Otofaji Analiz

Bu prosedürün amacı, filamanöz bir mantarda otofajiyi indüklemek ve gözlemlemektir. Bu işlem, öncelikle besin içeren ortamın küçük hacimlerinin sporlar veya küçük miselyum parçaları ile inoküle edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adımda, cam mikroskop lamlarının boşluklarında açlık pedleri hazırlanır ve ardından inokülat bu pedlerin üzerine aktarılır.

Son adımda, otofajiyi indüklemek için açlık pedleri nemli bir oda içerisinde inkübe edilir. Nihayetinde otofaji, floresan mikroskopi kullanılarak ilgilenilen floresan marker proteinlerin vakuollere translokasyonunun izlenmesiyle takip edilebilir. Bu yöntem, otofaji sürecini modüle eden yeni bileşiklerin tanımlanması gibi hücre biyolojisi alanındaki temel konuların çalışılmasına yardımcı olabilir.

Bir açlık deneyine hazırlanmak için, eğer ilgili P cresa genum suşu yeşil pirinç üzerinde tutuluyorsa, öncelikle üzeri miselyumlarla kaplı iki ila üç pirinç tanesini 1,5 µL mikro santrifüj tüpüne yerleştirin ve tüpü 500 µL maya özütü glikoz büyüme veya GG besiyeri ile doldurun. Ardından, sporların pirinçten ayrılması için tüpü 30 saniye boyunca vorteksleyin ve tüpü oda sıcaklığında bir gün boyunca inkübe edin. Ertesi gün, spor süspansiyonunu steril musluk suyunda 1/50 konsantrasyona seyreltin ve iyice karıştırın; eğer P cryogen agar üzerinde tutuluyorsa.

Miselyumun küçük parçalarını, 400 µL steril musluk suyu ve yaklaşık 100 mg cam boncuk içeren 1,5 mL'lik bir mikro santrifüj tüpüne aktarmak için bir pipet ucu kullanın. Ardından, miselyumların parçalanması için tüpü iki dakika boyunca vorteksleyin. PCE genumunu bir açlık pedinde kültüre etmek için, önce ısıtma plakasını yaklaşık 60 °C'ye ısıtın.

Ardından, iki gram agarı 100 mililitre musluk suyunda, sonuçtaki çözelti tamamen berraklaşana kadar mikrodalga fırında ısıtın ve agarın yaklaşık 60 °C'ye soğumasını bekleyin. Her örnek için 1,5 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpüne 400 µL steril musluk suyu veya bileşik çözeltisi ekleyin. Daha sonra tüpleri ve mikroskop lamlarını ısıtma plakası üzerinde en az 60 saniye boyunca ısıtın.

Tüm tüplere 60 °C'ye ısıtılmış 400 µL aros aktararak her tüpteki toplam hacmi 800 µL'ye tamamlayın ve tüpleri kısa süre vorteksleyin, ardından erken katılaşmayı önlemek için tüpleri tekrar ısıtma plakasına yerleştirin. Şimdi her mikroskop lamının çukuruna uygun aros çözeltisinden 140 µL pipetleyin. Kabarcık oluşmamasına dikkat ederek aros'u hemen lamel ile düzleştirin ve ardından lamları yaklaşık dört dakika dinlendirin.

Oda sıcaklığında agar pedleri katılaştığında, lam örtülerini dikkatlice kaydırarak çıkarmak için başparmağınızı veya işaret parmağınızı kullanın ve mikroskop lamlarını ve pedleri nemli bir hazneye yerleştirin. Ardından, önceden hazırlanmış 5 µL P. ergenum'u açlık pedinin merkezine pipetleyin ve kutuyu çok fazla hareket ettirmemeye veya kültürleri bozmamaya dikkat ederek, kuruma riskine karşı ekstra koruma sağlamak için nemli hazneyi plastik bir poşete sarın. Daha sonra, numuneleri analiz etmeden önce inokülatları oda sıcaklığında en az 20 saat boyunca saklayın.

Ertesi gün, lamları kuru kağıt havluya aktarın ve ardından her bir açlık pedine 50 µL su damlatın. Fazla suyu dışarı itmek için bir lamel kullanın ve taze kağıt havlu ile temizleyin. Daha sonra her bir lam için, miselyum büyümesine genel bir bakış elde etmek amacıyla 20x objektif kullanın.

Hy-Fi içindeki GFP lokalizasyonunu değerlendirmek için görüntüleri 63x veya 100x objektif ile açın. Son olarak, her görüntülemeden sonra lamları, bir sonraki deney zamanına kadar ıslak hazneye geri yerleştirin.

Bu görüntülerde, 20 saatlik inkübasyonda peroksizom degradasyonunu değerlendirmek için G-F-P-S-K-L-P Creo Genum suşu kullanılmıştır. GFP vakuollerde gözlemlenmemiş ve bu organellerde genişleme meydana gelmemiştir. Ancak, 40 saatlik büyüme sonunda, bazı hiflerde GFP işaretli VAKUOLER görüntülemiş olup bu durum otofajinin aktivasyonunu göstermiştir; 60 saatte ise GFP floresansı ve genişlemiş vakuoller daha belirgin şekilde gözlemlenmiştir.

Bu deneyde, negatif kontrol olarak p caressa Genum'un delta 80 G one mutantı kullanılmıştır. İşlem görmemiş G-F-P-S-K-L suşuyla gözlemlendiği üzere, pozitif kontrol olarak otofaji uyarıcı ilaç rapamisin kullanılmasına rağmen, 60 saatlik büyüme süresinde bile vakuol büyümesinin ve GFP'nin eksik olduğu not edilmiştir. GFP ile işaretlenmiş vakuoller 40 saatlik büyümeden sonra görünür hale gelmiş ve 60. saate gelindiğinde Hy-Fi tamamen büyük GFP içeren vakuoller ile dolmuştur.

Bu videoyu izledikten sonra, mentis funguslarında otofajinin nasıl analiz edileceğine dair iyi bir anlayışa sahip olmanız gerekir.