Probe-tabanlı Real-time PCR microRNA Kantitatif Ölçüm Yaklaşımları

Aşağıdaki deneyin genel amacı, plazma ve serum örneklerinde mikro RNA'yı ölçmek için kullanılan üç farklı prob tabanlı gerçek zamanlı PCR yöntemini göstermektir. Prob tabanlı gerçek zamanlı PCR, bir floresan raportör ve bir söndürücü içeren floresan etiketli probun hidrolizi ve tespiti ile elde edilir. Yapışkan polimeraz, yukarı akış astarından uzandığında ve probun beş ana ucuna ulaştığında, floresan yayıcının söndürücüden fiziksel olarak ayrılmasına yol açar.

Daha sonra, dedektör tarafından kaydedilen ve bu reaksiyondan gelen floresan sinyalinde artımlı bir artış olarak sunulan tek bir floro dört molekülü salınır. Sonuç olarak, üretilen PCR ürününün miktarı, floresanstaki artışa dayalı olarak ölçülebilir ve bu da amplifiye edilmiş hedef amplifi'nin doğru bir şekilde ölçülmesine olanak tanır. Bu yöntem, çeşitli kanserler ve diyabet gibi diğer hastalıklar için yeni biyobelirteçlerin keşfedilmesi için umut verici bir yöntem olarak ortaya çıkmaktadır.

Bu yöntem, serum ve plazmadaki mikroRNA'ların bolluğu hakkında fikir verebilse de, periferik hücreler ve dokular gibi diğer örneklere de uygulanabilir. Bu protokolün görsel bir gösterimi kritik öneme sahiptir, çünkü nano akışkan dizi slaytının sızdırmazlığında yer alan bazı adımların sadece protokolü okuyarak öğrenilmesi zor olabilir: Prob tabanlı gerçek zamanlı kantitatif PCR olgun mikro RNA tespiti için, ayrı QPCR reaktifinin 4.2 mikrolitresinde karışımlar, bir optik 96 kuyulu plakanın her bir oyuğuna, ardından 0.8 mikrolitre uygun taze hazırlanmış CDNA reaksiyon çözeltisi. Plakayı uygun optik kapakla kapatın ve ardından gerçek zamanlı PCR sisteminde QPCR'yi başlatın.

Bir ila 1000 nanogram toplam RNA başlangıç girişine sahip bir mikroakışkan dizi kartı hazırlamak için önce havuz A ve B primer tamponunu, deoksi nükleotid fosfatları, magnezyum klorürü ve RNA inhibitörünü buz üzerinde çözün. Daha sonra ters transkripsiyon yapmak için, her bir RNA örneğinin 100 nanogramını bir havuz A veya havuz B tüpüne alın, ardından her tüpteki toplam hacmi üç mikrolitreye getirmek için uygun hacimde nükleaz içermeyen su ekleyin. Daha sonra, uygun ters transkripsiyon reaktifinin 4.5 mikrolitresini uygun karşılık gelen tüplere karıştırın.

Ardından numuneleri termodöngüleyiciye yerleştirin ve ters transkripsiyona başlayın. Ters transkripsiyon ilerlerken. Bir ila 350 nanogram arasındaki toplam RNA numune girişleri için, numuneler hazır olduğunda, uygun preamp reaktifinden 22.5 mikrolitre alikot ederek, önceden tanımlanmış ön amplifikasyon primerleri havuzunu buz üzerinde çözer.

Havuz A ve havuz B tüplerine karıştırın ve her birine 2,5 mikrolitre ters kopyalanmış CDNA örneği ekleyin. Ardından numuneleri termodöngüleyiciye yükleyin ve preamp döngüsü. Döngünün sonunda, mikroakışkan kartı yüklemek için önceden güçlendirilmiş CDNA'ya 75 mikrolitre 0.1 x tris EDTA tamponu ekleyin.

Daha sonra, kart A için seyreltilmiş PREPL güçlendirilmiş CDNA'nın dokuz mikrolitresine 450 mikrolitre QPCR reaktif karışımı ekleyin, astar havuzu A kullanılarak hazırlanan PREPL güçlendirilmiş ürünü kullanın ve 441 mikrolitrelik nihai hacme 900 mikrolitre nükleaz içermeyen su ekleyin. Daha sonra oda sıcaklığına ulaştığında, yapışkan adam düşük yoğunluklu dizi kartını ambalajından çıkarın ve folyo tarafı aşağı bakacak şekilde temiz bir alana yerleştirin. 100 mikrolitre PCR reaksiyonu ekleyin.

Karttaki sekiz doldurma portunun her birine karıştırın. Kartı 331 GS ve oda sıcaklığında bir dakika döndürün. Daha sonra yavaş, sabit ve tek bir düzgün hareketle, taşıyıcıyı mühürleyicinin uç noktasına ulaşana kadar kart boyunca itin.

Mühürlü dizi kartını çıkarın ve rezervuarları kesin. Ardından, mikroakışkanlar dizisi gerçek zamanlı PCR sistemine doğru blok ısıtmalı kapağın ve numune taşıyıcının takıldığını onaylayın. Nano akışkan dizileri yüklemek için, seyreltilmiş prepl, güçlendirilmiş CDNA'yı çözün ve gerçek zamanlı QPCR reaktifini yapıştırın.

QPCR reaktif şişesini döndürerek karıştırın ve karıştırın. Daha sonra, 22.5 mikrolitre seyreltilmiş prepl, güçlendirilmiş CDNA'ya 22.5 mikrolitre QPCR reaktif karışımı ekleyin. Ardından, her bir numunenin A havuzunu ve B havuzunu yerleştirmeye özen göstererek, nano akışkan dizi iş akışı 384 kuyulu numune plakasının sekiz kuyusuna her numuneden beş mikrolitre ekleyin.

Bitişik sekiz kuyu bloğunda, tüm numuneler aktarıldığında, plakanın her bir bölümünü açık dizi numune plakası kapatıcı parçalarıyla kaplayın. Ardından, ilk nano akışkan dizi slaytını yaklaşık 15 dakika sonra oda sıcaklığına çözün. Nano akışkan dizi sistemine doğru blok düzenleme kapağının ve numune taşıyıcının takıldığı onaylandı ve ardından daldırma sıvısı şırıngasının pistonunu hafifçe çekerek gevşetin.

Kapağı çıkarın, ucu yerine yerleştirin ve uçtaki havayı yıkayın. Ardından yükleme sistemi uçlarını yükleme sisteminin içine yerleştirin. Kapağı açın ve numune plakasını yükleme sistemine yerleştirin.

Şimdi sıkıca oturan bir çift eldiven giyin. Sürgü ambalajını dikkatlice açın ve üst kısmına dokunmadan sürgüyü yavaşça paketten çıkarın. Slaytı, soldaki barkod ile yükleme sistemine yerleştirin.

Ardından, sızdırmazlık maddesini numune plakasının yüklenmesi amaçlanan kısmından çıkarın ve slayt barkod slayt konumunu, numune konumunu ve uç konfigürasyonunu girmek için yükleme sistemi yazılımını kullanın. Sürgü yüklenirken, sürgü kapağının altındaki şeffaf ve kırmızı plastiği çıkarın. Ardından, yükleme işleminin bitiminden sonraki 90 saniye içinde sürgüyü dikkatlice çıkarın ve kapatın.

Sürgüyü plaka kelepçesinin içine yerleştirin ve sürgülü kapağı 30 saniye boyunca sürgünün üzerine yerleştirin ve kapağın barkodun doğru şekilde görüntülenecek şekilde konumlandırıldığını onaylayın. Ardından, daldırma sıvısı şırıngasını, ucu kapağa bastıracak şekilde sürgünün içine yerleştirin ve sıvının kapak boyunca akmasına dikkat ederek sürgüyü yavaşça daldırma sıvısıyla doldurun. Sürgü dolduğunda, tutamak kırılana kadar vidayı çevirerek tapa ile kapatın.

Son olarak, sürgülü kapağın üst kısmındaki plastik kapağı çıkarın ve sürgüyü gerçek zamanlı PCR sisteminin sürgülü taşıyıcısına dikkatlice yerleştirin. Kaydırağın üst kısmına dokunmadan alçaltılırken kaydırağın alt kısmını desteklemeye dikkat edin. Ardından PCR sistemini başlatın ve numuneleri yükledikten sonraki bir saat içinde kantitatif PCR programını başlatın.

Bu prosedürü kullanarak, beş mikrolitrelik bir reaksiyon hacmi, güçlü bir korelasyona sahip 20 mikrolitrelik bir hacim kullanılarak elde edilenlere benzer sonuçlar üretebilir. Burada 39 döngüye kadar, mülayim Altman ve korelasyon grafikleri, az önce gösterildiği gibi, mikroakışkan dizi kartları kullanılarak aynı numune üzerinde test edilen 754 mikro RN'nin tümü için gösterilmiştir. Her iki izde de sıfır ile 19.99 arasında CT değerlerine sahip mikroRNA'lar da %98'lik bir belirleme katsayısı ile benzer ifadeler sergiler Ayrıca, 30 ile 40 arasındaki CT değerleri seçildiğinde denemeler arasında önemli farklılıklar gözlenen mikroRNA'ların sayısı artar. Bu grafikte, tüm 754 mikroRNA'lar için nano akışkanlar dizisi platform verileri gösterilmektedir.

Sonuçların gerçek amplifikasyonun göstergesi olduğundan emin olmak için amplifikasyon eğrilerini incelemek önemlidir. U six gibi temizlik mikroRNA'ları da değişkenlik açısından incelenmelidir. Örneğin, bu grafikte, verilerin güvenilirliğini gösteren düşük standart sapma gösteren U altı kopyanın tipik bir kümelemesi gösterilmiştir.

Son olarak, bu veriler, ikinci bir örneklemde U altı kopyanın artan değişkenliğini göstermektedir. Mikroakışkanlar ve Nana akışkan dizileri gibi yüksek verimli prob tabanlı teknolojiler, çok kısa sürede çok sayıda numunede birden fazla mikroRNA'nın bolluğunu tekrarlanabilir ve verimli bir şekilde tespit etme kolaylığı sunar. İş akışlarının her biri, mikroRNA hedeflerinin sayısına ve analiz edilecek örnek sayısına bağlı olarak farklı verimleri karşılamak üzere tasarlanmıştır.

Bu videoyu izledikten sonra, mikro NA bolluğunu ana hatirlamak için farklı prob tabanlı gerçek zamanlı PCR tekniklerinin nasıl uygulanacağını iyi anlamış olmalısınız.