Sistemik Bakteriyel Enfeksiyon ve Bağışıklık Savunma FENOTİPİ içinde

Bu prosedürün genel amacı, drosophila, melanogaster'e sağlam ve tekrarlanabilir bakteriyel enfeksiyonlar vermek, daha sonra enfeksiyon şiddetini ölçmek ve konakçı bağışıklık tepkisini ölçmektir. Bu, önce bakteriyel enfeksiyonun bir nano enjektör kullanılarak sineklere verilmesiyle gerçekleştirilir. Post mortalite zaman içinde enfeksiyon sonrası izlenebilir ve sistemik bakteri yükü, enfekte sineklerin homojenize edilmesi ve mevcut bakteri sayısının ölçülmesiyle herhangi bir noktada belirlenebilir.

Konak immün savunması, antibakteriyel peptit genlerinin ekspresyon seviyesinin ölçülmesi, sonuçta bakteriyel enfeksiyonun miktar tayini ve karakterizasyonu ile de ölçülebilir. Drosophila'da melanogaster, genetik ve çevresel faktörlerin sineğin bağışıklık yeterliliğini nasıl değiştirdiğini test etmek için kullanılabilir. Bu yöntem, konakçı genetik ve çevresel faktörlerin bağışıklık kabiliyetini nasıl etkilediği veya farklı bakterilerin enfeksiyonlarında nasıl farklılık gösterdiği gibi böcek bağışıklığı alanındaki temel soruları ele almak için kullanılabilir Kinetik, Bu yöntemi drosophila melanogaster'in bakteriyel enfeksiyona karşı bağışıklık savunmasını ölçmek için kullanıyor olsak da, diğer böceklere de uygulanabilir ve virüsler veya mantarlar gibi diğer patojen türlerinden yararlanabilir.

İnsanların bu yöntemi ilk öğrendiklerinde yaşadıkları yaygın bir sorun, sineklerde çok fazla yaralanmaya neden olabilmeleridir, bu da kontrollerde bile aşırı yüksek ölüm oranlarına neden olabilir. Bu yöntemin görsel gösterimi, sineğe en az zarar verecek şekilde enfeksiyonun nasıl yapılacağını öğrenmek için kritik öneme sahiptir. Ev sahibi türümüz oph melanogaster çok küçük olduğundan, enfeksiyonun mikroskop altında yapılması gerekir, bu da tekniğin başlangıçtaki karmaşıklığına katkıda bulunur.

Bununla birlikte, tekniğin küçük bir gösteriminin, sineklerle sınırlı deneyime sahip bilim adamları için bile erişilebilir hale getireceğine inanıyoruz. Deneye başlamak için, önceden hazırlanmış bir ana plakadan tek bir koloni seçin ve bir steril ortam şişesi aşılayın. Bakterileri gece boyunca 37 santigrat derecede sabit faza kadar büyütün.

Kültür durağan faza ulaştığında, hücreleri 600 mikrolitre kültürden bir masa üstü santrifüjde 5.000 kez üç dakika boyunca nazikçe peletleyin. G, ardından Rena ve Resus'u atın. Bakterileri 1000 mikrolitre steril fosfat tamponlu salin veya PBS içinde askıya alın.

Daha sonra, istenen 600 nanometre absorbansını elde etmek için yeniden askıya alınan hücreleri steril PBS'de seyreltin ve bu süspansiyonu sineklerin yalanlarını enfekte etmek için kullanın. Ödünç alınmış bir silikat cam kılcal çekerek bir cam iğne hazırlayın ve 50 mikrometre çapında bir açıklık oluşturmak için iğnenin ucunu kırmak için forseps kullanın. Ardından, tavan O-ringini ve beyaz ara parçası, büyük çukur dışa bakacak şekilde enjektörün metal pistonuna yerleştirin.

30 gauge iğneli bir şırınga kullanarak cam iğneyi mineral yağ ile doldurun. Daha sonra doldurulmuş cam iğneyi pensin içinden geçirin ve daha büyük O-ringi iğnenin kör ucundan bir milimetre uzakta tabanının etrafına yerleştirin. İğneyi metal pistonun üzerine kaydırın ve pens yerine oturana kadar yavaşça vidalayın.

Enjektör ile bakteri süspansiyonu arasında bir bariyer görevi görmesi için iğnede küçük bir hacimde yağ bırakarak mineral yağı enjektörden çıkarın. Mineral yağ, bakteri süspansiyonu veya iki sıvı arasında hava kabarcığı olmadığından emin olun. Ardından enjektörü enjeksiyon için istenen hacme ayarlayın.

Kılcal iğnenin ucunu dikkatlice bir steril PBS tüpüne sokun ve yaralama kontrolleri oluşturmak için enjektör iğnesini doldurmak için enjektör üzerindeki doldurma düğmesine basın. Anestezi uygulanmış sinekleri ventral lateral yüzeydeki anterior karın bölgesine steril PBS ile enjekte edin, enjekte edilen sinekleri yeni besiyeri olan taze şişelere yerleştirin ve sineklerin anesteziden kurtulmadan önce yiyeceğe yapışmasını önlemek için şişeleri yan yatırın. Ardından, kalan steril ortamı enjektörden çıkarın ve aynı iğneyi bakteri süspansiyonu ile yeniden doldurun.

Prosedürü tekrarlayın ve sineklere bakteri süspansiyonu enjekte edin. Alternatif olarak, enfeksiyon bir septik iğne deliği ile verilebilir. Enfekte edici pimi hazırlamak için 200 mikrolitrelik bir mikro pipet ucunun ucunu eritin ve erimiş plastiğe 0,15 milimetrelik bir böcek mnuchin pimi yerleştirin.

Plastiğin katılaşmasına izin verin, böylece pim plastikten uzanan 0,5 santimetrelik pim ile yerinde tutulur, karbondioksit ile anestezi yapın ve kanatların ve bacakların bağlanma yerlerinden kaçınarak toraksın sternal plevral plakasındaki sinekleri iğne ile delin. Yumuşak forseps kullanarak sinekleri minutia piminden çıkarın. Her sineği delmek arasında pimi bakteri süspansiyonuna batırdığınızdan emin olun.

Delinmiş sinekleri, tüm sinekler anesteziden iyileşene kadar şişeyi yan yatırarak yeni sinek ortamı olan taze bir şişeye yerleştirin. Enfekte sineklerin bir alt kümesini buz üzerindeki ayrı mikro santrifüj tüplerine yerleştirin. Her tüpe 250 mikrolitre PBS ekleyin ve sinekleri homojenize etmek için bir havaneli kullanın.

Daha sonra, homojenatı bir spiral plaka kullanarak bir LB havalandırın. Alternatif olarak, homojenatı seri seyreltme ile kaplamak için. Her sinek homojenatını 96'nın ilk satırına aktarın.

Kuyu plakası ve kalan sıraların her bir kuyusunu çok kanallı bir pipet kullanarak 90 mikrolitre PBS ile doldurun. Sinek homojenatı içeren ilk sıradan 10 mikrolitre alın ve homojenatı ikinci sıraya dağıtın. Homojenatı iyice karıştırmak için en az 10 kez yukarı ve aşağı sıkın.

Daha sonra 10 mikrolitre homojenat alın ve bir sonraki sıraya aktarın. En alt satırdan başlayarak kalan satırları kullanarak bu işlemi yineleyin. Her kuyucuktan 10 mikrolitre almak için çok kanallı pipeti kullanın ve bir LB plakasına koyun.

Numunelerin birbirine değmeyen ayrı noktalar olarak dağıtıldığından emin olun. Her sıradan tüm oyuklardan numune alınana kadar bu adımı tekrarlayın ve bunları LB plakası üzerinde azalan seyreltme sırasına göre dağıtın. Hangi kaplama yöntemi kullanılırsa kullanılsın, kolonilerin küçük ve gizli kalması için plakaları aşırı büyütmemeye dikkat edin.

Plakayı inkübatörden çıkarın. Deneysel bakteriler görünür koloniler haline geldikten sonra, ancak drosophila'dan kolonilerden önce, bağırsak mikrobiyotası spiral plakalar için yaklaşık 24 saat sonra görünür hale gelir. Plaka üzerindeki kolonilerin sayısına ve konumuna bağlı olarak mililitre homojenat başına bakteri yükünü tahmin edebilen otomatik bir koloni sayacı kullanarak büyüyen kolonileri sayın.

Spot plakalar için, 30 ila 300 koloni içeren herhangi bir seyreltmeden her sinek için kolonileri manuel olarak sayın ve orijinal homojenatın mililitresi başına bakteri sayısını hesaplayın. Sineklere, bir dizi optik yoğunluğu kapsayan 50 nanolitre bakteri süspansiyonu enjekte edildi ve hemen homojenize edildi ve kaplanmış enfeksiyon dozu, enjeksiyon için kullanılan bakteriyel süspansiyonun optik yoğunluğuna göre değişti. İlk bakteri yükleri, enjekte edilen ilk OD ile güçlü bir şekilde ilişkilidir.

Bu protokol, farklı enfeksiyon türlerinin gözlemlenmesini sağlar. Sinekler, 20 gün veya daha uzun süre devam eden kronik bir alt ölümcül enfeksiyona neden olabilen providencia rei ile enfekte olmuştur. Coli ile enfekte olmuş sinekler enfeksiyonu altı saat içinde temizleyecektir. Enfeksiyon sonrası.

Bağışıklık sisteminin indüksiyonu, RNA izolasyonu ve ardından antibakteriyel peptit transkriptinin Q rtpcr R'si yoluyla benzer şekilde tahmin edilebilir, ancak daha az kantitatif olarak antimikrobiyal peptit kontrolü altında GFP'yi eksprese eden uçar. Gen destekleyicileri, bir kez ustalaştıktan sonra bağışıklık sisteminin indüksiyonunu görselleştirmek için kullanılabilir. Bu teknik, saatte yüzlerce sineğin enfeksiyonuna izin verebilir.

Sineklerde enfekte olduktan sonra, öğrenme yeteneği, metabolik durum veya hayal edilebilecek hemen hemen herhangi bir başka özellik de dahil olmak üzere, herhangi bir sayıda fenotip makul bir şekilde ölçülebilir. Bu videoyu izledikten sonra, drosophila, melanogaster'a nasıl sağlam ve tekrarlanabilir bakteriyel enfeksiyonlar verileceğini ve daha sonra enfeksiyon şiddetini nasıl ölçeceğinizi ve konakçı bağışıklık tepkisini nasıl ölçeceğinizi iyi anlamış olmalısınız. Bazı bakterilerin insan sağlığı riskleri oluşturabileceğini unutmayın.

Uygun biyogüvenlik prosedürlerinin izlendiğinden ve enfekte sineklerin kaçmasını önlemek için yeterli koruma önlemlerinin alındığından emin olun. İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde iyi şanslar.