Küçük Molekül-modüle Farklılaşma ve sonraki Glikoz şiddetli açlık kullanma İnsan uyarılmış pluripotent kök hücrelerin yüksek oranda saf kardiyomiyositlerde türetilmesi

Bu prosedürün genel amacı, insan indüklenmiş pluripotent kök hücrelerinden türetilmiş saflaştırılmış bir kardiyomiyosit popülasyonu oluşturmaktır. İlk olarak, insan indüklenmiş pluripotent kök hücreleri, yaklaşık %85 konfluense ulaşana kadar hücre monokatmanında kültüre edilir. Daha sonra, Wnt hücre sinyal yolunu aktive eden küçük bir molekül bileşik eklenir ve mezoderm oluşumunu indüklemek için hücreler iki gün boyunca inkübe edilir.

Ardından, kardiyak mezoderm farklılaşmasını belirlemek için wind hücre sinyal yolunu inhibe eden küçük bir molekül bileşiği hücrelere eklenir. Hücreler daha sonra iki gün daha inkübe edilir. Yedinci güne gelindiğinde, farklılaşmış kardiyomiyositler atmaya başlar; heterojen farklılaşmış hücre popülasyonu, kardiyomiyositleri seçici olarak saflaştırmak için düşük glukozlu bir hücre kültürü besiyerinde inkübe edilir.

Son olarak, yüksek düzeyde saflaştırılmış bir atan kardiyomiyosit popülasyonu üretimini doğrulamak için hücreler ışık mikroskobu altında görsel olarak incelenir ve akış sitometrisi ile analiz edilir. Bu tekniğin küçük molekül kullanan diğer kardiyomiyosit farklılaşma protokollerine göre temel avantajı, ek bir glikoz yoksunluğu adımı içermesidir. Bu durum, glikoz dışındaki hücresel enerji kaynaklarını kullanabilen kardiyomiyositleri saflaştırmamıza olanak tanır.

Kardiyomiyosit olmayan hücreler, diferansiye hücrelerden oluşan bu heterojen popülasyondan seçici olarak uzaklaştırılabilir. Ardından kardiyomiyositler, in vitro hastalık modelleme veya yüksek kapasiteli ilaç keşfi gibi sonraki aşamalarda kullanılabilir. Deney için hazırlık aşamasında, beraberindeki metinde açıklandığı üzere altı kuyucuklu plakaları hücre dışı matriks çözeltisi (ECMS) ile önceden hazırlayın ve dondurulmuş insan kaynaklı pluripotent kök hücre (HI PSCs) flakonunu çözdürün.

Santrifüjle yıkama işleminden sonra, çözülmüş hücreleri rock inhibitörü içeren E eight içerisinde süspanse edin. Ardından, vial içeriğini ECM kaplanmış altı kuyucuklu bir plakanın bir kuyucuğuna aktarın. Hücreleri 37 °C sıcaklıkta ve %5 karbondioksit içeren bir inkübatöre yerleştirin.

24 saat sonra hücreler yapışmış olacaktır. Besiyerini, rock inhibitörü içermeyen E eight besiyeri ile değiştirin. Hücreleri kültüre etmeye devam edin ve E eight besiyerini günlük olarak yenileyin.

HI PSC'ler %75 ila %80 konfluense ulaştığında, pasajlama zamanı gelmiş demektir. Kültür ortamını hızlıca aspire edin. Kuyucukları bir mililitre steril oda sıcaklığında PBS ile yıkayın ve PBS'yi aspire edin.

Ardından 500 µL 0,5 mM EDTA veya başka bir hücre ayırma çözeltisi ekleyin. Oda sıcaklığında bir ila yedi dakika inkübe edin; mikroskop monitörü kullanarak kolonilerin kenarlarında kıvrılma veya kalınlaşma gözlemlendiğinde, hücre ayırma çözeltisini aspire edin. Daha sonra, bir P 1000 pipet kullanarak 10 µM rock inhibitörü ile desteklenmiş 1 mL E8 besiyeri ekleyin ve H-I-P-S-C kolonilerini plakadan tamamen ayırarak 5 ila 10 hücre kümesi oluşturana kadar tekrarlayan şekilde pipetleyin.

Ardından, büyük hücre kümelerini daha fazla dağıtmak için süspansiyonu 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Burada gösterildiği gibi, daha küçük kümeler oluşana kadar pipetle aşağı yukarı çekme işlemi uygulayın. Sonra, 1 mililitrelik hücre süspansiyonuna rok inhibitörü içeren 11 mililitre E sekiz ortamı ekleyerek hücreleri 1'e 12 oranında seyreltin.

Ardından, önceden kodlanmış plakalardaki ECMS'yi aspire edin. Plakaların her bir kuyucuğuna iki mililitre resüspande edilmiş hücre ekleyin; altı kuyucuklu bir plaka için kuyucuk başına yaklaşık 100.000 hücre idealdir; hücrelerin kuyucuk merkezinde kümelenmesini önlemek için hücreleri kuyucuk çevresine eşit şekilde dağıtmaya özen gösterin. Plakayı 24 saat boyunca inkübatöre yerleştirin.

Ertesi gün, besiyerini rok inhibitörü içermeyen E eight ile değiştirin. Hücreler %80 konfluense ulaşana kadar besiyerini her 24 saatte bir yenileyin. Tipik olarak hücreler, EDTA veya bir Xcel ayırma çözeltisi ile disosiyasyondan sonra üç ila altı gün içinde tekrar pasajlanmaya hazır hale gelir; farklılaşma için ECM kaplı altı kuyucuklu kültür plaklarına yaklaşık 100.000 insan iPSC ekin.

Hücreler %85 konfluens düzeyine ulaştığında, HI PSC'ler için uygulanan adımların aynısını takip ederek; insülin içermeyen ancak altı mikromolar GSK three beta inhibitörü CHIR 9 9 0 2 1 içeren R-P-M-I-B 27 besiyerine geçiş yapın. Hücreleri 48 saat inkübe edin ve her gün mikroskop altında inceleyin.

CHIR uygulamasının 24 saatinden sonra önemli miktarda hücre ölümü gözlemlenebilir. Bu durum normaldir ve iki günlük uygulamadan sonra yaygın olarak görülür. hPSC'lerin boyutunda ve sayısında artış görülür ve mezodermal bir kadere doğru farklılaşmaya devam ederler.

CHIR içeren kültür ortamını R-P-M-I-B 27 insülinli ortamla değiştirin ve üçüncü güne kadar inkübe edin. Üçüncü günde, ortamı insülinsiz R-P-M-I-B 27 ile değiştirin. Beş mikromolar Wnt inhibitörü IWR-1 ekleyin ve hücreleri 48 saat boyunca inkübe edin.

Beşinci günde, hücreleri mikroskop altında inceleyin. Mezodermal hücrelerin kardiyak soy hattına yönelmiş olması, birleşmeye başlaması ve karakteristik dal benzeri yapılar oluşturması gerekir. Besiyerini tekrar insülinsiz R-P-M-I-B 27 ile değiştirin ve hücreleri 48 saat boyunca inkübe edin.

Yedinci günde. Daha sonra her üç günde bir ortamı insülin içeren R-P-M-I-B 27 ile değiştirin; sekizinci ve 10. gün arasında aynı ortamla değiştirme işlemini tekrarlayın. Kardiyomiyositlerin spontan atımları, diferansiyasyonun 10. gününden sonra görülecektir.

Hücre alanlarının %50'den fazlası atmaktadır. Bununla birlikte, atan hücre tabakaları non-kardiyomiyositlerle karışık olabilir; 10. günde dal benzeri yapılar oldukça belirginleşecektir. Terminal diferansiye olmuş kardiyomiyositler bu noktadan sonra prolifere olmayacaktır.

Diferansiyasyon sonrası 10. günde, altı kuyucuklu plakanın her bir kuyucuğundaki besiyerini iki mililitre düşük glukozlu besiyeri ile değiştirin ve hücreleri 13. güne kadar üç gün boyunca bu besiyerinde tutun. 13. günde, hücreleri insülin içeren R-P-M-I-B 27 besiyerine geri döndürün veya isteğe bağlı olarak, glukoz açlığı sırasında kardiyomiyosit olmayan hücrelerin ayrışmasını kolaylaştırmak için hücreleri reflate edin.

Besiyerini aspire edin ve bir kez PBS ile yıkayın. 500 µL hücre dissosiyasyon enzimi ekleyin ve hücreleri beş dakika inkübe edin. Beş dakikalık enzim uygulamasının ardından, kardiyomiyositleri bir P 1000 yardımıyla manuel olarak pipetleyerek tek hücre süspansiyonu haline getirin. Hücreler dissosiye olduktan sonra, 30 defaya kadar yukarı-aşağı pipetleme yaparak hücreleri 15 mL'lik konik bir tüpe aktarın.

Hücre ayrıştırma enzimini seyreltmek için beş mililitre insülinli R-P-M-I-B 27 besiyeri ekleyin ve 200 Gs hızında dört dakika boyunca santrifüj edin; ardından süpernatantı aspire ederek atın. Daha sonra hücreleri iki mililitre R-P-M-I-B 27 besiyerinde yeniden süspande edin ve yeni bir ECMS kaplı altı kuyucuklu plakaya ekin. Optimal hücre sağkalımı için genellikle konfluens ile birlikte hücre sağkalımı artar.

Altı kuyucuklu bir kapta kuyucuk başına 2 milyon hücre yeniden ekleyin. Yeniden eklenmemiş hücreler için 14. günde, ikinci bir glukoz yoksuniyeti döngüsü kültürü için besiyerini tekrar iki mililitre düşük glukozlu besiyeri ile değiştirin. Hücreleri bu düşük glukoz durumunda üç gün daha tutun.

Kardiyomiyosit dışındaki hücrelerin çoğu 17. günde ölecektir. Besiyerini, insülin içeren iki mililitre R-P-M-I-B 27 ile değiştirin. Geriye kalan hücreler yüksek düzeyde saflaştırılmış kardiyomiyositler olacaktır.

Bu hücreler, gen ekspresyon analizi, ilaç tarama, metabolik analiz ve diferansiyasyon ile glikoz açlığı yöntemiyle saflaştırma sonrası kardiyomiyosit saflığını incelemek için çeşitli diğer alt analizlerde kullanılabilir; hücreler, kardiyomiyosit belirteçleri olan kardiyotropin ve T CTN T'ye karşı immün boyama ile karakterize edilmiştir. Diferansiye olmuş hücrelerin saflaştırılmamış bir popülasyonunun immünofloresan mikroskopisi, birçok hücrenin yeşil renkte gösterilen CTN T pozitif olduğunu ancak birçok hücrede CTN T ekspresyonunun eksik olduğunu ortaya koyarak 13. günde kardiyomiyosit olmayan hücrelerin varlığına işaret etmiştir. Buna karşılık, 10. günde başlayan üç günlük glikoz açlığından sonra, 13. günde neredeyse tüm hücreler CTNT pozitif çıkmış ve bu durum glikoz açlığı sonrası kardiyomiyositlerin başarıyla saflaştırıldığını göstermiştir.

Bu veriler, akış sitometrisi analizi kullanılarak daha da doğrulanmıştır. Kırmızı ile belirtildiği üzere, glukoz açlığına maruz kalmayan hücrelerin yaklaşık %50'si tn NT two pozitiftir. Glukoz açlığına maruz kalan hücrelerin ise %90'ı tn NT two pozitiftir.

Bu videoyu izledikten sonra, insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerini yüksek derecede saflaştırılmış kardiyomiyosit popülasyonlarına nasıl farklılaştıracağınız konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Bu saflaştırılmış hücreler, çeşitli aşağı akış in vitro uygulamaları için yüksek verimli bir şekilde üretilebilir. Pluripotent kök hücreleri kültüre ederken, mesajlaşma öncesinde yüzde yüz konfluense ulaşmalarına izin verilmemesi gerektiğini unutmayın.

Bazı kök hücre hatları, başlangıçtaki pluripotent kök hücre konfluens oranı %85'ten az olduğunda en iyi şekilde diferansiye olur. Son olarak, bazı kök hücre hatları glikoz yoksunluğu adımına daha hızlı veya daha şiddetli yanıt verebilir. Yeni kök hücre hatlarıyla çalışmadan önce bu parametreleri her zaman izleyin.