Kurumuş kan lekeleri - hazırlanması ve uzun ve moleküler teknikleri kullanmak için işleme

Bu prosedürün genel amacı, daha sonra immünolojik testlerde ve moleküler tekniklerde kullanılmak üzere kurutulmuş kan lekelerinin hazırlanması ve işlenmesi için standart bir protokol sağlamaktır. Bu, önce kılcal kanın alınması ve bir filtre kartına aktarılmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım, kan lekelerini gece boyunca kurutmak ve filtre kartının dairelerinden altı milimetrelik zımbalar elde etmektir.

Daha sonra, zımbalardan kurumuş kanın içi, en az dört saat boyunca bir çalkalayıcı üzerindeki tampona daldırılarak elde edilir. Hemolitik EIT'ler daha sonra santrifüjleme ile döküntülerden arındırılır. Son adım, Hepatit B, hepatit C ve insan immün yetmezlik virüsleri ile enfeksiyonların serolojik ve moleküler belirteçleri için temizlenmiş EIT'leri ticari olarak mevcut immünolojik testler ve moleküler tekniklerle analiz etmektir.

Hücreselden yapılmış bir filtre kartında toplanan arsayı kullanma fikri bir asır önce ortaya çıktı. Bununla birlikte, bu yöntemi ilk kez kullanan insanlar bugün bile sıklıkla mücadele edeceklerdir, çünkü son analizleri için kurutulmuş kan lekelerinin hazırlanmasını ve işlenmesini içeren tüm pre-analitik aşama, kurutulmuş kan lekesi testinin hemen hemen tüm uygulamaları için standartlaştırılmamıştır. Bu arka plan göz önüne alındığında, daha sonra immün test ve moleküler tekniklerde kullanılmak üzere kurutulmuş kan lekelerinin hazırlanması ve işlenmesi için kapsamlı, standartlaştırılmış bir adım adım protokol öneriyoruz.

Bu metodolojinin görsel olarak gösterilmesi, kılcal kanın alınması gibi birkaç adım olarak çok önemli görünmektedir. Bu doğru. Filtre kartlarına geçiş veya kalabalıktan uygun yumrukların hazırlanmasını öğrenmek kolay değildir ve sonuç olarak, tekniği ilk kez kullanan kişiler şüphesiz görsel temsilden faydalanacaktır.

Nico'nun parmağından kılcal damar kanı, laboratuvarımızdan bir teknisyen tarafından alınacak ve işleme prosedürünü gösterecektir. Elde edilen kan lekeleri, cilt delinmesi için moleküler biyolojik teşhis için laboratuvarımızda uzun yıllardır çalışmakta olan teknisyen ko tarafından yapılacaktır. İlk önce bir çift tek kullanımlık lateks lastik eldiven giyin.

Cilt ponksiyonundan önce hasta ellerini ısıtmalıdır. Üst delinme bölgesine doğru kan akışını zenginleştirmek için parmağa büyük ölçüde masaj yapılır. Daha sonra ucun Palmer tarafının, yazmayan elin üçüncü veya dördüncü parmağının distal falanksının cildini uygun bir dezenfektanla temizleyin, cildi tek kullanımlık bir güvenlik neşteri ile delin.

Parmaklar, yerçekiminin parmak ucunda kan toplanmasını kolaylaştıracak bir pozisyonda tutulmalıdır. İlk kan damlasını bir gazlı bezle silin, çünkü fazla doku sıvıları içerebilir. Delinme bölgesindeki kan akışını artırmak için parmağınıza tekrar masaj yaptıktan sonra, aşağıdaki damlayı yüzeye doğrudan parmak ucunuzla dokunmadan bir filtre kartının dairelerinden birine aktarın.

Bir sonraki büyük kılcal kan damlasının parmak ucunda oluşmasına izin verin ve bir sonraki dairede toplayın. Toplama sırasında gerekli tüm halkalar dolana veya kan akışı durana kadar bu işleme devam edin. Kanın sadece kılcal kuvvetlerle filtrenin dokusuna batırılmasına izin verin.

Kan akışı filtre kartının gerekli tüm dairelerini doldurmak için yeterli değilse, parmağınızı aşırı sıkmayın veya sağmayın. Kan akışı durursa, parmak ucuna bir bandaj yerleştirin, kan lekelerini kurutmak için muayene için daha fazla kan gerekiyorsa başka bir parmağa ikinci bir cilt delme işlemi yapın, filtre kartlarını biyolojik tehlike güvenlik kabininde temiz bir kağıt havlu üzerine koyun ve tercihen gece boyunca oda sıcaklığında kurumasını bekleyin. Herhangi bir harici ısı kaynağının yokluğunda, kurutma işlemi tamamlandığında, kan lekeleri eşit derecede koyu kahverengimsi bir renge sahiptir ve artık depolama için kırmızı alanlar görünmez.

Numuneleri nemden korumak için filtre kağıdı kartını bir ila iki kurutucu poşet içeren tek bir gaz geçirimsiz fermuarlı torbaya koyun. Bu torbayı mümkün olan en kısa sürede eksi 20 santigrat derece veya daha düşük bir sıcaklığa sahip bir dondurucuya aktarın. Dondurucular tarla koşullarında mevcut değilse, eksi dört santigrat derecede veya hatta ortam sıcaklığında 14 güne kadar saklama mümkündür.

Derece 9 0 3 filtre kartı transferinin her kanla ıslatılmış dairesinden tek kullanımlık altı milimetrelik bir cihazla bir noktayı delin, tüm delinmiş kurutulmuş kan lekelerini tek bir hastadan 12 kuyucuğuna kadar delin. Kuyu plakası kuyuyu %0.05 ile %20 ve %0.08 Sodyum azid içeren fosfat tamponlu tuzlu su ile doldurun. Moleküler analizler yapmak için ikinci bir kurutulmuş kan lekesi EIT serisi elde etmek için bu adımları tekrarlayın.

Daha sonra hücre kültürü plakasını bir laboratuvar çalkalayıcıya koyun ve zımbayla kurutulmuş kan lekelerinin en az dört saat veya tercihen gece boyunca nazikçe elüte olmasına izin verin. Ertesi gün, lekeler neredeyse kandan arındırılmıştır ve hemolitik süpernatanlar oluşmuştur. Bu EIT'leri mikro santrifüj tüplerine aktarın, daha sonra 10.500 kez G'de iki dakika santrifüjlemeye tabi tutun.

Ellucian santrifüjlü EIT'ler sırasında oluşan herhangi bir enkazdan gelen süpernatantlar artık amaçlanan analizler için kullanılmaya hazırdır. İlk EIT serisi, serolojik testler için kaplara aktarılır. İkinci seri, PCR analizi için mikro tüplere aktarılır.

Ticari olarak mevcut tahlilleri kullanarak hepatit B virüsü, hepatit C virüsü ve HIV enfeksiyonu belirteçleri için EIT'leri araştırın ve ilgili üreticinin talimatlarını dikkatlice izleyin. Son olarak, tam otomatik analizör üzerinde yapılan serolojik testlerin sonuçları sistem ekranında görüntülenir. Kurumuş kan lekelerinin hazırlanması ve işlenmesi için önerilen protokolün etkinliği ilk olarak hepatit B virüsü yüzey antijeni tayinlerine göre 1.762 birleştirilmiş serum kurutulmuş kan lekesi çiftinin analiz edilmesiyle değerlendirildi.

Tahlil protokolü değiştirildi, çünkü mililitre başına 0.05 uluslararası birimlik bir kesme değeri ile EIT'lerin% 56.2'si Sarah'dan elde edilen sonuçlara kıyasla reaktifti. Bu, hepatit B virüsü yüzey antijen testinde %14.7'lik bir yanlış pozitif orana karşılık geldi. Verilerin alıcı çalışma karakteristiği analizi, eşik değerin mililitre başına 0.15 uluslararası birime çıkarılmasının, hepatit B virüsü yüzey antijeninin varlığı için serum kurutulmuş kan lekesi çiftlerini araştırırken, Hepatit B virüsü yüzey antijeni pozitiflerinin hepatit B virüsü yüzey antijen negatiflerinden ideal bir şekilde ayrılmasına neden olacağını göstermiştir. sadece iki tutarsızlık elde edildi.

İki yanlış negatif Sarah, antiviral tedavi altındaki hastalardan kaynaklandı. Tam kan EIT'lerinden gerçek zamanlı PCR ile H-B-V-D-N-A'nın kalitatif tayini% 93'lük bir duyarlılık verdi, bu nedenle düşük serum H-B-V-D-N-A konsantrasyonlarına sahip yedi numune tespit edilmedi. Kurutulmuş kan lekesi EIT'lerinden sadece dört yanlış negatif anti HCV sonucu belirlendi.

İlgili C, büyük olasılıkla, enfeksiyonları uzun zaman önce çözülmüş olan hastalardan alınmıştır. Kurutulmuş kan lekesi EIT'lerinden H-C-V-R-N-A tayinleri için %100'lük analitik duyarlılık, H-C-V-R-N-A amplifikasyonu için kullanılan izotermal transkripsiyon aracılı amplifikasyon yaklaşımının mükemmel hassasiyetini göstermiştir. Kurutulmuş kan lekesi EIT'lerinde anti HIV antikorlarının tam otomatik bir sistemle tespiti de %100'lük bir analitik duyarlılıkla sonuçlanmıştırBu video, günümüzde hepatit B, hepatit C ve HIV enfeksiyonlarının serolojik ve moleküler belirteçlerini, nispeten yüksek bir elüsyon hacmi kullanıldığında ve serum veya plazma araştırmaları için oluşturulan deneme protokollerinin modifikasyonları yapıldığında bile, sıkı kan lekelerinin tümünde güvenilir bir şekilde tespit etmenin mümkün olduğunu göstermektedir. önemli ölçüde değişmedi.

Bununla birlikte, iletilen sonuçlar, kurutulmuş kan lekeleri tekniğinin doğal sınırlarını da doğruladı. Bazı durumlarda. Söz konusu protokol, çalışmanın pilot aşamasında Almanya'nın Berlin ve Essen şehirlerindeki 534 aktif uyuşturucu kullanıcısı üzerinde de saha koşullarında test edilmiştir: ilaçlar ve kronik bulaşıcı hastalıklar.

Elde edilen sonuçlar, altı ek büyük Alman şehrinde uyuşturucu çalışmasının ana aşaması için test algoritmasında küçük bir değişikliğe yol açmıştır.