2009).</li>
<li>van Olst, E. S. iebring-, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Affordable+luciferase+reporter+assay+for+cell-based+high-throughput+screening%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+Screen%22%5BJournal%5D)">Affordable luciferase reporter assay for cell-based high-throughput screening.</a> J. Biomol. Screen. 18 (4), 453-461 (2013).</li>
<li>Baker, J. M., Boyce, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+functional+screening+using+a+homemade+dual-glow+luciferase+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">High-throughput functional screening using a homemade dual-glow luciferase assay.</a> J. Vis. Exp. (88), (2014).</li>
<li>Malo, N., Hanley, J. A., Cerquozzi, S., Pelletier, J., Nadon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Statistical+practice+in+high-throughput+screening+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Statistical practice in high-throughput screening data analysis.</a> Nat. Biotechnol. 24 (2), 167-175 (2006).</li>
<li>Hitti, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+ribosomal+protein+promoter-based+reporter+system+for+selective+assessment+of+RNA+stability+and+post-transcriptional+control%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">A versatile ribosomal protein promoter-based reporter system for selective assessment of RNA stability and post-transcriptional control.</a> RNA. 16 (6), 1245-1255 (2010).</li>
<li>Oikonomou, P., Goodarzi, H., Tavazoie, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+identification+of+regulatory+elements+in+conserved+3%E2%80%99+UTRs+of+human+transcripts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Systematic identification of regulatory elements in conserved 3’ UTRs of human transcripts.</a> Cell Rep. 7 (1), 281-292 (2014).</li>
<li>Gandin, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polysome+fractionation+and+analysis+of+mammalian+translatomes+on+a+genome-wide+scale%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale.</a> J. Vis. Exp. (87), (2014).</li>
<li>Conne, B., Stutz, A., Vassalli, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+3%E2%80%99+untranslated+region+of+messenger+RNA%3A+A+molecular+%E2%80%9Chotspot%E2%80%9D+for+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">The 3’ untranslated region of messenger RNA: A molecular “hotspot” for pathology.</a> Nat. Med. 6 (6), 637-641 (2000).</li>
<li>Cheneval, D., Kastelic, T., Fuerst, P., Parker, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+methods+to+monitor+the+modulation+of+mRNA+stability%3A+a+novel+approach+to+drug+discovery+and+therapeutic+intervention%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+Screen%22%5BJournal%5D)">A review of methods to monitor the modulation of mRNA stability: a novel approach to drug discovery and therapeutic intervention.</a> J. Biomol. Screen. 15 (6), 609-622 (2010).</li>
<li>Pascale, A., Govoni, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+complex+world+of+post-transcriptional+mechanisms%3A+is+their+deregulation+a+common+link+for+diseases%3F+Focus+on+ELAV-like+RNA-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Mol.+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">The complex world of post-transcriptional mechanisms: is their deregulation a common link for diseases? Focus on ELAV-like RNA-binding proteins.</a> Cell. Mol. Life Sci. 69 (4), 501-517 (2012).</li>
<li>Michalova, E., Vojtesek, B., Hrstka, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+pre-mRNA+processing+and+altered+architecture+of+3%E2%80%99+untranslated+regions+contribute+to+the+development+of+human+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Mol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Impaired pre-mRNA processing and altered architecture of 3’ untranslated regions contribute to the development of human disorders.</a> Int. J. Mol. Sci. 14 (8), 15681-15694 (2013).</li>
<li>Bhattacharyya, A., Trotta, C. R., Peltz, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mining+the+GEMS--a+novel+platform+technology+targeting+post-transcriptional+control+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov.+Today%22%5BJournal%5D)">Mining the GEMS--a novel platform technology targeting post-transcriptional control mechanisms.</a> Drug Discov. Today. 12 (13-14), 553-560 (2007).</li>
<li>Peltz, S. W., Welch, E. M., Trotta, C. R., Davis, T., Jacobson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+post-transcriptional+control+for+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biol%22%5BJournal%5D)">Targeting post-transcriptional control for drug discovery.</a> RNA Biol. 6 (3), 329-334 (2009).</li>
</ol>

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Bu protokol, 3' UTR'ye bağlı transkripsiyon sonrası süreçleri hedefleyen modülatörlerin tanımlanmasını amaçlayan hücre bazlı bir raportör-gen tahlilini tanımlar. Birincil taramayı ve karşı taramayı kapsar ve gerekirse bir sitotoksisite testi eşlik edebilir. Birincil taramanın sonucu, tekrarlanabilirliği ve özgüllüğü karşı taramada daha da doğrulanan bir dizi değerli aday bileşiktir.
Birincil isabetlerin tanımlanması, bir raportör-3' UTR kimerik transkriptini eksprese eden hücrelerin tedavisi ü...

Gen ifadesinin uzun bir süre transkripsiyonel düzenleme için protein üretimini kontrol açık olmayan rolü ise önemli bir oynadığı düşünülmektedir edildi. Giderek artan kanıtlar, bununla birlikte, transkripsiyon sonrası düzenleme hücresel protein bolluğu 1,2 belirlemek için olduğu kadar, eğer değilse, transkripsiyonel düzenleme daha fazla katkı göstermektedir. Gen ifadesinin transkripsiyon sonrası kontrol ilk düşünce oldu çok daha karmaşık ve ayrıntılı. Aslında, post-transkripsiyonel kontrol tüm çeşitli aşamalarında mRNA işleme, lokalizasyonu, ciro, çeviri 3 gibi yeni açıklanan geri dönüşümlü RNA metilasyon 4 olmak üzere, düzenlendiği ortaya çıktı. Transkripsiyon sonrası düzenleme olan bir dizi işlem potansiyel olarak etkilenen kaynaktan deney aşağıda tarif edilen mRNA&#39;nın 3 &#39;çevrilmemiş bölge (3&#39; UTR) yer aldığı, bu odaklanmaktadır. 3 &#39;UTR geniş RNA bağlayıcı pr belirli etkileşim yoluyla esas mRNA kaderi etkilerdüzenleyici dizileri ve / veya ikincil yapılar 5 oteins ve kodlayıcı olmayan RNA&#39;lar. Bu nedenle, bu etkileşimleri değiştirebilir veya yukarı sinyal iletim yollarında engel küçük moleküller, protein bolluğu düzenleyen dengeyi kayacak. Bu tedavi yaklaşımı olan bir kanıt, hastalık-ilgili genler, bu şekilde farmakolojik müdahale için potansiyel bir hedef temsil etmektedir post transkripsiyonel düzenlenmesinde tabi olduğunu gösteren Varlığından insan patolojilerinin için özel bir önem taşımaktadır. Bu nedenle, yüksek verimli bir formatta transkripsiyon sonrası kontrol mekanizmaları ile girişim ile mRNA düzeyleri &#39;modülatörlerinin taranması için izin sistemleri, potansiyel yeni tedavi tanımlanmasında değerli araçlar olabilir. tarif edilen hücre bazlı bir raportör gen deneyi ile 3 &#39;UTR bağlı mekanizmalar yoluyla mRNA&#39;nın kaderi modüle edebilirler bileşiklerin tanımlanmasına izin verir. Birçok ana c oluşmaktadıromponents (Şekil 1) ve birkaç ön adım gerektirir tahlil fizibilite doğrulamak için. Her şeyden önce, raportör yapı, söz konusu geninden 3 &#39;UTR içerecek şekilde tasarlanmıştır. 3 &#39;UTR, örneğin ateşböceği lusiferaz (Şekil 1) gibi bir raportör genin ucuna kaynaştırılır. Takılı 3 &#39;UTR ile uygulanan transkripsiyon sonrası kontrol mekanizmalarının herhangi bir değişiklik, çeşitli lusiferaz seviyelerinde elde edilen bu kimerik transkripti stabilitesini ve / veya translasyon etkinliğini değiştirir. Bu nedenle, lüsiferaz faaliyetindeki değişimler de ilgi konusu genin, etkilenen transkripsiyon sonrası düzenleme dolaylı ölçü vermektedir. sisteminin ikinci bileşeni, bir kontrol raportör yapı, aynı haberci genini tanımlayan fakat herhangi bir 3 &#39;UTR içermeyen benzer bir sentezleme plazmiddir. İki raportör plasmidleri, geleneksel moleküler biyoloji protokollerini kullanarak laboratuarda tasarlanmış ya da ticari kaynaklardan satın alınabilir. bir hücre sırasına seçimi deney yapımı için kritik önem taşır. Hangi hücre hattı optimum model kullanılabilirlik, transfectability ve büyüme özellikleri gibi sadece pratik konulara patolojiye maksimum benzerlik gibi klinik gereksinimlerine kadar pek çok faktöre bağlıdır. Önemlisi, önce bir raportör gen 3 &#39;UTR füzyon kimerik transkript düzeyinde beklenen etkiye sahip olduğundan emin olmalısınız devam etmek. 3 lusiferaz sinyali anlamlı fark olmaması alternatif olanlar arama için isteyen, UTR bu hücresel modelde işlevsel değil &#39;UTR taşıyan ve kontrol muhabiri geçici 3 belirtmek istiyorum seçilen hücrelerde transfekte yapılarını&#39;. Yüksek işleme kapasiteli bir düzende, 3 &#39;UTR taşıyan ve kontrol lusiferaz raportör yapılan ile kararlı bir şekilde seçilen bir hücre dizisindeki entegre edilmelidir. Kullanarak stabil bir şekilde geçici olarak üzerinde entegre transfekteHücre hattı, çeşitli nedenlerden dolayı tercih edilir. Bu maliyetleri azalır, transfeksiyon verimliliği hareketlerinden kaynaklanan veri değişkenliği azaltmak, zor transfect hücre hatları da dahil olmak üzere bir hücresel modelin seçimi genişletmek olacaktır. Ayrıca, geçici transfeksiyon hücreleri üzerine çok sık sistemin doygunluk giden bir DNA plazmid ile aşırı yük. Bu şartlarda raportör ekspresyonu daha fazla bir artışın potansiyel regülasyonunda bileşiklere karşı duyarlılık azalmasına neden zor olabilir. Tüm tahlil bileşenleri kurmak zaman lusiferaz aktivite gerçekten yukarı ve aşağı-regüle &#39;3 takılı yoluyla özellikle olabilir Son olarak, bu deneyde, yani fizibilitesini belirlemek için yüksek verimli formatına geçmeden önce kritik UTR. iyi kontrol ilgi 3 &#39;UTR ile mRNA stabilitesini veya çevrilebilirlik modüle etmek için rapor küçük moleküller olacaktır. Bu sahip isemümkün değil, istenen etkiyi taklit vekil kontroller kabul edilir. Bu miRNA&#39;ların veya ilgi 3 &#39;UTR bağlanma yoluyla etkilere neden olduğu bilinmektedir, RNA bağlanan proteinleri olabilir. Bu tür kontrollerin değerlendirilmesi primer tarama geliştirilen testin işlevselliğini gösterir, aynı zamanda yüksek verimli biçimde dinamik aralık, hassasiyet ve performans tahmini için izin verir sadece daha önce. Açıklanan protokol kullanarak biz 2.000 bileşik kütüphane 6 gösterildi. Nöroblastom, bebeklik en sık ekstrakraniyal solid tümör, bir biyolojik model olarak kullanıldı ve amplifikasyon MYCN onkogen, 3 &#39;UTR güçlü bir hedef genin 7 olarak nöroblastom olumsuz sonuç, tahmin. 2 deneysel düzen özetliyor Şekil. Tarama bir seferde elenmiş 27 plaka toplu boyutu ile üç aşamada bölündü. 27 plakaları toplu Spektrum Koleksiyonu kütüphane dahilPlakalar n.1-n.8 + n.25 (ilk çalıştırma), n.9-n.16 + n.25 (ikinci dönem) ve n.16-n.24 + n.25 (üçüncü dönem), her plaka üç nüsha olarak tarandı. Böylece, bir kütüphane plakası (n.25) mümkün arası çalışma karşılaştırma yapma üç çalışır içerisinde test edildi. protokol aşağıda üç kopya halinde test edilen 9 kütüphane tabakalarından tek bir çalışma açıklar.

<table><tbody><tr><td>Kültür plakası 96 oyuklu Beyaz</td><td>PerkinElmer</td><td>6005688</td><td></td></tr><tr><td>StorPlate 96 oyuklu U alt (seyreltme plakası)</td><td>PerkinElmer</td><td>6008190</td><td></td></tr><tr><td>Reaktifler için 100 ml tek kullanımlık oluk</td><td>Tecan</td><td>10 613 048</td><td></td></tr><tr><td>300 ml tek kullanımlık robotik rezervuar</td><td>VWR</td><td>PB12001301</td><td></td></tr><tr><td>Robot uçları DITI 50&nbsp; &mu; l Steril</td><td>Tecan</td><td>30038607</td><td></td></tr><tr><td>Robot uçları DITI 200&nbsp; &mu; l Steril</td><td>Tecan</td><td>30038617</td><td></td></tr><tr><td>Matrisi 1.4 ml 2D Barcodelu, Düz Tabanlı Tüpler</td><td>Thermo Scientific</td><td>3711</td><td></td></tr><tr><td>ONE-Glo Lusiferaz Test Sistemi&nbsp;</td><td>Promega</td><td>E6120</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Lonza</td><td>BE12-918F</td><td></td></tr><tr><td>PBS-1x, Ca2+, Mg2+</td><td>Lonza</td><td>BE17-516F</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin 200&nbsp; mM</td><td>Lonza</td><td>BE17-605E</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Lonza</td><td>DE14-801F</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>Spectrum koleksiyonu (bileşik kitaplık)</td><td>MicroSource Discovery Systems</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Tecan Freedom EVO200 robot&nbsp;</td><td>Tecan</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Tecan F200 çoklu plaka okuyucu&nbsp;</td><td>Tecan</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

post-transkripsiyonel ayarlı genlerin kimyasal modülatörler için yüksek verimli tarama

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Transkripsiyonel ve transkripsiyon sonrası düzenleme Her iki genlerin ifadesi üzerinde derin bir etkiye sahip. Ancak, yaygın olarak kabul edilen hücre tabanlı tarama deneyleri esas promotör hedefleme moleküllerinin belirlenmesi amaçlı olan, transkripsiyonel regülasyonu odaklanmak. Sonuç olarak, transkripsiyon sonrası mekanizmalar büyük ölçüde gen ifadesi hedeflenen ilaç gelişimi ile ortaya edilmektedir. Burada ve değiştirmek mümkün bileşiklerin belirlenmesi onun mRNA kaderi modülasyonunda 3 &#39;çevrilmemiş bölge (3&#39; UTR) rolünü araştırmak amacıyla bir hücre bazlı deney tarif eder. Deney kararlı bir şekilde hastalığa, ilgili hücre hattına entegre ilgi konusu bir genin 3 &#39;UTR içeren bir lusiferaz raportör yapının kullanımına dayanmaktadır. Protokol tedavi 24 saat sonra lusiferaz aktivitesi etkileyen moleküllerin tanımlanması amaçlı birincil tarama başlangıç ​​odaklanarak, iki parçaya ayrılmıştır. protokolün ikinci bölümüaçıklar karşı tarama özellikle 3 &#39;UTR ile lusiferaz aktivitesini modüle bileşikleri ayırmak için gerekli. Ayrıntılı protokol ve temsil sonuçlarına ek olarak, biz tahlil geliştirme ve endojen hedefe isabet (ler) doğrulama konusunda önemli hususlar sağlamaktadır. tarif edilen hücre bazlı bir raportör gen deneyi bilim adamları 3 &#39;UTR bağımlı transkripsiyon sonrası mekanizmalar yoluyla protein seviyelerini modüle molekülleri tanımlamak için izin verecektir.

Tarif edilen yaklaşımı kullanarak, MYCN geninin 3 &#39;UTR ile uygulanan transkripsiyon sonrası kontrol mekanizmalarının potansiyel modülatörleri için bir 2000-bileşiği kütüphanesini taramıştır. 3, tek bir kütüphane plaka ile örneklenen primer tarama sonuçlarını tasvir etmektedir. Araç ile muamele edilen kontrol yüzdesi olarak gösterildi: Lusiferaz sinyali tek bir kütüphane plaka bileşikleri ile tedavi CHP134-mycn3UTR hücre plakaları üçer defa lusiferaz etkinliğinin ölçülmesiyl...

Burada, hücre bazlı bir raportör gen tahlilini, 3' UTR aracılığıyla uygulanan transkripsiyon sonrası kontrol mekanizmalarını modüle eden bileşikler için kimyasal kitaplıkları taramak için değerli bir araç olarak tanımlıyoruz.

Post-transkripsiyonel ayarlı genlerin kimyasal Modülatörler için yüksek verimli tarama

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Bu deney, transkriptlerin 3' uç çevrilmeyen bölgeleri aracılığıyla post-transkripsiyonel kontrol mekanizmalarını modüle eden bileşikler için kimyasal kütüphaneleri tarar. İlk olarak, hedeflenen gendeki ilgili 3' uç çevrilmeyen bölgeyi belirleyin. El luciferase 3' uç UTR kimera transkripti oluşturmak için bu 3' uç UTR'yi El luciferase kontrol raporlayıcı plazmidine klonlayın.Ardından, iki plazmidi hastalıkla ilgili bir hücre hattına stabil olarak entegre edin; kimerik transkripti taşıyan hücreleri 96 kuyucuklu plakalara ekleyin, bunları 24 saat boyunca bir bileşik kütüphanesi ile işleme tabi tutun ve ardından lusiferaz aktivitesini etkileyen molekülleri belirleyin.İleri doğrulama taraması için seçilen molekülleri özenle seçin ve ardından, hem kontrol hücrelerini hem de lusiferaz 3' UTR kimera transkripti taşıyan hücreleri seçilen bu kütüphane alt kümesi ile işleme tabi tutun. Sonuçlar, bir bileşiğin etkisinin 3' çevrilmeyen bölge aracılığıyla mı yoksa diğer vektör dizileri aracılığıyla mı gerçekleştiğini ayırt edecektir. Bu durum, çoğu raporlayıcı tabanlı tarama deneylerinden farklıdır.Transkripsiyon regülasyonuna odaklanan bu hücre tabanlı raporlama analizleri, 3' UTR (üç asal ve transle bölgesini) aracılığıyla mRNA transkript seviyelerini modüle eden bileşiklerin belirlenmesine odaklanır. Stabil olarak transfekte edilmiş nöroblastoma hücrelerini tripsinizasyon yoluyla hasat edin. Hücreleri 2 × 10⁵ hücre/mL konsantrasyona seyreltin.%10 FBS ve %1 L-glutamin içeren RPMI ile 27 plaka için hazırlık yapın. Sıvı aktarımı, oluk ölü hacimleri ve tekrarlanan pipetleme adımlarını göz önünde bulundurarak en az 250 mililitre hücre süspansiyonu hazırlayın. Ardından, hücre süspansiyonunu steril bir rezervuara boşaltın ve robot masasına yerleştirin.Dokuz adet barkodlu beyaz düz tabanlı 96 kuyucuklu plakayı ve bir kutu 200 µL steril pipet ucunu robot masasına yerleştirin. Hücre süspansiyonunu karıştırın, ardından dokuz plakanın her bir kuyucuğuna 75 µL hücre dağıtın.Kenar etkilerini en aza indirmek için plakaların üzerini kapatın ve hücrelerin kuyucukların dibine çökmesi için 30 dakika bekleyin. Ardından, dokuz plağın tamamını 37 °C ve %5 karbondioksit ortamına yerleştirip 24 saat boyunca inkübe edin. Benzer şekilde, kalan plakalarla dokuzarlı gruplar halinde işleme devam edin.Bileşik kütüphanesi plakalarını oda sıcaklığında çözdürün. Bir hazneyi steril PBS ile, diğerini ise PBS içinde %0,5 DMSO çözeltisi ile doldurun ve bunları robot masasına yerleştirin. Her bir kütüphane plakası için.Uygun şekilde hazırlayın ve etiketleyin. Bir adet dilüsyon plakası. Şimdi dilüsyon plakalarının 2 ile 11 arasındaki sütunlarının her bir kuyucuğunu 398 µL steril PBS ile doldurun.Ardından, birinci ve 12. sütunları steril PBS içindeki %0.5 DMSO'nun 50 µL'si ile doldurun. Daha sonra iki seyreltme plakasını yükleyin. Robot masasına iki kütüphane plakası, iki kutu 50 µL'lik steril uç ve altı hücre plakası yerleştirin.Şimdi hücre plakalarının üzerini açın, iki kütüphane plağından birindeki 10 millimolar stok çözeltiden ilgili dilüsyon plağına iki µL pipetleyin ve iyice karıştırın. Aynı uç setini kullanarak, 50 micromolar dilüsyonun üç µL'sini hücrelerin bulunduğu barkodlu üç beyaz 96 kuyucuklu plağa aktarın.Tüm uç setini değiştirin ve ikinci kütüphane plakası için hücre indüksiyonlarını tekrarlayın. Kültürlerin üzerini kapatın ve 24 saat boyunca inkübe edin. Ardından, kalan kütüphane plakaları için bileşik dilüsyonu ve hücre indüksiyonu işlemini tekrarlayın.Seçilen rekonstitüe lüsiferaz reaktifini oda sıcaklığına getiriniz. Lüsiferaz rezervuarını robot masasına yerleştiriniz ve reaktifi içine dökünüz. İndüklenmiş kültürlerin bulunduğu dokuz plakayı inkübatörden çıkarınız.Bunları robot masasına yerleştirin, kapaklarını açın ve oda sıcaklığına gelene kadar bekletin. Ardından, plakalar arasındaki her bir kuyuya 50 µL lusiferaz reaktifi ekleyin. Bir plakanın lüminesans okuma süresine eşit bir gecikme süresi tanımlayın.30 dakikalık inkübasyonun ardından, önce plakayı ilgili veri dosyasıyla ilişkilendirmek için plakanın barkodunu kaydedin. Ardından, ilk plakayı lüminometreye yerleştirin ve lüminesansı ölçün.Kısa bir çalkalama adımının ardından, tüm indüksiyon plakaları için lüminesans okumalarını tekrarlayın. Daha sonra kalan Lucifer race reaktifini toplayın ve -20 °C'de saklayın. Birincil taramanın deneysel verileri işlendikten sonra, bileşik özgünlüğünü bir karşı tarama ile doğrulamak için hitleri seçin.Seçilen hitleri belirleyin ve kontrollerin konumlarını da içerecek şekilde yeni tarama plakası için bir düzen oluşturun. Ardından, tekli 2D barkodlu tüplerde saklanan alikotları kullanarak yeni HIIT plakaları hazırlayın. Tarama işlemi için aynı protokol izlenir.Her bir hi plakası başına her stabil hücre hattından 3 adet 96 kuyucuklu plaka hazırlayın. Ertesi gün, hücreleri kütüphane bileşikleri ile işlemden geçirin. Her bir hi plakasını; CHP 1 34 micken için üç plaka, prime UTR için üç plaka ve kontrol hücreleri için üç plaka olacak şekilde, 24 saat boyunca 2 micromolar çalışma konsantrasyonunda işlem yapmak için kullanın.Tüm CHP 1 34 plakalarında, üç primer çevirilmeyen ve kontrol setlerinde lusiferaz aktivitesini ölçün. Birincil taramadaki veri analizinde olduğu gibi, işlem görmüş kuyucuklardan elde edilen deneysel verileri, aynı plaka üzerindeki araçla işlem görmüş kontrollerin ortalamasına göre normalize edin. Ardından, test edilen her bir bileşik için tekrarlar üzerinden ortalamayı ve standart sapmayı hesaplayın.CHP 1 34 3' UTR'ye karşı CHP 1 34'te lusiferaz aktivitesinin kat değişim oranı. Kontrol hücreleri için 1.5'ten büyük rastgele kat değişim eşikleri ve 0.01'den küçük anlamlılık P değerleri seçilmiştir. Bu deney, mic ve onkogenin 3' UTR'si aracılığıyla yürütülen post-transkripsiyonel kontrol mekanizmalarının potansiyel modülatörlerini belirlemek amacıyla 2000 bileşiklik bir kütüphaneyi taramıştır; 25 temsili kütüphane plağından birinin lusiferaz sinyali sonuçları, araç (vehicle) ile işlem görmüş hücrelerin yüzdesi olarak gösterilmiştir.Kontroller, bileşiklerin çoğunun üç prime UTR üzerinde belirgin bir etki oluşturmadığını göstermektedir. Hitler, ortalama değer ve standart sapmanın tüm analiz değerleri üzerinden hesaplandığı durumlarda seçilmiştir; lusiferaz aktivitesini %20'nin altına düşüren bileşikler, büyük olasılıkla bileşiğin belirgin hücresel toksisitesine işaret etmektedir. Bu grafik, W, X, Y ve Z olarak adlandırılan seçilmiş dört bileşiğin karşı taramasına ait temsili sonuçları göstermektedir. Kat değişim farkı ve T-testi ile belirtildiği üzere, hem W hem de X bileşikleri onkogene üç prime UTR reporter'dan artan lusiferaz ekspresyonu ile sonuçlanmıştır. Hem W hem de X bileşiklerinin etkileri gerçekten üç prime UTR'ye bağımlı olsa da, W bileşiğinin hücre canlılığı üzerinde anlamlı bir etkisi olmadığına dikkat edilmelidir.Bileşik X, CHP 1 34 kontrol hücrelerindeki normalize lüsiferaz sinyalinin gösterdiği üzere bazı sitotoksik aktiviteler sergilerken, iki mikromolar konsantrasyondaki ne bileşik Y ne de bileşik Z, lüsiferaz seviyeleri üzerinde 3' UTR'ye bağımlı bir etki göstermemiştir. Birincil tarama sırasında bileşik Y uygulamasıyla tespit edilen azalmış lüsiferaz aktivitesi, daha ziyade sitotoksisitenin bir sonucudur. Bileşik Z durumunda ise, artan lüsiferaz aktivitesi, viral promotörün 3' UTR açısından spesifik olmayan aktivasyonundan kaynaklanmaktadır.Kontrol ve çevrilmemiş setlerin her ikisinde de eşdeğer bir yukarı düzenleme gözlemlendiğinden, bu yüksek verimli analizde, kontrol hücrelerindeki birincil ısının doğrulanmasının, gerçekten üç asal çevrilmemiş bölge üzerinden etki eden bileşikleri, promotör aracılığıyla çalışan bileşiklerden ayırmak için kritik olduğunu unutmayın.

high-throughput-screening-for-chemical-modulators-post

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Içe doğru doğrultucu potasyum (Kir), yüksek verim Bileşik elemesi için kanal aktivitesini ölçmek için nicel bir floresan deneyi geliştirilmesi ve doğrulanması için yöntemler sunulmaktadır.

İçte düzeltici Potasyum Kanallarının Küçük moleküllü Modülatörler için Yüksek throughput Eleme

Bu yüksek verimli robot transfections ve bir ev yapımı çift ışıma lusiferaz deneyi kullanılarak transkripsiyon düzenleyiciler belirlenmesi için hızlı ve ucuz bir tarama yöntemi sunulmaktadır. Bu protokol, hızlı bir şekilde binlerce gen için doğrudan yan yana fonksiyonel veriler üreten ve ilgi duyulan herhangi bir geni hedef kolayca değiştirilebilir olduğunu.

Bir ev yapımı Çift kızdırma Lusıferaz Testi kullanarak yüksek verim Fonksiyonel Taraması

Hücresel süreçlerin bir sistem düzeyinde anlayış elde günümüz hücre biyolojisi bir hedeftir. Burada çeşitli hücresel fonksiyonunun çoklama lusiferaz gazetecilere yönelik stratejiler tarif son noktaları genom ölçekli RNAi kütüphaneleri kullanılarak gen işlevini sorgulamak için.

Kültür Hücreler Kanser ile ilişkili Sinyal İletimi sorgulanması için bir Multiplexed Lusiferaz tabanlı Tarama Platformu

Adenilat siklaz sinyal duyarlanmasına inhibitör G protein-eşli reseptörler sonuçları Kalıcı aktivasyonu. Temel moleküler yolları belirlemek için, nonbiased yaklaşımlar gereklidir, ancak bu strateji ölçeklenebilir hücre bazlı cAMP hassaslaşması testin geliştirilmesini gerektirmektedir. Burada, küçük molekül ve siRNA taranması için olan bir hassaslaşma deneyi tarif eder.

Adenilat siklaz uyuşturucu kaynaklı Sensitizasyonu: Küçük Molekül ve siRNA Tarama Uygulamaları için Deney düzene ve minyatür

Burada, hipoksiye HIF1A aracılı hücresel tepkinin yeni ubikitin ve ubikitin benzeri regülatörleri belirlemek için bir hedef siRNA "ubiquitome" ekranı gerçekleştirmek için bir yöntem tarif eder. Bu raportör etkinliğinin üzerinden sağlam bir okuma kullanılabilir herhangi bir biyolojik yoluna uyarlanabilir.

Kültür Memeli Hücrelerde Biyolojik tanımında ubikitin ve Ubiquitin benzeri Sistemi Regülatörleri tanımak siRNA Eleme

Biz bu çalışmada bir transgenik fareden türetilen lenfositlerin kullanılarak yeni floresans bazlı analiz sunuyoruz. Bu deney, inhibe veya lenfosit aktivasyonunu teşvik ya kapasitesine sahip küçük moleküller, yüksek verimli tarama (HTS) için uygundur.

Küçük moleküllerin yüksek verimli tarama için uygun bir floresan bazlı lenfositi analizi

Burada, saf ön hazırlıklı pluripotent geçiş kinaz regülatörleri için hedeflenmiş küçük molekül ekranları gerçekleştirmek için nicel ve ölçeklenebilir bir protokol sunuyoruz.

Embriyonik Kök Hücre Pluripotansını Yüksek Verimli İnhibitör Taramayla Düzenleyen Kinazları Tanımlamak İçin Basit Bir Yöntem

Bu iletişim kuralı ChIP-seq, 4sU seq, toplam RNA-seq ve hücre satırları ve Primer hücre için profil oluşturma ribozom Kombinatorik kullanımını açıklar. Transkripsiyon faktörü de novo transkripsiyon, RNA işlenmesi, ciro ve çeviri zamanla, bağlama ve olayların genel gidişatı harekete geçirmek ve/veya hızla değişen hücrelerde görüntüleme izleme değişiklikleri sağlar.

Gerçek zamanlı analiz bağlama, transkripsiyon, çeviri ve ciro hücresel etkinleştirme sırasında küresel olayları görüntülemek üzere transkripsiyon faktörü

Transkripsiyon faktörlerinin yeni düzenleyicilerini belirlemek için, çift luciferase tabanlı transkripsiyonel muhabir testi kullanarak dizili lentiviral veya retroviral RNAi kitaplıklarını taramak için bir yaklaşım geliştirdik. Bu yaklaşım, tek bir deneyde yüzlerce adayı taramak için hızlı ve nispeten ucuz bir yol sunar.

Dizili Kütüphanelerin Orta İşleç Lik Taraması ve Çift Luciferase Tabanlı Muhabir kullanılarak Transkripsiyon Faktörü Düzenleyicilerin Tanımlanması

Bu protokol, uygun maliyetli transkriptom tabanlı ilaç taraması için ex vivo veya in vitro hücre kültürlerinden transkriptomik veri ön işlemeye kadar bir iş akışını açıklar.

Uygun Maliyetli Transkriptomik Tabanlı İlaç Taraması

Keşfedin, hücre tabanlı luciferase raportör gen analizi ile post-transkripsiyonel düzenlemeyi modüle eden kimyasal bileşikleri yüksek verimli tarama yöntemini. Bu teknik, ilaç keşfi ve gen regülasyonu çalışmalarında yeni terapötik ajanların belirlenmesine yardımcı olur.

Post-transkripsiyonel ayarlı genlerin kimyasal Modülatörler için yüksek verimli tarama

Daha fazla video keşfet