Name: Otofaji Analiz Penicillium chrysogenum Floresan Mikroskopi ile Kombinasyon Açlık Pedleri kullanarak (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 51 s
Description: Öğrenin Penicillium chrysogenum'da otofajiyi açlık pedleri ve floresan mikroskopi kullanarak nasıl gözlemleyeceğinizi. Bu yöntem, hücre biyolojisi araştırmalarında otofaji sürecini modüle eden yeni bileşikleri tanımlamaya yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

CQS, LOEWE Bütünleştirici Mantar Araştırmaları Mükemmeliyet Kümesi'nden (IPF) bir burs aldı. Yazar, bu çalışmada kullanılan P. chrysogenum suşları için Ida J. van der Klei'ye ve rapamisin armağanı için Andreas S. Reichert'e teşekkür eder.

P. hazırlanması 1. chrysogenum Açlık Deneyler için <ol><li> P. Eğer Çevrede chrysogenum suşu pirinç (&#39;yeşil pirinç&#39;) tutulur, 1.5 ml mikrosantrifüj tüp içine miselyumu sporlanan ile kaplı 2-3 pirinç tanelerini yerleştirin. 500 ul YGG (10 g / l KCI, 20 g / l glukoz, 10 g / l maya azot baz, 5 g / l K 2 HPO 4, 20 g / l maya ekstresi) ile doldurun. <ol><li> Sporlar etkili bir pirinç ayrılacak şekilde 30 saniye için tüp karıştırın. </li><li> Oda sıcaklığında 1 gün (örneğin, 20 ila 25 ° C) tüp inkübe edin. </li><li> Steril musluk suyu bu spor süspansiyonu, bir 1/50 seyreltme hazırlanır, iyice karıştırın. </li></ol></li><li> P. Eğer Çevrede chrysogenum suşu bir agar plaka (örneğin, YGG agar) tutulur, 400 ul steril musluk suyu ve yaklaşık 100 mg gl içeren 1.5 ml mikrosantrifüj tüp içine misel küçük parçalar aktarmaksteril bir kürdan veya pipet kullanarak eşek boncuk. <ol><li> Vortex 2 dakika süreyle tüp böylece misel parçalanmış olur. Hemen tüp içeriğini kullanın. </li></ol></li></ol> P. Yetiştiriciliği 2. Hazırlık Adımları Açlık Pedleri üzerinde chrysogenum <ol><li> Bir ısıtma plakası üzerinde açma ve yaklaşık 60 ° C&#39;ye ayarlayın. </li><li> Bir mikrodalga fırında pişirme çözümü ile musluk suyu ml 100&#39;de agaroz 2 gr eritin. Bu çözüm ısıttıktan sonra tamamen açıktır özen gösterin. Değilse agaroz tamamen eriyene kadar, tekrar pişirin. Agaroz çözüm kullanılmadan önce yaklaşık 60 ° C&#39;ye kadar soğumasını bekleyin. </li><li> 400 ul steril musluk her (ek bileşikler eklenmiştir) su ya da (örneklerin sayısına bağlı olarak 2-4) 1.5 ml mikrosantrifüj tüpleri Dolgu 400 x ul (adım 2.5 bileşiği çözeltisi ul x ilaveli) ve koyun en az 1 dakika için ısıtma plakası üzerine bu yüzden water içinde ısınıyor. </li><li> En az 1 dakika için ısıtma plakası üzerine bir merkezi boşluğu içeren mikroskop slayt yerleştirin. </li><li> 1.5 ml mikrosantrifüj tüpleri ve girdap kısaca çözeltisine agaroz 400 ul% 2 ekleyin. Eğer istenirse bu adımdan sonra ilave bileşikler (yani, 1 uM rapamisin) ekleyin. Eğer bu yapılırsa, girdap her ek madde tüp pipetle kısaca sonra. Erken katılaşma önlemek için ısıtma masaya geri tüpleri koyun. NOT: mikrosantrifüj tüpü içinde toplam hacim 800 ul olmalıdır. </li></ol> Açlık Pedleri İçeren Mikroskop Slaytlar 3. Hazırlık <ol><li> (Hala ısıtma plakası üzerinde yer almaktadır) mikroskop lamı boşluğuna agaroz çözeltisi Pipet 140 ul. Mümkünse kabarcıkları yapmaktan kaçınmaya çalışın. </li><li> Hemen agaroz çözeltisi üzerine bir kapak kayma yerleştirin. Not: Bu, düz bir yüzeye yol açacaktır. </li><li> Mikro koyYaklaşık 4 dakika laboratuar tezgah üzerine kapsam slayt agaroz ped katılaşmaya izin. </li><li> Dikkatlice başparmak veya işaret parmağı yardımı ile kaymasını agaroz ped lamel çıkarın (kirlenmeyi önlemek için eldiven giymek!). </li><li> Kurumasını önlemek için bir ıslak odasına ped ile mikroskop lamı yerleştirin. Öneri: hala pipet uçları tutmak için ekleme sahip boş bir ipucu kutusunu kullanın. Alt tutulmasını sağlamak için, kutu, steril su eklenir. Insert üzerine mikroskop slaytlar yerleştirin ve kutusunu kapatın. </li></ol> 4. P. ile Açlık Pedleri aşılamak chrysogenum Kuluçka <ol><li> 1/50 spor (kültürler pirinç yetiştirilen olsaydı) seyreltme veya açlık pad merkezine üzerine (kültürler bir agar plaka üzerinde yetiştirilen olsaydı) misel parçalarını içeren sulandırılmamış çözeltinin 5 ul Pipet 5 ul. </li><li> Bu şekilde hizmet vermektedir (ıslak odasına kapatın ve bir plastik torba içinde sarınaçlık yastıkları kuruma karşı ek koruma). Çok aksi aşılama damla rahatsız olacak, çünkü kutusunu taşımak için dikkatli olun. </li><li> Örnekleri analiz etmek için en az 20 saat boyunca oda sıcaklığında sarılmış kutusunu saklayın. </li></ol> Örneklerinde 5. mikroskobik analizi <ol><li> Inkübasyon 20 saat sonra numuneler mikroskobik analiz için hazır; Kuru kağıt mendil üzerine mikroskop lamı koyun (alt ıslak olma eğilimindedir). </li><li> Açlık ped üzerine küçük bir su hacmi (yaklaşık 50 ul) pipetle. Ped üzerine bir lamel koyun ve fazla suyunu sıkın. Bir kağıt mendil ile fazla suyun çıkarın. </li><li> Floresan mikroskop gözlem masaya mikroskop lamı koyun. Misel büyüme bir bakış elde etmek için, bir 20X objektif kullanın. Hif GFP lokalizasyonu incelemek için kullanın 63X veya 100X hedefleri. Için numune analiz yok numune kademeli kuruma önlemek içinuzun 15 dakika ıslak odasına geri koymadan önce. </li><li> (40 saat ve büyüme 60 saat sonra, örneğin) düzenli aralıklarla 5.3 tekrarlayın. NOT: Numune ıslak odasına geri konabilir. O Miseliyum büyümeyi etkilemez gibi lamel kaldırmak için gerekli değildir. </li></ol>

<ol><li>Fischer, F., Hamann, A., Osiewacz, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+quality+control%3A+an+integrated+network+of+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem.+Sci%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial quality control: an integrated network of pathways.</a> Trends Biochem. Sci. 37 (7), 284-292 (2012).</li>
<li>Pollack, J. K., Harris, S. D., Marten, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+in+filamentous+fungi%5BTitle%5D)+AND+%22Fungal+Genet.+Biol%22%5BJournal%5D)">Autophagy in filamentous fungi.</a> Fungal Genet. Biol. 46 (1), 1-8 (2009).</li>
<li>Scheckhuber, C. Q., Osiewacz, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Podospora+anserina%3A+a+model+organism+to+study+mechanisms+of+healthy+ageing%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Genet.+Genomics%22%5BJournal%5D)">Podospora anserina: a model organism to study mechanisms of healthy ageing.</a> Mol. Genet. Genomics. 280 (5), 365-374 (2008).</li>
<li>Pinan-Lucarré, B., Iraqui, I., Clavé, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Podospora+anserina+target+of+rapamycin%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Genet%22%5BJournal%5D)">Podospora anserina target of rapamycin.</a> Curr. Genet. 50 (1), 23-31 (2006).</li>
<li>Kikuma, T., Ohneda, M., Arioka, M., Kitamoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+analysis+of+the+ATG8+homologue+Aoatg8+and+role+of+autophagy+in+differentiation+and+germination+in+Aspergillus+oryzae%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryot.+Cell%22%5BJournal%5D)">Functional analysis of the ATG8 homologue Aoatg8 and role of autophagy in differentiation and germination in Aspergillus oryzae.</a> Eukaryot. Cell. 5 (8), 1328-1336 (2006).</li>
<li>Pinan-Lucarré, B., Balguerie, A., Clavé, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+cell+death+in+Podospora+autophagy+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryot.+Cell%22%5BJournal%5D)">Accelerated cell death in Podospora autophagy mutants.</a> Eukaryot. Cell. 4 (11), 1765-1774 (2005).</li>
<li>Veneault-Fourrey, C., Barooah, M., Egan, M., Wakley, G., Talbot, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagic+fungal+cell+death+is+necessary+for+infection+by+the+rice+blast+fungus%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Autophagic fungal cell death is necessary for infection by the rice blast fungus.</a> Science. 312 (5773), 580-583 (2006).</li>
<li>Bartoszewska, M., Kiel, J. A., Bovenberg, R. A., Veenhuis, M., van der Klei, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+deficiency+promotes+beta-lactam+production+in+Penicillium+chrysogenum%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Autophagy deficiency promotes beta-lactam production in Penicillium chrysogenum.</a> Appl. Environ. Microbiol. 77 (4), 1413-1422 (2011).</li>
<li>Meijer, W. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peroxisomes+are+required+for+efficient+penicillin+biosynthesis+in+Penicillium+chrysogenum%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Peroxisomes are required for efficient penicillin biosynthesis in Penicillium chrysogenum.</a> Appl. Environ. Microbiol. 76 (17), 5702-5709 (2010).</li>
<li>Cubitt, A. B., Heim, R., Adams, S. R., Boyd, A. E., Gross, L. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding%2C+improving+and+using+green+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem.+Sci%22%5BJournal%5D)">Understanding, improving and using green fluorescent proteins.</a> Trends Biochem. Sci. 20 (11), 448-455 (1995).</li>
<li>Jung, C. H., Ro, S. H., Cao, J., Otto, N. M., Kim, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mTOR+regulation+of+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">mTOR regulation of autophagy.</a> FEBS Lett. 584 (7), 1287-1295 (2010).</li>
<li>Hickey, P. C., Read, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+living+cells+of+Aspergillus+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Med.+Mycol%22%5BJournal%5D)">Imaging living cells of Aspergillus in vitro.</a> Med. Mycol. 47, Suppl 1. S110-S119 (2009).</li>
</ol>

Yazarın açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Burada sunulan yöntem, P. otofaji uygun ve tekrarlanabilir çalışma sağlar chrysogenum. Örneğin, bu mantar ya da değil Otofaji tepkisini modüle edebilen olup çeşitli bileşiklerin etkinliğini taramak için kullanılabilir. rapamisin ile sonuçlar Devri sinyallemesinin engellenmesi P. otofaji belirgin bir indüksiyonuna neden olduğunu göstermektedir chrysogenum, diğer organizmalar 11 kanıtlanabildiği. Daha karmaşık mikroskopları (örneğin, konf...

İpliksi mantar gelişme işlemine çalışma için mükemmel bir model sistemleridir. Bunlar ucuz ekimi, döl ve genetik erişilebilirlik yüksek sayılar gibi birçok deneysel faydaları sunuyoruz. son nokta, çeşitli hücresel mekanizmalar için çok-çok uncharacterized genlerin önemini araştıran izin Transformantların yapımı için özellikle önemlidir. İpliksi mantar fazlası ve / veya işlevsel hücre bileşenlerinin çıkarılması için mitokondriyal bütünlüğü ve Otofaji sağlamak ve sürdürmek için çeşitli elemanlar ve anormal protein, mitokondriyal dinamikleri indirgenmesi için proteaz aktivitesi hücresel kalite kontrol yollarının mekanizmaların açıklanması için etkili olmuştur açlık 1,2,3 zamanlarında hücre canlılığı. Ipliksi mantarlar 2 Otofaji çalışma için uygun bir çok deneysel teknik vardır: vaküol (i) inceleme ıproteazlar, transmisyon elektron mikroskopisi 4 tarafından önlendiği zaman f de yoğun otofajik organları içeren, (ii) flüoresan boya monodansyl kadavenn kullanılarak floresan mikroskop 5,6 ve asidifiye autophagosomal yapıları (iii) algılama ile GFP Atg8 odak izleyerek autophagosomes görselleştirme 7. Burada, otofaji çalışmaları için penicillium chrysogenum büyüyen yeni bir yöntem sunulmaktadır. Ana unsur sadece agaroz sterilize musluk suyunda çözünmüş 1% oluşur &#39;açlık pedi&#39; olduğunu. Ek bileşikler (örneğin, stres, temizleyiciler, otofaji modülatörleri) sürece otomatik floresan göstermez altlığınızda ilave edilebilir. ped sığ merkezi boşluğu ihtiva mikroskop slaytlar yer almaktadır. Bir spor süspansiyonu ile ya da küçük miselyum fragmanları ile aşılanır Bu ped. ilgi suşu sporulat başarısız olursa ikinci tavsiye ediliretkin bir şekilde, e (örneğin, Δ atg1 suşları 8). slaytlar numunenin kuruma önlemek için (bunlar kolayca boş pipet ucu kutuları kullanılarak inşa edilebilir) ve oda sıcaklığında inkübe ıslak odalarında konumlandırılmış. P. chrysogenum, bu koşullar altında bir kaç gün için büyümeye edebilmektedir. Otofaji mantar Otofaji için olumlu bir belirtecidir vakuolar genişleme ile mikroskobik edilebilir. Bu katkı, bir P. chrysogenum soyu (Wisconsin 54-1255) C-terminal &#39;SKL&#39; dizisi 9 ile peroksisomlara hedeflenen yeşil floresan proteini oluşturan kullanılır. Bu nedenle, peroksizom bozulmasını izlemek mümkündür. Uygun lokalizasyon sinyallerini kullanarak, aynı zamanda hücrenin (örneğin, mitokondriya) &#39;in diğer bölmeleri etiket ve bozunmasını analiz etmek mümkündür. P. veri rağmen chrysogenum Ws54-1255 (GFP-SKL) kesinlikle mümkün, burada sunulmuşturDiğer ipliksi mantarlar için de &#39;açlık ped&#39; yöntemi kullanmak (örneğin, Neurospora crassa, Sordaria macrospora, Aspergillus türleri, vb).

<table><tbody><tr><td>Merkezi boşluklu mikroskop slaytları</td><td>Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Almanya</td><td>H884.1</td><td>Bunlar temizlendikten sonra birden çok kez kullanılabilir.</td></tr><tr><td>Cam boncuklar</td><td>Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Almanya</td><td>A553.1</td><td>Çap: 0,25 - 0,50 mm</td></tr></tbody></table>

otofaji analiz<em&gt; penicillium chrysogenum</em&gt; floresan mikroskopi ile kombinasyon açlık pedleri kullanarak

Analysis of Autophagy in Penicillium chrysogenum by Using Starvation Pads in Combination With Fluorescence Microscopy

Hücresel kalite kontrol sistemlerinin incelenmesi, çağdaş araştırmanın oldukça dinamik ve ilgili bir alanı olarak ortaya çıkmıştır. Hücrelerin, nükleik asitler, lipitler ve proteinler gibi biyolojik olarak ilgili moleküllere verilen hasara karşı çeşitli savunma hatlarına sahip olduğu ortaya çıkmıştır. Organel dinamiklerine (füzyon/fisyon/motilite/kalıtım) ve sıkı bir şekilde kontrol edilen proteaz aktivitesine ek olarak, fazla, hasar görmüş veya tehlikeye atılmış organellerin otofaji (hücresel 'kendi kendini yeme') ile bozulması bilim camiasından büyük ilgi görmüştür. Otofajinin düzenlenmesi oldukça karmaşıktır ve çoğu şimdiye kadar açıklanmamış olan genetik ve çevresel faktörlere bağlıdır. Burada, filamentli mantar Penicillium chrysogenum'da otofajinin uygun şekilde incelenmesine izin veren yeni bir yöntem sunulmaktadır. Otofajinin tekrarlanabilir bir şekilde uyarılması için mantarın 'açlık pedleri' olarak adlandırılan üzerinde büyümesine dayanır. Numuneler doğrudan mikroskopi ile test edilir ve otofaji indüksiyonu / ilerlemesi için değerlendirilir. Burada sunulan protokol, P. chrysogenum ile kullanım için sınırlı değildir ve diğer filamentli mantarlarda kullanım için kolayca uyarlanabilir.

P. peroksizom bozulması yukarıda ayrıntılı protokol kullanılmasını göstermek için chrysogenum suşu Ws54-1255 (GFP-SKL) analiz edildi. Bu gerginlik GFP-SKL genellikle peroksizom 9 aktarılır. Örnek floresan mikroskobu ile analiz edildiğinde, bu çok sayıda küresel şekiller görünümüne yol açar. Otofaji oluşursa, vakuolleri büyütmek. GFP-SKL otofaji (pexophagy) tarafından vakuollerde dahil olur. Nedeniyle GFP vakuol proteazlar tarafından bozulmaya dirençli olduğu gerçeğini bu organellerin 10...

Penicillium chrysogenum'da açlık pedleri (merkezi bir boşluk içeren bir mikroskop lamında agaroz ve musluk suyu karışımları) kullanarak otofajiyi incelemek için uygun ve güçlü bir yöntem burada sunulmaktadır.

Otofaji Analiz<em&gt; Penicillium chrysogenum</em&gt; Floresan Mikroskopi ile Kombinasyon Açlık Pedleri kullanarak

The study of cellular quality control systems has emerged as a highly dynamic and relevant field of contemporary research. It has become clear that cells ...

Bu prosedürün amacı, filamanöz bir mantarda otofajiyi indüklemek ve gözlemlemektir. Bu işlem, öncelikle besin içeren ortamın küçük hacimlerinin sporlar veya küçük miselyum parçaları ile inoküle edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adımda, cam mikroskop lamlarının boşluklarında açlık pedleri hazırlanır ve ardından inokülat bu pedlerin üzerine aktarılır.Son adımda, otofajiyi indüklemek için açlık pedleri nemli bir oda içerisinde inkübe edilir. Nihayetinde otofaji, floresan mikroskopi kullanılarak ilgilenilen floresan marker proteinlerin vakuollere translokasyonunun izlenmesiyle takip edilebilir. Bu yöntem, otofaji sürecini modüle eden yeni bileşiklerin tanımlanması gibi hücre biyolojisi alanındaki temel konuların çalışılmasına yardımcı olabilir.Bir açlık deneyine hazırlanmak için, eğer ilgili P cresa genum suşu yeşil pirinç üzerinde tutuluyorsa, öncelikle üzeri miselyumlarla kaplı iki ila üç pirinç tanesini 1,5 µL mikro santrifüj tüpüne yerleştirin ve tüpü 500 µL maya özütü glikoz büyüme veya GG besiyeri ile doldurun. Ardından, sporların pirinçten ayrılması için tüpü 30 saniye boyunca vorteksleyin ve tüpü oda sıcaklığında bir gün boyunca inkübe edin. Ertesi gün, spor süspansiyonunu steril musluk suyunda 1/50 konsantrasyona seyreltin ve iyice karıştırın; eğer P cryogen agar üzerinde tutuluyorsa.Miselyumun küçük parçalarını, 400 µL steril musluk suyu ve yaklaşık 100 mg cam boncuk içeren 1,5 mL'lik bir mikro santrifüj tüpüne aktarmak için bir pipet ucu kullanın. Ardından, miselyumların parçalanması için tüpü iki dakika boyunca vorteksleyin. PCE genumunu bir açlık pedinde kültüre etmek için, önce ısıtma plakasını yaklaşık 60 °C'ye ısıtın.Ardından, iki gram agarı 100 mililitre musluk suyunda, sonuçtaki çözelti tamamen berraklaşana kadar mikrodalga fırında ısıtın ve agarın yaklaşık 60 °C'ye soğumasını bekleyin. Her örnek için 1,5 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpüne 400 µL steril musluk suyu veya bileşik çözeltisi ekleyin. Daha sonra tüpleri ve mikroskop lamlarını ısıtma plakası üzerinde en az 60 saniye boyunca ısıtın.Tüm tüplere 60 °C'ye ısıtılmış 400 µL aros aktararak her tüpteki toplam hacmi 800 µL'ye tamamlayın ve tüpleri kısa süre vorteksleyin, ardından erken katılaşmayı önlemek için tüpleri tekrar ısıtma plakasına yerleştirin. Şimdi her mikroskop lamının çukuruna uygun aros çözeltisinden 140 µL pipetleyin. Kabarcık oluşmamasına dikkat ederek aros'u hemen lamel ile düzleştirin ve ardından lamları yaklaşık dört dakika dinlendirin.Oda sıcaklığında agar pedleri katılaştığında, lam örtülerini dikkatlice kaydırarak çıkarmak için başparmağınızı veya işaret parmağınızı kullanın ve mikroskop lamlarını ve pedleri nemli bir hazneye yerleştirin. Ardından, önceden hazırlanmış 5 µL P. ergenum'u açlık pedinin merkezine pipetleyin ve kutuyu çok fazla hareket ettirmemeye veya kültürleri bozmamaya dikkat ederek, kuruma riskine karşı ekstra koruma sağlamak için nemli hazneyi plastik bir poşete sarın. Daha sonra, numuneleri analiz etmeden önce inokülatları oda sıcaklığında en az 20 saat boyunca saklayın.Ertesi gün, lamları kuru kağıt havluya aktarın ve ardından her bir açlık pedine 50 µL su damlatın. Fazla suyu dışarı itmek için bir lamel kullanın ve taze kağıt havlu ile temizleyin. Daha sonra her bir lam için, miselyum büyümesine genel bir bakış elde etmek amacıyla 20x objektif kullanın.Hy-Fi içindeki GFP lokalizasyonunu değerlendirmek için görüntüleri 63x veya 100x objektif ile açın. Son olarak, her görüntülemeden sonra lamları, bir sonraki deney zamanına kadar ıslak hazneye geri yerleştirin.Bu görüntülerde, 20 saatlik inkübasyonda peroksizom degradasyonunu değerlendirmek için G-F-P-S-K-L-P Creo Genum suşu kullanılmıştır. GFP vakuollerde gözlemlenmemiş ve bu organellerde genişleme meydana gelmemiştir. Ancak, 40 saatlik büyüme sonunda, bazı hiflerde GFP işaretli VAKUOLER görüntülemiş olup bu durum otofajinin aktivasyonunu göstermiştir; 60 saatte ise GFP floresansı ve genişlemiş vakuoller daha belirgin şekilde gözlemlenmiştir.Bu deneyde, negatif kontrol olarak p caressa Genum'un delta 80 G one mutantı kullanılmıştır. İşlem görmemiş G-F-P-S-K-L suşuyla gözlemlendiği üzere, pozitif kontrol olarak otofaji uyarıcı ilaç rapamisin kullanılmasına rağmen, 60 saatlik büyüme süresinde bile vakuol büyümesinin ve GFP'nin eksik olduğu not edilmiştir. GFP ile işaretlenmiş vakuoller 40 saatlik büyümeden sonra görünür hale gelmiş ve 60. saate gelindiğinde Hy-Fi tamamen büyük GFP içeren vakuoller ile dolmuştur.Bu videoyu izledikten sonra, mentis funguslarında otofajinin nasıl analiz edileceğine dair iyi bir anlayışa sahip olmanız gerekir.

analysis-autophagy-penicillium-chrysogenum-using-starvation-pads

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bozulma ve geri dönüşüm için maya vakuol asidik lümen organelleri teslim izlemek için sağlam bir yaklaşım açıklanmıştır. Bu yöntem, genetik olarak kodlanmış çift emisyon floresan pH biyosensör ve floresan mikroskobu kullanarak tek tek hücrelerin görselleştirme hedef organellerin özel etiketleme dayanmaktadır.

Maya İzleme Mitophagy Floresan Mikroskopi Testi Saccharomyces cerevisiae

Otofaji hücreler protein ve organellerin aşağılamak ve geri dönüşüm sağlayan her yerde bulunan bir süreçtir. Biz görselleştirmek ve küçük ölçmek için gelişmiş floresan mikroskop geçerli, ama autolysosomes içine oluşumu ve autophagosomes ve lizozomlar dağılımı, ve füzyon da dahil olmak üzere otofaji indüksiyon ile ilgili temel, fiziksel değişiklikler,.

Gelişmiş 3D Floresan Mikroskobu kullanılarak Otofaji Kantitatif Analiz

Floresan etiketli otofaji belirteçlerin zaman atlamalı mikroskopi yüksek temporal çözünürlük ile dinamik otofaji yanıt izleme sağlar. 3 farklı renklerin bir kombinasyonu belirli Otofaji ve organel belirteçleri kullanarak, güçlü bir mekansal ve zamansal bağlamda autophagosome oluşumuna bir protein katkısı takip edebilir.

Erken Otofaji Etkinlikler Hücre Görüntüleme Canlı: Omegasomes ve Ötesi

Deneysel sepsis çekal ligasyon ve delme (CLP) yöntemini kullanarak farelerde neden olabilir. CLP kaynaklı sepsis bağlamında in vivo Otofaji değerlendirmek için mevcut protokoller burada sunulmuştur: (GFP)-LC3 fareler kullanılarak Otofaji ölçülmesi için bir protokol ve elektron mikroskobu ile autophagosome oluşumunu ölçmek için bir protokolü.

Çekal ligasyon ve Farelerde Autophagy incelemek için bir model olarak Sepsis Patamaya kaynaklı

Patojen yayılmasını karşı koymak için, konakçı hücreler bakteriler ve bölümlere Otofaji uyarabilme iskeletinin yeniden. Doku kültürü hücreleri, ev sahibi ve bu işlem altında patojen belirleyicileri kullanılarak Shigella enfeksiyonu tespit ve karakterize edilir. Shigella enfeksiyonu Zebra balığı modellerini kullanarak, keşfedilen moleküllerin ve mekanizmaların rolü in vivo incelenmiştir.

Kullanımı<em&gt; Shigella flexneri</em&gt; Otofaji-Sitoiskelet Etkileşimleri Okumak

Burada, otofajiyi objektif, kantitatif ve istatistiksel olarak sağlam bir şekilde ölçmek için, 3 autofagy markörün parlak detaylı görüntülerini karşılaştıran ve LC3 nokta sayımı ile birlikte lokalizasyonunu niceleyen analitik bir özelliğe sahip multispektral görüntüleme akış sitometrisi kullanılmıştır.

Multifektral Görüntüleme Akış Sitometrisi Kullanılarak LC3, p62 ve LAMP1 Birlikte Lokalizasyonu Ölçülerek Otofajik Fluxın Değerlendirilmesi

Protein toplama ve merkezi sinir sistemi Drosophila modellerinin autophagic akı floresan-görüntüleme tabanlı cep biyolojik çalışmalar nicel veri ayıklamak için bir basit ve uyarlanabilir iş akışı geliştirdiğimiz ateş.

Ateş Drosophila ImageJ kullanarak Fluorescently Tagged proteinlerin tarafsız analizi ile yılında niceliksel hücre biyolojisi

Bu yazıda hala, floresan görüntüler ve yüksek çözünürlüklü iletim elektron mikroskop görüntüleri kullanılarak incelenmiştir kripokal hücreler ve amipler bir ortak kültürü hazırlamak için bir protokol ayrıntıları. Burada gösterildiği gibi nicel veriler bu tür niteliksel bilgileri tamamlayabilir.

Kripokus-Amoeba etkileşimlerinde mikroskobik teknikler ve floresans okuma tamamlayıcı kullanımı

Bu protokol, Drosophila melanogaster larva yağ gövdesinde otofajinin besin tükenmesi yoluyla indüklenmesini açıklamakta ve transgenik sinek suşlarını kullanarak otofajideki değişiklikleri analiz etmektedir.

Drosophila melanogaster larva yağ gövdesinde açlığa bağlı otofajinin analizi

Bu protokolün amacı, LC3 immünofloresan ve LC3 nokta ölçümü yoluyla pankreas kanseri ve pankreas asinar hücrelerinde otofajik düzeyleri belirlemektir.

LC3 İmmünofloresan Kullanılarak İki Farklı Pankreas Hücre Modelinde Otofaji Düzeylerinin Değerlendirilmesi

Burada, hücresel üst yapı ile ilgili olarak nadir proteinlerin lokalizasyonunu araştırmak için bir araç olarak endojen, floresan etiketlemeye dayalı optimize edilmiş kesit korelasyonlu ışık-elektron mikroskobu için bir protokol sunuyoruz. Bu yaklaşımın gücü, Bafilomisin tedavisi olmadan aç bırakılmış hücrelerde endojen LC3'ün ultrastrüktürel lokalizasyonu ile gösterilmiştir.

Kesit Üzerinde Korbağül Işık-Elektron Mikroskobu ile Endojen LC3'ün Ultrastrüktürel Lokalizasyonu

Öğrenin Penicillium chrysogenum'da otofajiyi açlık pedleri ve floresan mikroskopi kullanarak nasıl gözlemleyeceğinizi. Bu yöntem, hücre biyolojisi araştırmalarında otofaji sürecini modüle eden yeni bileşikleri tanımlamaya yardımcı olur.

Otofaji Analiz

Daha fazla video keşfet