Name: Probe-tabanlı Real-time PCR microRNA Kantitatif Ölçüm Yaklaşımları (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: Öğrenin, plazma ve serum örneklerinde mikroRNA kantitatif ölçümü için prob-tabanlı real-time PCR yöntemlerini. Bu teknik, kanser ve diyabet gibi hastalıklarda yeni biyobelirteçler keşfetmek için değerli bir araçtır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Tüm yazarlar NHMRC CTC, Sydney, Juvenil Diyabet Araştırma Vakfı (JDRF), Avustralya Üniversitesi ve Rebecca Cooper Vakfı, Avustralya altyapı desteği kabul. Bu araştırma WW, RJF Aah Avustralya Araştırma Konseyi (FT110100254) ve JDRF, Avustralya (CRN201314) hibe yoluyla finanse edildi ve MVJ tüm ıslak laboratuvar deney yürütülen, ASJ veri analizi gerçekleştirmiştir. WW ilk taslağını yazdı. AAH çalışma planlanmış ve verileri analiz. Tüm yazarlar okuma ve yayımlanmak üzere gönderilen el yazması, rakamlar ve çalışma nihai sürümü üzerinde anlaştılar.

<ol><li>Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+functions+of+animal+microRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The functions of animal microRNAs.</a> Nature. 431, 350-355 (2004).</li>
<li>Alvarez-Garcia, I., Miska, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+functions+in+animal+development+and+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">MicroRNA functions in animal development and human disease.</a> Development. 132, 4653-4662 (2005).</li>
<li>Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs%3A+genomics%2C+biogenesis%2C+mechanism%2C+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function.</a> Cell. 116, 281-297 (2004).</li>
<li>Joglekar, M. V., Wei, C., Hardikar, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+estimation+of+multiple+miRNAs+and+mRNAs+from+a+single+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Quantitative estimation of multiple miRNAs and mRNAs from a single cell.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2010, pdb prot5478(2010).</li>
<li>Joglekar, M. V., Parekh, V. S., Hardikar, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet-specific+microRNAs+in+pancreas+development%2C+regeneration+and+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Indian+J+Exp+Biol%22%5BJournal%5D)">Islet-specific microRNAs in pancreas development, regeneration and diabetes.</a> Indian J Exp Biol. 49, 401-408 (2011).</li>
<li>Farr, R. J., Joglekar, M. V., Taylor, C. J., Hardikar, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+non-coding+RNAs+as+biomarkers+of+beta+cell+death+in+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr+Endocrinol+Rev%22%5BJournal%5D)">Circulating non-coding RNAs as biomarkers of beta cell death in diabetes.</a> Pediatr Endocrinol Rev. 11, 14-20 (2013).</li>
<li>Joglekar, M. V., Joglekar, V. M., Hardikar, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+islet-specific+microRNAs+during+human+pancreatic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Expr+Patterns%22%5BJournal%5D)">Expression of islet-specific microRNAs during human pancreatic development.</a> Gene Expr Patterns. 9, 109-113 (2009).</li>
<li>Iorio, M. V., Croce, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+profiling+in+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">MicroRNA profiling in ovarian cancer.</a> Methods Mol Biol. 1049, 187-197 (2013).</li>
<li>Mitchell, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+microRNAs+as+stable+blood-based+markers+for+cancer+detection%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection.</a> P Natl Acad Sci USA. 105, 10513-10518 (2008).</li>
<li>Mattie, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+high-throughput+microRNA+expression+profiling+provides+novel+biomarker+assessment+of+clinical+prostate+and+breast+cancer+biopsies%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer%22%5BJournal%5D)">Optimized high-throughput microRNA expression profiling provides novel biomarker assessment of clinical prostate and breast cancer biopsies.</a> Mol Cancer. 5, 24(2006).</li>
<li>Zhu, W., Qin, W., Atasoy, U., Sauter, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+microRNAs+in+breast+cancer+and+healthy+subjects%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Res+Notes%22%5BJournal%5D)">Circulating microRNAs in breast cancer and healthy subjects.</a> BMC Res Notes. 2, 89(2009).</li>
<li>Zhu, H. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+suitable+reference+genes+for+qRT-PCR+analysis+of+circulating+microRNAs+in+hepatitis+B+virus-infected+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Identification of suitable reference genes for qRT-PCR analysis of circulating microRNAs in hepatitis B virus-infected patients.</a> Mol Biotechnol. 50, 49-56 (2012).</li>
<li>Yamada, H., Itoh, M., Hiratsuka, I., Hashimoto, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+microRNAs+in+autoimmune+thyroid+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Endocrinol+%28Oxf%29%22%5BJournal%5D)">Circulating microRNAs in autoimmune thyroid diseases.</a> Clin Endocrinol (Oxf). , (2014).</li>
<li>Liu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+MicroRNA+Expression+Profile+as+a+Biomarker+in+the+Diagnosis+and+Prognosis+of+Pancreatic+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Serum MicroRNA Expression Profile as a Biomarker in the Diagnosis and Prognosis of Pancreatic Cancer.</a> Clinical Chemistry. 58, 610-618 (2012).</li>
<li>Gilad, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+microRNAs+are+promising+novel+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Serum microRNAs are promising novel biomarkers.</a> PLoS One. 3, e3148(2008).</li>
<li>Joglekar, M. V., Parekh, V. S., Mehta, S., Bhonde, R. R., Hardikar, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+profiling+of+developing+and+regenerating+pancreas+reveal+post-transcriptional+regulation+of+neurogenin3%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">MicroRNA profiling of developing and regenerating pancreas reveal post-transcriptional regulation of neurogenin3.</a> Dev Biol. 311, 603-612 (2007).</li>
<li>Hardikar, A. A., Farr, R. J., Joglekar, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+microRNAs%3A+understanding+the+limits+for+quantitative+measurement+by+real-time+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Heart+Assoc%22%5BJournal%5D)">Circulating microRNAs: understanding the limits for quantitative measurement by real-time PCR.</a> J Am Heart Assoc. 3, e000792(2014).</li>
<li>Wu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostic+and+Prognostic+Implications+of+a+Serum+miRNA+Panel+in+Oesophageal+Squamous+Cell+Carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Diagnostic and Prognostic Implications of a Serum miRNA Panel in Oesophageal Squamous Cell Carcinoma.</a> PLoS One. 9, e92292(2014).</li>
<li>McDonald, M. K., Capasso, K. E., Ajit, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+microRNA+profiling+of+exosomes+derived+from+blood+and+culture+media%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Purification and microRNA profiling of exosomes derived from blood and culture media.</a> J Vis Exp. , e50294(2013).</li>
<li>Joglekar, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+miR-30+family+microRNAs+confer+epithelial+phenotype+to+human+pancreatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Islets%22%5BJournal%5D)">The miR-30 family microRNAs confer epithelial phenotype to human pancreatic cells.</a> Islets. 1, 137-147 (2009).</li>
<li>Genda, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((microRNA+changes+in+the+dorsal+horn+of+the+spinal+cord+of+rats+with+chronic+constriction+injury%3A+A+TaqMan%28R%29+Low+Density+Array+study%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">microRNA changes in the dorsal horn of the spinal cord of rats with chronic constriction injury: A TaqMan(R) Low Density Array study.</a> Int J Mol Med. 31, 129-137 (2013).</li>
<li>Wang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+evaluation+of+three+microRNA+profiling+platforms%3A+microarray%2C+beads+array%2C+and+quantitative+real-time+PCR+array%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Systematic evaluation of three microRNA profiling platforms: microarray, beads array, and quantitative real-time PCR array.</a> PLoS One. 6, e17167(2011).</li>
<li>Cuk, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+microRNAs+in+plasma+as+early+detection+markers+for+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Circulating microRNAs in plasma as early detection markers for breast cancer.</a> Int J Cancer. 132, 1602-1612 (2013).</li>
<li>Morrison, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoliter+high+throughput+quantitative+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Nanoliter high throughput quantitative PCR.</a> Nucleic Acids Res. 34, e123(2006).</li>
<li>Git, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+comparison+of+microarray+profiling%2C+real-time+PCR%2C+and+next-generation+sequencing+technologies+for+measuring+differential+microRNA+expression%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Systematic comparison of microarray profiling, real-time PCR, and next-generation sequencing technologies for measuring differential microRNA expression.</a> RNA. 16, 991-1006 (2010).</li>
<li>Benes, V., Castoldi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+profiling+of+microRNA+using+real-time+quantitative+PCR%2C+how+to+use+it+and+what+is+available%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Expression profiling of microRNA using real-time quantitative PCR, how to use it and what is available.</a> Methods. 50, 244-249 (2010).</li>
<li>Chen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+quantification+of+microRNAs+by+stem-loop+RT-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR.</a> Nucleic Acids Res. 33, e179(2005).</li>
<li>Schmittgen, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+PCR+quantification+of+precursor+and+mature+microRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Real-time PCR quantification of precursor and mature microRNA.</a> Methods. 44, 31-38 (2008).</li>
<li>Kodani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+TaqMan+low-density+arrays+for+simultaneous+detection+of+multiple+respiratory+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Application of TaqMan low-density arrays for simultaneous detection of multiple respiratory pathogens.</a> J Clin Microbiol. 49, 2175-2182 (2011).</li>
<li>Taylor, C. J., Satoor, S. N., Ranjan, A. K., Pereirae Cotta,, V, M., Joglekar, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+measurement+of+noncoding+RNA+in+human+serum%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Diabetes+Res%22%5BJournal%5D)">A protocol for measurement of noncoding RNA in human serum.</a> Exp Diabetes Res. 2012, 168368(2012).</li>
<li>TPF & SPF File Download Options [Internet]. , Available from: 
	 <a target="_blank" href="http://www.appliedbiosystems.com/absite/us/en/home/products/tpf-spf-download.html">http://www.appliedbiosystems.com/absite/us/en/home/products/tpf-spf-download.html</a> (2014).</li>
<li>Turchinovich, A., Weiz, L., Langheinz, A., Burwinkel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+extracellular+circulating+microRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Characterization of extracellular circulating microRNA.</a> Nucleic Acids Res. 39, 7223-7233 (2011).</li>
<li>Li, Y., Kowdley, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+microRNA+isolation+from+clinical+serum+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Method for microRNA isolation from clinical serum samples.</a> Anal Biochem. 431, 69-75 (2012).</li>
</ol>

Madde işleme / yayın masrafları yayın için bu yazının kabul edilmesini müteakip, Life Technologies tarafından karşılanmıştır.

doğru ve tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek prob-temelli QPCR protokoller çerçevesinde kritik adımlar RT-ürünün aynı hacim ve konsantrasyon her qPCR reaksiyon yüklenen) emin 1 yapmak için vardır, 2) bileşenleri doğru oranları ve hacimleri için gerekli QPCR Reaksiyon hazırlandı ve de, 3) doğru ve tutarlı hacimleri qPCR reaksiyon eklenir karıştırılmış ve hala dikkatli ise 4) her bir numune ve reaksiyon, karışımın hazırlanması ve yüklenmesi, mümkün olduğu zaman, en kısa sürede tamamlanır edilir Yukarıdaki kritik adımlar daha önce belirtildiği. Mikroakiskan dizi kartları uygun santrifüj ve özel kovalar gerekir. Her kova 3 kartları (yüklü / boş) kadar tutabilir. Her bir kova 3 slot işgal ve kepçe santrifüj karşı yuvasına benzer kova (bu kova da boş veya tam 3 kart, içermelidir) koyarak dengeli olduğundan emin olun. Kepçeli kartı yerleştirilirkent tutucu, 8 rezervuarlar yukarı proje ve reaksiyon kuyuları santrifüj dış duvar baktığından emin olun. Oda sıcaklığında 1 dakika boyunca 331 x g&#39;de kartları dönerler. İlk spin sonra, santrifüj açmak ve görsel reaksiyon karışımı 384 kuyudan dağıtılan olmuştur emin olun. 1 kez daha aynı ayarlarda sıkma tekrarlayın. Kova kartı çıkarın ve 8 rezervuarların her reaksiyon karışımı seviyesi muntazam olduğundan emin olun. Rezervuar sol sıvı hacminde herhangi bir tutarsızlık daha kullanmak için kart uygunsuz olun. RT ürünün aynı konsantrasyona sahip olmak üzere, RNA aynı giriş konsantrasyonu, her bir RT reaksiyonu ilave edilir. Toplam RNA konsantrasyonu, bir mikro-volumespectrophotometer kullanılarak ölçülür. gözlenen 260/280 oranı, plazma / serum izole edilen RNA için 1.3 kadar düşük olabilir; mansap qPCR ilgili işlem veya veri 30 oluşturulan bu bir etkiye sahip görünmemektedir. Aynı şekilde, 260/280 oranıBurada test edilen RNA örnekleri gözlenen qPCR hiçbir anormal etkisi ile 1,3-1,7 arasında idi. Bu tür Biofluids gelenler gibi düşük RNA içerik örnekleri kullanarak, bu işlemden önce RNA miktarını belirlemek için zor olabilir. Biz RNA izolasyonu sentetik başak-in kullanımı yanı sıra ters transkripsiyon aşamalarını öneririz. Bizim deneyim, Arabidopsis thaliana miRNA adayları (sporcudan-miR-159a ve sporcudan-miR-172a) bizim deneyim yüksek olabilir, (örneğin cel-miR-39 ya da cel-miR-54 gibi) Caenorhabditis elegans miRNA&#39;lar tercih edilir A. daha benzerlik thaliana. Böyle sahne özgü başak-in kullanımı, farklı zamanlarda tahlil birden numuneler arasında miRNA veri normalleşmesi için hesap edebilirsiniz. CDNA sentez reaksiyonu için RNA sabit giriş hacmi kullanılması da 32,33 tavsiye edilir. miRNA ölçümü için üç prob-tabanlı protokoller burada anlatılan değişen miktarlarda ihtiyaçToplam RNA girişi, farklı iş akışları ve maliyetleri. Iş akışlarının her biri MiRNA hedeflerin sayısının ve analiz edilecek numune sayısına göre farklı bir verim sağlamak için tasarlanmıştır. Artan verim (384 rxn 3072 rxn 96 rxn) ile birlikte, reaksiyon başına maliyeti, zamanda bir birim elde edilen veri miktarı bir artması ile azalmaktadır. Bu platformların her TaqMan kimyası kullanmak için, elde edilen verilerin kalitesi benzer olması beklenebilir. TaqMan qPCR serum / plazma örneklerinde 9,11,27 yılında miRNA&#39;lar bolluğu tanımlamak için köklü bir yöntemdir. Burada ele alınan üç platform aynı kimya paylaşmalarına rağmen reaksiyon hacminde bir azalma transkript tespit dinamik aralığı içinde bir azalma (Farr, RJ ve diğ., Yayınlanmamış veriler), yol açar. 96-kuyu qPCR platformu düşük verim, ancak yüksek hassasiyet platformudur ve bizim görünümünde, tüm prob-tabanlı (ya bazlı boya) PCR platformları için &quot;altın standart&quot;. Bununla birlikte, bu zararNumunelerin birkaç yüz veya binlerce tahlil ve birden microRNA için ediliyorsa en ekonomik ya da verimli bir platform değildir. Mikroakiskan (TLDA) ve NANO AKIŞKAN (OA) platformlar kısa sürede büyük veri alma sağlamak için tasarlanmış yüksek verimli / içerik platformları vardır. Toplu farklılıklar TLDA kartları gözlenmiştir, ancak bu aynı partiden TLDA kartı talep ile en aza indirilebilir. Düşük bolluk miRNA&#39;lar TLDA kartları farklı gruplar aynı örneği kullanarak test edildiğinde - Biz TLDA platformu (Şekil 3) orta% 17&#39;sinde belirgin farklılıklar gösterdiğini görüyoruz. Bu nedenle TLDA kartlarını kullanarak analiz için aynı parti numaralarını kullanarak öneririz. Bu değişim aynı zamanda olası yükleme ve pipetleme hataları da dahil olmak üzere teknik değişkenlik nedeniyle olabilir. Ancak, biz TLDA kartları aynı toplu talebinde / önerisi. Önemli bir parti değişimi OA platformunda gözlenmiştir. Buna rağmen, TaqMan experimen tabanlıtal qPCR plazma / serum örneklerinde miRNA&#39;lar bolluğu ölçmek için teklif kolaylığı yaklaşır. Burada tartışılan, düşük, orta ve yüksek kapasiteli yaklaşımları son derece verimli, tekrarlanabilir ve temiz (düşük arka plan gürültü) kimya kullanılarak numunelerin ve miRNA&#39;ların bir dizi analiz esneklik sunuyor.

MikroRNA&#39;lar (miRNA&#39;ların) gen ifadesinin 1-3 düzenleyicileri olarak işlev, ~ 22 nükleotid kodlayıcı olmayan (NC) RNA bulunmaktadır. Hayvanlarda çoğu miRNA&#39;ların gen ifadesinin 2-4 negatif regülasyonuna yol açar 3 &#39;UTR, hedef, bir mRNA ile sekansa özel baz eşleştirme yoluyla işlev görür. Bu, genellikle, mRNA dönüşümünün bir engellenmesi ile veya ribozomal açılan kapalı gerçekleşir. Dolaşımdaki miRNA&#39;ların diyabet 5-7, yumurtalık 8, prostat 9 ve meme kanseri 10,11, hepatit B 12 ve diğer otoimmün hastalıklar 13 gibi hastalıkların, çeşitli araştırma ve klinik alanlarında yeni biyomarkerler olduğu gösterilmiştir. Araştırma daha erişilebilir ve 9,11-15 daha az invaziv insan plazma ve serum örneklerinden, dolaşımı gibi, farklı hücrelerde veya dokularda bol miRNA&#39;lar tespit için yapılmıştır. MiRNA miktar Farklı yöntemler, e olmuşturBu tür standart 96-plaka platformu 4,12,16-18, Mikroakiskan kartı platformu 12,18-23 ve NANO AKIŞKAN dizisi platformu 17,24 gibi birden çok platform kullanarak stablished. Kantitatif gerçek zamanlı PCR (qPCR) çoklu (dye- veya prob-bazlı) kimyaları kullanarak transkript göreceli veya mutlak sayıları ölçmek için yeteneği sunar. Probe-tabanlı gerçek zamanlı PCR kimya, tek bir transkript kopya tespit etmek için düşük eşiğe ve yüksek hassasiyet yarar vardır. Nispeten miktarının ve miRNA ifade 25 belirlemek için ona bir tercih yöntemi yaparak, etkin kullanımı basit ve son derece tekrarlanabilir mal edilir. Transkripsiyon (RT) ve qPCR 4,26,27 ters: Probe-tabanlı qPCR yöntemi genellikle iki adımdan oluşur. Sap-halka RT primer olgun veya birincil MiRNA molekülüne hibridize tamamlayıcı (c) DNA haline dönüştürülür burada RT. CDNA ürününün miktarının belirlenmesi sonra MiRNA özgü PCR primerleri kullanılarak gerçekleştirilmiştir26-28. sistemi tabanlı qPCR prensibi floresan-etiketli prob hidrolizini içerir, gerçek zamanlı olarak tamamlayıcı şerit uzantısı, tespitine dayanmaktadır. Bu sondalar, bir flüoresan raportör ve FRET (flüoresan rezonans enerji transferi) izin vermek için sadece ayrı olan bir söndürücü içerecek şekilde dizayn edilmiştir. Floresan muhabiri (verici) den emisyon Algılama söndürücü molekülünün yakınlığı ile maskelenir. Taq polimeraz (POL) ve yukarı akan primerde uzanır ve bir çatal (probun 5 &#39;ucu) ulaştığında, Taq pol ekzonükleaz aktivitesi söndürücü floresan damlatıcının fiziksel ayrılma / ayrılmasına yol açan sonda hidrolize eder. Floresan vericisi tek bir molekülün Bu sürüm, detektör tarafından kaydedilir ve çok iyi / reaksiyonundan flüoresan sinyalinde bir artış kademesi olarak sunulmuştur. Floresanstaki artış doğru qu izin üretilen PCR ürününün miktarı ile orantılıdıramplifiye edilmiş hedef 26,28 arasında antification. MiRNA miktarının artan talep ile birlikte, yüksek hacimli teknolojilere ortam numunelerinin daha fazla sayıda kısa bir miktarda işleme izin vermek için geliştirilmiştir. TaqMan Düşük Yoğunlukta Dizi (TLDA) bir plaka üzerinde analiz miRNA&#39;ların sayısında bir artış sağlar sistemi tabanlı qPCR kimyasına dayanan bir orta akış yenilikçi mikroakışkan tasarımdır. TLDA cDNA&#39;yı sentezlemek için kullanılan RT-primerler, önceden tanımlanmış bir havuz kullanılmasını içerir. Sonra, bu cDNA&#39;lar qPCR 22,26,29 kullanarak birden fazla miRN&#39;nın ekspresyonunu belirlemek için özelleştirilmiş bir 384 gözlü mikro-akışkan kart içine döndürülmektedir. Kartın her çukuru, bu nedenle tek bir TLDA kartı 26 içinde işlenebilir 384 reaksiyonlara, spesifik miRNA (ler) çoğaltmak için primerler ve problar, kurutuldu içerir. NANO AKIŞKAN dizi gen transkriptlerinin saptanması için kullanılan yüksek verimli bir platformdur <sup&gt; 24 ile aynı prob bazlı kimyası kullanılarak. Bu geçiş delikleri paslanmaz çelik slayt 24 3072 bir diziye 33 nanoliter reaksiyon karışımının kolay yüklemeyi kolaylaştırmak için hidrofobik-hidrofilik etkileşimler sunan özel bir matris kullanır. Bu makalede, serum / plazma içinde miRNA&#39;lar ölçülmesi için bu yöntemler uygulandı ve performans ve bu verileri yorumlarken dikkat edilmesi gereken kritik faktörler nasıl gösteren odaklanır. Hesaba alındığında, bireysel fayda ve sınırlamalar, bu makalede ele alınacak.

<table><tbody><tr><td>Ters transkripsiyon</td><td></td><td></td><td></td>için</tr> <tr><td>96 kuyu platformu</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TaqMan MicroRNA Testleri INV SM&nbsp;</td><td>Uygulamalı Biyosistemler &nbsp;</td><td>4427975</td><td>https://www.lifetechnologies.com/au/en/home/life-science/pcr/real-time-pcr/real-time-pcr-assays/mirna-ncrna-taqman-assays/single-tube-mirna-taqman-assays.html?ICID=search-4427975 Tahliller, bir paket RT primeri ve PCR primeri olarak gelir.</td></tr><tr><td>TaqMan MicroRNA Ters Transkripsiyon Kiti</td><td>Uygulamalı Biyosistemler &nbsp;</td><td>4366597 veya 4366596</td><td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4366597?ICID=search-4366597 veya http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4366596?ICID=search-4366596 TaqMan MicroRNA Ters Transkripsiyon Kiti, 96 kuyulu üç TaqMan platformunun tümünde ters transkripsiyon için kullanılan kitin aynısıdır.</td></tr><tr><td>96 oyuklu bir platformda</td><td></td><td></td><td></td>çalıştırılan qPCR için</tr><tr><td>2x TaqMan Fast Universal PCR Master Mix, AmpErase UNG&nbsp yok;</td><td>Uygulamalı Biyosistemler &nbsp;</td><td>4367846</td><td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4367846?ICID=search-4367846 2X TaqMan Fast Universal PCR Master Mix, qPCR için kullanılır&nbsp; iki TaqMan platformu-96 kuyulu platform ve TLDA.</td></tr><tr><td>MicroAmp Optik Yapışkan Film</td><td>Uygulamalı Biyosistemler</td><td>4311971 https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4311971?ICID=search-product</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp Hızlı Optik 96 Kuyulu Reaksiyon Plakası, 0.1 ml&nbsp;</td><td>Uygulamalı Biyosistemler</td><td>4346907</td><td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4346907?ICID=search-product</td></tr><tr><td>Mikroakışkanlar platformu (TLDA)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ters transkripsiyon</td><td></td><td></td><td></td>için</tr><tr><td>96 kuyulu platform TaqMan MicroRNA Ters Transkripsiyon Kiti kitine (4366597 veya 4366596) bakın (yukarıda gösterildiği gibi).</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Megaplex RT Primerler, İnsan Havuzu A v2.1</td><td>Uygulamalı Biyosistemler &nbsp;</td><td>4399966</td><td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4399966?ICID=search-4399966 Megaplex RT Primerleri, Human Pool A v2.1, RT için kullanılır&nbsp; iki TaqMan platformu - TLDA ve OpenArray.</td></tr><tr><td>Megaplex RT Primerler, İnsan Havuzu B v3.0</td><td>Uygulamalı Biyosistemler &nbsp;</td><td>4444281</td><td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444281?ICID=search-4444281 Megaplex RT Primerleri, Human Pool B v3.0, RT için kullanılır&nbsp; iki TaqMan platformu - TLDA ve OpenArray.</td></tr><tr><td>VEYA</td><td></td><td></td><td>VEYA</td></tr><tr><td>Megaplex Astar Havuzları, İnsan Havuzları Seti v3.0</td><td>Uygulamalı Biyosistemler &nbsp;</td><td>4444750</td><td>http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444750?ICID=search-4444750 Megaplex Primer Havuzları, İnsan Havuzları Seti v3.0, RT için kullanılır&nbsp; iki TaqMan platformu - TLDA ve OpenArray.</td></tr><tr><td>Ön amplifikasyon</td><td></td><td></td><td></td>için</tr><tr><td>TaqMan PreAmp Master Mix</td><td>Applied Biosystems &nbsp;</td><td>4391128 veya 4488593</td><td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4391128?ICID=search-4391128 veya http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4488593 TaqMan PreAmp Master Mix, qPCR'nin ön amplifikasyonu için kullanılır&nbsp; iki TaqMan platformu - TLDA ve OpenArray.</td></tr><tr><td>Megaplex PreAmp Primerler, İnsan Havuzu B v3.0&nbsp;</td><td>Uygulamalı Biyosistemler &nbsp;</td><td>4444303</td><td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444303?ICID=search-4444303 Megaplex PreAmp Primer, Human Pool B v3.0, qPCR'nin ön amplifikasyonu için kullanılır&nbsp; iki TaqMan platformu - TLDA ve OpenArray.</td></tr><tr><td>Megaplex PreAmp Primerler, İnsan Havuzu A v2.1</td><td>Uygulamalı Biyosistemler &nbsp;</td><td>4399233</td><td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4399233?ICID=search-4399233 Megaplex PreAmp Primer, Human Pool A v2.1, qPCR'nin ön amplifikasyonu için kullanılır&nbsp; iki TaqMan platformu - TLDA ve OpenArray.</td></tr><tr><td>1x TE Tampon (100 ml)</td><td>İnvitrojen</td><td>12090-015</td><td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/12090015?ICID=search-product 1x TE Tamponu, qPCR'nin ön amplifikasyonu için kullanılır&nbsp; iki TaqMan platformu - TLDA ve OpenArray.</td></tr><tr><td>384 kuyulu mikroakışkan (TLDA) kartını</td><td></td><td></td><td></td>yüklemek ve çalıştırmak için</tr><tr><td>TaqMan Array İnsan MicroRNA A+B Kart Seti v3.0&nbsp;</td><td>Uygulamalı Biyosistemler</td><td>4444913</td><td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444913</td></tr><tr><td>Nanoakışkanlar platformu (OpenArray)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ters transkripsiyon</td><td></td><td></td><td></td>için</tr><tr><td>96 kuyulu platform TaqMan MicroRNA Ters Transkripsiyon Kiti kitine (4366597 veya 4366596) bakın (yukarıda gösterildiği gibi).</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ön amplifikasyon</td><td></td><td></td><td></td>için</tr><tr><td>TLDA ön amplifikasyon reaktiflerine bakın (yukarıda gösterildiği gibi)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Slaytları</td><td></td><td></td><td></td>yüklemek ve çalıştırmak için</tr><tr><td>TaqMan OpenArray Human MicroRNA Panel, QuantStudio 12K Flex (1 panel)</td><td>Applied Biosystems &nbsp;</td><td>4470187</td><td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4470187?ICID=search-4470187</td></tr><tr><td>QuantStudio 12K Flex OpenArray Aksesuar Seti&nbsp;</td><td>Uygulamalı Biyosistemler &nbsp;</td><td>4469576</td><td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4469576?ICID=search-4469576</td></tr><tr><td>OpenArray 384 kuyulu Numune Plakaları&nbsp; &nbsp;</td><td>Uygulamalı Biyosistemler &nbsp;</td><td>4406947</td><td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4406947?ICID=search-4406947</td></tr><tr><td>TaqMan OpenArray Gerçek Zamanlı PCR Master Mix</td><td>Uygulamalı Biyosistemler &nbsp;</td><td>4462159</td><td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4462159?ICID=search-4462159</td></tr><tr><td>OpenArray AccuFill Sistem İpuçları&nbsp;</td><td>Uygulamalı Biyosistemler &nbsp;</td><td>4457246</td><td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4457246?ICID=search-4457246</td></tr><tr><td>Diğerleri Nükleaz</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>İçermeyen Su</td><td>Qiagen</td><td>129117</td><td>http://www.qiagen.com/products/catalog/lab-essentials-and-accessories/nuclease-free-water</td></tr></tbody></table>

probe-tabanlı real-time pcr microrna kantitatif Ölçüm yaklaşımları

Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs

Bir doğru ve tekrarlanabilir bir analiz sağlayan en hassas algılama yöntemlerinin biri olduğu sistemi tabanlı bir kantitatif PCR (qPCR), kopya çokluğunu ölçmek için tercih edilen bir yöntemdir. Probe-tabanlı kimya diğer (boya-tabanlı) kimyaları ile karşılaştırıldığında en az arka plan floresan sunuyor. Halen, transkript bolluğu ölçmek için kullanan prob-tabanlı kimya kullanılabilir çeşitli platformlar vardır. 96 oyuklu bir plaka içerisinde QPCR ancak 96 numune veya miRNA&#39;ların sadece maksimum tek bir çalışma olarak test edilebilir en rutin olarak kullanılan bir yöntemdir. Numunelerin büyük bir sayı / miRNA&#39;ların analiz edilecek ise, bu, zaman alan ve sıkıcı bir iştir. Örneğin, mikroflüidik (örneğin TaqMan® Dizi Card) NANO AKIŞKAN diziler (örneğin, OpenArray) teklif kolaylığı gibi yüksek verimli tarama sistemi tabanlı platformların yeniden üretilebilir ve etkili bir şekilde kısa bir süre içinde numune çok sayıda çok sayıda mikroRNA bolluk tespit etmek. Burada, deneysel kurulum a göstermeknd hacmi artan düzeyi sunan sistemi tabanlı kimya ve üç değişik platformlar (96 boşluklu plaka, mikroflüidik ve NANO AKIŞKAN dizileri) kullanılarak, serum ya da plazma örnekleri EDTA gelen MiRNA nicelendirilmesi için protokol.

Bir miRNA prob-bazlı analiz qPCR reaksiyonu için önerilen hacim 20 ul. NOT: 5 ul bir reaksiyon hacmi 20 ul hacim 4,7,30 kullanılarak elde edilenlere benzer sonuçlar elde etmek mümkün olduğunu doğrulamıştır. 5 ul reaksiyon hacmi düşürülmesi duyarlılığında önemli bir kayıp olmadan reaktif maliyetlerinde% 75&#39;lik bir azalmaya da izin verir. Şekil 2&#39;de de görüldüğü gibi, reaksiyon, 20 ul hacimler ve 5 ul kadar (0.92 r 2, p = 0.0002) ile 39 döngü kadar güçlü bir eş ilişki olduğunu göstermektedir. Mikroflüidik dizisi, geleneksel 96 plaka PCR&#39;ler kıyasla çoklu örnekleri analiz daha etkili bir yoldur, (Kart A ve B Kart için) yaklaşık 5 saat içinde bir numunede ifade 754 miRNA&#39;lar verileri elde etmek için bir araç sağlar. &lt;B Bland-Altman arsa (gösterir - Biz aynı örnek için miRNA Mikroakiskan dizi kartları karşılaştırıldığında (Örnek A ve A tekrarlama Numune) Şekil 3A.Güçlü&gt; Şekil 3A), bu örnekler için test edilen bütün 754 miRNA&#39;ların korelasyonu arsa (3B). Kartları (Kart A ve B) birden çok yerde hem rastgele yerleştirilmiş 3 farklı kontrol miRNA&#39;ların (U6, RNU44 ve RNU48) vardır. U6 döngüsü eşiği (Ct) değerleri 2 koşular arasında karşılaştırıldığında, biz değerler (Tablo 4) arasında anlamlı farklılık gözlenmedi. Bu U6 değerlendirildi numunedeki fazla bolluk (alt Ct değeri) olarak ifade edilmektedir ki burada dikkat etmek de önemlidir. Daha sonra genel olarak katsayısı% 98 tayini (Şekil 3C-D) miRNA&#39;ların içindeki ifade vardı çalışır (n = 150), hem de 0-19,99 arasında Ct değerleri, tüm miRNA&#39;lar karşılaştırıldı. Betwee anlamlı fark miRNA&#39;lar sayısı. - Her iki çalışır, 20 ve 29,99 arasında Ct değerlerine sahip 277 miRNA&#39;lar, 16 Mirs özgün ve tekrar çalışır (F Şekil 3E) arasında anlamlı farklılıkCt değerleri, her iki çalışır (- H Şekil 3G) için 30-40 arasında seçildi zaman n çalışır (327 89) artmıştır. NANO AKIŞKAN dizi platformu Şekil 4A&#39;da gösterildiği gibi, test edilen her serum / plazma numunesinden 754 miRNA&#39;ların için veri sağlar Bu amplifikasyon eğrileri incelemek için önemlidir -., tüm qPCR olduğu gibi - sonuç doğru amplifikasyon göstergesi olduğundan emin olmak için. 48 altdizilimlerden Her (Şekil 1) de üç en popüler &quot;temizlik&quot; ncRNAs için bir deneyi içerir:. U6, RNU44 ve RNU48 Şekil 4B U6 tipik bir kümelenme tek örnek çoğaltır göstermektedir. Bu çoğaltır düşük standart sapma (SD &lt;0.5) görüntüler ve böylece güvenilirlik bir göstergesidir. Seçenek olarak ise, Şekil 4C, bir ikinci numunede U6 çoğaltır (SD&gt; 0.5) daha fazla değişkenlik gösterir. Bu geçerlilik o ortadan kaldırmamaktadırKalan deneyleri f, her ne kadar daha kapsamlı bir eleştirisini gerektirecek yapar. U6, biyolojik sıvılarda en &quot;temizlik&quot; miRNA&#39;lar gibi, bir değişken ifade olabilir. Bu Şekil 4C&#39;de belirtilen örneklerin biri Şekil 4B&#39;de sunulmaktadır daha az U6 içeriği 4 kat görüntüler dikkate alınmalıdır. 4C&#39;de sunulan numunede U6 seviyesi bir panel 4B&#39;de sunulmaktadır daha başlamak üzere% 75 daha az olduğu için, daha büyük bir teknik değişkenlik küçük reaksiyon hacmi 17 daha da ağırlaştırmaktadır transkript Poisson dağılımına bağlı olarak tahmin edilmektedir. Çalışma tamamlandıktan sonra başka bir araçtır ihracat için kullanılabilir Kalite kontrol (QC) görüntüleri vardır. Bu bir seçim, her geçiş deliği doğru (Şekil 5) yüklenmiş olduğunu doğrulamak için ROX, qPCR reaktif karışımı bulunan pasif boya, flüoresansmı kullanır. Tr bir delik ya da gerçekten bir<html> Lastik altdizilim, yetersiz numune hacmi, buharlaşma, 384-numune plaka tamamen Accufill sistemi ya da ipuçları içinde örnek plaka mühür, ya da kusurları kaldırmak için başarısızlık kuyulardan mevcut kabarcıklar nedeniyle yük değil. Delikler aracılığıyla-gerçekte tahlil yüklü hiç zaman, &quot;saptanamaz&quot; olarak etiketleme miRNA&#39;lar önlemek için tespit edilmelidir Herhangi boşaltılır. Bu sorun, karşılaşılırsa örnek / master en az 5 ul 384 gözlü numune plakasının her oyuğuna yüklü olduğundan emin, Numune levhası, uygun bir şekilde, yükleme öncesinde santrifüjlenir, folyo conta tamamen uzaklaştırıldı, ve yüklenen OpenArray slayt mühürlü ve izleyen tüm koşular için ayrılan süre içinde çalıştırılır. Yükleme sorunları hala devam ediyorsa, bu daha büyük olasılıkla belirli bir toplu veya dizilerin çok veya ilgili sarf malzemeleri ve daha fazla yardım ilişkin olabilir üretici ile aranmalıdır. &quot;Src =&quot; / files / ftp_upload / 52.586 / 52586fig1.jpg &quot;/&gt; Şekil 1: NANO AKIŞKAN Dizi iş akışı için numunelerin Düzeni: (A) Her 384 numune plaka kadar 8 NANO AKIŞKAN diziler için örnekleri tutabilir. (B) ile seyreltildi, ön-yükseltilmiş cDNA komşu 8 oyuklu grupları Havuz A ve Havuz B, 8 oyuk (4 sıra 2 sütun) yerleştirilir. Her daire bir kuyu temsil eder. (Cı) bir numunesi, plakanın her bir NANO AKIŞKAN dizinin bir alt dizisinde yüklenecektir. Her küçük kare bir SubArray temsil eder. <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/52586/52586fig2.jpg" /> Şekil 2: Geleneksel 96-PCR platformları için Co-ilişki analizi: 20 ul ve BT değerleri (39 döngü) standart 96-plaka platformunu kullanarak TaqMan Gerçek zamanlı qPCR üzerinde 5 ul reaksiyon birimler arasında eş ilişkisi. 4 Farklı microRNA göre (miR-375, 4 farklı insan serum ve plazma örneklerinin miR-30c, miR-30d ve miR-7). Diğerleri saptanamayan beri sadece 11 veri noktaları çizilir. R, 2 = 0.92, p = 0.0002. <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/52586/52586fig3.jpg" /> . Şekil 3: (- B A) Mikroakiskan dizi kartlarını kullanarak miRNA profilleme Sirkülasyon 2 Mikroakiskan kartları (kart-A ve kart-B) kullanarak, 754 miRNA&#39;lar bir profil oluşturulur. Burada gösterildiği gibi, biz 2 Mikroakiskan dizi için aynı örneği kullanılan Mikroakiskan kartı sonuçlarının tekrarlanabilirliği kontrol etmek çalışır. Bu 0-19,99 arasında Ct değerleri ile, genel olarak miRNA&#39;ların benzer bir ifade, gözlenen (Cı - D). Tekrar çalışır arasında 20-29,99 ve önemli farklılıklar (F - E) arasında Ct değerleri ile birkaç miRNA&#39;lar (277 16) vardır. 327 Seksen dokuzyüksek Ct değerleri ile mikroRNAlar (30-40) Her iki çalışır (- H G) arasında önemli farklılıklar sergiledi. &#160; Veriler eşleştirilmiş T testi kullanılarak analiz edilmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52586/52586fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/52586/52586fig4.jpg" /> Şekil 4: PCR Ürün Amplifikasyon Curves Temsilcisi Profili: Bir insan plazma numunesi için tüm miRNA hedefler kombine (A) amplifikasyon eğrileri temsili figür var. U6 için bir deney (ortak bir kontrol ncRNA) her alt dizisinde yerleştirilir. (B) örnek &lt;(0.5 (C), yüksek standart sapma SD) gösterirken (0.5 düşük değişkenlik SD)&gt; U6 çoğaltır içinde gösterir. Her iki numune de tota olaninsan plazmasından izole l RNA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52586/52586fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/52586/52586fig5.jpg" /> Şekil 5: NANO AKIŞKAN Diziler QC Analizi: Bir doğru yüklendiğinden NANO AKIŞKAN dizi (solda) ve bir yanlış yüklenmiş NANO AKIŞKAN dizi (sağda) Kalite kontrolü (QC) görüntüler. (qPCR reaktif karışımı mevcut) pasif boya, ROX, bir doğru yüklendiğinden yoluyla-delik göstermek için fluoresces. Sağdaki dizi geçiş delikleri qPCR reaktif karışımı ile yüklenmez ve bu yanlış negatif PCR reaksiyonları olarak tespit edilmelidir birkaç Altdizilim / vardır. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Bileşenler </td><td> 5 ul reaksiyon başına Hacim (ul) </td></tr&gt; <tr><td> RT tamponu (10x) </td><td> 0.5 </td></tr><tr><td> dNTP (100 mM) </td><td> 0.05 </td></tr><tr><td> RNaz inhibitör </td><td> 0.6 </td></tr><tr><td> Nükleazlar içermeyen su </td><td> 1.39 </td></tr><tr><td> Ters Transkriptaz </td><td> 0.33 </td></tr><tr><td> Toplam hacim </td><td> 2.33 </td></tr></tbody></table> Tablo 1A: Standart bir 96-çukurlu plaka platformu kullanılarak TaqMan gerçek zamanlı qPCR için 5 ul RT reaksiyonu hazırlığı RT reaktif karışım bileşenleri. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Bileşenler </td><td> 5 ul reaksiyon başına Hacim (ul) </td><td> 20 ul reaksiyon başına Hacim (ul) </td></tr><tr><td> Hızlı PCR masterkarışım (2x) </td><td> 2.5 </td><td> 10 </td></tr><tr><td> TaqMan qPCR tahlil (20x) * </td><td> 0.25 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Nükleazlar ücretsizsu </td><td> 1.45 </td><td> 5.8 </td></tr><tr><td> Toplam Hacim: </td><td> 4.2 </td><td> 16.8 </td></tr></tbody></table> * Test, seçilen miRNA göre tahlil bileşeni. Tablo 1B: Standart bir 96-çukurlu plaka platformu kullanılarak TaqMan gerçek zamanlı qPCR bir 5 ya da 20 ul qPCR Reaksiyon hazırlanmasında QPCR reaktif karışım bileşenleri. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Bileşenler </td><td> Reaksiyon başına Hacim (ul) </td></tr><tr><td> Megaplex RT Astarlar (10x) </td><td> 0,8 </td></tr><tr><td> dTTP (100 mM) ile, dNTPler </td><td> 0.2 </td></tr><tr><td> Multiscribe Ters Transkriptaz (50 U / ul) </td><td> 1.5 </td></tr><tr><td> 10X RT Tampon </td><td> 0,8 </td></tr><tr><td> MgCl2 (25 mM) </td><td> 0.9 </td></tr><tr><td> RNaz inhibitör &amp; #<html> 160; (20 U / ul) </td><td> 0.1 </td></tr><tr><td> Nükleazlar ücretsiz su </td><td> 0.2 </td></tr><tr><td> Toplam </td><td> 4,5 </td></tr></tbody></table> Tablo 2A: TLDA MiRNA panel için 5 ul RT reaksiyonu hazırlığı RT reaktif karışım bileşenleri. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Bileşenler </td><td> Reaksiyon başına Hacim (ul) </td></tr><tr><td> TaqMan PreAmp master (2x) </td><td> 12.5 </td></tr><tr><td> Megaplex PreAmp Astarlar (10x) </td><td> 2.5 </td></tr><tr><td> Nükleazlar içermeyen su </td><td> 7.5 </td></tr><tr><td> Toplam </td><td> 22.5 </td></tr></tbody></table> Tablo 2B: TLDA MiRNA panel için bir 25 ul önceden amplikasyon Reaksiyon hazırlanmasında PreAmp reaktif karışım bileşenleri. &quot;Cellspacing =&quot; 0 &quot;&gt; <tbody><tr><td> Bileşenler </td><td> Reaksiyon başına Hacim (ul) </td></tr><tr><td> Megaplex RT Astarlar (10x) </td><td> 0.75 </td></tr><tr><td> dTTP (100 mM) ile, dNTPler </td><td> 0.15 </td></tr><tr><td> Multiscribe Ters Transkriptaz (50 U / ul) </td><td> 1.5 </td></tr><tr><td> 10X RT Tampon </td><td> 0.75 </td></tr><tr><td> MgCl2 (25 mM) </td><td> 0.9 </td></tr><tr><td> RNaz inhibitör (20 U / ul) </td><td> 0.09 </td></tr><tr><td> Nükleazlar ücretsiz su </td><td> 0.35 </td></tr><tr><td> Toplam </td><td> 4,5 </td></tr></tbody></table> Tablo 3A: sistemi tabanlı NANO AKIŞKAN MiRNA panel için 5 ul RT reaksiyonu hazırlığı RT reaktif karışım bileşenleri. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Bileşens </td><td> Reaksiyon başına Hacim (ul) </td></tr><tr><td> TaqMan PreAmp master (2x) </td><td> 12.5 </td></tr><tr><td> Megaplex PreAmp Astarlar (10x) </td><td> 2.5 </td></tr><tr><td> Nükleazlar içermeyen su </td><td> 7.5 </td></tr><tr><td> Toplam </td><td> 22.5 </td></tr></tbody></table> Tablo 3B:. Prob-bazlı NANO AKIŞKAN miRNA paneli için bir 25 ul öncesi amplikasyon reaksiyon hazırlık PreAmp reaktif karışımı bileşenleri NOT: etkileşimli ek, üç platformlar için sağlanan excel tabloları zaten hata pipetle telafi etmek için% 5 ek hesaplar. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Numune A </td><td> Bir tekrarı Örnek </td></tr><tr><td> 15,535 </td><td> 16,156 </td></tr><tr><td> 15,471 </td><td> 15,652 </td></tr><tr><td> 15.623 </td><td> 16,063 </td></tr><tr><td> 15,963 </td><td> 15,889 </td></tr><tr><td> 14,006 </td><td> 13,993 </td></tr><tr><td> 14,502 </td><td> 14,623 </td></tr><tr><td> 14,907 </td><td> 14,384 </td></tr><tr><td> 13,732 </td><td> 14,946 </td></tr></tbody></table> Tablo 4: Mikroakiskan dizisi kartını kullanarak miRNA U6 profil Sirkülasyon. İki Mikroakiskan dizi kartları (A ve B) kullanma. Örnek A U6 kontrol miRNA Cı-değerleri (toplam = 8). Koşular arasında gözlenen Tutarlı U6 kontrolü miRNA bolluğu.

Sirkülasyon mikroRNAlar son zamanlarda çeşitli kanser ve diğer hastalıklar için umut verici ve yeni biyolojik belirteçler olarak ortaya çıkmıştır. Bu makalenin amacı üç farklı prob-tabanlı gerçek zamanlı PCR platformları ve ölçmek ve microRNA dolaşan bereket belirlemek için kullanılabilir yöntemleri tartışmaktır.

Probe-tabanlı Real-time PCR microRNA Kantitatif Ölçüm Yaklaşımları

Probe-based quantitative PCR (qPCR) is a favoured method for measuring transcript abundance, since it is one of the most sensitive detection methods that ...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, plazma ve serum örneklerinde mikro RNA'yı ölçmek için kullanılan üç farklı prob tabanlı gerçek zamanlı PCR yöntemini göstermektir. Prob tabanlı gerçek zamanlı PCR, bir floresan raportör ve bir söndürücü içeren floresan etiketli probun hidrolizi ve tespiti ile elde edilir. Yapışkan polimeraz, yukarı akış astarından uzandığında ve probun beş ana ucuna ulaştığında, floresan yayıcının söndürücüden fiziksel olarak ayrılmasına yol açar.Daha sonra, dedektör tarafından kaydedilen ve bu reaksiyondan gelen floresan sinyalinde artımlı bir artış olarak sunulan tek bir floro dört molekülü salınır. Sonuç olarak, üretilen PCR ürününün miktarı, floresanstaki artışa dayalı olarak ölçülebilir ve bu da amplifiye edilmiş hedef amplifi'nin doğru bir şekilde ölçülmesine olanak tanır. Bu yöntem, çeşitli kanserler ve diyabet gibi diğer hastalıklar için yeni biyobelirteçlerin keşfedilmesi için umut verici bir yöntem olarak ortaya çıkmaktadır.Bu yöntem, serum ve plazmadaki mikroRNA'ların bolluğu hakkında fikir verebilse de, periferik hücreler ve dokular gibi diğer örneklere de uygulanabilir. Bu protokolün görsel bir gösterimi kritik öneme sahiptir, çünkü nano akışkan dizi slaytının sızdırmazlığında yer alan bazı adımların sadece protokolü okuyarak öğrenilmesi zor olabilir: Prob tabanlı gerçek zamanlı kantitatif PCR olgun mikro RNA tespiti için, ayrı QPCR reaktifinin 4.2 mikrolitresinde karışımlar, bir optik 96 kuyulu plakanın her bir oyuğuna, ardından 0.8 mikrolitre uygun taze hazırlanmış CDNA reaksiyon çözeltisi. Plakayı uygun optik kapakla kapatın ve ardından gerçek zamanlı PCR sisteminde QPCR'yi başlatın.Bir ila 1000 nanogram toplam RNA başlangıç girişine sahip bir mikroakışkan dizi kartı hazırlamak için önce havuz A ve B primer tamponunu, deoksi nükleotid fosfatları, magnezyum klorürü ve RNA inhibitörünü buz üzerinde çözün. Daha sonra ters transkripsiyon yapmak için, her bir RNA örneğinin 100 nanogramını bir havuz A veya havuz B tüpüne alın, ardından her tüpteki toplam hacmi üç mikrolitreye getirmek için uygun hacimde nükleaz içermeyen su ekleyin. Daha sonra, uygun ters transkripsiyon reaktifinin 4.5 mikrolitresini uygun karşılık gelen tüplere karıştırın.Ardından numuneleri termodöngüleyiciye yerleştirin ve ters transkripsiyona başlayın. Ters transkripsiyon ilerlerken. Bir ila 350 nanogram arasındaki toplam RNA numune girişleri için, numuneler hazır olduğunda, uygun preamp reaktifinden 22.5 mikrolitre alikot ederek, önceden tanımlanmış ön amplifikasyon primerleri havuzunu buz üzerinde çözer.Havuz A ve havuz B tüplerine karıştırın ve her birine 2,5 mikrolitre ters kopyalanmış CDNA örneği ekleyin. Ardından numuneleri termodöngüleyiciye yükleyin ve preamp döngüsü. Döngünün sonunda, mikroakışkan kartı yüklemek için önceden güçlendirilmiş CDNA'ya 75 mikrolitre 0.1 x tris EDTA tamponu ekleyin.Daha sonra, kart A için seyreltilmiş PREPL güçlendirilmiş CDNA'nın dokuz mikrolitresine 450 mikrolitre QPCR reaktif karışımı ekleyin, astar havuzu A kullanılarak hazırlanan PREPL güçlendirilmiş ürünü kullanın ve 441 mikrolitrelik nihai hacme 900 mikrolitre nükleaz içermeyen su ekleyin. Daha sonra oda sıcaklığına ulaştığında, yapışkan adam düşük yoğunluklu dizi kartını ambalajından çıkarın ve folyo tarafı aşağı bakacak şekilde temiz bir alana yerleştirin. 100 mikrolitre PCR reaksiyonu ekleyin.Karttaki sekiz doldurma portunun her birine karıştırın. Kartı 331 GS ve oda sıcaklığında bir dakika döndürün. Daha sonra yavaş, sabit ve tek bir düzgün hareketle, taşıyıcıyı mühürleyicinin uç noktasına ulaşana kadar kart boyunca itin.Mühürlü dizi kartını çıkarın ve rezervuarları kesin. Ardından, mikroakışkanlar dizisi gerçek zamanlı PCR sistemine doğru blok ısıtmalı kapağın ve numune taşıyıcının takıldığını onaylayın. Nano akışkan dizileri yüklemek için, seyreltilmiş prepl, güçlendirilmiş CDNA'yı çözün ve gerçek zamanlı QPCR reaktifini yapıştırın.QPCR reaktif şişesini döndürerek karıştırın ve karıştırın. Daha sonra, 22.5 mikrolitre seyreltilmiş prepl, güçlendirilmiş CDNA'ya 22.5 mikrolitre QPCR reaktif karışımı ekleyin. Ardından, her bir numunenin A havuzunu ve B havuzunu yerleştirmeye özen göstererek, nano akışkan dizi iş akışı 384 kuyulu numune plakasının sekiz kuyusuna her numuneden beş mikrolitre ekleyin.Bitişik sekiz kuyu bloğunda, tüm numuneler aktarıldığında, plakanın her bir bölümünü açık dizi numune plakası kapatıcı parçalarıyla kaplayın. Ardından, ilk nano akışkan dizi slaytını yaklaşık 15 dakika sonra oda sıcaklığına çözün. Nano akışkan dizi sistemine doğru blok düzenleme kapağının ve numune taşıyıcının takıldığı onaylandı ve ardından daldırma sıvısı şırıngasının pistonunu hafifçe çekerek gevşetin.Kapağı çıkarın, ucu yerine yerleştirin ve uçtaki havayı yıkayın. Ardından yükleme sistemi uçlarını yükleme sisteminin içine yerleştirin. Kapağı açın ve numune plakasını yükleme sistemine yerleştirin.Şimdi sıkıca oturan bir çift eldiven giyin. Sürgü ambalajını dikkatlice açın ve üst kısmına dokunmadan sürgüyü yavaşça paketten çıkarın. Slaytı, soldaki barkod ile yükleme sistemine yerleştirin.Ardından, sızdırmazlık maddesini numune plakasının yüklenmesi amaçlanan kısmından çıkarın ve slayt barkod slayt konumunu, numune konumunu ve uç konfigürasyonunu girmek için yükleme sistemi yazılımını kullanın. Sürgü yüklenirken, sürgü kapağının altındaki şeffaf ve kırmızı plastiği çıkarın. Ardından, yükleme işleminin bitiminden sonraki 90 saniye içinde sürgüyü dikkatlice çıkarın ve kapatın.Sürgüyü plaka kelepçesinin içine yerleştirin ve sürgülü kapağı 30 saniye boyunca sürgünün üzerine yerleştirin ve kapağın barkodun doğru şekilde görüntülenecek şekilde konumlandırıldığını onaylayın. Ardından, daldırma sıvısı şırıngasını, ucu kapağa bastıracak şekilde sürgünün içine yerleştirin ve sıvının kapak boyunca akmasına dikkat ederek sürgüyü yavaşça daldırma sıvısıyla doldurun. Sürgü dolduğunda, tutamak kırılana kadar vidayı çevirerek tapa ile kapatın.Son olarak, sürgülü kapağın üst kısmındaki plastik kapağı çıkarın ve sürgüyü gerçek zamanlı PCR sisteminin sürgülü taşıyıcısına dikkatlice yerleştirin. Kaydırağın üst kısmına dokunmadan alçaltılırken kaydırağın alt kısmını desteklemeye dikkat edin. Ardından PCR sistemini başlatın ve numuneleri yükledikten sonraki bir saat içinde kantitatif PCR programını başlatın.Bu prosedürü kullanarak, beş mikrolitrelik bir reaksiyon hacmi, güçlü bir korelasyona sahip 20 mikrolitrelik bir hacim kullanılarak elde edilenlere benzer sonuçlar üretebilir. Burada 39 döngüye kadar, mülayim Altman ve korelasyon grafikleri, az önce gösterildiği gibi, mikroakışkan dizi kartları kullanılarak aynı numune üzerinde test edilen 754 mikro RN'nin tümü için gösterilmiştir. Her iki izde de sıfır ile 19.99 arasında CT değerlerine sahip mikroRNA'lar da %98'lik bir belirleme katsayısı ile benzer ifadeler sergiler Ayrıca, 30 ile 40 arasındaki CT değerleri seçildiğinde denemeler arasında önemli farklılıklar gözlenen mikroRNA'ların sayısı artar. Bu grafikte, tüm 754 mikroRNA'lar için nano akışkanlar dizisi platform verileri gösterilmektedir.Sonuçların gerçek amplifikasyonun göstergesi olduğundan emin olmak için amplifikasyon eğrilerini incelemek önemlidir. U six gibi temizlik mikroRNA'ları da değişkenlik açısından incelenmelidir. Örneğin, bu grafikte, verilerin güvenilirliğini gösteren düşük standart sapma gösteren U altı kopyanın tipik bir kümelemesi gösterilmiştir.Son olarak, bu veriler, ikinci bir örneklemde U altı kopyanın artan değişkenliğini göstermektedir. Mikroakışkanlar ve Nana akışkan dizileri gibi yüksek verimli prob tabanlı teknolojiler, çok kısa sürede çok sayıda numunede birden fazla mikroRNA'nın bolluğunu tekrarlanabilir ve verimli bir şekilde tespit etme kolaylığı sunar. İş akışlarının her biri, mikroRNA hedeflerinin sayısına ve analiz edilecek örnek sayısına bağlı olarak farklı verimleri karşılamak üzere tasarlanmıştır.Bu videoyu izledikten sonra, mikro NA bolluğunu ana hatirlamak için farklı prob tabanlı gerçek zamanlı PCR tekniklerinin nasıl uygulanacağını iyi anlamış olmalısınız.

probe-based-real-time-pcr-approaches-for-quantitative-measurement

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Thermo Scientific Matrix çok kanallı pipet ile el gibi bir robot kullanarak qPCR için 96-iyi dizileri Biz ön microRNA kurulum ve analiz gösterecektir.

Kantitatif Gerçek-zamanlı PCR (qPCR) Diziler kullanarak Pre-mikro RNA&#39;lar ve microRNA, Profilleme

Burada örnek sınırlı miktarda çalışma, özellikle microRNA (miRNA) ekspresyon düzeyleri için bir maliyet ve zaman etkili yüksek verimli bir tarama aracı olarak mikroakışkan platformu ile birlikte optimize edilmiş bir multiplex ters transkriptaz kantitatif PCR (QRT PCR) protokolü açıklamak.

Yüksek Verimli MicroRNA Profil: Optimize edilmiş, Multiplex QRT-PCR Fluidigm Dinamik ArrayTM IFCS Nanoliter Ölçeğinde

Kantitatif Real Time PCR (qPCR) tümör örneklerinde çeşitli mikroRNA ifade seviyeleri (miRNA) molekülleri araştırmak için hızlı ve duyarlı bir yöntemdir. Farklı miRNA moleküller yüzlerce bu yöntem ifadesi kullanılarak, amplifiye miktarı, ve aynı cDNA şablon ile analiz edilebilir.

Kantitatif Gerçek-zamanlı PCR (qPCR) tarafından Prostat tümörlerinde mikroRNA Algılama

Biz beyin omurilik sıvısı (BOS) microRNA profili gerçek zamanlı PCR bir protokol açıklar. RNA ekstre etme protokolleri hariç, prosedür diğer vücut sıvıları, kültürlenmiş hücreler ya da doku örneklerinden elde edilen RNA ile uzatılabilir.

Kantitatif Real Time PCR kullanarak Beyin Omurilik Sıvısı MicroRNA Profil

Östrojen ve mikroRNA'lar hem aracılığıyla sinyal Moleküler meme kanseri gelişiminde ve büyümesinde önemli olan. Östrojen transkripsiyon faktörleri olan östrojen reseptörleri aktive eder. Pek çok transkripsiyon faktörleri microRNA ekspresyonunu düzenleyen ve estrojen ile düzenlenen microRNA farklı büyük ölçekli teknikler kullanılarak profilli olabilir.

Meme Kanseri Hücrelerinde östrojen düzenlenmiş microRNA profil

Boya bazlı bir kimya ve damlacık dijital PCR teknolojisi kullanılarak hücresiz mikroRNA'ların miktar tayini için hassas ve doğru bir yöntem açıklanmaktadır.

MicroRNA Niceleme DNA bağlayıcı Boya Kimya ve Damlacık Dijital PCR kullanarak Sirkülasyon

Bu rapor plazma miRNA, nicel gerçek zamanlı ters transkripsiyon PCR ile veya öncesi amplifikasyon olmadan kullanarak mutlak düzeylerini ölçmek için bir protokolünü açıklar. Bu iletişim kuralı plazma miRNAs miktarı daha iyi anlaşılmasını tanıyor ve nitel karşılık gelen verilerden farklı çalışmalar veya laboratuvar değerlendirmesini sağlar.

Cynomolgus maymunlar, nicel gerçek zamanlı ters transkripsiyon PCR kullanarak plazma mikroRNA düzeylerinin mutlak miktar

Burada, lipoprotein parçacıklarının yerel Micro-RNA içeriğinin (mutlak/göreceli) belirlenmesi için nicel gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyon tabanlı protokol sunulur. Buna ek olarak, Mikro-RNA seviyesini artırmak için bir yöntem, hem de lipoprotein parçacıkları hücresel alımını oranını belirlemek için bir yöntem gösterilmiştir.

MicroRNA ile yerli lipoprotein parçacıkları zenginleştirme ve onların mutlak/bağıl microRNA Içerik ve onların hücresel transfer hızı sonraki belirlenmesi

Bu protokol bir prob tabanlı gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (PCR), bir sülforhodamin içinde B (SRB) tahlil, 3 ' tercüme edilmemiş bölgeler (3 ' UTR) klonlama ve bir Lusiferaz tahlil ilgi bir Mirna hedef genler doğrulamak ve mirnas işlevlerini anlamak için kullanır.

Tümör hücrelerinde MicroRNA seviyeleri, fonksiyonları ve Ilişkili hedef genler değerlendirmek için bir In vitro protokol

Burada, küçük RNA'ları yalıtmak, mikroRNA'lar için zenginleştirmek ve yüksek iş elde etme sıralaması için numune hazırlamak için adım adım bir strateji tanımlıyoruz. Daha sonra açık kaynak araçlarını kullanarak sıra okumaları nasıl işleyip mikroRNA'lara hizalayan açıklarız.

MikroRNA'ları Yalıtmak ve Sıralamak ve Açık Kaynak Araçlarını Kullanarak Analiz Etmek Için Komple Bir Boru Hattı

Protokol, mikroRNA ve çoğullanmış proteinleri aynı anda tespit etmek ve ölçmek için formalinle sabitlenmiş parafine gömülü doku ile tandem bir immünofloresan hibridizasyon testini tanımlar.

Yeni Bir Tespit ve Miktar Belirleme Yöntemi Olarak Kilitli Nükleik Asit Yerinde Hibridizasyon Yoluyla MikroRNA Amplifikasyonu ve Tanınması

Öğrenin, plazma ve serum örneklerinde mikroRNA kantitatif ölçümü için prob-tabanlı real-time PCR yöntemlerini. Bu teknik, kanser ve diyabet gibi hastalıklarda yeni biyobelirteçler keşfetmek için değerli bir araçtır.

Probe-tabanlı Real-time PCR microRNA Kantitatif Ölçüm Yaklaşımları

Daha fazla video keşfet