Görüntüleme Ca ^{2+ Dinamikleri}

Bu prosedürün genel amacı, bir floresan biyosensör kullanarak fare retinasındaki koni fotoreseptörlerinden gelen ışık uyaranıyla uyarılan kalsiyum sinyallerini kaydetmektir. Bu, retinanın, yalnızca koni fotoreseptörlerinde genetik olarak kodlanmış kalsiyum sensörünü ifade eden transgenik bir fare hattından izole edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, retina dokusunun dikey dilimlerini kesmektir.

Daha sonra, retina dilimleri lamel astarlara monte edilir ve iki fotonlu bir mikroskop altına yerleştirilir. Son adım, ışık stimülasyonuna yanıt olarak koni fotoreseptörlerinin bireysel sinaptik terminallerinden gelen kalsiyum sinyallerini kaydetmektir. Sonuç olarak, kaydedilen kalsiyum sinyalleri çevrimdışı olarak analiz edilir.

Bu yöntemle, birçok mısır gıda reseptörünün aktivitesini aynı anda hücre altı çözünürlükte kaydedebiliriz. Bu, daha zor ve zaman alıcı olan elektrik, tek hücreli kayıtlar gibi mevcut tekniklere göre en büyük avantajdır. Bu yüzden ele almak istediğimiz soru, kalsiyumun fotoreseptör dejenerasyonunda rol oynayıp oynamadığı ve nasıl rol oynadığıdır.

Bu yöntem, kalsiyum akışının fotoreseptör dejenerasyonuna neden olup olmadığını veya hücrenin ölmekte olduğu gerçeğinin bir sonucu olup olmadığını belirlememizi sağlar. Genel olarak, bu yönteme yeni başlayan bireyler, esas olarak retina ışığına duyarlı haftalık olarak korunmaları gerektiğinden ve bu nedenle retina, diseksiyon ve dilim iyonu dahil olmak üzere tüm hassas adımların yeşil kırmızı ışık altında gerçekleştirilmesi gerektiğinden mücadele edeceklerdir. Bu işleme başlamak için, bir fare göz küresini taze karbonhidratlı oksijenli hücre dışı çözelti içeren bir Petri kabına aktarın.

Göz küresini kornea ve sklera arasındaki sınır boyunca herhangi bir noktada keskin bir enjeksiyon iğnesi ile delin. Daha sonra, bir çift forseps ile gözü sklerada tutun ve yavaşça bir makas bıçağını deliğe sokun. Gözün ön kısmını göz kabından ayırmak için aura serratasını kesin.

Ardından, retinadaki dorsal pozisyonu belirtmek için göz kabını kalem işaretinin konumunda radyal olarak kesin. Ardından vizör lastiğini, sırt kesimi uzağı gösterecek şekilde yerleştirin. Forseps uçlarını retina ve sklera arasına sokarak göz kabının sol ve sağ tarafındaki sklerayı tutun.

Daha sonra, iica'nın skleral kısmını nazikçe ters çevirerek retinayı ayırın. Son olarak, retinayı skleradan kurtarmak için optik siniri kesin. Retinanın kenarını bir çift forseps ile tutun ve ikinci bir forseps çifti kullanarak retina yüzeyindeki kalıntıları ve vitreus gövdesini nazikçe temizleyin.

Retina yüzeyi temiz olduğunda, üç ek kısa radyal kesim yapın. Şimdi yavaşça bir cam slaytı dokuya yakın hücre dışı çözeltiye daldırın. Dokunun mekanik hasarını ve katlanmasını azaltmak için kenarı tutarak retinayı bir ganglion hücresi tarafı yukarı bakacak şekilde cam slayt üzerine nazikçe çekin.

Daha sonra, kavisli bir neşter bıçağı kullanarak seçilen retina bölgesinden yaklaşık bir veya iki milimetrelik bir dikdörtgen kesin, doku etrafındaki fazla solüsyonu silin. Daha sonra önceden hazırlanmış nitroselüloz fiber zarı, ganglion hücre tarafı zara yapışacak şekilde retina parçasının üzerine yerleştirin. Dokuyu sıkıca tutturmak için hemen zarın üzerine bir damla hücre dışı ortam ekleyin.

Membrana monte edilmiş retina dokusunu taze hücre dışı solüsyon içeren dilimleme odasına aktarın. Daha sonra retinayı 200 mikrometre kalınlığında dikey dilimler halinde kesin. Bir doku doğrayıcı yapıştırıcı kullanılarak, yüksek vakumlu gres ile önceden hazırlanmış bir cam kapak astarına tek bir zar monte edilmiş dilim

Cam yüzeyi retinanın altında ve yağdan uzak tutun. Bundan sonra, oda sıcaklığında tutma haznesindeki her bir kapak kayması monte edilmiş dilime bir damla hücre dışı çözelti ekleyin. Küçük bir su haznesini köpürterek ve atmosferi tutma haznesinde tutarak hazneye karbojen ekleyin. Nemlendirilmiş.

Dilimleri tek tek kayıt odasına aktarmadan önce 10 ila 15 dakika bekletme odasında dinlendirin. Tutma odasından kayıt odasına bir dilim aktarın ve hemen karbonatlı hücre dışı bir çözelti ile perfüze etmeye başlayın. Dakikada iki mililitre perfüzyon akış hızını ve 37 santigrat derece sıcaklığı koruyun.

Kayıt odasında. 20 x 0,95 NA suya daldırma objektifi ve kayıt odasının altında bir kızılötesi LED ile birlikte bir CCD kamera kullanın. Retina dilimini bulmak için, üretici tarafından belirtildiği gibi iki fotonlu görüntüleme sistemini başlatın.

Ardından, lazeri açın ve 860 nanometreye ayarlayın. ECFP ve sitrinin floresan görüntülemesi için iki algılama kanalını açın. Daha sonra, görüntü elde etme yazılımını kullanarak, taramak için iki foton mikroskobunu kontrol edin ve kayıt için bir sıra koni terminali seçin, görüntü alımını 128 x 16 piksel görüntülere veya benzer bir konfigürasyona ayarlayın, taranan alanı koni terminalleriyle sınırlayın dış segmentlerdeki fotoğraf pigmentlerinin ağarmasını önlemek için.

Lazeri açın. Işık uyaranları sunmadan veya farmakolojik ajanlar uygulamadan önce konilerin tarama lazerine ve uyaran arka plan ışığına 20 ila 30 saniye uyum sağlamasına izin verin. Şimdi keyfi uyaranların sunumuna başlayın.

Uyaranlar, özelleştirilmiş yazılım tarafından kontrol edilen bir mikroişlemci kartı kullanılarak iki LED'in yoğunluğunun zaman içinde modüle edilmesiyle üretilir. Ardından, ilgili görüntü alma yazılımını kullanarak iki floresan kanalını aynı anda kaydetmeye başlayın. Kayıtlar, retina dilimlerindeki koni fotoreseptörlerinin sinaptik terminallerine odaklandı.

Bu, yedi ayrı terminale sahip kaydedilmiş bir bölge örneğidir. Floresan, biri fre asa sitrini ve diğeri perde donörü için olmak üzere iki kanal kullanılarak kaydedildi. ECFP'yi seçin. Gösterilen. İşte sitrin ve ECFP floresansındaki ışık uyandıran değişiklikler, tek bir ilgi bölgesinde kaydedildi.

Ve burada bir koni terminalinin beş saniyelik aralıklarla yanıp sönen bir saniyelik parlak ışık serisine verdiği kalsiyum tepkileri var. Bu şekil, ışıkla uyarılan koni kalsiyum tepkilerinin örnek kantitatif analizini göstermektedir. Ve burada tek bir koni terminalinden gelen ışıkla uyarılmış kalsiyum tepkileri var.

Bu şekil, ortalama kalsiyum yanıtının belirlenmesini göstermektedir. Dinlenme kalsiyum seviyesi, ışık stimülasyonundan önceki taban çizgisini temsil eder ve yanıt boyutu, dinlenme kalsiyum seviyesi ile tepe genliği arasındaki ve yanıt başlangıcı ve ofset kinetiği arasındaki alan olan ra'dır. Bu prosedür daha da uzatılabilir.

Örneğin, fotoreseptör kalsiyum sinyalleri, adaptasyon gibi araştırmak veya foto transdüksiyonun farklı aşamalarını ayrıntılı olarak incelemek için çeşitli farmakolojik ve büyük stimülasyon koşulları altında majör olabilir. Bu teknik, normal fizyolojik koşullar altında koni fotoreseptörlerindeki kalsiyum dinamiklerini araştırmaya izin verir. Ve bu, özellikle acro topia veya retinitis pigmentosa gibi insan kör edici hastalıklarında birincil ve ikincil koni fotoreseptör dejenerasyonunu anlamak için önemlidir.