Bir Penetran Mikro-elektrot Array ile bir Kırımsız Hipokampal Hazırlık Sinir Faaliyet Yayılım

Biz nöronların CA1-CA3 dizi koruyan bir in vitro katlanmamış hipokampus geliştirdik. Nüfuz mikro elektrot dizisi ile birlikte, sinir aktivitesi hem uzunlamasına hem de enine yönlerde izlenebilir. Tüm hipokampta yayılma aynı anda kaydedilebilir Bu yöntem hippocampal slice preparatlarda fazla avantajlar sağlamaktadır.

Bu prosedürün genel amacı, kemirgen hipokampusunun açılması ve düz doku preparatının penetran mikro elektrot dizisine yerleştirilmesi sürecini tanıtmaktır. Kayıt için. Bu, önce bir fare hipokampusunun beyninin yarısından izole edilmesiyle gerçekleştirilir.

İkinci adım, hipokampusun kavisli yapısını özel yapım aletlerle ortaya çıkarmaktır. Daha sonra, katlanmamış hipokampus kayıt odasına aktarılır ve kayıt dizisine yerleştirilir. Son adım, deneyden sonra katlanmamış hipokampusu diziden çıkarmaktır.

Sonuç olarak, nüfuz eden mikro elektrot dizisi tarafından kaydedilen nöral aktivite yayılımını göstermek için veri analizinde bireysel normalizasyon haritalama yöntemi kullanılır. Bu tekniğin temel avantajı, nöral aktiviteyi enine ve boyuna olmak üzere iki yönde kaydetmemize izin vermesidir. Nöral aktivitenin gerçek yayılımını görmek için, sağlam bir hipokampusa ihtiyacınız var, göçük kavanozlarını açın ve bir kayıt odasına düz bir şekilde uzanın ve yayılma daha sonra hem enine hem de boyuna yönlerde gerçekleşecektir.

Ve daha sonra dokunun yayılma hızını anlayabildik. Biz her iki yönde de faaliyetteydik ve yayılma mekanizmalarını, özellikle de sinaptik olmayan mekanizmaları inceleyebildik. Bu sinaptik iletim ile yayılan aktiviteyi bu boşluk bağlantılarıyla görebildik ve hız nedeniyle, bunun difüzyon olmadığını biliyoruz.

Şimdi bu yayılmanın gerçek mekanizmalarını çözmeye çalışıyoruz. Genel olarak, bu tekniğe yeni olan bireyler, hipokampusun açılması gibi zorlu prosedürler nedeniyle mücadele edecek ve düz doku preparatını, dokuya veya diziye zarar vermeden bu nüfuz eden mikro elektrot dizisine yerleştirecektir. Bu işleme başlamak için, fare kafasını buz gibi soğuk oksijenli sükroz içine yerleştirin.

Bir BOS, kafatasının derisini çıkarmak için bir çift ince makas kullanır. Daha sonra, kafatasını orta hat boyunca ve temporal lobun yakınındaki iki ucu kesin. Ardından kesilen kafatasını başın yanlarına doğru soyun.

Beyni açığa çıkarmak için, beyni spatula ile dikkatlice kafatasından çıkarın. Bundan sonra, beyni ıslak filtre kağıdı ile kaplı buz gibi soğuk bir cerrahi aşamaya yerleştirin. Beyincik'i buzla soğutulmuş bir bıçakla çıkarın.

Daha sonra beynin orta hattını keserek iki yarım küreyi ayırın. Daha sonra iki ayrılmış yarım küreyi buz gibi soğuk sakarozla dolu bir behere yerleştirin. %95 oksijen, %5 karbondioksit ile köpürmüş bir BOS

Bir yarım küreyi filtre kağıdı ile kaplı buz gibi soğuk aşamaya aktarın. Ekstra çözeltiyi emmek için beynin etrafına normal kağıt havlular veya filtre kağıtları yerleştirin. Daha sonra, hipokampusu ortaya çıkarmak için korteksi beynin orta kısmından ayırmak için iki ateşle parlatılmış cam pipet kullanın.

Daha sonra, dokuya iki ila üç damla buz gibi soğuk suse A BOS uygulayın ve fazla çözeltiyi çıkarın. Hipokampusun iki ucundaki korteks ile bağlantıları kesin. Daha sonra ateşle parlatılmış cam aletlerle hipokampusu beyinden çıkarın.

Daha sonra, tüm hipokampusu, ous tarafı yukarı bakacak ve hipokampal sulkus aşağı bakacak şekilde ayırın: Dokuya tekrar iki ila üç damla buz gibi soğuk BOS'u hızla uygulayın ve etrafındaki fazla solüsyonu çıkarın. Ardından, tüm hipokampusu ters çevirmek için ateşle parlatılmış cam aletini kullanın. Sulkusu ortaya çıkarmak için, hipokampusun septal ve temporal uçlarını kesmek için buz gibi soğuk bir bıçak kullanın.

Gerekirse, sulkusun içine özel yapım bir cam iğne sokun ve fiber yolunu DG'den yaklaşık üçe kadar kesin. Ardından DG'yi kenara çekmek ve hipokampusu açmak için metal bir tel halka kullanın. Tüm ameliyat süreci genellikle yaklaşık iki dakika sürer.

Dokuya iki ila üç damla daha buz gibi soğuk sükroz A BOS uygulayın ve etrafındaki fazla solüsyonu çıkarın. Ardından, katlanmamış hipokampusun kenarlarını buz gibi soğuk bir bıçakla kesin. Preparatı, kayıt odasına aktarmadan önce bir saat boyunca normal A BOS ile doldurulmuş ve oda sıcaklığında %95 oksijen, %5 karbondioksit ile köpürtülmüş geri kazanım odasına aktarın.

Bu prosedürde, bir şişeyi normal A BOS ile ve başka bir şişeyi dört AP A BOS balonu ile doldurun. %95 oksijen, %5 karbondioksit içeren çözeltiler deneylerin başından itibaren üretilmiştir. Bir deney sırasında hangi çözeltinin seçileceğini kontrol etmek için bir trivalf konektörü kullanın.

Ardından, odanın çıkışına bir vakum tüpü bağlayın. Çözeltiyi bir toz haznesine çıkarmak için, çözeltiyi kayıt odasına vermeden önce boru hattını ısıtın ve 35 santigrat derece kontrollü sıcaklıkta tutun. Kayıt odasının giriş ve çıkışını kapattıktan sonra, katlanmamış hipokampusu kayıt odasına aktarmak için özel yapım bir cam pipet damlalığı kullanın.

Mikroskop altında, katlanmamış hipokampusu, alvia tarafı aşağı bakacak şekilde, ca üç alan uzağa bakacak ve ca bir alan araştırmacıya doğru bakacak şekilde konumlandırın, kayıt odasının kenarından bir vakum pipeti kullanarak odadaki çözeltiyi dikkatlice aspire edin, oda kuruyana ve doku dizi üzerinde uzanana kadar. Ardından, katlanmamış hipokampusu dizi üzerinde tutmak için dokunun üzerine özel yapım bir doku ankrajını dikkatlice yerleştirin. Kayıt odasını birkaç damla çözelti ile doldurun.

IV açma haznesinde akış hızını saniyede yaklaşık iki damlaya ayarlamak için girişi ve çıkışı kademeli olarak açın. Kayıt odasındaki dokuyu normal A BOS ile yaklaşık bir dakika inkübe edin. Ardından çözümleri değiştirin.

Dört AP çözünmüş A BOS'a uygulayın ve akış hızını uygun şekilde ayarlayın. Dokuyu kayıttan önce yaklaşık beş ila 10 dakika boyunca dört AP çözünmüş A CS'de inkübe edin. Dokuyu PMEA'dan çıkarmak için, doku ankrajını bir mikro manipülatör ile kontrol edin ve ankrajı kayıt odasından kademeli olarak kaldırın.

Akışı durdurmak için hem girişi hem de çıkışı kapatın. Kayıt odasında, dokunun köşesini kaldırmak için küçük bir boya fırçası kullanın. Doku çözelti içinde yüzmüyorsa, doku hala dizi üzerinde otururken odayı dikkatlice kurutmak için vakum tüpünü kullanın.

Ardından, hazneyi kademeli olarak yeniden doldurmak için girişi dikkatlice açın ve akışı durdurmak için girişi kapatın. Kayıt haznesi dolduğunda, mendilin köşesini kaldırmak için küçük boya fırçasını kullanın. Yine. Doku çözelti içinde yüzüyorsa, dokuyu emmek için vakum tüpünü kullanın.

Girişteki akışı ve çıkıştaki vakumu açın. Sistemi damıtılmış suyla yıkayın ve kurulayın. Bu, bazal dendritik bölgede bulunan mikro elektrotlardan birinden kaydedilen ve 34.9 desibellik bir sinyal-gürültü oranı olan 100 Mikromolar dört AP tarafından indüklenen spontan aktivitenin bir örneğidir.

Ve işte kırmızı dikdörtgen içinde büyütülmüş aktiviteler. Bu, somata'ya daha yakın bulunan ve 27.2 desibellik bir sinyal-gürültü oranı gösterilen başka bir mikro elektrottan gelen ham verilerdir. İşte somatik tabaka içine yerleştirilmiş bir elektrottan elde edilen bir kaydın başka bir örneği.

Bu örnekte, sinyal-gürültü oranı 18,53 desibeldir ve burada bir mikro elektrottan kaydedilen temel gürültü verilmiştir. Taban çizgisi genellikle 150 ila 200 mikrovolt arasında bir tepeden tepeye değere sahiptir ve tek bir elektrotun empedansı bir ila iki mega ohm civarındadır. Bu video, dizi ile kaydedilen ve daha sonra bireysel normalleştirme yöntemi kullanılarak işlenen nöral yayılımı gösterir.

Veri analizinde, tüm doku boyunca tüm yayılma bu prosedürü takiben yaklaşık 100 milisaniye sürer. Nöro odakların hareketi gibi ek soruları cevaplamak için katlanmamış, hipokampus in vitu nörogörüntüleme gibi diğer yöntemler de gerçekleştirilebilir. Bu videoyu izledikten sonra, hipokampusun yerinde nasıl açılacağını, düz doku hazırlığının mikro ders dizisine nasıl açılacağını iyi anlamış olmalısınız.