Name: Görüntüleme Ca 2+ Dinamikleri (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 5 s
Description: Öğrenin, fare retinasında koni fotoreseptörlerinin akson uçlarında Ca²⁺ dinamiklerini görüntülemek için iki foton mikroskobu kullanarak ışık uyarılı kalsiyum sinyallerini nasıl kaydedeceğinizi. Bu yöntem, fotoreseptör dejenerasyonunda kalsiyumun rolünü incelemeyi kolaylaştırır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) tarafından desteklenmiştir (Werner Reichardt Centre for Integrative Neuroscience Tübingen, EXC 307 to T.E. ve T.S.; KFO 134'ten B.W. ve F.P.D.'ye), Alman Federal Eğitim ve Araştırma Bakanlığı'na (BMBF) (BCCN Tübingen, FKZ 01GQ1002'den T.E ve T.B.'ye) ve Avrupa Birliği'ne (DRUGSFORD; SAĞLIK-F2-2012-304963 M.K. ve FPD'ye).

Tüm hayvan prosedürleri Alman Federal Hükümet tarafından belirlenen ve Tübingen Üniversitesi kurumsal hayvan refahı komitesi tarafından onaylanmış hayvan koruma kuralları ve yasalara bağlı kalarak yürütülmüştür. 1. Hayvan Modelleri <ol><li> HR2.1: TN-XL Ca 2+ biyosensör fare <ol><li> Transgenik HR2.1 kullanın: TN-XL fare hat koni fotoreseptörlerin 10 seçici Ca 2 + biyosensör TN-XL ifade. Standart 12 saat gündüz / gece ritmi ile kaldırdı iki cinsiyetten 6 haftalık fareler - 3 kullanın. </li></ol></li></ol> 2. Retina Diseksiyon <ol><li> Fizyolojik çözelti, <ol><li> 125 mM NaCI, 2.5 mM KCI, 1 mM MgCI2, 1,25 mM NaH 2 PO 4, 26 mM NaHCO 3, 0.5 mM L-glutamin, ve 20 mM (+) glikoz içeren hücre-dışı çözelti taze 2 L, hazırlayın. Tüm malzemeyi eritmek kadar karıştırın. </li><li> &quot;Kabarcık&quot; hücre dışı çözelti,10 dakika - 5 için carboxygen (% 95 O2,% 5 CO2) ile. 2 mM&#39;lik bir konsantrasyona ulaşmak için CaCl2 ekleyin. </li><li> Dışı çözüm köpüren sonra, onun pH ölçümü. pH, aksi takdirde bu hatalar çözeltinin hazırlanması sırasında yapılmış olması muhtemeldir, 7.4 olmalıdır. Sabit pH sağlamak için deney boyunca köpüren hızı ve çözüm sıcaklığı sabit tutun. </li><li> 2 matara, retina diseksiyon için bir ve kayıt kurulumu (perfüzyon) için birine stok ayırın. </li></ol></li><li> Göz enükleasyon ve retinanın izolasyonu (5-10 dk) <ol><li> Enükleasyon için çalışma alanı içinde loş kırmızı aydınlatma koruyun. Diseksiyon sırasında koni beyazlatma önlemek için 650 nm (veya daha uzun) bir zirve dalga boyu LED kullanın. </li><li> Koniler tamamen kayıtları sırasında duyarlı olmasını sağlamak için iyi havalandırılan, lightproof kutu içine kendi kafesi koyarak 2 saat için fare koyu adapte. </li><li> Bir Laborato altında fare uyuşturanbir buharlaştırıcı ve standart bir fare kafesi taşıyan bir gaz-sızdırmaz bir kap kullanılarak izofluran (% 5) ile Ry kapağı. Buharlaştırıcı&#39;yı işlerken dikkatle imalatçının talimatları izleyin. Alerjenlere maruziyeti azaltmak için eldiven ve yüz maskesi kullanın. </li><li> Diseksiyon için 40X büyütme - 10 ile binoküler mikroskop kullanın. </li><li> Dekapitasyon yoluyla anestezi fare kurban. </li><li> Yönlendirme için, su geçirmez bir kalemle her göz (= dorsal) üst işaretleyin. Sol veya sağ gözünü kullanarak konusunda takip edin. </li><li> Göz küresi arkasında optik sinir keserek dikkatlice kavisli makas kullanılarak göz çıkarın. Diseksiyon için taze carboxygenated hücre dışı çözelti ihtiva eden bir Petri kabı gözün aktarın. Gözü aktarmak için, optik sinir güdük tutunuz. </li><li> Keskin bir enjeksiyon iğnesi ile kornea ve (ora serrata de yani) sklera arasındaki sınır boyunca herhangi bir noktada göz delmek. </li><li> E tuthafifçe forseps çifti ile sklera de siz tek makas önceki adımda yapılan deliğe bıçak yerleştirin. Arka kısmında (göz kapağı) için göz (kornea, lens, vitreus) ön kısmını ayırmak için ora serrata boyunca kesin. Retina üzerinde dorsal konumunu belirtmek için kalem işareti pozisyonunda (optik disk doğru) radyal Göz yuvası kesin. Not: Bu şekilde hazırlanan eyecups daha sonra kullanmak için sürekli carboxygenated çözelti içinde muhafaza edilebilir. </li><li> Dorsal uzakta kendini noktaları kesilmiş şekilde Petri kabındaki Göz yuvası çevirin. Retina ve sklera arasında forseps ipuçları sokulmasıyla sol ve forseps, her bir çift Göz yuvası sağ tarafındaki sklera al. </li><li> Yavaşça Göz yuvası skleral kısmını ters çevirerek retina ayırın. Son olarak, sklera retina boşaltmak için makas diseksiyon mikro kullanarak optik sinir kesti. Not: Bu kritik bir adımdır. Retina (örneğin, tarafından zarar görmemesidokunaklı ve) forseps ile sıkarak. </li><li> Forseps ikinci bir çifti kullanılarak retina yüzeyinden birikintileri ve vitreus cismin çıkarılması hafifçe forseps bir çift ile retinanın kenarlarında birini basılı tutun. Retina yüzeyi temiz olduğunda, üç ek kısa, radyal kesimler (yaklaşık olarak her 90 °) yapmak için makas diseksiyon mikro kullanın. Bu kesimler, bir dikkatle fotoreseptör tarafı Petri kabı (Şekil 1A) aşağı bakacak şekilde retina düzleştirmek için izin verir. </li></ol></li><li> Dilim hazırlık (10-15 dakika) <ol><li> Dilimleri montaj ve kayıt odasına aktarılması için retina dilimleme ve cam kapak fişleri için önceden nitroselüloz filtre membranlar hazırlayın. Makas kullanılarak yaklaşık 10 x 5 mm büyüklüğünde bir dikdörtgen parçalar halinde nitroselüloz filtre membranı kesin. Bir glasscutter kullanılarak yaklaşık olarak 10 x 5 mm büyüklüğünde bir dikdörtgen parçalar halinde lamelleri kesilir. </li><li> Yavaş yavaş yakın hücre dışı çözelti bir cam slayt batırmakdokusu. Yavaşça, forseps bir çift kullanarak çok kenarında onu kapma ganglion hücre tarafı yukarı cam slayt üzerine retina çekin. Bu süreç, mekanik hasar ve doku katlanmasını azaltır. </li><li> İlgili araştırma sorusu ile ilgilidir retinanın bölge seçin (ayrıca Tartışma bakınız). Adım 2.2.9 yapılan uzun kesilmiş dorsal retina yarısını (Şekil 1A) işaretler, unutmayın. Kavisli neşter bıçak kullanarak seçilen retina bölgesi dışında bir dikdörtgen, yaklaşık 1 x 2 mm büyüklüğünde parça kesin. Doku çevresindeki aşırı çözüm siliniz. </li><li> Ganglion hücre tarafı zarına yapışan şekilde retina parçasının üzerine filtre zarı yerleştirin. Hemen sonra, sıkı bir şekilde zara doku takmak için zar üzerine, hücre dışı ortamın bir damla ekleyin. </li><li> Taze dışı solüsyon içeren dilimleme odasına zar monte retina doku aktarın. </li><li> 200 mikron dikey dilimler halinde kesin retinaBir doku kesici 23 takılan bir taze traş makinesi bıçak kullanılarak kalınlığı (Şekil 1B). Her retina parça için bıçağı değiştirin. Not: jilet ile belirtildiği gibi, tüm membran, aynı anda bölünmeler şekilde mükemmel dilimleme odasının alt yüzeyi ile uyumlu hale getirilmesi gereken bir keserken sesi &quot;linkine tıklayarak&quot; - aksi takdirde bıçak bükülebilir ve dilim zarar. </li><li> Zara yüksek vakum gres uygulayarak cam kapak-slip tek bir zar monte dilim Tutkal sadece (Şekil 1C) sona erer. Gres ücretsiz retina altındaki cam yüzeyini tutun. </li><li> Tutma odası içinde hücre dışı bir çözelti damla kapsadığı lamel monte dilimleri tutun - örneğin, kapalı ışık geçirmeyen kap, alüminyum folyo ile kaplanmış kapaklı bir Petri kabı - oda sıcaklığında bir carboxygen atmosferi altında. Holding atmosfer tutmak için küçük bir su deposu köpüren tarafından carboxygen tanıtılmasıbölme nemlendirilmelidir; Bu kurumasını dilimleri önler. </li><li> Kayıt odasına onları (tek tek) geçmeden önce 15 dakika - dilimler 10 tutma odasında dinlenmek için izin verin. Dilimler, oda sıcaklığında bölme tutarak 4-5 saat kadar muhafaza edilebilir (~ 21 ° C). </li></ol></li></ol> 3. İki foton Ca 2+ Görüntüleme <ol><li> İki foton mikroskopi <ol><li> Bir Hareketli Hedef Mikroskop (MOM) tipi iki foton mikroskop kullanın. Ayrıntılar ayrıca bkz hem MOM tasarım ve görüntüleme işlemleri, daha önce 24 tarif edildi 10,21,25 (kaynaklar ve şirketler için, bakınız Tablo 1). Not: kullanılan aşağıdaki minimum gereksinimleri karşılayan herhangi bir dik iki foton mikroskopu: Bu ~ 860 nm&#39;ye ayarlanabilir bir (a) darbeli bir lazer, (b), iki eş zamanlı olarak elde edilen floresans kanallarının en az, (Cı ile donatılmış olması gerekir )) eCFP ve sitrin floresan, (d için filtrelerhafif bir uyarıcısı (mümkünse tasarımlar için, 24,26 bakınız), ve yeterli bir kare hızında zaman lapsed görüntü dizileri kayıt sağlar (e) yazılım ca ilgi 2+ sinyallerini çözmek için. </li><li> İmalatçının işaret ettiği gibi, iki-fotonlu görüntüleme sistemi başlatın. Strictly tesisin lazer güvenlik kurallarına uyun. ~ 860 nm için lazer ve nağme o başlayın. </li><li> Kayıt odasına tutarak odasından bir dilim aktarın ve hemen carboxygenated ekstrasellüler çözümü ile perfüze başlar. 2 ml / dk&#39;lık bir perfüzyon akış oranı ve kayıt bölümü içinde, 37 ° C&#39;lik bir sıcaklıkta muhafaza. </li><li> 20X 0.95 NA suya daldırma hedefi kullanın. Varsa, retina dilim (Şekil 2) bulmak için kayıt odasına altında bir LED kızıl-ötesi ile birlikte bir CCD kamera kullanmak. Aksi takdirde iki foton görüntüleme (3.1.5 bakınız) kullanarak dilim bulun. </li><li> Biyosensör ifadesini görüntülemek için iki foton görüntüleme geçin. AçeCFP ve sitrin floresan görüntüleme için iki algılama kanalları. </li><li> Tarama ve (Şekil 3A) kayıt için koni terminalleri bir satır seçmek için iki foton mikroskop kontrol görüntü elde etme yazılımı kullanın. 128 x 16 piksel görüntüleri (31.25 Hz) veya benzer yapılandırmaya Set görüntü elde etme. Dış segmentlerinde photopigments beyazlatma önlemek için koni terminallerine taranan alan kısıtlayın. Not: (Ca 2+ unbinding için bağlayıcı Ca τ = ~ 0.6 sn 2+, τ = ~ 0.2 saniye; 16 bakınız) TN-XL kalsiyum sensörü için ~ 8 Hz minimum kare hızı önerilir. </li></ol></li><li> Hafif stimülasyon ve kayıt <ol><li> Başka yerde 10,21,26 açıklandığı gibi aşağıdaki adımları gerçekleştirmek için alt kademe tam saha ışık uyarıcı kullanın. Not: Tam saha ışık uyarıcısı için basit bir çözüm, iki bant-geçiren filtreden geçen LED&#39;ler (: 360 BP 12, &quot;yeşil&quot;: 578 BP 10 örneğin, &quot;mavi&quot;) kullanmaktırBu fare koni dalga boyu hassasiyetlerini maç ama aynı zamanda floresan tespiti için kullanılan filtreler ile örtüşmeyen (cf. 3.2.4). LED&#39;lerden gelen ışık kayıt odasına (Şekil 2) altına doğru Kondenser tarafından odaklanmıştır. Bu stimülatörü tasarımı, kendi kalibrasyon ile ilgili ayrıntılı bilgi için, ışık yoğunlukları kullanılan ve uyarılmış koni fotoğraf izomerleştirme oranları, 10,21,26 bakın. </li><li> Işık uyaranlara (3.2.3 bakınız) sunulması ya da farmakolojik ajanlar uygulamadan önce - (ayrıca Potansiyel Tuzaklar bakın, 30 saniye 20) lazer açın ve koni tarama lazer ve uyarıcı arka plan ışığı uyum sağlar. </li><li> (Şekil 3B, C de gösterildiği gibi hafif örneğin, yanıp söner) keyfi uyaranların sunumu başlatın. Aşama 3.2.1 tarif stimülatörü durumunda, özel bir yazılım tarafından kontrol edilen bir mikro-işlemci kartına (kullanılarak, zaman içinde iki LED yoğunluğunu modüle harekete geçirici bir güçdetayları) 10,21,26 bkz. </li><li> İki floresan kanalları kaydetmeye başlayın (. Örneğin, &quot;mavi&quot; FRET verici eCFP için 483 nm ve &quot;sarı&quot; FRET-alıcısı için 535 nm, gözlük bakınız Tablo 1 için) aynı anda ilgili görüntü elde etme yazılımı kullanarak (ayrıca bkz 3.1 .6). Örneğin, hafif bir yanıp söner (Şekil 3B, C), kayıt en az 8 durumunda - 10 uyarım sunumları (çalışma). </li></ol></li><li> &quot;In-dilim&quot; Ca 2+ kalibrasyonu <ol><li> Telaffuz Ca (3,4 de tarif edildiği gibi), (3.1.6 ve 3.2.4 tarif edildiği gibi) ve koni bir dizi taban Ca 2 + seviyesini elde konik terminalleri 2 + işaretleri. </li><li> 5 uM (DMSO içinde çözülmüş) ionomisin ve 10 mM EGTA ile &quot;Ca 2 + serbest&quot; hücre dışı ortama geçiş (veya alternatif olarak, BAPTA) ilave edildi. Tutanak koni terminalleri yine her 5 dk minimal floresan oranını (R dk) belirlemek, &lt;etmekem&gt; yani hücre içi Ca (yakın) yokluğunda oranı 2+. 30 dakika - Bu her yerde 15 arasında sürebilir. Not: Bir perfüzyon sistemi, farklı hazneler arasında geçiş sağlar olması gereklidir. </li><li> (DMSO içinde çözülmüş) ile 5 uM ionomisin ve 2.5 mM Ca2 + ile birlikte hücre dışı ortama geçin. 5 dakikalık bir inkübasyon süresinden sonra, kayıt koniler yine her 5 dakika, yani maksimum flüoresans oranı (Rmax), 2 + hücre içi Ca doyurucu konsantrasyonlarının mevcudiyetinde oranını ölçmek için kullanılır. Kararlı olmak Ca 2 + oranı 15 dk - ionomycin uygulamayı takiben, bu 3 arasında sürebilir. Not: 2+ yüksek Ca dilimleri merceğin ve sonunda hücrelere zarar verecek uzun süre iyonomisin. Normal morfolojisini muhafaza analizinde tek hücreler yer alır. Konsantrasyonları (örneğin, EGTA, iyonomisin) adapte edilmesi gerekebilir. Ca 2 + kalibrasyon hakkında daha fazla bilgi içinprotokol, 13,17 bkz. </li></ol></li><li> Veri analizi Not: İlgili mikroskop yazılımı ile uyumlu ve özel analiz komut çalıştırabilen bir görüntü işleme ve veri analiz yazılımı paketi kullanın. <ol><li> Bir görüntüleme veri dosyası yükleyin ve her koni terminali (Şekil 3A) çevresinde ilgi (ROI) bölgeleri çizin. ROI içindeki her bir çerçevede, ortalama floresans şiddeti ve FRET alıcı (sitrin) ve verici (eCFP) floresans (R = F A / F; Şekil 3B, C) ​​arasındaki oranı (R) hesaplamadan önce, arka plan floresanı çıkarılır. Bu oran genellikle göreceli hücre içi Ca2 + konsantrasyonu için bir vekil olarak kullanılır, ancak kalibrasyon (3.3) sonra, aynı zamanda mutlak konsantrasyonları (3.4.3 bakınız) tahmin edilebilir. Not: pediküller dış pleksiform tabakasında konumlarına tarafından kabul edilebilir ve bunların morfolojisi (biraz daha küçük koni daha &quot;lekeler&quot; düzleştirilmişsomata) koni akson sonunda yer. </li><li> Ortalama uyaran denemeleri (Şekil 4A). Cevap boyutu için önlemler olarak eğrisi (R A) altında ışık uyarımı, tepe genliği (R amp) ve bölgeye önce böyle Ca 2 + bazal seviyesi (R üssü) olarak ortalama izleri (Şekil 4B), yanıtı parametreleri ayıklayın. Ayrıca, bu tür tepki yükselişi (t artış) ve çürüme süresi (t çürüme) olarak ortalama izleri, yanıtı kinetiği ayıklamak (% 20 ve R amp% 80 arasında = ilgili zaman aralıkları Şekil 4B resme bakınız). Bu parametreleri belirlemek için nasıl hakkında daha fazla bilgi için, 10. görüyorum. </li><li> Adımlar 3.3.1-3.3.3 itibaren ölçümlere dayalı mutlak koni Ca2 + konsantrasyonu tahmini hesaplayın. Minimum ve maksimum Ca2 + konsantrasyonu, R ve R min max Ca, sırasıyla donör floresan için oranları kullanın 2+ </s&gt; TT-bağlı (F D, Ca-bound) ve -unbound kadar (F D, Ca-ücretsiz) devlet yanı sıra, in vivo ayrışma sabiti aşağıdaki TN-XL için (Kd = 0.77, 16 bakınız) denklem (27&#39;ye analog): </li></ol></li></ol><img alt="Denklem 1" src="/files/ftp_upload/52588/52588eq1.jpg" />

<ol><li>Trifunovic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroprotective+strategies+for+the+treatment+of+inherited+photoreceptor+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Neuroprotective strategies for the treatment of inherited photoreceptor degeneration.</a> Current Molecular Medicine. 12, 598-612 (2012).</li>
<li>Paquet-Durand, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calpain+is+activated+in+degenerating+photoreceptors+in+the+rd1+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Calpain is activated in degenerating photoreceptors in the rd1 mouse.</a> Journal of Neurochemistry. 96, 802-814 (2006).</li>
<li>Paquet-Durand, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+key+role+for+cyclic+nucleotide+gated+%28CNG%29+channels+in+cGMP-related+retinitis+pigmentosa%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">A key role for cyclic nucleotide gated (CNG) channels in cGMP-related retinitis pigmentosa.</a> Human Molecular Genetics. 20, 941-947 (2011).</li>
<li>Frasson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinitis+pigmentosa%3A+rod+photoreceptor+rescue+by+a+calcium-channel+blocker+in+the+rd+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Retinitis pigmentosa: rod photoreceptor rescue by a calcium-channel blocker in the rd mouse.</a> Nature Medicine. 5, 1183-1187 (1999).</li>
<li>Bush, R. A., Kononen, L., Machida, S., Sieving, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+calcium+channel+blocker+diltiazem+on+photoreceptor+degeneration+in+the+rhodopsin+Pro213His+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">The effect of calcium channel blocker diltiazem on photoreceptor degeneration in the rhodopsin Pro213His rat.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41, 2697-2701 (2000).</li>
<li>Pawlyk, B. S., Li, T., Scimeca, M. S., Sandberg, M. A., Berson, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absence+of+photoreceptor+rescue+with+D-cis-diltiazem+in+the+rd+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Absence of photoreceptor rescue with D-cis-diltiazem in the rd mouse.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 43, 1912-1915 (2002).</li>
<li>Sampath, A. P., Matthews, H. R., Cornwall, M. C., Bandarchi, J., Fain, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-dependent+changes+in+outer+segment+free-Ca2%2B+concentration+in+salamander+cone+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+General+Physiology%22%5BJournal%5D)">Light-dependent changes in outer segment free-Ca2+ concentration in salamander cone photoreceptors.</a> The Journal of General Physiology. 113, 267-277 (1999).</li>
<li>Choi, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encoding+light+intensity+by+the+cone+photoreceptor+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Encoding light intensity by the cone photoreceptor synapse.</a> Neuron. 48, 555-562 (2005).</li>
<li>Krizaj, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+stores+in+vertebrate+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Calcium stores in vertebrate photoreceptors.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 740, 873-889 (2012).</li>
<li>Wei, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-driven+calcium+signals+in+mouse+cone+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Light-driven calcium signals in mouse cone photoreceptors.</a> The Journal of Neuroscience. 32, 6981-6994 (2012).</li>
<li>Johnson, J. E. Jr, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+regulation+of+ATP+and+Ca2%2B+dynamics+in+vertebrate+rod+and+cone+ribbon+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Vision%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal regulation of ATP and Ca2+ dynamics in vertebrate rod and cone ribbon synapses.</a> Molecular Vision. 13, 887-919 (2007).</li>
<li>Jeon, C. J., Strettoi, E., Masland, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+major+cell+populations+of+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The major cell populations of the mouse retina.</a> The Journal of Neuroscience. 18, 8936-8946 (1998).</li>
<li>Palmer, A. E., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+calcium+signaling+using+genetically+targetable+fluorescent+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Measuring calcium signaling using genetically targetable fluorescent indicators.</a> Nature Protocols. 1, 1057-1065 (2006).</li>
<li>Paredes, R. M., Etzler, J. C., Watts, L. T., Zheng, W., Lechleiter, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+calcium+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Chemical calcium indicators.</a> Methods. 46, 143-151 (2008).</li>
<li>Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+non-disruptive+technique+for+loading+calcium+buffers+and+indicators+into+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A non-disruptive technique for loading calcium buffers and indicators into cells.</a> Nature. 290, 527-528 (1981).</li>
<li>Hendel, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+changes+of+genetic+calcium+indicators+and+OGB-1+correlated+with+neural+activity+and+calcium+in+vivo+and+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Fluorescence changes of genetic calcium indicators and OGB-1 correlated with neural activity and calcium in vivo and in vitro.</a> The Journal of Neuroscience. 28, 7399-7411 (2008).</li>
<li>Dreosti, E., Odermatt, B., Dorostkar, M. M., Lagnado, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetically+encoded+reporter+of+synaptic+activity+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A genetically encoded reporter of synaptic activity in vivo.</a> Nature Methods. 6, 883-889 (2009).</li>
<li>Mank, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+FRET-based+calcium+biosensor+with+fast+signal+kinetics+and+high+fluorescence+change%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">A FRET-based calcium biosensor with fast signal kinetics and high fluorescence change.</a> Biophysical Journal. 90, 1790-1796 (2006).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+locus+control+region+adjacent+to+the+human+red+and+green+visual+pigment+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A locus control region adjacent to the human red and green visual pigment genes.</a> Neuron. 9, 429-440 (1992).</li>
<li>Connaughton, V. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+retinal+slice+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Zebrafish retinal slice preparation.</a> Methods in Cell Science. 25, 49-58 (2003).</li>
<li>Baden, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tale+of+two+retinal+domains%3A+near-optimal+sampling+of+achromatic+contrasts+in+natural+scenes+through+asymmetric+photoreceptor+distribution%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A tale of two retinal domains: near-optimal sampling of achromatic contrasts in natural scenes through asymmetric photoreceptor distribution.</a> Neuron. 80, 1206-1217 (2013).</li>
<li>Kemmler, R., Schultz, k, Dedek, K., Euler, T., Schubert, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+regulation+of+cone+calcium+signals+by+different+horizontal+cell+feedback+mechanisms+in+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Differential regulation of cone calcium signals by different horizontal cell feedback mechanisms in the mouse retina.</a> The Journal of Neuroscience. 34, 11826-11843 (2014).</li>
<li>Werblin, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmission+along+and+between+rods+in+the+tiger+salamander+retina%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Transmission along and between rods in the tiger salamander retina.</a> The Journal of Physiology. 280, 449-470 (1978).</li>
<li>Euler, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eyecup+scope--optical+recordings+of+light+stimulus-evoked+fluorescence+signals+in+the+retina.+Pflugers+Archive%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Eyecup scope--optical recordings of light stimulus-evoked fluorescence signals in the retina. Pflugers Archive.</a> European Journal of Physiology. 457, 1393-1414 (2009).</li>
<li>Baden, T., Berens, P., Bethge, M., Euler, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spikes+in+mammalian+bipolar+cells+support+temporal+layering+of+the+inner+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Spikes in mammalian bipolar cells support temporal layering of the inner retina.</a> Current Biology. 23, 48-52 (2013).</li>
<li>Breuninger, T., Puller, C., Haverkamp, S., Euler, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatic+bipolar+cell+pathways+in+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Chromatic bipolar cell pathways in the mouse retina.</a> The Journal of Neuroscience. 31, 6504-6517 (2011).</li>
<li>Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+generation+of+Ca2%2B+indicators+with+greatly+improved+fluorescence+properties%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties.</a> The Journal of Biological Chemistry. 260, 3440-3450 (1985).</li>
<li>Thoreson, W. B., Mangel, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lateral+interactions+in+the+outer+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Lateral interactions in the outer retina.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 31, 407-441 (2012).</li>
<li>Trifunovic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cGMP-dependent+cone+photoreceptor+degeneration+in+the+cpfl1+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">cGMP-dependent cone photoreceptor degeneration in the cpfl1 mouse retina.</a> The Journal of Comparative Neurology. 518, 3604-3617 (2010).</li>
<li>Sahaboglu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinitis+pigmentosa%3A+rapid+neurodegeneration+is+governed+by+slow+cell+death+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Disease%22%5BJournal%5D)">Retinitis pigmentosa: rapid neurodegeneration is governed by slow cell death mechanisms.</a> Cell Death & Disease. 4, e488(2013).</li>
<li>Sahaboglu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PARP1+gene+knock-out+increases+resistance+to+retinal+degeneration+without+affecting+retinal+function%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">PARP1 gene knock-out increases resistance to retinal degeneration without affecting retinal function.</a> PloS One. 5, e15495(2010).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Elektrofizyolojik tek hücreli kayıtları veya sentetik floresan göstergeler Ca 2 + görüntüleme kullanarak Önceden var olan protokoller teknik nedenlerle (bkz) bir dizi için fare koni fotoreseptör Ca 2+ dinamiklerini kaydetmek için mücadele ediyoruz. Burada açıklanan protokol Ca 2 + sinyalleri ve verimli ve nispeten basit bir şekilde bireysel, belirlenen fare koni terminalleri bile mutlak Ca 2 + düzeyleri ölçülebilir. Bu protokol zaten başarıyla sağlıklı fare retinadaki koni fonksiyonunun farklı yönlerini ele üç çalışmalarında kullanılmıştır. İlk çalışmada 10 yılında HR2.1: TN-XL fare Ca 2 + biyosensör koni özgü ifadesi engel olmadığını gösteren immünohistokimya, ERG kayıtları, iki foton Ca 2 + görüntüleme ve farmakoloji kullanılarak karakterize edildi koni anatomisi ve işlevi. İkinci çalışmada 21, kromatikve fare koni akromatik tepki özellikleri &quot;yeşil&quot; opsin hakim olduğu dorsal ve &quot;mavi&quot; opsin hakim olduğu ventral fare retina arasındaki koni fonksiyonu çarpıcı farklılıklar gösteren, retina üzerinde haritalanmıştır. Koni özelliklerinde Bu bölgesel farklılıklar fare kozalakları farklı spektral tipi dolayısıyla akromatik zıtlıkların (yakın) en uygun örnekleme sağlamak ve düşündüren, doğal ortamda diferansiyel kontrast dağılımı (yani, toprağa karşı gökyüzü) uyumlu bir sunabilir evrimsel bir avantaj. Koni akson terminalleri yatay hücrelerden aldığınız üçüncü çalışmada 22 karşılıklı geribildirim araştırıldı. Tüm önerilen yatay hücre geribildirim mekanizmaları koni akson terminallerinde 28 voltaj kapılı Ca 2+ kanalları üzerinde hareket gibi, koni terminali Ca 2 + yatay hücre-koni etkileşimleri için bir proxy olarak hizmet verebilir. Kemmler tarafından çalışma 22 destekler coworkersgörünüm yatay hücreler fotoreseptör glutamat salınımını kontrol etmek için çeşitli mekanizmalar içeren karmaşık bir geribildirim sistemi kullanmak olduğunu. Bu çalışmalar, tarif edilen protokol çok yönlülüğünü göstermekte ve bu koni fonksiyonu ve sinaptik devreleri ilgili sorular geniş bir şekilde adapte edilebilir olduğunu göstermektedir. Buna ek olarak, protokol koni fizyolojisinin daha iyi anlama yolunda, farklı koni bölümlerinde yerel Ca 2 + sinyalizasyon okuyan mümkün kılar. Böyle bir bilginin sonunda koniler etkileyen dejeneratif hastalıklar için özellikle potansiyel terapötik yaklaşımların rasyonel gelişimi için izin, dejenere koniler patofizyolojik süreçleri anlamak önemlidir. HR2.1 olarak: TN-XL, fare hattı, Ca 2 + biyosensör dış segmenti hariç olmak üzere, koni boyunca ifade edilir. Bu Ca 2 + dinamik doğrudan ve rasyometrik değerlendirilmesi için bir fırsat sağlarFarklı konik bölümlerinde s. Ca değişim yana dış segmente 2 + akımları membran potansiyeli ve voltaj kapılı Ca + 2 kanal elde edilen aktivasyonu yoluyla terminalleri yansıtılır, dış segmente işlemler dolaylı gözlenebilir. Potansiyel tuzaklar: retina diseksiyonu kritik bir adımdır: Fare, retina genellikle fotoreseptör dış segmentleri ve pigment epiteli arasındaki Göz yuvası ayrılır. Bu nedenle, izole retinanın ışığa duyarlı fotoreseptör dış segmentleri maruz kalır ve mekanik hasarlara karşı son derece duyarlı. Büyük bakım araçları ile fotoreseptör tarafı dokunarak veya yapışkan yüzeyinde yan (örneğin, bir filtre membran) doku taşıyarak zarar vermemeye dikkat edilmelidir. Kaliteli retina dilim onların temiz kesim yüzeyi tarafından mikroskop altında kabul edilebilir veaçıkça tanımlanmış dış kesimleri ile iyi organize fotoreseptör tabakası ile. Dilim kalitesinin Fonksiyonel değerlendirme hızla (- 20 kozalakları 10 ile bir görüş alanı, örneğin), parlak ışık uyaranları yanıp sönen ve duyarlı koni yüzdesi belirlenerek yapılabilir. Burada, tepki kalitesi sinyal-gürültü oranı (S / N) (ışık tepkisi genliği vs ışık uyaran önce bazal gürültü genliği) hesaplanarak değerlendirilmelidir; S / 2 N - 3 minimum eşik olarak kabul edilmelidir. Tipik olarak, biz% 50&#39;den az duyarlı konik dilimleri atın. Ayrıca aşırı spontan spike davranışı (10&#39;a bakınız Şekil 4) atılmalıdır görüntüler kozalakları ile dilimler. Söz konusu anatomik ve fonksiyonel kriterlere uygun kayıt odasında Dilimler 1 için tutarlı tepkiler göstermek - 2 saat (yanıt tutarlılık ile ilgili ayrıntılar için, 10 bakınız). Dilimler saat hayatta Çünkütutma odasına bizimki, başarılı bir deney 6 saat kadar sürebilir. Bu dilimleme kaçınılmaz retina ağlarda yanal bağlantıları koparır olarak koni ve yatay hücreler arasında uzun değişen mekânsal etkileşimleri inceleyerek açısından bazı sınırlamalar vardır dikkat çekicidir. Ancak, 300&#39;e um retina dilim kalınlığını artırarak bu sorunu 22 iyileştirmektedir. Dikey retina dilimlerinin kullanımı, büyük ölçüde (10,21 bkz detaylı bir tartışma için) opsin ağartma önler ve böylece, uyarım lazer ile ışık duyarlı konik dış bölümlerin tarama önler ve. Bununla birlikte, kaydedilen Ca 2 + sinyalleri sadece hafif uyaranlara bağlı değil, aynı zamanda tarama uyarma lazer tarafından oluşturulan bir arka plan aydınlatması bileşeni tarafından etkilenen olsun. Aslında, bu tür iki-fotonlu görüntüleme deneylerde etkili bir arka plan aydınlatması dağınık lazer ışığı, kaydedilen CE tarafından yayılan flüoresans ışınlarının bir kombinasyonu olup,lls ve herhangi bir LED arka plan uyaran bileşeni. Kayıttan önce (çalışır durumda, ışık uyarısının arka bileşenle) lazer taraması 30 s - Bu nedenle, koniler, en az 20 adapte izin verilmelidir. Avantajları ve uygulamalar: Koniler sinyal yolları 2 + Ca doğrulayabilir konik Ca 2 + görüntüleme ile kombinasyon halinde farmakolojik çalışmaları ve şunlar olabilir: Bu koni Ca 2 + -imaging protokolü için bazı uygulamalar 10,21,22, yukarıda tarif edilmiş olsa da, diğer uygulamaları tasavvur edilebilir etkinlik ve Ca farklı oyuncular hedefleme ilaçların gücünü test etmek için kullanılır 2+ 10&#39;a -signaling. Ancak, anahtar uygulama koni işlevini etkileyen hastalıklar incelemek için olabilir. Insan hastalıkları taklit eden pek çok retina dejenerasyonu fare modelleri mevcuttur. Örneğin, koni fotoreseptör kaybı 1 (cpfl 1) fare primer koni dejenerasyon modeli acı olduğunuBir Pde6c mutasyon 29 arasında. Tersine, çubuk dejenerasyon 1 (rd 1) Fare Pde6b mutasyon muzdarip. Bu birincil çubuk fotoreseptör dejenerasyonu, 30 1&#39;de rd 1 çubuk kaybı tamamlandığında, ikincil koni dejenerasyon setleri neden olurken. HR2.1 bu hayvanların melezleme: TN-XL hat okuyan ve hem birincil hem de ikincil koni dejenerasyon Ca 2+ dinamiklerini karşılaştırarak izin ve koni hücre ölümü sırasında Ca 2+ rolüne dair değerli içgörüler sağlamaya muhtemeldir olacaktır. Ayrıca, farmakolojik koni dejenerasyon kaynaklı - örneğin seçici PDE6 inhibitörleri kullanan - koni dejenerasyon 10,29,31 aşağı mekanizmaları tanımlamak için hizmet edebilir. Özetle, protokol burada fare koni fotoreseptör hücre içi bölümlerinde Ca 2 + ölçmek izin verir ve geniş bir yelpazede altında koni fizyolojisini ortaya çıkarmak için büyük fırsatlar sunuyor tariffizyolojik ve patofizyolojik durumların. Buna ek olarak, bu protokol koni Ca 2 + -signaling müdahale ve böylece konik hastalıklar için yeni tedaviler kurmak için tasarlanmış farmakolojik maddelerin taranması için kullanılabilmektedir.

Görüş retina fotoreseptör fototransdüksiyon kaskadının ışık kaynaklı aktive olması ile başlar. Koni fotoreseptör renk ve yüksek çözünürlüklü gündüz vizyon aracılık oysa Rod fotoreseptör, düşük ışık seviyelerinde vizyon sağlar. Birçok fotoreseptör özgü genler bu hücrelerin dejenerasyonuna yol mutasyonlara karşı hassastır. Fotoreseptör kaybı ile ilişkili moleküler belirteçlerin bir dizi 1 tanımlanmıştır, ama şimdiye kadar ayrıntılı moleküler mekanizmaları ve olaylar dizisi belirsizliğini koruyor. Altered Ca2 + homeostazı fotoreseptör hücre ölümü, bir tetik, dejenerasyon süreci 2,3 sırasında Ca aktivitesi 2 + -bağımlı kalpain tip proteazların yukarı regülasyonu ile desteklenen bir hipotez olarak öne sürülmüştür. Ancak, bugüne kadar, bu hipotez Ca 2 + fizyolojik ölçümleri ile desteklenmemektedir. Re Ca 2+ kanal blokerleri etkisi üzerinde çeşitli çalışmalarda tutarsızlıklarintestinal hastalıklar daha doğrudan memeli koni fotoreseptör Ca 2+ değerlendirmek için yöntemler çağrısında hücre ölümü 4-6 Ca 2+ katılımı meydan okudu. Daha önce, en elektrik kayıt ve Ca 2+ görüntüleme çalışmaları nedeniyle koni 7-9 daha kolay erişim kurbağa ve sürüngen modellerinde yapılmıştır. Ancak, memeli fotoreseptör fizyolojisi olmayan memelilerde 10, özellikle de bu farklı olabilir, insan kalıtsal retinal dejenerasyon bağlamında memeli fotoreseptör fizyolojisi hakkında daha iyi bir anlayış yenilikçi tedavilerin geliştirilmesi için bir anahtardır. İnsan retina hastalıkları taklit eden pek çok fare modelleri mevcuttur, ancak küçük fare konileri 11 Ca 2+ dinamikleri hakkında bilinmektedir. Elektrik teknikler, özellikle olmayan farelerde,, koni yüksek verimli kayıtlar için uygun değildir burada çubuklar (~% 97) önemli ölçüde koni (~% 3) sayıca 12 </s&gt; yedekleyin. Ayrıca, bu tür tüm hücre yama-kelepçe kayıtları gibi hassas elektrofizyolojik teknikler, hücre içi ortamını rahatsız ve mutlak hücre içi Ca + 2 konsantrasyonları Ca 2+ akımlar veri değil sağlar. Koni Ca 2 + dinamikleri hakkında sorular ele alırken Dolayısıyla, alt temporal çözünürlük rağmen, görüntüleme tercih edilen bir yöntemdir. görüntüleme ile önemli bir konu seçici bir floresan Ca 2 + göstergesi boya ile kozalakları etiketlemek için nasıl. Uygun bölmelere ve hücre özgüllüğü dokuya &quot;toplu yükleme&quot; sentetik Ca 2 + göstergesi boyalarla elde etmek zordur. Sonuç olarak, etiketli kozalakları olarak 13,14 çubukları ve Müller glial hücreler güvenilir ayırt edilemez. Ayrıca, sentetik boyalar tutarlı şartlar altında uzun süreli kayıtları önlenmesi, hücre dışına sızıntı eğilimindedir. O de gerektirir Dahası, onların AM-ester formunda sentetik Ca 2 + göstergeleri yükleme, sorunluTERGENTR (örneğin, DMSO) ve formaldehit 15 oluşturur. Mutlak Ca 2 + ölçümler için, rasyometrik göstergeler zorunludur. Ancak, en iyi mevcut sentetik rasyometrik göstergesi Fura-2 şiddetine bağlı olarak, kendi içinde koniler uyarır ve bu şekilde çalışmaları engelleyebilir, 760 nm ile 700 aralığında uyarma ışık (iki foton uyarılması için) gerektirir koni Ca fizyolojik aydınlatma koşullarında 2+ dinamiği. Sentetik boyalar farklı olarak, genetik olarak kodlanmış Ca2 + göstergeleri bir hücre tipine seçici biçimde ifade edilebilir. Onlar hücre dışına sızıntı yok ve ağartma kaçınılması, bu nedenle, uzun süreli ve güvenilir rasyometrik ölçümler mümkündür. İki foton mikroskopi ile kombine edildiğinde Hücre tipi seçici Ca 2 + biyosensörler ifadesi, büyük ölçüde fizyolojik şartlar altında 13,16,17 Ca 2 + değerlendirmek ve hücre içi çalışmak için güçlü bir araç temsil </&gt; sup. Burada, biz ışık uyaran-uyarılmış koni Ca incelemek için bir protokol açıklar transgenik Ca 2 + biyosensör fare hattında 2+ dinamiği: FRET tabanlı Ca 2 + biyosensör TN-XL 18 ifade (HR2.1 TN-XL), seçici koniler, insan kırmızı opsin promotör HR2.1 19 altında. Koni terminallerini erişmek için, ex-vivo dilim hazırlık 20 kullanılmıştır. protokol zaten başarıyla sağlıklı farelerde 10,21,22 koni fonksiyonu üç çalışmalarında kullanılmıştır. Ayrıca, protokol koni Ca okuyan sağlar 2+ örneğin spesifik genetik koşullarda sinyalizasyon, HR2.1 ile kalıtsal retina dejenerasyonu için fare modelleri melezleme yoluyla: TN-XL fareler.

<table><tbody><tr><td>Yüksek vakumlu gres</td><td>Dow Corning</td><td>1018817</td><td><a href="http://www.dowcorning.com/">http://www.dowcorning.com</a></td></tr><tr><td>Kapak fişleri</td><td>R. Langenbrinck</td><td></td><td>24 x 60 mm; 

<a href="http://www.langenbrinck.com">http://www.langenbrinck.com</a></td></tr><tr><td>Cam slaytlar</td><td>R. Langenbrinck</td><td></td><td>76 x 26 mm; 
<a href="http://www.langenbrinck.com">http://www.langenbrinck.com</a></td></tr><tr><td>Doku doğrayıcı için bıçaklar</td><td>MARTOR KG</td><td>ARGENTAX No. 1044</td><td>0,25 mm; 

<a href="http://www.martor.de">http://www.martor.de</a></td></tr><tr><td>Doku doğrayıcı</td><td>Özel yapım</td><td></td><td>F. Werblin23 tarafından tasarlanan bir tasarıma dayalıdır, T. Schubert tarafından</td></tr><tr><td>uyarlanmıştır Nitroselüloz filtre membranı ızgaralı</td><td>Merck Millipore AABG01300</td><td></td><td>Filtre tipi: 0,8 ve mikro; m;

<a href="http://www.emdmillipore.com">http://www.emdmillipore.com</a></td></tr><tr><td>Isoflurane CP</td><td>CP pharma</td><td>AP/DRUGS/220/96<</td><td>a href="http://www.cp-pharma.de/">http://www.cp-pharma.de</a></td></tr><tr><td>UV/yeşil LED tabanlı tam alan stimülatörü</td><td>Özel yapım</td><td></td><td>Ayrıntılar için bkz10</td></tr><tr><td>Açık kaynaklı mikroişlemci kartı</td><td>Arduino</td><td></td><td><a href="http://www.arduino.cc/">http://www.arduino.cc</a></td></tr><tr><td>Görüntüleme yazılımı CfNT</td><td>Özel olarak yazılmış</td><td></td><td>, Michael M&uuml tarafından geliştirilen; ller, Tıbbi Araştırma için MPI, Heidelberg, Almanya</td></tr><tr><td>IgorPro</td><td>Wavemetrics</td><td></td><td><a href="http://www.wavemetrics.com/">http://www.wavemetrics.com</a></td></tr><tr><td>VC3-4 Sistemi fokal perfüzyon sistemi</td> 100 &mu ile <td>ALA Bilimsel Alet</td><td></td><td>; m çaplı uç manifoldu; 

<a href="http://www.alascience.com/">http://www.alascience.com/</a></td></tr><tr><td>Mai Tai HP DeepSee (Ti:Safir lazer)</td><td>Newport Spectra-Physics</td><td></td><td><a href="http://www.spectra-physics.com/">http://www.spectra-physics.com</a></td></tr><tr><td>Hareketli objektif mikroskobu (MOM), W. Denk, MPImF, Heidelberg, Almanya tarafından tasarlanmıştır</td><td>Sutter Instruments</td><td></td><td><a href="http://www.sutter.com/MICROSCOPES/index.html">http://www.sutter.com/MICROSCOPES/index.html</a></td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>XLUMPlanFL 20X/0.95w objektif</td><td>Olympus</td><td></td><td><a href="http://www.olympusamerica.com/">http://www.olympusamerica.com</a></td></tr><tr><td>Vaporizer 100 serisi</td><td>Surgivet<</td><td></td><td>a href="http://www.surgivet.com/ ">http://www.surgivet.com</a></td></tr><tr><td>İyonomisin, Kalsiyum tuzu</td><td>Yaşam teknolojileri</td><td>I24222</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com/">http://www.lifetechnologies.com</a></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3889</td><td><a href="https://www.sigmaaldrich.com/">https://www.sigmaaldrich.com</a></td></tr><tr><td>Dimetil sülfoksit (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>101191250</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/">http://www.sigmaaldrich.com</a></td></tr><tr><td>Leica MZ95</td><td>leica microsystems</td><td></td><td><a href="http://www.leica-microsystems.com/">http://www.leica-microsystems.com/</a></td></tr></tbody></table>

görüntüleme ca<sup&gt; 2+</supfare retina koni fotoreseptör akson terminalleri içinde&gt; dinamikleri

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

Retina koni fotoreseptör (koni) günışığı vizyon hizmet ve renk ayrımcılığı temelini oluşturur. Bunlar genellikle çok sayıda retinal hastalıklarda körlüğe yol açan, dejenerasyon tabidir. Kalsiyum (Ca2 +), fotoreseptör sinyal ve metabolizmada önemli bir ikinci mesajcı dolaylı çeşitli hayvan modellerinde fotoreseptör dejenerasyonu ile bağlantılı olduğu ileri sürülmüştür. Sistematik koni fizyolojisinin bu yönlerini incelemek ve patofizyolojisi elektriksel retina çubuk fotoreseptör hakimdir fare, özellikle bu küçük hücrelerden kayıt zorluklar tarafından engellenmiştir. Bu sorunu aşmak için, biz kozalakları münhasıran genetik olarak kodlanmış Ca 2 + biyosensör TN-XL ifade ve fotoreseptör dejenerasyonu için fare modelleri ile melez edilebilir transgenik fare hattı kullanarak bir iki foton Ca 2 + görüntüleme protokolü kurdu. Burada açıklanan protokol dikey kesitler hazırlamak üzere şunları içerir: (R,20, fareler ve koni Ca 2 + seviyesinde hafif uyarıcı uyarılmış değişikliklerin optik görüntüleme gelen retina dilim &quot;). protokol aynı zamanda mutlak Ca 2 + konsantrasyonları &quot;in dilim Ölçümü&quot; sağlar; kayıtları kalibrasyon takip edilebilir. Bu protokol, fonksiyonel koni özellikleri içine çalışmalar sağlar ve koni anlayışı Ca 2 + sinyalizasyon yanı sıra fotoreseptör ölümü ve retina dejenerasyonu Ca 2+ potansiyel tutulumuna katkıda bulunması beklenmektedir.

Dikey dilimleri HR2.1 hazırlanan (Şekil 1) birleştirerek: İki foton görüntüleme (Şekil 2) ile TN-XL fare retinanın, biz koni fotoreseptör akson terminallerinde ışık uyaran-uyarılmış Ca 2 + sinyalleri rasyometrik ölçümler yapmak başardık . Bu yaklaşım erişme ve sentetik Ca 2 + göstergeleri ile önceden varolan optik görüntüleme yöntemleri üzerinde fare konileri görselleştirme önemli bir gelişmeyi temsil eder. Örneğin, genetik olarak kodlanmış rasyometrik Ca koni özgü anlatım 2+ biyosensör TN-XL ölçüde koni akson terminallerinin kimlik (Şekil 3A ROI bakınız) kolaylaştırdı. Bu nedenle, bizim protokol hem koni ve çubuk akson terminalleri katkılarıyla örnek &quot;karma&quot; sinyalleri olarak, belirsiz kökenli kayıt sinyallerinin riskini ortadan kaldırır. Bizim yaklaşımımız Indivi düzeyinde tek deneme yanıtları çözme veriyorÇift koni akson terminali. Koni terminalden Ca 2 ışık uyarılmış ekstrüzyon artış ve verici ve alıcı floresan sırasıyla (Şekil 3B), bir azalma ile işaretlenir. Flüoresans oranı (R) azalma koni ve voltaj kapılı Ca + 2 kanal daha sonra kapağın ışık kaynaklı hiperpolarizasyon kaynaklanan konik ucu (Şekil 3C), Ca ekstrüzyonu 2 + karşılık gelir. Birkaç koni akson terminalleri (Şekil 3A) aynı anda izlenebilir Çünkü, veri toplama çok verimli ve koni Ca 2+ yanıtları yüzlerce tek bir deneyde toplanabilir. (Şekil 4) kantitatif bu yanıtları değerlendirerek, koni Ca 2 + sinyalleri karşılaştırılabilir ve koşullar (Tartışma) aralığında değerlendirilmiştir. Bu FRET-alıcısı (sitrin) ve -donor (eCFP) floresan arasındaki oranı kullanmak genellikle yeterli olurHücre içi Ca 2 + seviyesinin göreceli bir önlem olarak; (F A / F D detaylar için, 3.4 bakınız). Oysa, gerektiğinde, bu oran mutlak hücre içi Ca 2 + konsantrasyonları ([Ca 2 +]) (Şekil 5) elde etmek için kalibre edilebilir. Bu protokolde kullanılan arka plan aydınlatması At (detaylar için, bkz 10&#39;a ve Şekil 3 efsane), kalibrasyon [Ca 2 +] in &quot;vahşi tip&quot; HR2.1 dinlenme mutlak bir tahmin vermiştir: TN-XL fare koni terminalleri 243 ± 159 literatür 11 fareleri için aralığında nM (ortalama ± SD). <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/52588/52588fig1.jpg" /> Dikey retina dilim 1. Hazırlık Şekil. Retinanın (A) İzole ve retina dilimleme için hazırlanan basık. (B) Dikdörtgen parça (lerdilimleme sonra filtre kağıdı membran (koyu gri) üzerine monte edilmiş) A kırmızı kutu ee. (C) gres kullanarak bir cam lamel sabit zar monte retina dilim Üst görünümü. (D) retina dilim bir kısmının şematik çizimi (C kırmızı kutuya bakın). Koni fotoreseptör yeşil gösterilir. V, ventral; D dorsal; N, nazal; T, zamansal; OS dış segment; ONL, dış nuklear tabaka; OPL, dış pleksiform tabakasını içermektedir; INL, iç nuklear tabaka; IPL, iç pleksiform tabakası; GCL, ganglion hücre tabakası. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52588/52588fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/52588/52588fig2.jpg" /> Retina dilim Şekil 2. İki foton görüntüleme: Kayıt yapılandırma İllüstrasyon Üst:. Su daldırma objektif lens odaklama olacakTarama retina içine lazer (kırmızı aşağı ok) ve yayılan floresan (yukarı oklar) toplama am. objektif bir CCD kamerası kullanılarak bir dilim görüntülerken, belirli bir kondansatör altına monte edilmiş bir LED aydınlatma kızılötesi ışık iletilir toplar geçin.:., hücre dışı çözelti ile kayıt odasına monte edilir ve perfüze Retina dilim Alt: Kondenser mercek stimülasyon LED&#39;lerden gelen ışık odaklama (ve CCD kamera görüntüleme kızılötesi LED) retina dokusu içine kayıt odasının şeffaf altından geçerek. IR LED, kızılötesi ışık yayan diyot; CCD, şarj-kuplajlı aygıt; BP, bant geçiren. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52588/52588fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/52588/52588fig3.jpg" /> Şekil 3. Işık EvokeFare koni Fotoreseptörlerin akson terminallerinde d Ca 2+ cevapları. (A) Sol: Kayıtlar retina dilimleri koni fotoreseptörlerin (yeşil) sinaptik terminalleri (kırmızı kutu) üzerinde duruldu Sağ:. Örnek Kaydedilen bölge için 7 ayrı terminaller. Floresan iki kanal kullanılarak kaydedildi:. (; 535 BP 50 üst) ve FRET-verici eCFP için bir tane (alttan; 480 BP 32) FRET-alıcı sitrin için bir (B) sitrin Işık uyarılmış değişiklikler (F A) ve eCFP (F D) floresan tek ROI kaydedildi. (C) Ca 2+ yanıtları 5 sn aralıklarla 1 sn parlak ışık yanıp söner bir dizi için bir koni terminalinin (oran F A / F D gibi). ROI, ilgi bölgesi; BP, bant geçiren filtre; F, floresan yoğunluğu; keyfi birimler, au; FRET, Förster rezonans enerji transferi; eCFP, mavi floresan proteinin geliştirilmiş. Uyaran yoğunluğu (p. 13,0 ve bir arka plan düzeye ekleyerek sırasıyla M- ve S-opsins için 12.8, (içinde ~ 10 = LED&#39;ler kapalı, uyarma lazer tarama): 10 3 · P · s -1) koni başına içinde otoğraf-izomerizasyon oranı <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52588/52588fig3large.jpg" target="_blank">tıklayınız Burada bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için.</a> <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/52588/52588fig4.jpg" /> Işık uyarılmış koni Ca 2+ yanıtların Şekil 4. örnek olarak kantitatif analiz (A) tek bir koni terminalden (Ír gibi) Işık uyarılmış Ca 2 + yanıtları (tek denemeler: gri izleri, n = 16; ortalama:. Siyah iz ) (B) Parametreler ortalama Ca 2 + yanıtı için belirlenen:. önce ışık uyarısına bazal temsil eden) Ca 2 + seviyesi (R tabanını İstirahat, yanıt boyutu ar olarakEA-altında-eğrisi% 80 (R, A) ve tepe genliği (R amp), yanıt başlangıç ​​kinetikleri (t yükselmesi R amp% 20 ila% 80 arasında bir zaman aralığı) ve çıkıntı (t çürüme, zaman aralığı R amp% 20) kadar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52588/52588fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/52588/52588fig5.jpg" /> Şekil 5. mutlak Ca 2 + konsantrasyonu tahmin. Dinlenme Ca 2 + konsantrasyonu ([Ca 2 +] oran F A / F D gibi) TN-XL fare 8 koni akson terminallerinde kaydedilen (çevrelerin, SD ± ortalama) Farklı hücre dışı solüsyonlar için: iki kez standart bir hücre dışı ortamda (Ctrl 1 ve 2), daha sonra en az (&quot;sıfır&quot;), [Ca2 +] (10 mM EGTA) ANYüksek [Ca 2 +] (2.5 mM) ile d dışı ve hücre içi Ca 2 + dengelenmeye iyonomisin 5 mcM varlığında son iki koşul. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52588/52588fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Biz fare retinanın ex-vivo dilim hazırlık kullanarak koni fotoreseptörlerin akson terminallerinde Ca 2 + dinamiklerini izlemek için bir protokol açıklar. Bu protokol önemli bir memeli model sisteminde koni Ca 2 + sinyalizasyon kapsamlı çalışmalar, fare verir.

Görüntüleme Ca<sup&gt; 2+</supFare Retina Koni fotoreseptör Akson Terminalleri içinde&gt; Dinamikleri

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to ...

Bu prosedürün genel amacı, floresan bir biyosensör kullanarak fare retinasındaki koni fotoreseptörlerinden ışık stimülasyonu ile uyarılan kalsiyum sinyallerini kaydetmektir. Bu işlem, genetik olarak kodlanmış kalsiyum sensörünü yalnızca koni fotoreseptörlerinde eksprese eden transgenik bir fare hattından retinanın izole edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım ise retinal dokunun dikey kesitlerinin alınmasıdır.Ardından, retinal kesitler lameller üzerine monte edilir ve iki fotonlu bir mikroskobun altına yerleştirilir. Son adım, ışık stimülasyonuna yanıt olarak koni fotoreseptörlerinin bireysel sinaptik terminallerinden kalsiyum sinyallerinin kaydedilmesidir. Nihayetinde, kaydedilen kalsiyum sinyalleri çevrimdışı olarak analiz edilir.Bu yöntemle, birçok mısır gıda reseptörünün aktivitesini hücre altı çözünürlükte eş zamanlı olarak kaydedebiliriz. Bu, daha zor ve zaman alıcı olan elektriksel tek hücre kayıtları gibi mevcut tekniklere göre temel avantajdır. Dolayısıyla, yanıtlamak istediğimiz soru, kalsiyumun fotoreseptör dejenerasyonuna katılıp katılmadığı ve katılıyorsa bunun nasıl olduğudur.Bu yöntem, kalsiyum girişinin fotoreseptör dejenerasyonunu tetikleyip tetiklemediğini veya bunun hücrenin ölmekte olmasının bir sonucu olup olmadığını belirlememize olanak tanır. Genel olarak, bu yöntemde yeni olan kişiler, retinal ışık duyarlılığının korunması gerektiği ve bu nedenle retina diseksiyonu ve dilimleme dahil tüm hassas adımların yeşil veya kırmızı ışık altında gerçekleştirilmesi gerektiği için temel olarak zorluk yaşayacaklardır. Bu prosedüre başlamak için, bir fare göz küresini taze olarak karbondioksit ile oksijenlendirilmiş hücre dışı solüsyon içeren bir Petri kabına aktarın.Kornea ile sklera arasındaki sınır boyunca herhangi bir noktadan göz küresini keskin bir enjeksiyon iğnesiyle delin. Ardından, gözü sklera kısmından bir pensle tutun ve makasın bir ucunu nazikçe deliğe yerleştirin. Gözün ön kısmını göz çukurundan ayırmak için ora serrata boyunca kesin.Ardından, retinadaki dorsal pozisyonu belirtmek için kalemle işaretlenen konumdan göz çanağını radyal olarak kesin. Sonra, dorsal kesi dışarıya bakacak şekilde göz çanağını konumlandırın. Pens uçlarını retina ile sklera arasına yerleştirerek göz çanağının sol ve sağ tarafındaki sklerayı kavrayın.Ardından, iica'nın sklera kısmını nazikçe ters çevirerek retinayı ayırın. Son olarak, retinayı skleradan serbest bırakmak için optik siniri kesin. Retinanın kenarını bir pensle tutun ve ikinci bir pens kullanarak retinal yüzeydeki kalıntıları ve vitreus cismini nazikçe temizleyin.Retina yüzeyi temiz olduğunda, üç adet daha kısa radyal kesi yapın. Şimdi, bir lamı dokuya yakın bir şekilde hücre dışı çözeltiye yavaşça daldırın. Mekanik hasarı ve dokunun katlanmasını azaltmak için kenarından tutarak retinayı, gangliyon hücresi tarafı yukarı gelecek şekilde nazikçe lamın üzerine çekin.Ardından, kavisli bir bistüri ucu kullanarak seçilen retinal bölgeden yaklaşık bir çarpı iki milimetrelik bir dikdörtgen kesin ve doku etrafındaki fazla solüsyonu silin. Daha sonra, ganglion hücresi tarafı membrana yapışacak şekilde, önceden hazırlanmış nitroselüloz fiber membranı retina parçasının üzerine yerleştirin. Dokunun membrana sıkıca tutunması için membran üzerine hemen bir damla hücre dışı ortam ekleyin.Membran üzerine monte edilmiş retinal dokuyu, taze hücre dışı çözelti içeren dilimleme haznesine aktarın. Ardından retinayı 200 µm kalınlığında dikey dilimler halinde kesin. Bir doku doğrayıcı kullanarak, membran üzerine monte edilmiş tek bir dilimi, yüksek vakum gresi ile önceden hazırlanmış bir lam üzerine yapıştırın.Cam yüzeyi retinanın altında tutun ve yağdan arındırın. Ardından, oda sıcaklığındaki tutma odasında monte edilmiş her bir lam üzerindeki kesite bir damla hücre dışı solüsyon ekleyin. Tutma odasındaki atmosferi nemli tutmak için küçük bir su rezervuarını kabarcıklandırarak odaya karbogen verin.Dilimlerin kayıt odasına tek tek aktarılmadan önce bekleme odasında 10 ila 15 dakika dinlenmesini sağlayın. Bekleme odasından bir dilimi kayıt odasına aktarın ve hemen karbonatlı hücre dışı solüsyon ile perfüzyona başlayın. İki mililitre/dakika perfüzyon akış hızını ve 37 °C sıcaklığı koruyun.Kayıt odasında. 20 x 0,95 NA su daldırma objektifi ve kayıt odasının altında bulunan bir kızılötesi LED ile birlikte bir CCD kamera kullanın. Retinal kesiti konumlandırmak için, üreticinin belirttiği şekilde iki foton görüntüleme sistemini başlatın.Ardından, lazeri açın ve 860 nanometreye ayarlayın. ECFP ve sitrin floresan görüntüleme için iki deteksiyon kanalını açın. Sonrasında, görüntüleme yazılımını kullanarak, kayıt için bir sıra koni terminalini tarayıp seçmek üzere iki foton mikroskobunu kontrol edin; görüntü alımını 128 x 16 piksellik görüntülere veya benzer bir konfigürasyona ayarlayın, dış segmentlerdeki fotopigmentlerin ağarmasını önlemek için taranan alanı koni terminalleriyle sınırlandırın.Lazeri açın. Işık stimülasyonları sunmadan veya farmakolojik ajanlar uygulamadan önce, konilerin tarama lazerine ve stimülasyon arka plan ışığına adapte olması için 20 ila 30 saniye bekleyin. Şimdi belirlenen stimülasyonların sunumuna başlayın.Stimülasyonlar, özelleştirilmiş bir yazılım tarafından kontrol edilen bir mikroişlemci kartı kullanılarak, iki LED'in yoğunluğunun zamanla modüle edilmesiyle oluşturulur. Ardından, ilgili görüntüleme yazılımı kullanılarak iki floresan kanalı eş zamanlı olarak kaydedilmeye başlanır. Kayıtlar, retinal kesitlerdeki koni fotoreseptörlerinin sinaptik terminallerine odaklanmıştır.Bu, yedi ayrı terminalin bulunduğu kaydedilmiş bir bölge örneğidir. Floresans, biri fre scepter citrine ve diğeri fret donörü ECFP için olmak üzere iki kanal kullanılarak kaydedilmiştir. Burada, tek bir ilgi alanında kaydedilen citrine ve ECFP floresansındaki ışıkla uyarılan değişimler gösterilmektedir.Burada, beş saniyelik aralıklarla uygulanan bir saniyelik bir dizi parlak ışık flaşına karşı bir koni terminalinin kalsiyum yanıtları yer almaktadır. Bu şekil, ışıkla uyarılmış koni kalsiyum yanıtlarının örneklem nicel analizini göstermektedir. Ve burada, tek bir koni terminalinden elde edilen ışıkla uyarılmış kalsiyum yanıtları görülmektedir.Bu şekil, ortalama kalsiyum yanıtının belirlenmesini göstermektedir. Dinlenme kalsiyum seviyesi, ışık stimülasyonu öncesindeki baz çizgiyi temsil eder ve yanıt büyüklüğü, dinlenme kalsiyum seviyesi ile pik genlik arasındakı ve yanıtın başlangıç ile bitiş kinetikleri arasındaki alan olan ra'dır. Bu prosedür daha da genişletilebilir.Örneğin, adaptasyon gibi çeşitli farmakolojik ve güçlü stimülasyon koşullarını araştırmak veya fototransdüksiyonun farklı aşamalarını ayrıntılı olarak incelemek için fotoreseptör kalsiyum sinyalleri belirleyici olabilir. Bu teknik, normal fizyolojik koşullar altında koni fotoreseptörlerindeki kalsiyum dinamiğinin incelenmesine olanak tanır. Bu durum, akrotopi veya retinitis pigmentosa gibi insanlarda körlüğe yol açan hastalıklardaki birincil ve ikincil koni fotoreseptör dejenerasyonunun anlaşılması açısından özellikle önemlidir.

imaging-ca2-dynamics-cone-photoreceptor-axon-terminals-mouse

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Biz bir emme elektrot kullanarak tek bir fare kozalakları flaş cevaplarını kaydetmek için nasıl gösterecektir.

Tek hücreli fare Koni fotoreseptörlerin Emiş Kayıtlar

Biz sağlam fare retinadan çubuk ve koni photoresponses elde etmek için transretinal elektroretinogram (ERG) kayıtları nispeten basit bir yöntem sunduk. Bu yaklaşım ışığında cevaplar ayırmak ve izole düz monte retina arasında yer alan elektrotlar kullanarak bunları kaydetmek için fotoreseptör gelen sinaptik iletim bloğu yararlanır.

Fare Retina gelen Transretinal ERG Kayıtlar: Rod ve Koni Photoresponses

Kaynak: Wang, Z.,  et al. Transpupiller İki Fotonlu Fare Retinasının İn Vivo Görüntülemesi.  J. Vis. Uzm. (2021). Bu video, iki foton mikroskobu kullanılarak in vivo retinal görüntüleme için bir tekniği göstermektedir. Anestezi uygulanmış fareler, başlarını sabitleyerek, göz kayganlaştırıcı uygulayarak ve gözün üzerine bir lamel yerleştirerek görüntülemeye hazırlanır. Floresan proteinleri eksprese eden retinal ganglion hücreleri (RGC'ler) ilk olarak hizalama için epifloresan kullanılarak...

Fare Retinasının İki Fotonlu İn Vivo Görüntülemesi

Kaynak: Kulkarni, M. et al. Fare retinasının koni fotoreseptörü akson terminallerinde Ca2+ dinamiği. J. Vis. Uzm. (2015)Bu video, transgenik bir fare retinasının koni fotoreseptörlerindeki kalsiyum dinamiklerini izlemek için iki foton mikroskobunun kullanımını göstermektedir. Arka plan aydınlatması ve ışık stimülasyonu altında kalsiyum seviyelerini ölçmek için retina dilimleri hazırlama, FRET tabanlı kalsiyum biyosensörlerini görüntüleme ve floresan değişikliklerini analiz etme adımlarını ana...

Fare Retina Koni Fotoreseptörlerinde Kalsiyum Dinamiğini İzlemek için İki Foton Mikroskobu

Bu video, Thy1-GFP transgenik hattında in vivo iki foton mikroskobu kullanılarak fare retrosplenial korteksindeki nöronların kronik olarak görüntülenmesine izin veren kraniyotomi prosedürünü göstermektedir. Bu yaklaşım, mCherry eksprese eden adeno ilişkili virüsün dorsal hipokampusa enjeksiyonu ile birleştirilir. Bu teknikler, RSC'de deneyime bağlı yapısal plastisitenin uzun süreli izlenmesine izin verir.

Eşzamanlı İki foton<em&gt; İn Vivo</em&gt; Fare Retrosplenial kortekste sinaptik Girişlerin Görüntüleme ve postsinaptik Hedefler

Bu protokolü nasıl yüksek çözünürlüklü spektral etki alanı optik Koherens tomografi gibi görüntüleme teknikleri açıklar ve lazer ophthalmoscopy tarama bir oftalmik görüntüleme platformu üzerinde bilgi edinme sistemiyle küçük Rodents yararlı olabilir dağıtım, hücre sırasıyla retina kalınlığı ve mikroglial.

Vivo Tayf alanlı optik Koherens tomografi ve lazer Ophthalmoscopy tarama Cx3cr1gfp/gfp muhabir farelerin görüntüleme

İn vivo görüntüleme, sağlık ve hastalıkta biyoloji çalışmaları için güçlü bir araçtır. Bu protokol, standart iki foton mikroskobu ile fare retinasının transpupiller görüntülemesini tanımlar. Ayrıca, retinanın birden fazla hücresel kohortunu floresan olarak etiketlemek için farklı in vivoimaging yöntemleri göstermektedir.

Transpupiller İki Foton Fare Retinasının In vivo Görüntülenmesi

Burada, uyanık farelerde mikroglial dinamiklerin ve nöronal aktivitenin eşzamanlı görüntülenmesi için adeno ilişkili virüs enjeksiyonunu kraniyal pencere implantasyonu ile birleştiren bir protokolü tanımladık.

Uyanık Farelerde Mikroglial Dinamiğin ve Nöronal Aktivitenin Eşzamanlı Görüntülenmesi

Mevcut protokol, gıda sargısı, şeffaf silikon ve kapak camı kullanarak büyük (6 x 3 mm2) bir kafatası penceresi yapmayı açıklamaktadır. Bu kafatası penceresi, aynı farede in vivo geniş alan ve iki fotonlu kalsiyum görüntüleme deneylerine izin verir.

İn Vivo Büyük Bir Kraniyal Pencere Kullanarak Bir Fareden Geniş Alan ve İki Foton Kalsiyum Görüntüleme

Bu protokol, vahşi tip farelerde korteksi bozulmadan bırakırken iki foton mikroskobu ile tek nöron aktivitesinin görüntülenmesi ve kısmi korteks mutant farelerde geniş alan mikroskobu ile tüm SC'nin görüntülenmesi dahil olmak üzere, uyanık farelerin superior colliculus'unda (SC) kalsiyum yanıtlarını görüntüleme prosedürünü detaylandırır.

Fare Superior Colliculus'ta Kalsiyum Görüntüleme

Bu çalışma, farelerin ön pençe derisindeki düşük eşikli mekanoreseptör (LTMR) akson terminallerinin görselleştirilmesi için in vivo iki fotonlu görüntüleme yaklaşımını sunmaktadır. Bireysel aksonların tekrarlanan, yüksek çözünürlüklü görüntülemesi kullanılarak, bu yöntem gelişim sırasında ve yetişkinlerde deri duyusal devresinin yapısı ve işlevini incelemek için yeni bir platform sağlar.

Fare Derisindeki Dokunma Duyusal Akson Morfolojisinin İntravital İki Fotonlu Görüntülemesi

Öğrenin, fare retinasında koni fotoreseptörlerinin akson uçlarında Ca²⁺ dinamiklerini görüntülemek için iki foton mikroskobu kullanarak ışık uyarılı kalsiyum sinyallerini nasıl kaydedeceğinizi. Bu yöntem, fotoreseptör dejenerasyonunda kalsiyumun rolünü incelemeyi kolaylaştırır.

Görüntüleme Ca

Daha fazla video keşfet