Amyotrofik Lateral Skleroz TDP-43 Türevleri karşı Morfoloji Özel Reaktifler İzolasyonunda Roman Atomik Kuvvet Mikroskobu Tabanlı biopanning

Bu prosedürün genel amacı, katran DNA bağlayıcı proteine karşı morfolojiye özgü reaktifleri izole etmektir. İki fazlı A FM tabanlı radyo kaydırma teknolojisi kullanan bir LS'de bulunan 43 varyant. Bu, ilk önce çeşitli bir faj kütüphanesinin, immün tüpler kullanılarak hedef dışı antijenlere karşı çok sayıda negatif kaydırma turuna tabi tutulmasıyla gerçekleştirilir.

Negatif kaydırma, sığır serum albümini, agrega alfa sinükleini ve sağlıklı insan beyin dokusuna karşı sırayla gerçekleştirilir. İkinci adım, tüm istenmeyen fajların başarılı bir şekilde uzaklaştırılmasını sağlamak için her negatif kaydırma setinden sonra bir FM doğrulamasını tamamlamaktır. Bu negatif kaydırma örneğinde, toplanmış alfa sinüklein kullanılarak fajlar bir turdan sonra görülebilir, ancak 10. turdan sonra yoktur.

Daha sonra, sınırlı numune mevcudiyeti nedeniyle kalan negatif kaydırma turları MICA® üzerinde gerçekleştirilir. Sağlıklı ve frontotemporal demans veya FTD dokusundan immün çökeltilmiş TDP 43'e reaktif fajlar sırayla çıkarılır. Son adım, çökeltilmiş bir LS immünosuna bağlanan fajları izole etmektir.

Mika'ya bağlı fajlar kullanılarak TDP 43, tripsin, trietil, amin ve TG one hücreleri kullanılarak ima edilir. Sonuç olarak, bu potansiyel a LS klonlarının özgüllüğü dolaylı fa eliza'lar ve nokta lekeler kullanılarak doğrulanır, homojenize A-L-S-F-T-D ve sağlıklı insan beyin dokuları her iki testte de hareketsiz hale getirilir. Test edilen diğer gruplara kıyasla genellikle bir LS dokusuna daha fazla reaktivite tespit edilir.

Bu tekniğin konvansiyonel faj biyo kaydırmaya göre ana avantajı, düşük konsantrasyonlarda mevcut olsa bile, hastalığa özgü protein varyantlarını doğrudan karmaşık biyolojik örneklerden seçici olarak tanıyan reaktiflerin izolasyonunu sağlamak için bir FM tarafından doğrulanan kapsamlı negatif kaydırma protokollerinin kullanılmasıdır. Bir FM, biyomoleküler özelliklerin ve etkileşimlerin araştırılması konusunda içgörü sağlayabilse de, biyo kalemin ilerlemesini izlemek ve tek CLO'ların özgüllüğünü doğrulamak gibi diğer sistemlere de uygulanabilir. Bu prosedüre, önce BSA'ya karşı negatif kaydırma yapmak için metin protokolünde ayrıntılı olarak açıklandığı gibi faj üretimi ile başlayın, mililitre başına bir miligramın dört mililitresini ekleyin.

Fosfat tamponlu salin veya PBS içinde 12 immüno tüpe BSA çözeltisi ve gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Daha sonra, üç kütüphanenin her birinden faj parçacıklarını birleştirin ve negatif kaydırma işleminin gelecekteki doğrulaması için bu faj karışımından küçük bir miktar ayırın. Daha sonra BSA çözeltisini ilk tüpten atın ve bağlanmamış BSA'yı çıkarmak için tüpü PBS ile iki ila üç kez yıkayın, birleşik faj kütüphanelerini bu ilk tüpe ekleyin, bağlanmamış fajları toplamadan önce döndürücü üzerinde oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.

Kaydırma işleminin başarısını doğrulamak için her bir hedefe karşı çok sayıda negatif kaydırma turunu bitirdikten sonra küçük bir miktar faj tasarrufu yapmanın önemli olduğunu unutmayın ve kontaminasyon durumunda, her seferinde kalan BSA çözeltisi tüpleriyle negatif kaydırma işlemini tekrarlayın. Önceki tüpün inkübasyonundan sonra toplanan bağlanmamış fajı kullanın. Ardından, videonun bir sonraki bölümünde ayrıntılı olarak açıklanan A FM prosedürünü kullanarak tüm BSA faj bağlayıcılarının çıkarıldığını doğrulayın.

Bir FM kullanarak faj bağlanmasını görselleştirmek için, parçalanmış, mika'ya 10 ila 20 mikrolitre hedef antijen ekleyin ve beş ila 10 dakika inkübe edin. MICA'yı beş kez suyla yıkayın, ardından MICA'ya 10 ila 20 mikrolitre faj ekleyin ve beş ila 10 dakika inkübe edin. Mika'yı beş kez daha suyla yıkayın ve kurumaya bırakın.

Oda sıcaklığında havada bulunan bir kontrolör olan nano kapsam üç ile bir FM kılavuz çekme modu kullanarak bir FM görüntüleme işlemini gerçekleştirin. Silisyum a FM probları, 300 kilohertz'lik bir rezonans frekansına ve metre başına 40 Newton'luk bir yay sabitine sahiptir. Bir FM ucunu uç yükleyiciye yerleştirin.

Uç yükleyiciyi A FM mikroskobuna takın. Numuneyi A FM mikroskobunun altına yerleştirin. Lazeri A FM ucuna hizalamak için düğmeleri kullanın.

Tarama hızını 3,05 hertz ve tarama çözünürlüğünü satır başına 512 örnek olarak ayarlayın. Silika titreşimini optimize etmek için makineyi otomatik olarak ayarlayın. Ucun frekansı, numune taramasını başlatın.

Uç, bağlı fajın yüksekliğini ölçerek MICA'nın yüzeyini tarayacaktır. Fajlar, tüm parçacık boyutlarının her görüntüde karşılaştırılabilir olmasını sağlamak için arka planın temel düzleştirme işlemiyle görüntüleri elde ettikten sonra uzun beyaz çizgilerdir. Faj genişliği, diğer parçacık boyutlarına ve tarama alanına bağlı olarak görüntüden görüntüye değişebilir, ancak fajın antijene bağlanıp bağlanmadığının doğruluğundan asla ödün vermez.

Görüntü, 2D görüntü olarak düzleştirilir ve PEG kontaminasyonunun neden olduğu kötü görüntülenen bölgeler, gelecekteki veri analizinden kaldırılmak üzere vurgulanır. İmmünoçökeltilmiş protein miktarının daha düşük olması nedeniyle, metin protokolünde açıklandığı gibi sağlıklı insan beyin dokusundan sağlıklı TDP 43 proteinini indükler. Önce MICA'yı kullanarak bu negatif kaydırma turlarını gerçekleştirin: Sekiz MICA'yı yaklaşık 100 mikrolitre immüno-çökeltilmiş proteinde ilk MICA'ya ayırın ve inkübasyonu takiben oda sıcaklığında beş ila 10 dakika inkübe edin.

MICA'yı beş kez% 0.1 fosfat tamponlu tuzlu su ile tween 20 kısaltılmış PBST ile yıkayın. Daha sonra, sağlıklı insan beyin dokusuna karşı negatif kaydırmadan sonra yaklaşık 100 mikrolitre faj ekleyin ve oda sıcaklığında beş ila 10 dakika inkübe edin. İnkübasyonun ortasında, immüno-çökeltilmiş proteini ikinci mika'ya ekleyin.

MICA'yı %0,1 PBST ile beş kez yıkamadan önce ilk MICA'dan fajı toplayın. İkinci mikayı yıkadıktan sonra, önceden toplanan fajı ekleyin. Faj, immüno-çökeltilmiş protein ile sekiz mikanın tümüne negatif olarak pan yapılana kadar tüm işlemi tekrarlayın.

Metin protokolünde açıklandığı gibi LS'li bireylerin beyinlerinden immüno-çökeltme TDP 43 proteinini başlatmak için bir FM ile ilk ve sekiz tur negatif kaydırmadan sonra faj kullanarak kaydırma işleminin başarısını doğrulayın, üç MICA yüzeyini ayırın. Ardından, oda sıcaklığında beş dakikalık bir inkübasyonun ardından ilk MICA'ya 50 mikrolitre A LS TDP 43 ekleyin. MICA'yı %0.1 PBST ile beş kez yıkayın.

Daha sonra, sağlıklı TDP 43'e karşı negatif kaydırmadan sonra toplanan 50 mikrolitre fajı MICA'ya ekleyin ve beş dakika inkübe edin. Bağlanmamış fajları toplayın. Bu kaydırma adımlarında toplanan tüm fajları ayrı tutmak önemlidir.

Ardından, üç elucian yöntemi kullanarak bağlı fajları toplayın. İlk olarak, her MICA'ya 50 mikrolitre tripsin ekleyin ve en fazla 10 dakika inkübe edin. Çözümü toplayın ve kaydedin.

Daha sonra, her MICA'ya 50 mikrolitre 100 milimolar trietilamin ekleyin ve en fazla 10 dakika inkübe edin. Çözeltiyi bir molar tris HCL tamponu pH 7.4'ün eşit hacminde toplayın ve üçüncüyü kaydedin, 50 mikrolitre TG bir hücreyi doğrudan MICA'ya ekleyin ve 37 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin. Ayrıca, ilk iki elucian yönteminden toplanan fajları aynı konsantrasyonda 100 mikrolitre TG bir hücreye ekleyin ve 37 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin.

Ardından, bu işlemi ikinci bir mika ile tekrarlayın. Toplanan bağlanmamış fajı A LST DP 43 ile ilk MICA'yı kullanarak alın ve A-A-L-S-T-D-P 43 ile ikinci MICA'ya ekleyin ve beş dakika inkübe edin. Fajlarla enfekte olmuş TG bir hücreyi, her bir A LST DP 43 MICA'dan tripsin ile ima edilen ve tüm luria burani burgu plakasındaki plakayı ampisilin veya LBA plakası ile birleştirin.

Aynı işlemi, toplam üç plaka için iki set A LS TDP 43 MICA'dan trietil amin ve TG bir imgeli faj için tekrarlayın. Tüm adımları üçüncü bir A LS mika ile tekrarlayın, ancak bu durumda, frontotemporal demansa karşı iki tur negatif kaydırmadan sonra toplanan fajı kullanın. T DP 43, enfekte olmuş TG bir hücresini üç LBA plakası üzerine yerleştirir ve gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe eder.

Ertesi gün. Bir LS klonu potansiyeli olan altı LBA plakasındaki koloni sayısını sayın. Sağlıklı TDP 43'e karşı negatif kaydırmadan sonra fajı kullanarak, bu klonlardan faj ve çözünür tek zincirli değişken alanlı antikor fragmanları veya s cvs üreterek, iki tur pozitif kaydırmadan sonra üçüncü A LS MICA'dan üç LBA plakasından üç LBA plakasına kıyasla daha az koloni olmalıdır ve bir LS dokusuna özgüllüğü doğrulamak için farklı immünolojik testler kullanarak analiz edin.

Tüm reaktif fajların çıkarıldığından emin olmak için çeşitli hedeflere karşı negatif kaydırma adımlarını izlemek için bir FM görüntüleme kullanılır. Bir FM sonuçları, toplanmış alfa sinükleine karşı bir tur negatif kaydırmadan sonra faj bağlanması gösterdi ve sekiz turdan sonra bağlanma olmadığını gösterdi. Sağlıklı insan beyni homojenatında bulunan birçok antijen olan faj bağını çıkarmak için sağlıklı insan beyin dokusuna karşı negatif kaydırma yapıldı.

Burada, bir tur negatif kaydırmadan sonra sağlıklı dokuya faj bağlanması ve 10 tur negatif kaydırmadan sonra faj bağlanmaması gösterilmiştir. Potansiyel klonlardan hem faj hem de çözünür SCFE hazırlandıktan sonra, bir LS dokusuna özgüllük açısından dolaylı Eliza'da test edildiler. Fajların neredeyse tamamı, sağlıklı doku yerine LS dokusunu tercih etti.

Bir LS'ye faj bağlanmasını frontotemporal demans veya FTD dokusu ile karşılaştırırken benzer sonuçlar elde edilir. Hem sağlıklı hem de FTD dokusunda bir LS dokusuna SCFV bağlanmasının karşılaştırılması, hemen hemen tüm klonlarda bir LS dokusuna seçici bağlanma gösterdi. Nokta blot immünolojik testi, bir LS dokusuna bağlanmayı daha fazla doğrulamak ve ayrıca diğer immünolojik uygulamalarda hangi klonların reaktif olduğunu belirlemek için kullanıldı.

Burada, klon iki bir LS dokusuna bağlanma gösterilmiştir. Bu videoyu izledikten sonra, potansiyel tanı ve/veya terapötik araçlar olarak hizmet edebilecek hastalığa, belirli ilgi alanlarına, reaktiflere karşı reaktifleri izole etmek için FM tabanlı bir biyop kaydırmanın nasıl uygulanacağını iyi anlamış olmalısınız.