Name: Görselleştirme Streptococcus pneumoniae Kalp Microlesions ve sonraki Kardiyak Tadilat içinde (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: Keşfedin Streptococcus pneumoniae ile enfekte farelerde kardiyak mikrolesyon oluşumunu ve iyileşme sonrası kalp remodelasyonunu görselleştirme yöntemlerini. Bu protokol enfeksiyona bağlı kalp hasarı araştırmaları için güvenilir bir model sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Amerikan Kalp Derneği'nden 13IRG14560023 hibesi ve CJO'ya AI078972 ve HL108054 NIH hibeleri ile desteklenmiştir. AOB'ye destek, NIH Ulusal Translasyonel Bilimleri Geliştirme Merkezi, NIH ULTR001120 ve F31 A110417701'den geldi.

NOT: Tüm fare deneyleri gözden ve San Antonio Texas Sağlık Bilimleri Merkezi Üniversitesi&#39;nde (protokol # 13032-34-01C) Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komiteleri tarafından kabul edildi. Hayvan bakımı ve Kamu Hukuku 89-544 (Hayvan Refahı Yasası) ve değişiklikleri, Halk Sağlığı Hizmetleri kurallar ve Laboratuvar Hayvanları Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu (Sağlık ve İnsan Hizmetleri Bakanlığı&#39;nın) yapıştırılır deney protokolleri. 1. Enfeksiyon <ol><li> Yaş 10-12 haftalık yaş arası her iki cinsiyetten, BALB / c fareleri elde edilir. NOT: S. pneumoniae serotip 4 suşu TIGR4 16 sıralandı edilmiş bir şiddetli klinik izolat olduğunu. </li><li> Optik yoğunluk (OD) 0.5 620 ulaşana kadar% 5 CO2 içinde 37 ° C &#39;de, Todd-Hewitt lapası içindeki TIGR4 büyütün (1.0 x 10 8 koloni oluşturan birim [CFU] / ml&#39;ye karşılık gelir). 3 ile 10 dakika boyunca santrifüj ile pnömokokal kültür Pelet500 xg ve bir vakum hattı kullanarak süpernatant kaldırmak. Askıda ve 1.0 x 10 4 CFU / ml&#39;lik bir son konsantrasyona değin steril fosfat-tamponlu tuzlu su (PBS) ile bakteri seyreltin. </li><li> Bir indüksiyon odasını kullanarak, oksijen% 2.5 buharlaşmış izofluran ile fareler uyutmak. Künt cımbız ile nazik ayak tutam tarafından anestezi durumunu onaylayın. <ol><li> Bir yandan ile ense anestezi fare tutarak, dik, S. 100 ul her bir fare karın içinden (ip) enjekte (1.0 x 10 3 CFU yükleme dozuna tekabül eden), 27-30 ölçü iğne ile bir şırınga kullanılarak pneumoniae süspansiyon. Kendi kafeste fare geri yerleştirin. Fareler genellikle enjeksiyondan sonra 30-40 sn uyandırmak. </li></ol></li><li> Enfeksiyon en az (erken) 24 veya 30 (gelişmiş) saat devam izin verin. <ol><li> CO 2 boğularak fareler Euthanize. Fareyi sağlamak için servikal dislokasyon yapın vefat etti. Ötenazi ayrıca uzaklaştırılarak onaylanırAdım 1.6 kalbin. </li></ol></li><li> Alkollü bir bezle kuyruk dezenfekte ve 2-3 mm&#39;lik bölümü makasla kesme. Kan, 2 ul toplayın ve seri olarak, sodyum heparin, 1 U / mL, beş kez içeren PBS içinde kan 10 kat seyreltilir. Plaka seri bir triptik soya kan agar plakası üzerinde seyreltme ve koloni ertesi gün tahmin etmek bakteremi seviyesini önemli olan CO 2.% 5, 37 ° C&#39;de gece boyunca inkübe edilir. </li><li> Bir cerrahi platformda bir yatar pozisyonda fare hareketsiz. % 70 etanol ve pat kuru ile göğüs püskürtün. Cerrahi makas ve forseps göğüs boşluğu açmak kullanarak, göğüs kafesini çıkarmak ve kalp ve akciğerler maruz diyaframı transect. Kullanımı makas kalbe bağlı kan damarlarını kesmek ve yavaşça forseps ile morarma önlemek için dikkatle kalp tüketim. </li><li> PBS ile kalp durulayın ve ardından koronal kesitler doku kesit sırasında elde olacağı gibi doku örnek toplama kasetleri içine yerleştirin. Parafin gömme, pla içinparafin gömme için göndermek% 10 tamponlu formalin çözeltisi ve ertesi gün kasetler ce. <ol><li> Alternatif kuru buz konulmuş bir cryomold içinde Ekim Bileşik kullanarak flaş dondurma. </li></ol></li></ol> Kardiyak Lezyonların ve Lezyonlarının içinde pnömokok 2. Görselleştirme <ol><li> Kalbin 4 odaları her doku bölümünde görünür şekilde parafin kalp bölümleri azaltın. 5 mikron kalınlığında slaytlar kesin. </li><li> Standart yöntemler kullanılarak 17 hematoksilen eosin ve (H &amp; E) ile Deparaffinize ve leke slaytlar. </li><li> Büyütme: Görünüm H &amp; E düşük (100X, 200X) ve yüksek (400X, 1,000X yağ daldırma) bir ışık mikroskobu kullanılarak kalp bölümleri boyandı. Miyokardiyumda microlesions varlığı için kalpleri karakterize etmektedir. Burada, bir 100X 1.3 Sayısal açıklık Planı-Neofluar amacı ile donatılmış bir Zeiss Axioskop 2 mikroskop kullanılarak, H &amp; E görüntüleri kazanır. NOT: En erken kardiyak l aşamalarıesions bağışıklık hücrelerine monositler gibi görünen (monositler ve granülositler) varlığında ayırıcı renkli görünüm ve bazı durumlarda ayrımcılık yapılmaktadır. Özellikle 30 saatte görülen ilerlemiş lezyonlar, ise, bağışıklık hücreleri yok ve büyük vakuol benzeri lezyonlar onların yerine gözlenmektedir vardır. Kalp lezyon gelişiminin erken evrelerinde bağışıklık hücre akını oluşabilir ederken bir gereklilik olarak görünmüyor unutmayın önemlidir. </li></ol> Microlesions içinde pnömokokki, 3. immünoflüoresan mikroskopi <ol><li> Pozitif yüklü cam slaytlar üzerine 5 um ve yer bölümleri bir kalınlığa mikrotom ile cryomolds Bölüm kalp. Dondurulmuş kalp bölümler çözülme ve hava kuru izin ver. (25 ° C&#39;de, pH 6.8-7.2) 10 dakika,% 10 nötr tamponlu formalin için bölümler düzeltildi. </li><li> Daha sonra PBS içinde tekrar yıkama, PBS içinde% 0.2 Triton X-100 içinde, 15 dakika boyunca geçirgenliği, 5 dakika boyunca PBS içinde slaytlar (3x) yıkanır. </li><li> Blok doku secti<html> 1 saat boyunca PBS içinde% 10 keçi serumu ile slaytlar üzerine. </li><li> PBS, kapaklı slaytlar durulayın ve 1 tavşan anti-serotip 4 pnömokok antiserumu ile kardiyak bölümleri inkübe: 1000 PBS içerisinde% 10 keçi serumu ile 2 st için 37 ° C &#39;de. NOT: Negatif kontroller için araştırmacılar naif tavşan antiserumunu kullanmanız gerekir </li><li> 37 ° C&#39;de 30 dakika süre ile 2000: 1 bir keçi anti-tavşan FITC ile konjüge edilmiş antikor ile% 10 keçi serumu-PBS ile bölümlere PBS, kapak ile yıkanıp inkübe sonra. </li><li> Üreticinin talimatlarına sonra ökaryotik çekirdeklerin görünüm için, 5 mg / ml DAPI (4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindol) kullanın. Yıkayın ve FluorSave ile doku bölümleri monte edin. </li><li> Düşük ve yüksek hem büyütmede bir konfokal mikroskop sistemi kullanılarak floresan görüntü elde. En iyi sonuçları elde etmek için buna göre sayısal diyafram ayarlayın. Burada, bir 60X 1.42 sayısal diyafram amacı ile bir konfokal sistemi kullanılarak floresan görüntüler elde. </li></ol>Septik Fareler &quot;&gt; 4. Antibiyotik Kurtarma <ol><li> Daha önce 1. adımda belirtildiği gibi TIGR4 1.0 x 10 3 CFU ile fareler enfekte ip ile başlayın. </li><li> 30 saat sonra enfeksiyondan itibaren, 36 saat süre ile 100 ul tuzlu su içinde her 12 saat farmasötik dereceli ampisilin ip (80 mg / kg vücut ağırlığı) uygulamaktadır. Parafine ve doku, kesit olarak, adım 1.6 de tarif edildiği gibi arzu edilen bir zaman noktasında ve süreç kalpleri toplayın. </li></ol> 5. Kollajen Biriktirme Algılama <ol><li> Standart yöntemler kullanılarak 17 deiyonize su, deparaffinize ve hidrat doku bölümleri ile ksilen ve kademeli alkol yıkar kullanma. 5 dakika boyunca, sulu% 0.2 fosfomolibdik asit ile bölümleri tedavi ve 5 dakika boyunca iyonu giderilmiş su ile durulama. </li><li> Oda sıcaklığında 2 saat süre ile pikrik asit içinde% 0.1 Sirius Kırmızı leke bölümleri. </li><li> 3 dakika boyunca 0.01 N hidroklorik asit bölümleri yıkayın ve 1 dakika boyunca% 70 etanol ile yıkayın. </li><li> Dehydraaynı kullanarak bölümleri te ancak 5.1 de tarif edilene yıkama sırasını tersine çevirmek, ksilen artan kardiyak bölümleri kurutmak ve daha sonra etanol konsantrasyonlarını kademeli. </li><li> Mikroskopik değerlendirme için bir montaj çözümü Mount doku bölümleri. </li><li> Kollajen birikimi bölgeleri belirlemek için, bir ışık mikroskobu kullanılarak düşük ve yüksek büyütme altında derin okuma boyama alanlarında lekeli doku bölümleri inceleyin. Kırmızı kalp ventriküller içinde herhangi bir alan kollajen tevdi edilmiş bir alandır. Bu kırmızı leke olmadan Alanları kollajen birikimi eksik sağlıklı doku sitelerdir. Burada, bir 20X 0.5 sayısal diyafram objektif ile donatılmış bir mikroskop kullanılarak Picro Sirius Kırmızı lekeli görüntüler elde. NOT: Sağlıklı dokularda kırmızı atrium lekeleri. </li></ol>

<ol><li>Corrales-Medina, V. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+complications+in+patients+with+community-acquired+pneumonia%3A+incidence%2C+timing%2C+risk+factors%2C+and+association+with+short-term+mortality%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Cardiac complications in patients with community-acquired pneumonia: incidence, timing, risk factors, and association with short-term mortality.</a> Circulation. 125, 773-781 (2012).</li>
<li>Corrales-Medina, V. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+bacterial+pneumonia+is+associated+with+the+occurrence+of+acute+coronary+syndromes%5BTitle%5D)+AND+%22Medicine+%28Baltimore%29%22%5BJournal%5D)">Acute bacterial pneumonia is associated with the occurrence of acute coronary syndromes.</a> Medicine (Baltimore). 88, 154-159 (2009).</li>
<li>Corrales-Medina, V. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+complications+in+patients+with+community-acquired+pneumonia%3A+a+systematic+review+and+meta-analysis+of+observational+studies%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Med%22%5BJournal%5D)">Cardiac complications in patients with community-acquired pneumonia: a systematic review and meta-analysis of observational studies.</a> PLoS Med. 8, e1001048(2011).</li>
<li>Corrales-Medina, V. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Risk+stratification+for+cardiac+complications+in+patients+hospitalized+for+community-acquired+pneumonia.+Mayo+Clin%5BTitle%5D)+AND+%22Proc%22%5BJournal%5D)">Risk stratification for cardiac complications in patients hospitalized for community-acquired pneumonia. Mayo Clin.</a> Proc. 89, 60-68 (2014).</li>
<li>Kumar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+11+common+viral+and+bacterial+pathogens+causing+community-acquired+pneumonia+or+sepsis+in+asymptomatic+patients+by+using+a+multiplex+reverse+transcription-PCR+assay+with+manual+%28enzyme+hybridization%29+or+automated+%28electronic+microarray%29+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Detection of 11 common viral and bacterial pathogens causing community-acquired pneumonia or sepsis in asymptomatic patients by using a multiplex reverse transcription-PCR assay with manual (enzyme hybridization) or automated (electronic microarray) detection.</a> Journal Of Clinical Microbiology. 46, 3063-3072 (2008).</li>
<li>Musher, D. M., Rueda, A. M., Kaka, A. S., Mapara, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+association+between+pneumococcal+pneumonia+and+acute+cardiac+events%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">The association between pneumococcal pneumonia and acute cardiac events.</a> Clin Infect Dis. 45, 158-165 (2007).</li>
<li>Brown, A. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Streptococcus+pneumoniae+translocates+into+the+myocardium+and+forms+unique+microlesions+that+disrupt+cardiac+function%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Streptococcus pneumoniae translocates into the myocardium and forms unique microlesions that disrupt cardiac function.</a> PLoS Pathogens. In press, (2014).</li>
<li>Orihuela, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laminin+receptor+initiates+bacterial+contact+with+the+blood+brain+barrier+in+experimental+meningitis+models%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Laminin receptor initiates bacterial contact with the blood brain barrier in experimental meningitis models.</a> The Journal of Clinical Investigation. 119, 1638-1646 (2009).</li>
<li>Flick, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+elimination+of+the+binding+motif+on+fibrinogen+for+the+S.+aureus+virulence+factor+ClfA+improves+host+survival+in+septicemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Genetic elimination of the binding motif on fibrinogen for the S. aureus virulence factor ClfA improves host survival in septicemia.</a> Blood. 121, 1783-1794 (2013).</li>
<li>Cheng, A. G., DeDent, A. C., Schneewind, O., Missiakas, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+play+in+four+acts%3A+Staphylococcus+aureus+abscess+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A play in four acts: Staphylococcus aureus abscess formation.</a> Trends Microbiol. 19, 225-232 (2011).</li>
<li>Arenal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Do+the+spatial+characteristics+of+myocardial+scar+tissue+determine+the+risk+of+ventricular+arrhythmias%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">Do the spatial characteristics of myocardial scar tissue determine the risk of ventricular arrhythmias.</a> Cardiovasc Res. 94, 324-332 (2012).</li>
<li>Deneke, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+histopathology+of+electroanatomic+mapping+after+cooled-tip+radiofrequency+ablation+to+treat+ventricular+tachycardia+in+remote+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cardiovasc+Electrophysiol%22%5BJournal%5D)">Human histopathology of electroanatomic mapping after cooled-tip radiofrequency ablation to treat ventricular tachycardia in remote myocardial infarction.</a> J Cardiovasc Electrophysiol. 16, 1246-1251 (2005).</li>
<li>Bakker, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reentry+as+a+cause+of+ventricular+tachycardia+in+patients+with+chronic+ischemic+heart+disease%3A+electrophysiologic+and+anatomic+correlation%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Reentry as a cause of ventricular tachycardia in patients with chronic ischemic heart disease: electrophysiologic and anatomic correlation.</a> Circulation. 77, 589-606 (1988).</li>
<li>Verma, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationship+between+successful+ablation+sites+and+the+scar+border+zone+defined+by+substrate+mapping+for+ventricular+tachycardia+post-myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cardiovasc+Electrophysiol%22%5BJournal%5D)">Relationship between successful ablation sites and the scar border zone defined by substrate mapping for ventricular tachycardia post-myocardial infarction.</a> J Cardiovasc Electrophysiol. 16, 465-471 (2005).</li>
<li>Wu, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+risk+for+ventricular+tachyarrhythmias+and+sudden+cardiac+death%3A+is+there+a+role+for+cardiac+MRI%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Cardiovasc+Imaging%22%5BJournal%5D)">Assessing risk for ventricular tachyarrhythmias and sudden cardiac death: is there a role for cardiac MRI.</a> Circ Cardiovasc Imaging. 5, 2-5 (2012).</li>
<li>Tettelin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+genome+sequence+of+a+virulent+isolate+of+Streptococcus+pneumoniae%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Complete genome sequence of a virulent isolate of Streptococcus pneumoniae.</a> Science. 293, 498-506 (2001).</li>
<li>Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematoxylin+and+eosin+staining+of+tissue+and+cell+sections%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc%22%5BJournal%5D)">Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections.</a> CSH Protoc. 2008, (2008).</li>
</ol>

Yazarlar bu çalışmada herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan etmektedirler.

Bu raporda, son derece tekrarlanabilir bir yöntem S. ikna etmek pneumoniae IPD sırasında farelerde kalp microlesions aracılı ve görselleştirme teknikleri gösterilmiştir. Fareler, insan sepsiste oluşur ve miyokarda nihai bakteriyel translokasyon neden benzer yüksek dereceli bakteremi, yol temizlenmesi için bağışıklık sisteminin eşiği aşması bakterilerin bir dozu ile enfekte edilir. S., henüz bilinmeyen nedenlerden dolayı merkezinde pneumoniae vücut bağışıklığı tepkisi ile kararlı çoğal...

Toplum kökenli pnömoni (TKP) için yetişkinlerin Yatış mortalite 1-4 katkıda istenmeyen kardiyak olaylar için belgelenmiş bir risk taşır. Corrales-Medine ve ark tarafından yapılan yeni bir çalışmada. Kardiyak komplikasyonlar ve / veya sorumlu pnömoni ile ilişkili ölümlerin 3% 27 için ilişkili bulunmuştur. Streptococcus pneumoniae (pnömokok), TKP&#39;nin ve sepsis 5 en yaygın nedeni, doğrudan başvuran erişkin hastaların 6 gibi birçok 19 olarak% olumsuz kardiyak olaylar ile ilişkili olmuştur. Pnömoni ile ilişkili advers kardiyak olaylar sıklığını 6 azalan yeni veya kötüleşen konjestif kalp yetmezliği, aritmi ve miyokard infarktüsü sayılabilir. Brown ve arkadaşları tarafından yapılan bir PLoS patojenler makalede., S. pneumoniae myocardiu içine kardiyak vasküler endotelyum, giriş ile translokasyon yeteneğine sahip olduğu bulunmuşturm ve invaziv pnömokokal hastalığın (IPD) 7 sırasında ventrikül bakteri dolu ayrık olmayan pürülan mikroskobik lezyonlar (microlesions) oluşumu. Kardiyak microlesion oluşumunun kanıtı pnömokok enfeksiyonuna yenik olan insan olmayan primatlar ve bireylerden kardiyak örnekleri gözlenmiştir. Benzer şekilde, deneysel olarak enfekte olmuş fareler, yeniden üretilebilir kalp microlesions geliştirdi. Farelerde, microlesion büyüklüğü ve sayısı olumlu süresi ve bakteriyemi, serumlar kardiyak troponin düzeyleri şiddeti ve anormal kalp elektrofizyoloji ile korelasyon. Kalbine bakteriyel translokasyon, kan-beyin engeli ve pnömokok menenjit, bir laminin reseptörü ve Trombosit vasküler endotel hücrelerinin, yani kolin bağlanma proteini A aracılı istilası karşısında pnömokokun translokasyon için sorumlu olan mekanizmalar aracılığıyla meydana geldiği bulunmuştur harekete geçirme faktörü reseptörü bağımlı bir şekilde 8. Microlesiyon oluşumu, kardiyomiyositlerde 7 öldürdüğü bulunmuştur pnömokok gözenek oluşturucu toksin pnömolizin gerekiyor. Pnömokok kalp microlesions Staphylococcus aureus gibi diğer gram pozitif bakterilerin neden olduğu iltihaplı yumuşak doku ve kardiyak abseler farklıdır. Bu, nötrofillerin ve fibrin oluşumu, 9,10 ile çevrili bir bakteri, tek odakları ile karakterize edilir. Microlesions S. tarafından oluşturulan pneumoniae etkilenen bir kalp boyunca dağılmış, boyut olarak daha küçüktür, ve immün hücre infiltrasyonu yoksundur. Enfeksiyonun erken aşamalarında, microlesions S. neden pneumoniae kardiyomiyopati patolojik bulguların anımsatan hasarlı veya iltihaplı doku alanlar olarak görünür. Bazı monositler, ancak kendi varlığını kısa ömürlü ve lezyonlar hızla aynı anda GR devam ederken görünüm nekrotik hale gelir ve bakteri dolu, bu süre içinde görülebilirhayvan veya antimikrobiyal müdahale ölümüne kadar boyutu ow. Önemli bir şekilde, antibiyotik müdahale 3 gün içinde, aşırı bağışık hücre içi filtratı önceki lezyon bölgesinde görülmektedir ve bu sağlam kollajen birikimi eşlik eder. Benzer kalp biçimlenme kardiyak fonksiyon 11-15 sonuçlarını kalıcı birlikte enfarktüsü aşağıdaki meydana bildirilmiştir. Böylece, microlesions hastalık bölüm hayatta nekahet bireylerde kalp-ilişkili mortalite insidansında artış IPD&#39;ye sırasında ve muhtemelen ortaya istenmeyen kardiyak olaylar için potansiyel bir açıklama vardır. Burada, kullanıcı enfeksiyonun erken ve geç aşamalarında IPD ve kardiyak lezyon oluşumu ve kardiyak microlesions görselleştirme deneysel fare modelinde sağlanır. antimikrobiyal müdahale ile kaydedilmiş olan hayvanlarda kollajen birikimi tespiti için protokol gösterilmiştir. Bu makalenin amacı f olduğunuBu önemli ve yeni pnömokok patoloji diğer araştırmacıların araştırma acilitate.

<table><tbody><tr><td>Todd-Hewitt et suyu&nbsp;</td><td>Neogen</td><td>7161A</td><td></td></tr><tr><td>O.C.T Bileşiği&nbsp;</td><td>Doku-Tek (Sakura Finetek)&nbsp;</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100&nbsp;</td><td>Fisher Scientific (Acros)</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>Normal Keçi Serumu</td><td>Abcam</td><td>ab7481</td><td></td></tr><tr><td>anti-serotip 4 pnömokok antiserumu&nbsp;</td><td>Statens Serum Institut</td><td>16747</td><td></td></tr><tr><td>keçi anti-tavşan FITC konjuge antikoru&nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>111-096-144</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Fluorsave</td><td>Millipore</td><td>345789</td><td></td></tr><tr><td>Permount</td><td>Fisher Scientific</td><td>S70104</td><td></td></tr><tr><td>Ampisilin</td><td>Sigma</td><td>A9393</td><td></td></tr><tr><td>fosfomolibdik asit% 0.2 & nbsp;</td><td>Elektron Mikroskobu Bilimleri</td><td>26357-01</td><td></td></tr><tr><td>Pikrik asitte %0.1 Sirius Kırmızısı&nbsp;</td><td>Elektron Mikroskobu Bilimleri</td><td>26357-02</td><td></td></tr><tr><td>0.01 N hidroklorik asit&nbsp;</td><td>Elektron Mikroskobu Bilimleri</td><td>26357-03</td><td></td></tr><tr><td>Doku Tack Mikroskobu Slaytları</td><td>Polysciences, Inc</td><td>24216</td><td></td></tr><tr><td>Paralube Veteriner Merhem</td><td>Dechra</td><td>12920060</td><td></td></tr><tr><td>Hematoksilen ve Eozin Boyama Kiti</td><td>belirtilmemiş&nbsp;</td><td></td><td>standart</td></tr></tbody></table>

görselleştirme<em&gt; streptococcus pneumoniae</em&gt; kalp microlesions ve sonraki kardiyak tadilat içinde

Visualization of Streptococcus pneumoniae within Cardiac Microlesions and Subsequent Cardiac Remodeling

Bakteriyemi sırasında Streptococcus pneumoniae miyokard içine vasküler endotel boyunca transloke ve ayrık bakteri dolu mikroskobik lezyonlar nedeniyle bağışıklık hücrelerini infiltre yokluğu dikkat çekiyor (microlesions) oluşturabilir. Nedeniyle kardiyotoksik ürünlerin onların serbest bırakılması, S. microlesions içinde pneumoniae sıklıkla erişkinlerde fulminate invazif pnömokok hastalığı sırasında gözlenen kalp yetmezliğine katkıda bulunduğu düşünülmektedir. Burada 30 saat içinde kalp microlesion oluşumunu tekrarlanabilir neden deneysel fare enfeksiyonu için bir protokol gösterilmiştir. Öğretim Hematoksilin ve lekeli kalp bölümleri ve erken ve geç microlesions arasındaki morfolojik farklılıkları eozin içinde microlesion tanımlama sağlanır vurgulanır. Öğretim S. doğrulanması için bir protokol sağlanır Pnömokok kapsüler polisakkarit ve karşı antikorlar kullanılarak microlesions içinde pneumoniaeimmunofluorescent mikroskopi. Son, enfekte fare ve algılama ve nekahet farelerin kalplerinde skar oluşumu değerlendirilmesi için kurtarır antibiyotik müdahale için bir protokol sağlanır. Birlikte, bu protokoller S. maruz kalma sonucu pnömokok kalp işgali, kardiyomiyosit ölümü, kardiyak remodeling altında yatan moleküler mekanizmaların soruşturma kolaylaştıracaktır pneumoniae ve kalp pneumococci için bağışıklık tepkisi.

H &amp; E ile Microlesions görselleştirme Kardiyak microlesions Şekil 1. TIGR4 ile ip meydan aşağıdaki İPH farelerin kalp bölümleri lekeli H &amp; E ventrikül gözlenen hematoksilen daha fazla sayıda 24 ve 30 saat sonrası enfeksiyon (hpi) arasındaki bu lezyonların boyutunda artış gösteriyor edildi lezyon içinde görünür -stained (yani, mor-mavi) pnömokok. Microlesions bir vakuol-benzeri morfolojisi, daha yoğun eosin (kırmızı), lezyon bölgesinde hemen bitişik ...

Streptococcus pneumoniae, kalpte ayrık pürülan olmayan mikroskobik lezyonlar oluşturur. Kardiyak mikrolezyon oluşumunun bir murin modeli için protokol ana hatlarıyla belirtilmiştir. Mikroskopi kullanılarak mikrolezyon görselleştirmesi, erken ve geç mikrolezyonlar arasında ayrım ve nekahat dönemindeki hayvanların kalplerinde kardiyak yeniden şekillenmeyi tespit etme yöntemleri hakkında talimat verilmektedir.

Görselleştirme<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em&gt; Kalp Microlesions ve sonraki Kardiyak Tadilat içinde

During bacteremia Streptococcus pneumoniae can translocate across the vascular endothelium into the myocardium and form discrete bacteria-filled ...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, enfekte farelerin kalbinde ESMO kardiyak mikro lezyon oluşumu için tekrarlanabilir bir protokol göstermektir. Bu, farelerin ESMO ile enfekte edilmesi ve baktereminin gelişmesine izin verilmesiyle sağlanır; böylece bakterilerin kalp damarlarına erişimi sağlanarak miyokardı istila etmeleri ve mikroskobik lezyonlar oluşturmaları mümkün olur. Ardından kalpler ya parafine gömülüp geleneksel yöntemlerle boyanır ya da immunofloresan boyama için OCT bileşiğine sabitlenir.Boyanmış kesitlerin değerlendirmesi, miyokard boyunca rastgele dağılmış kardiyak mikro lezyonları, kollajen birikimlerini ve kardiyak mikro lezyonlar içindeki konvalesan miyokard kesitlerini ve pnömokok kapsüllerini gösterebilir. Prosedürü gerçekleştiren Armand Brown, laboratuvarımdaki bir lisansüstü öğrencisidir. Bu yöntem, farelerde invaziv pnömokok hastalığı sırasında S. pneumonia'nın kardiyak hasar etkileri hakkında bilgi sağlayabilir.Ayrıca, insan dışı primatlar veya insanlar gibi diğer sistemlerden alınan kardiyak örneklere de uygulanabilir. ESMO Serotip dört suşu Tiger four'un Todd Hewitt besiyerinde, 620 nanometrede 0,5 optik yoğunluğa ulaşana kadar büyütülmesiyle başlayın. Doğru yoğunluğa ulaşıldığında, kültürü 3.500 G'de 10 dakika boyunca santrifüj ederek çökelteyin.Ardından, süpernatantı bir vakum hattı kullanarak uzaklaştırın ve bakterileri mililitre başına 10.000 koloni oluşturan birim olacak şekilde steril PBS ile yeniden süspansiyon haline getirin. Şimdi, 10 ila 12 haftalık valve C farelerini anesteziye alın ve anestezi durumlarını küt uçlu bir cımbızla parmak ucuna hafifçe bastırarak doğrulayın; bakteriyel süspansiyonu şırıngaya çekin ve 27 ila 30 gauge bir iğne takın. Ardından, bir elinizle anestezi altındaki fareyi ensesinden tutarken diğer elinizle 100 µL süspansiyonu intraperitoneal olarak enjekte edin ve her bir fareyi tekrar kafesine yerleştirin.Fareler genellikle enjeksiyondan 30 ila 40 saniye sonra uyanırlar. S. pneumoniae dozunun doğru ayarlanması kritiktir; aksi takdirde fareler enfeksiyondan kurtulabilir veya lezyonların gelişebileceği kadar süre geçmeden çok hızlı bir şekilde invaziv pnömokokal hastalığa yakalanabilirler. Her bakteriyel suşun farklı virülans seviyeleri olduğundan, doğru dozu belirlemek deneme yanılma yöntemi gerektirebilir.Enfeksiyonun erken evre için en az 24 saat veya ileri evre enfeksiyon için 30 saat boyunca ilerlemesine izin verin. Daha sonra, enfekte olan her bir fareyi ötanize edin. Öncelikle, kuyruğu alkollü pamukla dezenfekte ederek iki ila üç milimetrelik bir kesit şeklinde kan örneği alın.Kulak çentiği bölgesinden iki microliter kan toplayın. Kanı, mililitre başına bir unit sodyum heparin içeren PBS içinde on kat seri dilüsyonla seyreltin. Beş farklı dilüsyon seviyesini triptik soya kan agar plaklarına ekleyin ve bir gece boyunca inkübe edin.Ertesi gün koloni sayımlarını yapın. Bir sonraki bölümde açıklandığı şekilde kalbin hasat işlemine geçin. Alternatif olarak, enfeksiyondan 30 saat sonra uygulanabilir.100 µL serum fizyolojik içerisinde ampisilinle intraperitonal uygulama yaparak fareyi kurtarmaya çalışın. Ampisilin uygulamasına 36 saat boyunca her 12 saatte bir devam edin ve istenen zaman noktalarında kalpleri toplayın. İlk olarak, kalbi çıkarın.Ötanazi uygulanmış fareyi bir cerrahi platform üzerinde sırtüstü pozisyonda sabitleyin, göğüs bölgesini %70 etanol ile püskürterek temizleyin ve kurulayın. Cerrahi makas ve pens kullanarak göğüs boşluğunu açın. Kalp ve akciğerleri açığa çıkarmak için göğüs kafesini çıkarın ve diyaframı kesin.Ardından kalbe bağlı olan kan damarlarını kesin ve kalbi ezmeden nazikçe çıkarmak için pens kullanın. Kalbi PBS ile yıkayın ve koronal kesit alma işlemi için bir doku örneği toplama kasetine yerleştirin. Daha sonra kasetleri %10 tamponlu formalin çözeltisine aktarın ve ertesi gün parafin gömme işlemi için gönderin.Erken evrelerde, kardiyak lezyonlar renk görünümündeki değişimle ve bazı durumlarda bağışıklık hücrelerinin varlığıyla tanımlanabilir. İleri evre lezyonlarda bağışıklık hücreleri yok olacak ve lezyonlar büyüyecektir. Bunların yerinde VA benzeri lezyonlar görülür.Pozitif yüklü cam lamlar üzerindeki beş mikronluk kalp kesitlerini önce dondurun, ardından çözdürün ve havada kurumaya bırakın. Lamları 25 °C'de 10 dakika boyunca %10 nötr tamponlu formalinde sabitleyin. Daha sonra sabitleyiciyi, her biri beş dakika süren üç kez PBS ile yıkama yaparak uzaklaştırın.Ardından dokuyu, PBS içinde %0,2 Triton X-100 ile 15 dakika boyunca geçirgenleştirin. Deterjanı, doğrudan PBS ile üç kez daha yıkayarak uzaklaştırın. Daha sonra dokuyu, PBS ile duruladıktan sonra PBS içinde %10 kaplama serumu ile bir saat boyunca bloke edin ve kesiti 37 °C'de iki saat boyunca antiserum ile inkübe edin.Negatif kontrolleri naif tavşan antiserumu ile işleyin. Kardiyak doku, XI immunofloresan boyasını kolayca absorbe ederek yüksek arka plan seviyelerine yol açtığından, farklı antikor türleri için inkübasyon süresi ve konsantrasyonun optimize edilmesi gerekecektir. İki saat sonra, antiserumu PBS ile yıkayarak uzaklaştırın. Ardından çözeltiyi ikincil bir antikorla değiştirin ve lamları 37 °C'de 30 dakika boyunca inkübe edin. Şimdi 5 mg/mL DPI uygulayın ve lamları PBS ile yıkayın.Son olarak, lamları kapatma medyumu ile kapatın, kaydedin ve konfokal mikroskopi ile görüntüleyin. İşleme, parafini uzaklaştırarak ve doku kesitlerini hidrate ederek başlayın. Ksilen yıkamalarını takiben dereceli bir alkol yıkama serisi uygulayın.Ardından kesitleri beş dakika boyunca %0,2 fosfomolibdik asit içinde bekletin, ardından beş dakika suyla durulayın; sonra iki saat boyunca %0,1 sirius red ve pikrik asit ile boyayın. Daha sonra kesitleri üç dakika boyunca 0,01 normal hidroklorik asit ile yıkayın ve bir dakika boyunca %70 etanol ile durulayın. Şimdi, dereceli alkol banyosu serisini tersine çevirerek kesitleri dehidrate edin, ardından ksilen yıkamaları yapın, ışık mikroskobu için kapatma işlemi gerçekleştirin ve lamları değerlendirin.Farelerde, Tiger 4 suşu ile yapılan challenge sonrası invaziv pnömokok hastalığı gelişti. Ventriküllerde kardiyak mikro lezyonlar gözlemlendi ve enfeksiyondan sonraki 24 ile 30. saatler arasında lezyon boyutunda ve sayısında artış kaydedildi. S. pneumoniae'nin gerçekten lezyonların içinde olduğunu doğrulamak için kesitler, Tiger 4 tarafından üretilen serotip dört kapsüler polisakkarit için boyandı.Bu durum, mikrolezyon bölgelerinde sıkıca paketlenmiş ve yoğun agregatların varlığını doğruladı. Ampisilin ile kurtarılan farelerin ve enfekte edilmemiş kontrollerin kalp kesitlerinde Piro serious red boyaması gerçekleştirildi. Kurtarmalarda.Ventriküllerde eski lezyon bölgeleri gibi görünen yerlerden yayılan bantlarla birlikte, boyanın varlığında ve yoğunluğunda dramatik bir artış gözlendi. Bu prosedürü uygularken, baktereminin ve kardiyak mikro lezyonların oluşması için yeterli sürenin tanıması amacıyla, enfeksiyonun en az 28 ila 30 saat boyunca ilerlemesine izin verecek miktarda S pneumonia ile farelerin enfekte edilmesi gerektiğini hatırlamak önemlidir.

visualization-streptococcus-pneumoniae-within-cardiac-microlesions

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Kaynak: Brown, A. O. ve diğerleri. Streptococcus pneumoniae'nin kardiyak mikrolezyonlar içinde görselleştirilmesi ve ardından kardiyak yeniden şekillendirme. J. Vis. Exp. (2015).Bu video, fare kalp dokusundaki bakteriyel mikrolezyonların mikroskobik görselleştirilmesini göstermektedir. Streptococcus pneumoniae ile enfekte olan bir farenin kalbi, koronal kesitler için işlemeden önce toplanır, yıkanır ve sabitlenir. Bu bölümler hematoksilin ve eozin ile boyanır ve mikroskob altında incelenir;...

Fare kalp dokusunda bakteriyel mikrolezyonların mikroskobik görselleştirmesi

Kaynak: Brown, A. O. ve Orihuela, C. J. Streptococcus pneumoniae'nin Kardiyak Mikrolezyonlar İçinde Görselleştirilmesi ve Sonraki Kardiyak Yeniden Şekillendirme. J. Vis. Exp. (2015)Video, kimyasal olarak sabitlenmiş fare kalp dokusu kesitlerinin bağışıklık boyama işlemini gösteriyor; böylece enfeksiyon kaynaklı mikrolezyonlar içinde bulunan patojenik bakteriler görselleştirilmektedir. Süreç, doku yıkama, membran geçirgenliği, spesifik olmayan bölgelerin blokajı, antikor etiketleme, nükleer...

Fare kalp dokusu bölümünde bakteri dolu mikrolezyonların görüntüleme için immünbojenlenmesi

Bu çalışma, otoimmün miyokarditten etkilenen farelerde kardiyak anormallikleri değerlendirmek için invaziv olmayan bir araç olarak manyetik rezonans mikroskopi görüntülemenin başarılı bir şekilde kurulduğunu göstermektedir.  Veriler, tekniğin canlı hayvanlarda hastalığın ilerlemesini izlemek için kullanılabileceğini göstermektedir.

Fare Manyetik Rezonans Görüntüleme Mikroskopi tarafından Deneysel Otoimmün Miyokardit Kardiyak anormallikler noninvaziv değerlendirilmesi

Burada, hücreden arındırılmış kalp dokularında hücre dışı matriks üst yapısını görselleştirmek için bir yöntem gösterilmiştir.

Macerated Tissue taramalı elektron mikroskobu Ekstraselüler Matrix Visualize&#39;a

Güvenilir ve doğru sonuç değerlendirmesi klinik tedavi içine klinik öncesi tedavilerin çeviri için anahtardır. Geçerli kağıt domuz akut miyokard infarktüsü modelinde kardiyak performans ve hasar üç klinik açıdan primer sonuç parametreleri değerlendirmek açıklamaktadır.

Akut Miyokard İnfarktüsü bir Domuz Modeli İlköğretim Sonuç Değerlendirmesi

Burada, CD11c.DTR farelerinin intratrakeal difteri toksini tedavisi ile indüklenen, bir aseptik fulminan miyokardit modelinde kardiyak CD45 + lökosit infiltrasyonunu görselleştirmek için bir ışık-tabakalı mikroskopik yaklaşım anlatılmaktadır.

Bir Fulminan Miyokardit Modelinde Işık Yeri Mikroskopisi İle Lökosit İnfiltrasyonunun Nicel Görselleştirilmesi

Burada insan IPS-hücre cardiomyocytes eskiden şiling şimdi domuz modelinde türetilmiş bir kalp kası yama implantasyonu ve ardından sol ventrikül cryoinjury indüksiyon için bir iletişim kuralı mevcut.

HiPSC elde edilen kalp kası yamalar implantasyonu eskiden şiling şimdi domuz modelinde miyokardiyal yaralanma sonra

Bu protokol, perikard ve içeriğini korurken farelerde miyokard enfarktüsünü indükleme adımlarını özetlemektedir.

Bozulmamış Bir Perikard İskemik Kemirgen Modeli

Burada, kollajen seçici kontrast artırımı ile sağlıklı ve patolojik büyük memeli tüm kalplerinin yüksek çözünürlüklü mikro bilgisayarlı tomografi görüntülerini elde etmek için bir protokol sunuyoruz.

Kronik Hastalığı Olan Büyük Memeli Kardiyak Modellerinin Kontrastlı Mikro Bilgisayarlı Tomografi Görüntülemesinde Doku Hazırlama Teknikleri

Reperfüze akut miyokard enfarktüsünde (repAMI) kardiyak hasarın üç boyutlu (3D) rekonstrüksiyonu, ilişkili hastalığı etkileyen paternlerin aslına uygun olarak ölçülmesini ve birlikte lokalizasyonunu sağlar. Burada, kardiyak hasarın, risk altındaki alanın ve bağışıklık hücresi tepkisinin eşzamanlı ölçümü için otomatikleştirilebilir bir ışık tabakası kılavuzluğunda görüntüleme yaklaşımı sağlanmıştır.

Işık Tabakası Floresan Mikroskobu Kullanılarak Reperfüze Akut Miyokard Enfarktüsünde Kardiyak Hasar ve İmmün Yanıtın Eşzamanlı 3D Analizi

Keşfedin Streptococcus pneumoniae ile enfekte farelerde kardiyak mikrolesyon oluşumunu ve iyileşme sonrası kalp remodelasyonunu görselleştirme yöntemlerini. Bu protokol enfeksiyona bağlı kalp hasarı araştırmaları için güvenilir bir model sunar.

Görselleştirme

Daha fazla video keşfet