Amyotrofik Lateral Skleroz TDP-43 Türevleri karşı Morfoloji Özel Reaktifler İzolasyonunda Roman Atomik Kuvvet Mikroskobu Tabanlı biopanning

Bu prosedürün genel amacı, iki aşamalı A FM tabanlı radyo panning teknolojisi kullanılarak bir LS'de bulunan 43 varyanta karşı, tar DNA bağlayıcı proteine özgü morfolojik reaktifleri izole etmektir. Bu işlem, öncelikle çeşitli bir faj kütüphanesinin immünotüpler kullanılarak hedef dışı antijenlere karşı birden fazla negatif panning turuna tabi tutulmasıyla gerçekleştirilir.

Negatif panning sırasıyla sığır serum albümini, agrege alfa sinüklein ve sağlıklı insan beyin dokusuna karşı gerçekleştirilir. İkinci adım, istenmeyen tüm fajların başarılı bir şekilde uzaklaştırıldığından emin olmak için her negatif panning setinden sonra bir FM doğrulaması tamamlamaktır. Bu negatif panning örneğinde, agrege alfa sinüklein kullanıldığında fajlar bir turdan sonra görünür durumdayken, 10. turdan sonra mevcut değildirler.

Ardından, sınırlı örnek mevcudiyeti nedeniyle geri kalan negatif ayıklama turları MICA üzerinde gerçekleştirilir. Sağlıklı dokulardan ve frontotemporal demans veya FTD dokularından immünopresipite edilen TDP 43'e reaktif olan fajlar sırasıyla uzaklaştırılır. Son adım, $\alpha$ LS immünopresipitesine bağlanan fajların izole edilmesidir.

Mika bağlı fajlar kullanılarak TDP 43; tripsin, trietilamin ve TG one hücreleri ile belirtilmiştir. Nihayetinde, bu potansiyel ALS klonlarının özgüllüğü, indirekt FA ELISA ve dot blot yöntemleri kullanılarak doğrulanmıştır; her iki analizde de homojenize edilmiş ALS-FTD ve sağlıklı insan beyin dokuları immobilize edilmiştir. Genellikle, test edilen diğer gruplara kıyasla ALS dokusuna karşı daha yüksek reaktivite saptanmıştır.

Bu tekniğin konvansiyonel faj biyopanning yöntemine göre temel avantajı, kompleks biyolojik örneklerde düşük konsantrasyonlarda bulunsa dahi, hastalığa özgü protein varyantlarını seçici olarak tanıyan reaktiflerin izolasyonunu sağlamak amacıyla bir FM ile doğrulanmış kapsamlı negatif panning protokollerinin kullanılmasıdır. Bir FM, biyomoleküler özelliklerin ve etkileşimlerin incelenmesine dair içgörü sağlayabildiği gibi, biyopanning sürecinin izlenmesi ve tekil CLO'ların özgünlüğünün doğrulanması gibi diğer sistemlere de uygulanabilir. Bu prosedüre, önce BSA'ya karşı negatif panning gerçekleştirmek için metin protokolünde detaylandırıldığı üzere faj üretimi ile başlayın; bir mg/mL'lik çözeltiden dört mL ekleyin.

Fosfat tamponlu salin veya PBS içindeki BSA çözeltisini 12 immünotüpe ekleyin ve dört derece santigrat sıcaklıkta gece boyunca inkübe edin. Ardından, üç kütüphanenin her birinden gelen faj partiküllerini birleştirin ve negatif tarama sürecinin gelecekteki doğrulaması için bu faj karışımından küçük bir miktar ayırın. Daha sonra ilk tüpteki BSA çözeltisini boşaltın ve bağlanmamış BSA'yı uzaklaştırmak için tüpü PBS ile iki ila üç kez yıkayın, birleştirilmiş faj kütüphanelerini bu ilk tüpe ekleyin ve bağlanmamış fajları toplamadan önce rotatör üzerinde oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe edin.

Her bir hedefe karşı gerçekleştirilen çok sayıda negatif ayıklama (negative panning) turu tamamlandıktan sonra, ayıklama işleminin başarısını doğrulamak ve kontaminasyon durumunda kalan BSA çözeltisi tüpleriyle negatif ayıklama sürecini her seferinde tekrarlayabilmek için küçük bir miktar faj saklamanın önemli olduğunu unutmayın. Önceki tüpün inkübasyonundan sonra toplanan bağlanmamış fajları kullanın. Ardından, videonun bir sonraki bölümünde detaylandırılan FM prosedürünü kullanarak tüm BSA faj bağlayıcılarının uzaklaştırıldığını doğrulayın.

Bir FM kullanarak faj bağlanmasını görselleştirmek için, klivajlanmış mikaya 10 ila 20 µL hedef antijen ekleyin ve beş ila 10 dakika inkübe edin. Mikayı su ile beş kez yıkayın, ardından mikaya 10 ila 20 µL faj ekleyin ve beş ila 10 dakika inkübe edin. Mikayı su ile beş kez daha yıkayın ve havada kurumaya bırakın.

Nano Scope Three ve bir kontrolör kullanarak, oda sıcaklığında havada AFM tıklama modu ile bir AFM görüntüleme işlemi gerçekleştirin. Silikon AFM probları 300 kHz rezonans frekansına ve 40 N/m yay sabitine sahiptir. AFM ucunu uç yükleyiciye yerleştirin.

Uç yükleyiciyi AFM mikroskobuna takın. Numuneyi AFM mikroskobunun altına yerleştirin. Lazeri AFM ucuna hizalamak için düğmeleri kullanın.

Tarama hızını 3.05 hertz ve tarama çözünürlüğünü satır başına 512 örnek olarak ayarlayın. Silika titreşimini optimize etmek için cihazı Auto-Tune ile ayarlayın. Uç frekansını belirledikten sonra örnek taramaya başlayın.

Prob, bağlı fajanın yüksekliğini ölçerek MICA yüzeyini tarayacaktır. Fajlar, uzun beyaz çizgiler şeklindedir; edinim sürecini takiben, her görüntü içindeki tüm partikül boyutlarının karşılaştırılabilir olduğundan emin olmak için görüntüler temel arka plan düzleştirme işlemiyle işlenir. Diğer partikül boyutları ve tarama alanı nedeniyle faj genişliği görüntüden görüntüye farklılık gösterebilir, ancak bu durum fajanın antijene bağlanıp bağlanmadığına dair doğruluğu asla etkilemez.

Görüntü 2D bir görüntüye dönüştürülür ve PEG kontaminasyonunun neden olduğu düşük kaliteli görüntüleme bölgeleri, gelecekteki veri analizlerinden çıkarılmak üzere vurgulanır. İmmünopresipite edilen protein miktarının düşük olması nedeniyle, metin protokolünde açıklandığı şekilde sağlıklı insan beyin dokusundan sağlıklı TDP 43 proteinini immünopresipite edin. Negatif panning turlarını önce MICA kullanarak gerçekleştirin. Yaklaşık 100 microliters immünopresipite proteinle ilk MICA'ya sekiz MICA yüzeyini ekleyin ve inkübasyonun ardından oda sıcaklığında 5 ila 10 dakika inkübe edin.

MICA'yı beş kez %0,1 fosfat tamponlu salin ve tween 20 (kısaca PBST) ile yıkayın. Ardından, sağlıklı insan beyin dokusuna karşı negatif tarama sonrası yaklaşık 100 µL faj ekleyin ve oda sıcaklığında beş ila 10 dakika inkübe edin. İnkübasyonun ortasında, immünopresipite edilmiş proteini ikinci mica'ya ekleyin.

MICA'yı beş kez %0,1 PBST ile yıkamadan önce, ilk MICA'dan fajları toplayın. İkinci mika yıkandıktan sonra, önceden toplanan fajları ekleyin. Fajlar, immünopresipite edilen protein ile sekiz mikanın tamamına karşı negatif panning işlemi tamamlanana kadar tüm süreci tekrarlayın.

Metin protokolünde açıklandığı üzere, LS hastası bireylerin beyinlerinden TDP 43 proteinini immün çöktürmeye başlamak için bir FM ile yapılan birinci ve sekizinci negatif panning turlarının ardından, faji kullanarak panning işleminin başarısını doğrulayın ve üç MICA yüzeyini temizleyin. Ardından, oda sıcaklığında beş dakikalık inkübasyonun ardından ilk MICA'ya 50 µL A LS TDP 43 ekleyin. MICA'yı 0,1% PBST ile beş kez yıkayın.

Ardından, sağlıklı TDP 43'e karşı negatif tarama sonrası toplanan faji 50 µL miktarında MICA'ya ekleyin ve beş dakika inkübe edin. Bağlanmamış fajları toplayın. Bu tarama aşamalarında toplanan tüm fajların ayrı tutulması önemlidir.

Ardından, bağlanmış fajları üç elüsyon yöntemi kullanarak toplayın. İlk olarak, her bir MICA'ya 50 µL tripsin ekleyin ve 10 dakikadan fazla olmamak kaydıyla inkübe edin. Çözeltiyi toplayın ve saklayın.

Ardından, her bir MICA'ya 50 µL 100 mM trietilamin ekleyin ve 10 dakikadan fazla inkübe etmeyin. Çözeltiyi eşit hacimde 1 M tris HCl tamponu (pH 7.4) ile toplayın ve saklayın; üçüncüsü olarak, MICA'ya doğrudan 50 µL TG1 hücreleri ekleyin ve 37 °C'de 30 dakika inkübe edin. Ayrıca, ilk iki elüsyon yönteminden toplanan fajları, aynı konsantrasyondaki 100 µL TG1 hücrelerine ekleyin ve 37 °C'de 30 dakika inkübe edin.

Ardından, bu işlemi ikinci bir mika ile tekrarlayın. İlk MICA ile A LST DP 43 kullanılarak toplanan bağlanmamış fajları alın ve beş dakika inkübe etmek üzere A-A-L-S-T-D-P 43 içeren ikinci MICA'ya ekleyin. Her bir A LST DP 43 MICA'dan tripsin ile ayrıştırılan ve fajlarla enfekte edilmiş TG one hücrelerini birleştirin ve ampisilinli Luria Bertani agar plaklarına veya LBA plaklarına ekin.

Aynı işlemi, toplam üç plaka olacak şekilde, iki set A LS TDP 43 MICA'dan elde edilen trietil amin ve TG one ile ilişkilendirilmiş fajlar için tekrarlayın. Tüm adımları üçüncü bir A LS mika ile tekrarlayın; ancak bu durumda, frontotemporal demansa karşı iki tur negatif panning sonrası toplanan fajları kullanın. T DP 43 plakasındaki enfekte TG one hücrelerini üç LBA plakasına ekleyin ve 37 °C'de gece boyunca inkübe edin.

Ertesi gün. Potansiyel ALS klonlarını içeren altı LBA plakasındaki koloni sayısını belirleyin. Sağlıklı TDP 43 üreten fajlara karşı negatif panelleme sonrası, iki tur pozitif panelleme uygulanan üç LBA plakasında, üçüncü ALS MICA'dan gelen üç LBA plakasına kıyasla daha az koloni bulunmalıdır. Bu klonlardan fajlar ve çözünür tek zincirli değişken bölge antikor fragmanları veya scV'ler üretin ve ALS dokusuna özgüllüğü doğrulamak için farklı immünolojik analizler kullanarak analiz edin.

Tüm reaktif fajların temizlendiğinden emin olmak için çeşitli hedeflere karşı uygulanan negatif tarama basamaklarını izlemek amacıyla FM görüntüleme kullanılır. FM sonuçları, agregasyon yapmış alfa sinükleine karşı bir tur negatif tarama sonrası faj bağlanması olduğunu, sekiz tur sonrası ise bağlanma olmadığını göstermiştir. Sağlıklı insan beyin homogenatında bulunan birçok antijene bağlanan fajları temizlemek için sağlıklı insan beyin dokusuna karşı negatif tarama gerçekleştirilmiştir.

Burada, bir tur negatif panning sonrası fajların sağlıklı dokuya bağlandığı ve 10 tur negatif panning sonrası hiçbir fajın bağlanmadığı gösterilmiştir. Potansiyel klonlardan hem faj hem de çözünür SCFE hazırlandıktan sonra, bunlar bir LS dokusuna özgüllük açısından indirekt Eliza ile test edilmiştir. Fajların neredeyse tamamı, sağlıklı dokuya kıyasla bir LS dokusuna tercih göstermiştir.

Faj bağlanması bir LS ile frontotemporal demans veya FTD dokusu arasında karşılaştırıldığında benzer sonuçlar elde edilmiştir. Sağlıklı ve FTD dokularındaki LS dokusuna SCFV bağlanmasının karşılaştırılması, neredeyse tüm klonlarda tekrar LS dokusuna seçici bağlanma olduğunu göstermiştir. LS dokusuna bağlanmayı daha fazla doğrulamak ve ayrıca hangi klonların diğer immünolojik uygulamalarda reaktif olduğunu belirlemek için dot blot immünolojik testi kullanılmıştır.

Burada, bir LS dokusuna bağlanan klan iki gösterilmiştir. Bu videoyu izledikten sonra, hastalığa özgü hedef ilgi alanlarına karşı, potansiyel tanısal ve/veya terapötik araçlar olarak hizmet edebilecek reaktifleri izole etmek için FM tabanlı biop taramanın nasıl uygulanacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.