Görüntüleme Ca

Bu prosedürün genel amacı, floresan bir biyosensör kullanarak fare retinasındaki koni fotoreseptörlerinden ışık stimülasyonu ile uyarılan kalsiyum sinyallerini kaydetmektir. Bu işlem, genetik olarak kodlanmış kalsiyum sensörünü yalnızca koni fotoreseptörlerinde eksprese eden transgenik bir fare hattından retinanın izole edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım ise retinal dokunun dikey kesitlerinin alınmasıdır.

Ardından, retinal kesitler lameller üzerine monte edilir ve iki fotonlu bir mikroskobun altına yerleştirilir. Son adım, ışık stimülasyonuna yanıt olarak koni fotoreseptörlerinin bireysel sinaptik terminallerinden kalsiyum sinyallerinin kaydedilmesidir. Nihayetinde, kaydedilen kalsiyum sinyalleri çevrimdışı olarak analiz edilir.

Bu yöntemle, birçok mısır gıda reseptörünün aktivitesini hücre altı çözünürlükte eş zamanlı olarak kaydedebiliriz. Bu, daha zor ve zaman alıcı olan elektriksel tek hücre kayıtları gibi mevcut tekniklere göre temel avantajdır. Dolayısıyla, yanıtlamak istediğimiz soru, kalsiyumun fotoreseptör dejenerasyonuna katılıp katılmadığı ve katılıyorsa bunun nasıl olduğudur.

Bu yöntem, kalsiyum girişinin fotoreseptör dejenerasyonunu tetikleyip tetiklemediğini veya bunun hücrenin ölmekte olmasının bir sonucu olup olmadığını belirlememize olanak tanır. Genel olarak, bu yöntemde yeni olan kişiler, retinal ışık duyarlılığının korunması gerektiği ve bu nedenle retina diseksiyonu ve dilimleme dahil tüm hassas adımların yeşil veya kırmızı ışık altında gerçekleştirilmesi gerektiği için temel olarak zorluk yaşayacaklardır. Bu prosedüre başlamak için, bir fare göz küresini taze olarak karbondioksit ile oksijenlendirilmiş hücre dışı solüsyon içeren bir Petri kabına aktarın.

Kornea ile sklera arasındaki sınır boyunca herhangi bir noktadan göz küresini keskin bir enjeksiyon iğnesiyle delin. Ardından, gözü sklera kısmından bir pensle tutun ve makasın bir ucunu nazikçe deliğe yerleştirin. Gözün ön kısmını göz çukurundan ayırmak için ora serrata boyunca kesin.

Ardından, retinadaki dorsal pozisyonu belirtmek için kalemle işaretlenen konumdan göz çanağını radyal olarak kesin. Sonra, dorsal kesi dışarıya bakacak şekilde göz çanağını konumlandırın. Pens uçlarını retina ile sklera arasına yerleştirerek göz çanağının sol ve sağ tarafındaki sklerayı kavrayın.

Ardından, iica'nın sklera kısmını nazikçe ters çevirerek retinayı ayırın. Son olarak, retinayı skleradan serbest bırakmak için optik siniri kesin. Retinanın kenarını bir pensle tutun ve ikinci bir pens kullanarak retinal yüzeydeki kalıntıları ve vitreus cismini nazikçe temizleyin.

Retina yüzeyi temiz olduğunda, üç adet daha kısa radyal kesi yapın. Şimdi, bir lamı dokuya yakın bir şekilde hücre dışı çözeltiye yavaşça daldırın. Mekanik hasarı ve dokunun katlanmasını azaltmak için kenarından tutarak retinayı, gangliyon hücresi tarafı yukarı gelecek şekilde nazikçe lamın üzerine çekin.

Ardından, kavisli bir bistüri ucu kullanarak seçilen retinal bölgeden yaklaşık bir çarpı iki milimetrelik bir dikdörtgen kesin ve doku etrafındaki fazla solüsyonu silin. Daha sonra, ganglion hücresi tarafı membrana yapışacak şekilde, önceden hazırlanmış nitroselüloz fiber membranı retina parçasının üzerine yerleştirin. Dokunun membrana sıkıca tutunması için membran üzerine hemen bir damla hücre dışı ortam ekleyin.

Membran üzerine monte edilmiş retinal dokuyu, taze hücre dışı çözelti içeren dilimleme haznesine aktarın. Ardından retinayı 200 µm kalınlığında dikey dilimler halinde kesin. Bir doku doğrayıcı kullanarak, membran üzerine monte edilmiş tek bir dilimi, yüksek vakum gresi ile önceden hazırlanmış bir lam üzerine yapıştırın.

Cam yüzeyi retinanın altında tutun ve yağdan arındırın. Ardından, oda sıcaklığındaki tutma odasında monte edilmiş her bir lam üzerindeki kesite bir damla hücre dışı solüsyon ekleyin. Tutma odasındaki atmosferi nemli tutmak için küçük bir su rezervuarını kabarcıklandırarak odaya karbogen verin.

Dilimlerin kayıt odasına tek tek aktarılmadan önce bekleme odasında 10 ila 15 dakika dinlenmesini sağlayın. Bekleme odasından bir dilimi kayıt odasına aktarın ve hemen karbonatlı hücre dışı solüsyon ile perfüzyona başlayın. İki mililitre/dakika perfüzyon akış hızını ve 37 °C sıcaklığı koruyun.

Kayıt odasında. 20 x 0,95 NA su daldırma objektifi ve kayıt odasının altında bulunan bir kızılötesi LED ile birlikte bir CCD kamera kullanın. Retinal kesiti konumlandırmak için, üreticinin belirttiği şekilde iki foton görüntüleme sistemini başlatın.

Ardından, lazeri açın ve 860 nanometreye ayarlayın. ECFP ve sitrin floresan görüntüleme için iki deteksiyon kanalını açın. Sonrasında, görüntüleme yazılımını kullanarak, kayıt için bir sıra koni terminalini tarayıp seçmek üzere iki foton mikroskobunu kontrol edin; görüntü alımını 128 x 16 piksellik görüntülere veya benzer bir konfigürasyona ayarlayın, dış segmentlerdeki fotopigmentlerin ağarmasını önlemek için taranan alanı koni terminalleriyle sınırlandırın.

Lazeri açın. Işık stimülasyonları sunmadan veya farmakolojik ajanlar uygulamadan önce, konilerin tarama lazerine ve stimülasyon arka plan ışığına adapte olması için 20 ila 30 saniye bekleyin. Şimdi belirlenen stimülasyonların sunumuna başlayın.

Stimülasyonlar, özelleştirilmiş bir yazılım tarafından kontrol edilen bir mikroişlemci kartı kullanılarak, iki LED'in yoğunluğunun zamanla modüle edilmesiyle oluşturulur. Ardından, ilgili görüntüleme yazılımı kullanılarak iki floresan kanalı eş zamanlı olarak kaydedilmeye başlanır. Kayıtlar, retinal kesitlerdeki koni fotoreseptörlerinin sinaptik terminallerine odaklanmıştır.

Bu, yedi ayrı terminalin bulunduğu kaydedilmiş bir bölge örneğidir. Floresans, biri fre scepter citrine ve diğeri fret donörü ECFP için olmak üzere iki kanal kullanılarak kaydedilmiştir. Burada, tek bir ilgi alanında kaydedilen citrine ve ECFP floresansındaki ışıkla uyarılan değişimler gösterilmektedir.

Burada, beş saniyelik aralıklarla uygulanan bir saniyelik bir dizi parlak ışık flaşına karşı bir koni terminalinin kalsiyum yanıtları yer almaktadır. Bu şekil, ışıkla uyarılmış koni kalsiyum yanıtlarının örneklem nicel analizini göstermektedir. Ve burada, tek bir koni terminalinden elde edilen ışıkla uyarılmış kalsiyum yanıtları görülmektedir.

Bu şekil, ortalama kalsiyum yanıtının belirlenmesini göstermektedir. Dinlenme kalsiyum seviyesi, ışık stimülasyonu öncesindeki baz çizgiyi temsil eder ve yanıt büyüklüğü, dinlenme kalsiyum seviyesi ile pik genlik arasındakı ve yanıtın başlangıç ile bitiş kinetikleri arasındaki alan olan ra'dır. Bu prosedür daha da genişletilebilir.

Örneğin, adaptasyon gibi çeşitli farmakolojik ve güçlü stimülasyon koşullarını araştırmak veya fototransdüksiyonun farklı aşamalarını ayrıntılı olarak incelemek için fotoreseptör kalsiyum sinyalleri belirleyici olabilir. Bu teknik, normal fizyolojik koşullar altında koni fotoreseptörlerindeki kalsiyum dinamiğinin incelenmesine olanak tanır. Bu durum, akrotopi veya retinitis pigmentosa gibi insanlarda körlüğe yol açan hastalıklardaki birincil ve ikincil koni fotoreseptör dejenerasyonunun anlaşılması açısından özellikle önemlidir.