Primer Tümör ve Akciğer Metastazı Eğitim için MEF Hücre İzolasyonu

Bu prosedürün genel amacı, farelerde meme kanseri tümör agenezini incelemektir. İlk olarak, fare meme tümörlerinden primer hücrelerin hazırlanması gösterilmektedir. Ardından, akciğer metastazını görüntülemek için fare akciğerinin nasıl çıkarılacağı sunulmaktadır.

Son olarak, mouse mammary tumor virus polyoma middle T antigen için transgenik farelerin meme kanseri tümör oluşumunu araştırmak için kullanılabileceğini gösteren bu yöntemler kapsamında, fare embriyolarından fare embriyonik fibroblastlarının hazırlanması gösterilmiştir. Bu yöntem meme kanseri hakkında bilgi sağlayabilmesinin yanı sıra, diğer katı tümörlerin araştırılmasında da uygulanabilir. Tümör çıkarma adımları sırasında diğer dokular yerine sadece tümörlerin izole edilmesi önemli olduğundan, bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi kritiktir. Bir mouse mammary tumor virus polyoma middle T antigen transgenik faresinin cildini, üretra ağzından boyun bölgesine kadar makasla açarak başlayın.

Ardından deriyi sabitleyin ve meme tümörünü izole edin. Tümörü in situ olarak soğuk PBS ile yıkayın ve tümörü steril 10 santimetrelik bir doku kültürü plağına yerleştirin. Daha sonra, plağı steril bir laminar akışlı kabine transfer edin ve tümörü bir kübik milimetre boyutundaki parçalara bölmek için steril bir jilet ve makas kullanın.

Parçaları kollajenaz ile 37 °C'de bir sarsıcılı inkübatörde inkübe edin. İki saat sonra, oluşan tümör dokusu süspansiyonunu santrifüjle çöktürün. Peleti üç kez daha PBS Resus ile yıkayın; son yıkamadan sonra peleti iki mililitre tripsin EDTA içinde 37 °C'de beş dakika boyunca karıştırarak süspande edin.

Ardından hücreleri üç kez daha yıkayın ve normal büyüme ortamında yeniden süspande edin. Son olarak, istenen hücre sayısına ulaşana kadar sonraki üç gün boyunca ortamı her gün değiştirerek hücreleri 10 santimetrelik bir doku kültürü tabağında inkübe edin. Akciğeri çıkarmadan önce karaciğeri ve diyaframı çıkarın ve kaburgaları yerinden ayırın.

Ardından, juguler vene yakın trakeanın üst kısmını açın ve akciğerleri doldurmak için trakeadan uygun ajanı enjekte etmek üzere bir kateter kullanın, akciğerleri çıkarın ve eğer Z fix kullanılıyorsa dokuyu parafine gömün. Çin mürekkebi kullanılıyorsa dokuyu beş dakika boyunca inec solüsyonunda bekletin; normal akciğer dokusu siyah renkte görünürken tümör nodülleri beyaz görünecektir. Sekonder bölgelerde gözlemlenen çapı 0,5 mm veya daha büyük olan tümör nodüllerini, fare embriyonik fibroblastları oluşturmak için metastaz olarak sınıflandırın.

İlk olarak, embriyoları rahatsız etmemeye dikkat ederek, gösterildiği gibi hamile bir farenin derisini üretra açıklığından boyna kadar açın. Ardından, uterus boynuzlarını çıkarın ve bunları steril PBS ile durulayın. Daha sonra embriyoları plasentadan dikkatlice ve teker teker ayırın.

Her bir embriyoyu, buz soğukluğunda PBS içeren 10 santimetrelik bir kültür kabına yerleştirin. Baş, karaciğer ve bağırsak çıkarıldıktan sonra, embriyonun kalan kısmını PBS içeren 12 kuyucuklu bir doku kültürü plağının bir kuyucuğunda durulayın ve gövdeyi bir kübik milimetrelik parçalara bölün. Dokuları beş mililitre tripsin EDTA içeren başka bir kuyucuğa aktarın ve dokuyu 37 derece Celsius'ta inkübe edin.

Beş dakika sonra, sindirimi durdurmak için bir mililitre FBS ekleyin. Ardından oluşan hücre süspansiyonunu santrifüjleyin ve peleti yeniden süspanse edin. Son olarak hücreleri, bir mililitre ılık DMEM içerisinde, antibiyotiklerle desteklenmiş 10 mililitre DMEM içeren 10 santimetrelik bir kültür kabına aktarın ve istenen hücre sayısına ulaşana kadar hücreleri kültüre edin.

Hayvanın sakrifiye edileceği tümör progresyon aşaması, spesifik çalışmaya ve I-A-C-U-C kılavuzlarına bağlıdır. Örneğin, fare meme tümörü virüsü polyoma orta T antijenine sahip olan bu 100 günlük FVB fare, az önce gösterildiği gibi bir meme tümörü izole edildikten üç ay sonra sakrifiye edilmiştir. Primer tümör hücreleri elde edilmiştir.

Birçok gen meme kanserinin akciğere metastazını yönettiği için, metastatik süreci incelemek amacıyla az önce gösterildiği gibi akciğerler de çıkarılmıştır. Tümör nodüllerini görüntülemek için akciğerler Z fix ile şişirilmiş ve Hindistan mürekkebi ile boyanmıştır. Burada, FVB suşu fare embriyolarından izole edilmiş fare embriyonik fibroblastları gösterilmektedir.

Bu videoyu izledikten sonra, primer fare tümör hücrelerini ve fare embriyonik fibroblastlarını nasıl izole edeceğiniz ve fare akciğerini nasıl çıkaracağınız konusunda iyi bir bilgiye sahip olmalısınız. İzofluran ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın; bu nedenle, bu prosedürü gerçekleştirirken her zaman kimyasal bir çeker ocak altında çalışmak gibi önlemler alınmalıdır.