Görselleştirme

Aşağıdaki deneyin genel amacı, enfekte farelerin kalbinde ESMO kardiyak mikro lezyon oluşumu için tekrarlanabilir bir protokol göstermektir. Bu, farelerin ESMO ile enfekte edilmesi ve baktereminin gelişmesine izin verilmesiyle sağlanır; böylece bakterilerin kalp damarlarına erişimi sağlanarak miyokardı istila etmeleri ve mikroskobik lezyonlar oluşturmaları mümkün olur. Ardından kalpler ya parafine gömülüp geleneksel yöntemlerle boyanır ya da immunofloresan boyama için OCT bileşiğine sabitlenir.

Boyanmış kesitlerin değerlendirmesi, miyokard boyunca rastgele dağılmış kardiyak mikro lezyonları, kollajen birikimlerini ve kardiyak mikro lezyonlar içindeki konvalesan miyokard kesitlerini ve pnömokok kapsüllerini gösterebilir. Prosedürü gerçekleştiren Armand Brown, laboratuvarımdaki bir lisansüstü öğrencisidir. Bu yöntem, farelerde invaziv pnömokok hastalığı sırasında S. pneumonia'nın kardiyak hasar etkileri hakkında bilgi sağlayabilir.

Ayrıca, insan dışı primatlar veya insanlar gibi diğer sistemlerden alınan kardiyak örneklere de uygulanabilir. ESMO Serotip dört suşu Tiger four'un Todd Hewitt besiyerinde, 620 nanometrede 0,5 optik yoğunluğa ulaşana kadar büyütülmesiyle başlayın. Doğru yoğunluğa ulaşıldığında, kültürü 3.500 G'de 10 dakika boyunca santrifüj ederek çökelteyin.

Ardından, süpernatantı bir vakum hattı kullanarak uzaklaştırın ve bakterileri mililitre başına 10.000 koloni oluşturan birim olacak şekilde steril PBS ile yeniden süspansiyon haline getirin. Şimdi, 10 ila 12 haftalık valve C farelerini anesteziye alın ve anestezi durumlarını küt uçlu bir cımbızla parmak ucuna hafifçe bastırarak doğrulayın; bakteriyel süspansiyonu şırıngaya çekin ve 27 ila 30 gauge bir iğne takın. Ardından, bir elinizle anestezi altındaki fareyi ensesinden tutarken diğer elinizle 100 µL süspansiyonu intraperitoneal olarak enjekte edin ve her bir fareyi tekrar kafesine yerleştirin.

Fareler genellikle enjeksiyondan 30 ila 40 saniye sonra uyanırlar. S. pneumoniae dozunun doğru ayarlanması kritiktir; aksi takdirde fareler enfeksiyondan kurtulabilir veya lezyonların gelişebileceği kadar süre geçmeden çok hızlı bir şekilde invaziv pnömokokal hastalığa yakalanabilirler. Her bakteriyel suşun farklı virülans seviyeleri olduğundan, doğru dozu belirlemek deneme yanılma yöntemi gerektirebilir.

Enfeksiyonun erken evre için en az 24 saat veya ileri evre enfeksiyon için 30 saat boyunca ilerlemesine izin verin. Daha sonra, enfekte olan her bir fareyi ötanize edin. Öncelikle, kuyruğu alkollü pamukla dezenfekte ederek iki ila üç milimetrelik bir kesit şeklinde kan örneği alın.

Kulak çentiği bölgesinden iki microliter kan toplayın. Kanı, mililitre başına bir unit sodyum heparin içeren PBS içinde on kat seri dilüsyonla seyreltin. Beş farklı dilüsyon seviyesini triptik soya kan agar plaklarına ekleyin ve bir gece boyunca inkübe edin.

Ertesi gün koloni sayımlarını yapın. Bir sonraki bölümde açıklandığı şekilde kalbin hasat işlemine geçin. Alternatif olarak, enfeksiyondan 30 saat sonra uygulanabilir.

100 µL serum fizyolojik içerisinde ampisilinle intraperitonal uygulama yaparak fareyi kurtarmaya çalışın. Ampisilin uygulamasına 36 saat boyunca her 12 saatte bir devam edin ve istenen zaman noktalarında kalpleri toplayın. İlk olarak, kalbi çıkarın.

Ötanazi uygulanmış fareyi bir cerrahi platform üzerinde sırtüstü pozisyonda sabitleyin, göğüs bölgesini %70 etanol ile püskürterek temizleyin ve kurulayın. Cerrahi makas ve pens kullanarak göğüs boşluğunu açın. Kalp ve akciğerleri açığa çıkarmak için göğüs kafesini çıkarın ve diyaframı kesin.

Ardından kalbe bağlı olan kan damarlarını kesin ve kalbi ezmeden nazikçe çıkarmak için pens kullanın. Kalbi PBS ile yıkayın ve koronal kesit alma işlemi için bir doku örneği toplama kasetine yerleştirin. Daha sonra kasetleri %10 tamponlu formalin çözeltisine aktarın ve ertesi gün parafin gömme işlemi için gönderin.

Erken evrelerde, kardiyak lezyonlar renk görünümündeki değişimle ve bazı durumlarda bağışıklık hücrelerinin varlığıyla tanımlanabilir. İleri evre lezyonlarda bağışıklık hücreleri yok olacak ve lezyonlar büyüyecektir. Bunların yerinde VA benzeri lezyonlar görülür.

Pozitif yüklü cam lamlar üzerindeki beş mikronluk kalp kesitlerini önce dondurun, ardından çözdürün ve havada kurumaya bırakın. Lamları 25 °C'de 10 dakika boyunca %10 nötr tamponlu formalinde sabitleyin. Daha sonra sabitleyiciyi, her biri beş dakika süren üç kez PBS ile yıkama yaparak uzaklaştırın.

Ardından dokuyu, PBS içinde %0,2 Triton X-100 ile 15 dakika boyunca geçirgenleştirin. Deterjanı, doğrudan PBS ile üç kez daha yıkayarak uzaklaştırın. Daha sonra dokuyu, PBS ile duruladıktan sonra PBS içinde %10 kaplama serumu ile bir saat boyunca bloke edin ve kesiti 37 °C'de iki saat boyunca antiserum ile inkübe edin.

Negatif kontrolleri naif tavşan antiserumu ile işleyin. Kardiyak doku, XI immunofloresan boyasını kolayca absorbe ederek yüksek arka plan seviyelerine yol açtığından, farklı antikor türleri için inkübasyon süresi ve konsantrasyonun optimize edilmesi gerekecektir. İki saat sonra, antiserumu PBS ile yıkayarak uzaklaştırın. Ardından çözeltiyi ikincil bir antikorla değiştirin ve lamları 37 °C'de 30 dakika boyunca inkübe edin. Şimdi 5 mg/mL DPI uygulayın ve lamları PBS ile yıkayın.

Son olarak, lamları kapatma medyumu ile kapatın, kaydedin ve konfokal mikroskopi ile görüntüleyin. İşleme, parafini uzaklaştırarak ve doku kesitlerini hidrate ederek başlayın. Ksilen yıkamalarını takiben dereceli bir alkol yıkama serisi uygulayın.

Ardından kesitleri beş dakika boyunca %0,2 fosfomolibdik asit içinde bekletin, ardından beş dakika suyla durulayın; sonra iki saat boyunca %0,1 sirius red ve pikrik asit ile boyayın. Daha sonra kesitleri üç dakika boyunca 0,01 normal hidroklorik asit ile yıkayın ve bir dakika boyunca %70 etanol ile durulayın. Şimdi, dereceli alkol banyosu serisini tersine çevirerek kesitleri dehidrate edin, ardından ksilen yıkamaları yapın, ışık mikroskobu için kapatma işlemi gerçekleştirin ve lamları değerlendirin.

Farelerde, Tiger 4 suşu ile yapılan challenge sonrası invaziv pnömokok hastalığı gelişti. Ventriküllerde kardiyak mikro lezyonlar gözlemlendi ve enfeksiyondan sonraki 24 ile 30. saatler arasında lezyon boyutunda ve sayısında artış kaydedildi. S. pneumoniae'nin gerçekten lezyonların içinde olduğunu doğrulamak için kesitler, Tiger 4 tarafından üretilen serotip dört kapsüler polisakkarit için boyandı.

Bu durum, mikrolezyon bölgelerinde sıkıca paketlenmiş ve yoğun agregatların varlığını doğruladı. Ampisilin ile kurtarılan farelerin ve enfekte edilmemiş kontrollerin kalp kesitlerinde Piro serious red boyaması gerçekleştirildi. Kurtarmalarda.

Ventriküllerde eski lezyon bölgeleri gibi görünen yerlerden yayılan bantlarla birlikte, boyanın varlığında ve yoğunluğunda dramatik bir artış gözlendi. Bu prosedürü uygularken, baktereminin ve kardiyak mikro lezyonların oluşması için yeterli sürenin tanıması amacıyla, enfeksiyonun en az 28 ila 30 saat boyunca ilerlemesine izin verecek miktarda S pneumonia ile farelerin enfekte edilmesi gerektiğini hatırlamak önemlidir.