Adli 'Dokunmatik DNA' Kanıt dan Basitleştirilmiş mikromanipulasyon tarafından Kurtarılan Tek İnsan Bioparticles geliştirilmiş Genetik Analiz

Bu prosedürün genel amacı, adli dokunmatik DNA kanıtlarından varsayılan biyopartiküller olarak adlandırılan bireysel veya aglomera hücreleri kurtarmak ve vericinin bir DNA profilini elde etmektir. Şiddet içeren bir suçun işlenmesi sırasında, bir saldırganın kurbanın bileğini tutması gibi, az sayıda hücre bir bireyden başka bir bireye aktarılır. Önce az sayıda hücreyi kurtarmak için, temas alanını örneklemek için bir mikroskop lamına bağlı düşük yapışma özelliğine sahip bir jel film kullanın.

İkinci adım, mikroskop altında daha kolay görüntüleme için aktarılan biyo parçacıkları boyamaktır. Ardından, mikro manipülasyon kullanarak biyo parçacıkları jel filmden izole edin. Suda çözünür yapıştırıcıyı bir tungsten iğnesinin ucunda toplayın ve jel film yüzeyinden ilgilenilen biyo parçacıkları çıkarmak için kullanın.

Son adım, tek tek toplanan biyopartiküllerin, eser DNA kanıtının donörünün bir DNA profilini elde etmek için nihai olarak geliştirilmiş DNA tipleme yöntemleri kullanılmak üzere bir PCR koleksiyonunun altındaki bir PCR amplifikasyon karışımına dikkatlice aktarılmasıdır. Tamam, benim laboratuvarımda, bir birey ile başka bir birey arasında veya bir birey ile bir nesne arasında kişiye karşı şiddet içeren bir suçun işlenmesi sırasında aktarılan az sayıda hücrenin genetik analizine odaklanıyoruz. Geleneksel yöntemler genellikle bu kadar az sayıda hücreden DNA profilini kurtarmada başarısız olur.

Burada, herhangi bir adli tıp laboratuvarına dahil edilebilecek tek tek hücreler veya hücre kümeleri gibi bu kadar az sayıda hücrenin fiziksel olarak geri kazanılması ve genetik analizi için basitleştirilmiş bir yöntem geliştirdik. Prosedürü göstermek, laboratuvarımda yüksek lisans öğrencisi olan Katie Fairish olacak. Bu işleme başlamak için, biyo parçacıkları toplamak için kullanılacak jel filmi hazırlayın.

Jel filmi, katı destek olarak kullanılan cam mikroskop lamı için uygun olan istenen boyutta kesin. Örneğin, üç inç'e bir inç'lik bir cam slayt için, iki inç'e 0,75 inçlik jel film boyutunu kullanın. Jel filmden beyaz desteği çıkarın ve jel filmi, tam bir bağlantı sağlamak için sıkıca bastırarak mikroskop kızağına takın.

Jel film yüzeyini kirletmeden jel film parçası boyunca basınç uygulanmasına izin vermek için çıkarılmaması gereken şeffaf bir üst koruyucu tabaka olduğunu unutmayın: Koruyucu tabaka takılı hazırlanan jel film slaytları, ihtiyaç duyulana kadar oda sıcaklığında saklanabilir. Jel filmi kullanmaya hazır olduğunuzda, şeffaf üst koruyucu tabakayı çıkarmak için steril cımbız kullanın. Jel film yüzeyini istenen dokunulan bir nesne veya yüzeyle doğrudan temas edecek şekilde yerleştirin.

Örneğin, bilekten insan derisi. Biyo partiküllerin jel filme verimli bir şekilde aktarılmasını sağlamak için az miktarda basınç uygulayın. Çok fazla baskı uygulamayın çünkü cam slayt aynı nesneden veya yüzeyden birden fazla numuneyi kırabilir veya aynı jel film parçası üzerine toplanabilir Aynı şekilde, biyo partiküller nesnelerden ve gömlek yakası gibi giyim eşyalarından toplanabilir.

Biyo partiküllerin jel film üzerine transferini doğrulamak için, trans veya epi aydınlatma kullanarak slaydı stereo mikroskopta inceleyin. Jel filmin daha geniş alanlarını görüntülemek için yaklaşık 20 x'lik bir büyütme en iyisidir, yaklaşık 200 x'lik bir büyütme ise tek tek biyo parçacıkları görüntülemek için en iyisidir. Jel film numune slaytını oda sıcaklığında kapalı bir slayt kutusunda saklayın.

Boyama ve/veya biyo partikül toplama için hazır olana kadar, görselleştirmeye yardımcı olmak için biyo partiküller boyanabilir. Bunu gerçekleştirmek için, önce daha önce gösterildiği gibi hazırlanan jel film numune slaytını bir lavabonun üzerindeki bir slayt boyama rafına yerleştirin. Tek kullanımlık bir transfer pipeti kullanarak, tüm jel film yüzeyini trian mavisi leke ile kaplayın, oda sıcaklığında bir ila iki dakika inkübe edin.

Gerekirse lekenin lavaboya akmasını sağlamak için sürgüyü eğerek fazla lekeyi çıkarın. Slayt, tek kullanımlık bir transfer pipeti kullanılarak steril su ile nazikçe su basılarak durulanabilir. Slayt havalandırıldıktan ve kurutulduktan sonra, uygun boyamayı sağlamak için bir stereo mikroskop kullanarak slaytı görüntüleyin.

Lekeli slayt, oda sıcaklığında kapalı bir slayt kutusunda saklanabilir. Uygun sayıda 0.2 mililitre PCR tüpünü bir rafa yerleştirerek ve tüpleri uygun şekilde etiketleyerek bu prosedüre başlayın. İstenilen sayıda numune için uygun hacimde STR amplifikasyon karışımı hazırlayın.

Vorteks ve master iyice karışır ve kısa bir süre mini santrifüj PI yolunda santrifüjlenir. 3.5 mikrolitre amplifikasyon. Her bir tüpü gevşek bir şekilde 0.2 mililitrelik tüp kapağına karıştırın.

Bir parça çift taraflı yapışkan bandı doğrudan bir cam bloğun üzerine yerleştirin. Bu, numune toplama sırasında 0.2 mililitrelik tüpü yerinde tutmak için kullanılacaktır. Temiz bir cam mikroskop lamına başka bir çift taraflı yapışkan bant parçası yerleştirin.

Ardından, çift taraflı yapışkan bandın üzerine bir parça suda çözünür dalga omuz bandı yerleştirin. Bandın uzunluğu boyunca baskı uygulayarak bandı yerine sabitleyin. Koruyucu üst beyaz tabaka daha sonra çıkarılabilir.

Ardından, ilk 0.2 mililitrelik tüpü cam blok üzerindeki çift taraflı yapışkan bant üzerine yerleştirin. Numune toplanana kadar bu tüpü bir kenara koyun. Düşük büyütme oranında görüntülerken suda çözünür dalga asker bant slaytını mikroskobun altına yerleştirin.

İğnenin ucundaki küçük miktarda veya yapışkan topunu toplamak için bandın yüzeyini nazikçe kazımak için bir dil standı iğnesinin ucunu kullanın. Yapışkan topun boyutu, toplanacak biyo parçacıkların sayısına bağlı olacaktır. Dikkatlice. Dilleri çıkarın.

İğnenin ucunu rahatsız etmeden mikroskop altından yapıştırıcı ile iğneyi dik tutun. Gerekirse iğneyi bir rafa yerleştirin. Prosedürün en kritik yönü, biyo partiküllerin toplanması ve aktarılmasıdır.

Başarıyı sağlamak için, analist bu tekniklerde yetkin olana kadar teknikler uygulanmalıdır. Slaytı desteklemek için bir cam blok kullanarak önceden hazırlanmış bir jel film örneğini mikroskop sahnesine yerleştirin. Biyo parçacıklar kolayca görüntülenene kadar odağı ve büyütmeyi ayarlayın.

Toplanacak biyo parçacıkları tanımlayın. Tungsten iğnesini yapışkan top ile alın ve iğneyi, ilgilenilen biyo parçacıkların bulunduğu jel film yüzeyinin üzerine yerleştirin. İğnenin ucunu biyopartikül ile temas edecek şekilde aşağı doğru bastırın.

Biyopartikülün toplandığından emin olmak için iğneyi yukarı kaldırın. İstenilen sayıda biyo parçacık toplanana kadar bu işlemi tekrarlayın. Mikroskop tablasına hazırlanmış bir 0.2 mililitrelik PCR tüpü yerleştirin.

Büyütmeyi, amplifikasyon karışımını içeren tüpün alt kısmı odakta olacak şekilde ayarlayın. Mikroskoptan görüntülerken, tungsten iğnesini, iğnenin ucu amplifikasyon karışımına girene kadar 0.2 mililitrelik PCR tüpüne dikkatlice yerleştirin. Yapıştırıcı çözülene ve biyo partiküllerin çözeltiye salındığı gözlenene kadar iğneyi amplifikasyon karışımında tutun.

İğneyi çıkarın. 0.2 mililitrelik tüpü dik olarak yerleştirin ve gevşek bir şekilde kapatın. Tungsten iğnesini önceden nemlendirilmiş bir alkollü mendille temizleyin ve ek numuneler için bu toplama prosedürünü tekrarlayın.

Toplanan biyo partiküllerin otozomal STR profillemesi için gelişmiş amplifikasyon protokolüne başlamak için, amplifikasyon karışımı içeren her 0.2 mililitrelik tüpe 1.5 mikrolitre lizis tamponu ekleyin ve biyo partiküller tüplerin kapaklarını sıkıca kapatın. Numuneleri termal döngüleyiciye yerleştirin ve amplifikasyon tamamlandığında protokol metninde açıklanan döngü koşullarını kullanarak numuneleri yükseltin. Amplifikasyon ürünlerini, kılcal elektroforez ile tespit edilmeye hazır olana kadar dört santigrat derecede saklayın.

Bir gömlek yakası örneğindeki tek tek biyo parçacıkların temsili görüntüleri gösterilmemiştir. Toplanan biyo parçacıklar daire içine alınır. Kırmızı daireler bir profilin kurtarıldığını gösterir.

Alel geri kazanım yüzdesi dahildir. Siyah daireler bir profilin kurtarılmadığını gösterir. Benzer şekilde, bu görüntüler, burada gösterilen bir gömlek yakası örneğindeki kümelenmiş biyo parçacıklara aittir, gömlek yakasından alınan bireysel biyo parçacık örneklerinden birinden elde edilen STR profilidir.

Doğruluğu, bir referans profiliyle karşılaştırılarak belirlendi. Alel sayıları, her lokusta her zirvenin altında belirlenir. X ekseni parça boyutunu temsil eder ve Y ekseni sinyal yoğunluğunu temsil eder.

Bu profil, makul ölçüde dengelenmiş inter lokus tepe yükseklikleri ve alelik bırakma olmaması ile yüksek kalitededir. Bu sonraki profil, gömlek yakasından alınan topaklanmış biyo parçacık örneklerinden birinden elde edilen tam bir STR profilidir. Son olarak, bu şekil, %3 alel geri kazanımı ile tek bir biyo partikülün başarısız DNA profillemesinin bir örneğini göstermektedir.

Bu yöntem, fiziksel saldırı vakalarında saldırganlardan tek kaynaklı DNA profillerinin kurtarılmasını teşvik etmelidir. Bu yöntemin, karışık DNA profillerinin yorumlanması ve evrişiminin çözülmesi ile ilgili bazı sorunları da ortadan kaldırdığı dikkatimizden kaçmamıştır.