Görselleştirme Streptococcus pneumoniae Kalp Microlesions ve sonraki Kardiyak Tadilat içinde

Aşağıdaki deneyin genel amacı, enfekte farelerin kalbinde ESMO kardiyak mikro lezyon oluşumu için tekrarlanabilir bir protokol göstermektir. Bu, fareleri ESMO ile enfekte ederek ve bakteriyemi gelişimine izin vererek, böylece bakterilere miyokardiyumu istila edebilecekleri ve mikroskobik lezyonlar oluşturabilecekleri kalp damar sistemine erişim sağlayarak elde edilir. Daha sonra kalpler ya parafindir, konvansiyonel olarak gömülür ve boyanır ya da immünofloresan boyama için OCT bileşiğine sabitlenir.

Lekeli bölümlerin değerlendirilmesi, miyokard kollajen birikimleri boyunca rastgele dağılmış kardiyak mikro lezyonları gösterebilir ve kardiyak mikro lezyon içindeki kalp bölümlerimi ve pnömokok kapsüllerini iyileştirebilir ve prosedürü gösterir. Armand Brown laboratuvarımda yüksek lisans öğrencisi mi? Bu yöntem, farelerde invaziv pnömokok hastalığı sırasında S pnömonisinin kardiyak zararlı etkileri hakkında fikir verebilir.

İnsan olmayan primatlar veya insanlar gibi diğer sistemlerden alınan kardiyak örneklere de uygulanabilir. Todd Hewitt et suyunda ESMO Serotip dört suşu Tiger four'u 620 nanometrede 0,5'lik bir optik yoğunluğa büyütmekle başlayın. Doğru yoğunlukta olduğunda, kültürü 10 dakika boyunca 3.500 G'de peletleyin.

Daha sonra süpernatanı bir vakum hattı kullanarak çıkarın ve bakterileri mililitre başına 10.000 koloni oluşturan birimde steril PBS ile yeniden süspanse edin. Şimdi anestezi uygulanmış 10 ila 12 haftalık valf C fareleri ve anestezi durumlarını bir çift künt cımbızdan hafif bir ayak parmağı tutamıyla onaylayın, bakteri süspansiyonlu nilüfer şırıngası ve 27 ila 30 gauge iğne takın. Daha sonra anestezi uygulanmış bir fareyi bir elinizle tırnağından tutun, diğer elinizle intraperitoneal 100 mikrolitre süspansiyon enjekte ederken, her bir fareyi kafesine geri yerleştirin.

Fareler tipik olarak enjeksiyondan 30 ila 40 saniye sonra uyanır. S pnömoni dozunun doğru alınması kritiktir, aksi takdirde fareler enfeksiyondan kurtulabilir veya lezyonların gelişmesi için çok hızlı bir şekilde invaziv pnömokok hastalığına gelebilir. Her bakteri türü farklı seviyelerde kulak merceğine sahip olduğundan, doğru dozu belirlemek deneme yanılma gerektirebilir.

Enfeksiyonun en az 24 saat erken bir aşamaya veya ileri evre bir enfeksiyon için 30 saate kadar ilerlemesine izin verin. Daha sonra enfekte olmuş her fareyi ötenazi yapın. İlk olarak, bir kan örneği alın, kuyruğu alkollü bir çubukla dezenfekte edin ve iki ila üç milimetrelik bir bölümü kesin.

Snip bölgesinden iki mikrolitre kan toplayın. Sodyum heparin içeren PBS'de kanı mililitre başına bir birim olacak şekilde on kat seyreltin. Triptik soya kanı agar plakaları üzerine beş seviye seyreltme uygulayın ve gece boyunca inkübe edin.

Ertesi gün koloni sayımlarını yapın. Bir sonraki bölümde anlatıldığı gibi kalbi hasat etmeye devam edin. Alternatif olarak, enfeksiyondan 30 saat sonra.

100 mikrolitre salin içinde ampisilin interperitoneal uygulayarak fareyi kurtarmaya çalışın. 36 saat boyunca her 12 saatte bir ampisilin sağlamaya devam edin ve istenen zaman noktalarında kalpleri toplayın. İlk önce kalbi hasat edin.

Ötenazi yapılmış fareyi cerrahi bir platformda sırtüstü pozisyonda hareketsiz hale getirin ve göğsüne %70 etanol püskürtün ve kurulayın. Cerrahi makas ve forseps kullanarak göğüs boşluğunu açın. Göğüs kafesini çıkarın ve kalbi ve akciğerleri ortaya çıkarmak için diyaframı kesin.

Daha sonra kalbe bağlı kan damarlarını kesin ve kalbi morarmadan nazikçe çıkarmak için forseps kullanın. Kalbi PBS ile durulayın ve koronal kesit için bir doku örneği toplama kasetine yerleştirin. Daha sonra kasetleri% 10 tamponlu formalin çözeltisine aktarın ve ertesi gün parafin gömme için gönderin.

Erken evrelerde, kardiyak lezyonlar renk görünümündeki değişiklikler ve bazı durumlarda bağışıklık hücrelerinin varlığı ile tanımlanabilir. İlerlemiş lezyonlarda, bağışıklık hücreleri yok ve büyük olacaktır. VA benzeri lezyonlar yerlerinde bulunur.

Pozitif yüklü cam slaytlar üzerinde beş mikronluk bir kardiyak kesit kullanarak, önce bölümleri dondurun, sonra çözün ve kurumaya bırakın. Slaytları 25 santigrat derecede 10 dakika boyunca% 10 nötr tamponlu formin içinde sabitleyin. Ardından, sabitleyiciyi üç yıkama ve PBS ile yıkama başına beş dakika boyunca çıkarın.

PBS'de %0.2 tritton X 100 ile dokuyu 15 dakika geçirgen hale getirin. Deterjanı düz PBS'de üç yıkama daha yaparak çıkarın. Daha sonra dokuyu PBS'de duruladıktan sonra bir saat boyunca PBS'de% 10 kaplama serumu ile bloke edin, bölümü 37 santigrat derecede iki saat boyunca antiserum ile örtün.

Negatif kontrolleri saf tavşan antiserumu ile tedavi edin Kardiyak doku, yüksek arka plan seviyelerine yol açan XI İmmünofloresan boyasını kolayca emdiğinden, farklı antikor türleri için inkübasyon süresindeki konsantrasyonun muhtemelen optimize edilmesi gerekecektir İki saat sonra, antis serumu PBS ile yıkayın. Daha sonra çözeltiyi ikincil bir antikorla değiştirin ve slaytların 37 santigrat derecede 30 dakika inkübe etmesine izin verin. Şimdi mililitre başına beş miligram DPI uygulayın ve slaytları PBS ile yıkayın.

Son olarak, slaytları zemine monte edin, kaydedin ve konfokal mikroskopi ile görüntüleyin. Parafini çıkararak ve doku bölümlerini nemlendirerek başlayın. Ksilen yıkamaları ve ardından kademeli bir dizi alkollü yıkama kullanın.

Daha sonra bölümleri beş dakika boyunca %0,2 fosfometik asit içinde yıkayın, ardından iki saat boyunca %0,1 ciddi kırmızı ve ric asit ile bir sonraki lekeyi beş dakika suyla durulayın. Daha sonra bölümleri 0.01 normal hidroklorik asit içinde üç dakika yıkayın ve bir dakika boyunca% 70 etanol içinde durulayın. Şimdi kademeli alkol banyosu serisini tersine çevirerek bölümleri kurutun, ardından ışık mikroskobu montajı kullanarak ksilen yıkayın ve slaytları değerlendirin.

Fareler, kaplanla yapılan bir meydan okumanın ardından invaziv pnömokok hastalığı geliştirdi. Ventriküllerde dört suş kardiyak mikro lezyon gözlendi ve pnömoninin gerçekten lezyonlar içinde olup olmadığını kontrol etmek için enfeksiyondan 24 ila 30 saat sonra lezyon boyutunda ve sayısında bir artış kaydedildi. Kesitler, Tiger four tarafından üretilen serotip dört kapsüler polisakkarit için boyandı.

Bu, mikrolezyon bölgelerinde sıkıca paketlenmiş ve yoğun agregaların varlığını doğruladı. Ampisilin ve enfekte olmamış kontrollerle kurtarılan farelerden alınan kardiyak kesitlerde Piro ciddi kırmızı boyama yapıldı. Kurtarmalarda.

Ventriküllerdeki eski lezyon bölgeleri gibi görünen bantlardan akan bantlarla lekenin varlığında ve yoğunluğunda dramatik bir artış oldu. Bu prosedürü denerken, bakteriyemi ve kardiyak mikro lezyonların oluşması için yeterli zamana sahip olması için enfeksiyonun en az 28 ila 30 saat devam etmesine izin vermek için fareleri S pnömonisi kullanımı ile enfekte etmeyi hatırlamak önemlidir.