Name: Küçük Molekül-modüle Farklılaşma ve sonraki Glikoz şiddetli açlık kullanma İnsan uyarılmış pluripotent kök hücrelerin yüksek oranda saf kardiyomiyositlerde türetilmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 53 s
Description: Keşfedin, insan uyarılmış pluripotent kök hücrelerinden küçük molekül modülasyonu ve glikoz açlığı kullanarak yüksek saflıkta kardiyomiyosit türetme yöntemini. Bu teknik kardiyovasküler hastalık modellemesi ve ilaç taraması için güçlü bir protokol sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma kısmen NIH/NHBI (U01 HL099776-5), NIH Direktörünün Yeni Yenilikçi Ödülü (DP2 OD004411-2), California Rejeneratif Tıp Enstitüsü (RB3-05129), Amerikan Kalp Derneği (14GRNT18630016) ve Lucile Packard Çocuk Vakfı ve Stanford'daki Çocuk Sağlığı Araştırma Enstitüsü'nden (SMW'ye) Bağışlanmış Fakülte Burs Ödülü tarafından desteklenmiştir. Ayrıca Amerikan Kalp Derneği Doktora Öncesi Bursu 13PRE15770000 ve Ulusal Bilim Vakfı Lisansüstü Araştırma Burs Programı DGE-114747 (AS) 'den fon desteğini de kabul ediyoruz.

NOT: Bu protokolde kullanılan tüm reaktifler için Satıcı bilgileri Tablo 1&#39;de listelenen olmuştur ve Malzeme Listesi. Hücrelerle temas Bütün çözeltiler ve ekipmanlar, steril olmalı ve aseptik teknik buna göre kullanılmalıdır. Aksi belirtilmediği sürece, bir nemlendirilmiş 37 ° C,% 5 CO2 kuluçka tüm kültür inkubasyon yapın. Bu protokol, her farklılıklar hangi hiPSCs tohumlanmış olan, 6 oyuklu plakalar içerisinde gerçekleştirilir. Farklılaşması ve arıtılmasından sonra hücreleri kesilerek edilebilir ve aşağı doğru kullanımı için kaplandı. 1. Orta Hazırlık <ol><li> E8 ortam için, her bir orta bileşeni için bir stok çözelti (NaHCO 3, L-askorbik asit 2-fosfat, sodyum selenit, transferin, insülin, FGF2, TGFb1) bu -20 ° C&#39;de çözüm saklayın. DMEM / F12 şişesine stok çözümleri uygun miktarda ekleyin ve sterilize etmek filtre. Çözelti ConcentrHisse senedi bileşenleri ve E8 orta tirme ve reaksiyon kurulum Tablo 1&#39;de bulunabilir. </li><li> Hücre-dışı matris solüsyon için, 4 ° CO / H de (genellikle 10 mg / ml&#39;de verilir) taban membran matrisi eritin. Insan pluripotent kök hücreleri, alfa-6-p-1 integrini 9 kullanarak bu malzemeye de bağlı olabilir, çünkü Matrigel yaygın pluripotent kök hücre kültürü için kullanılmıştır. Bir kez buz soğukluğunda pipet uçları ve tüpler buz üzerinde 2.25 mg (250 | il) alikotları sağlamak ve -80 ° C&#39;de alikot saklamak çözülmüş. <ol><li> ECM&#39;li plakaları ön kaplanması yaparken, çözülme ve buz üzerinde hücre dışı matriks solüsyonu (ECMS) bölmeyin. 1 oranında ECM ve buz soğukluğunda, DMEM / F12 ortamı karıştırma: 200 buz üzerinde. Erken ECMS katılaşma önlemek için serin tutun. </li></ol></li><li> Insülin ortamı, RPMI / B27 için, RPMI ortamı, 500 ml B27 eksi İnsülin 10 mi ekleyin. </li><li> Orta (insülin) ile RPMI / B27 için, Insuli ile (B27 Supplement 10 ml ekleyinn) ve RPMI ortamı 500 ml Pen-strep antibiyotik 5 mi. </li><li> Düşük glukoz ortamı için, B27 eki 10 ml ve glikoz bulunmayan RPMI ortamı 500 ml Pen-strep antibiyotik 5 ml ilave ediniz. </li><li> : 1 oranında dondurma / dondurarak saklama ortamı, bir 9 dimetilsülfoksit (DMSO) ile birlikte fetal sığır serumu karıştırın. dondurma ortamı 4 ° C&#39;de 1 aya kadar saklanabilir. Not: Tüm ortamlar filtrelenmiş ve depolanmış 4 ° C ve, aksi belirtilmediği sürece, 2 hafta içerisinde kullanılmalıdır. Aksi belirtilmediği sürece aşağıda kullanılan tüm reaktif / çözeltisi hacimleri, 6-çukurlu plaka içindeki tek bir oyuk için tasarlanmıştır. </li></ol> 2. ECM&#39;li 6 oyuklu levhalar Ön kaplama <ol><li> Daha sonra 6-delikli plaka için her bir oyuğa taze ECMlerin 2 ml uygulanır 200: 1 lik bir oranda buz soğukluğunda DMEM / F12 ortamında (örneğin, Matrigel) bazal membran matrisi karıştırılmasıyla ECMler sağlayın. Oyuk, 6 oyuklu plaka içerisinde her bir yaklaşık olarak 90 mg ECMler alacaktır. </li><li> ECM inkübeS, 37 ° C&#39;de 1 saat boyunca plakaları kaplama. Her çukurdan, aspirat DMEM / F12 çözeltisi hücreleri kaplama hemen önce. Plakalar daha sonra hücrelerin almaya hazır olacaktır. </li></ol> 3. Çözülme Dondurulmuş hiPSCs NOT: optimal kültürleme ve donma / çözülme döngüsü aşağıdaki hiPSC-CMS içine hiPSCs mansap farklılaşmasına neden olabilir yakından bu prosedürü izleyin. <ol><li> 6 gözlü bir plakanın her bir için hiPSCs bir şişe çözülme. Her bir şişeye, kaya inhibitörü (10 uM) ile, soğuk E8 ortamın 9 ml, 15 ml lik konik bir tüp hazırlanır. ROCK inhibitörü kriyopreservasyona 10 aşağıdaki hiPSCs sağkalım geliştirir. Yaklaşık 5 mm çapında buz kristali kalana kadar hücreleri çözülme için 37 ° C su banyosu içinde şişeleri tutun. </li><li> % 70 etanol ile şişelerin dış püskürtün. Steril laminer kaput onları geçmeden önce kağıt mendil ile silin şişeleri. </li><li> Hazırlanan konik tüp içine hücreleri aktarın. T durulayınO E8 ortamının 500 ul ile bir kez şişe ve aynı konik tüp çözülmüş hücreleri içeren ortam transfer. 200 x g&#39;de 4 dakika boyunca oda sıcaklığında santrifüje. </li><li> Santrifüj işleminden sonra süpernatan aspire yavaşça ROCK inhibitörü (10 uM) ile E8 ortamının 2 ml hücre pelletini. 6 yuvalı plaka ECMler ile önceden kaplanmış bir oyuğuna yeniden süspansiyon haline hücreleri aktarın. </li><li> Kültürleme 24 saat sonra ROCK inhibitörü olmadan E8 ortamı ile orta değiştirin. Hücreler bu zamana kadar yapıştırılır olmalıdır. </li></ol> HiPSCs 4. pasaj <ol><li> Tipik olarak, bir 6-yuvalı plaka içinde% 75 -80% Ortak akışkanlığa eriştikten sonra geçit hiPSCs. Kültür ortamı aspire. Hızlı bir şekilde, steril 1 ml RT PBS ile yıkayın. Aspire PBS. <ol><li> 500 0.5 mM EDTA ul ya da 1 x hücre ayırma çözeltisi (ör Accutase) ilave edilir ve oda sıcaklığında 1-7 dakika inkübe edilir. EDTA inkübasyon için uygun zaman hiPSC hattı ile değişir. Görünür kıvırma o görmek için bekliyoruzkenarlarda kolonilerin r kalınlaşma, bu o EDTA veya hücre dekolmanı çözümü gösterecektir olarak kaldırılacak hazırdır. </li></ol></li><li> EDTA veya hücre dekolmanı çözümü aspire. 10 uM KAYA inhibitörü ile takviye edilmiş E8 ortamın 1 ml ilave edilir. Tekrar tekrar yukarı ve aşağı pipetleme ve P1000 pipet ile koloniler kapalı püskürtülerek kuyudaki hiPSC kolonileri yerinden. Koloniler tamamlanmasından sonra 5-10 hücre kümeleri içine kırılmış olmalıdır. </li><li> 15 ml konik bir tüp içine ROCK inhibitörü ile E8 1 ml ortam maddesi içinde süspansiyon haline getirilmekte koloniler aktarın. </li><li> E8 orta küçük kümeleri içine büyük hücre kümeleri bozar. Hücreleri sulandırmak için hücre süspansiyonu önleyicisi ile E8 ortamın uygun bir hacim. seyreltme için eklemek için ortam hacmi hücre yoğunluğuna bağlıdır ve kuyuların sayısının numaralı seribaşı olan. İdeal olarak, hiPSCs tek,% 80 konfluent de 1:12 seyreltilmelidir. <ol><li> Ce mevcut 1 ml ROCK inhibitörü ile 11 ml E8 orta ekledaha önce zikredilen 15 ml konik bir tüp içinde ll çözelti 1:12 seyreltme elde edildi. </li></ol></li><li> Ayrıca (Her fragmanı 50-200 hücreleri iyi civarında) küçük hücreli parçalara hücre kümeleri çiğnemek. Bu hücre sağkalım azaltır kaçının aşırı triturating. </li><li> Aspire önceden kaplanmış plakalar gelen ECMS ve her kuyuya yeniden süspanse hücrelerin 2 ml ekleyin. 6-çukurlu plaka içinde çukur başına yaklaşık 100,000 hücre idealdir. Iyi merkezindeki hücrelerin kümeleme önlemek için kuyu etrafına eşit hücreleri dağıtmak hedefliyoruz. </li><li> Kültür, 24 saat sonra, ROCK inhibitör olmadan E8 ortamı ile orta yerine. Hücreler% 80 konfluent hale gelene kadar kültür ortamı, her 24 saat değiştirin. Sonra, hücreler yine geçit hazırız. Genellikle% 80 konfluent ulaşmak için ayrılmış geçitlerin arasında yer 3-6 gün sürer. </li></ol> 5. Donma hiPSCs NOT: optimal kültürleme ve kalça mansap farklılaşmasına neden olabilir yakından bu prosedürü takipHiPSC-CMS içine SC&#39;ler donma / çözülme döngüsü aşağıdaki. <ol><li> Hücre hattı adı, hücre tipi, geçit numarası ve donma tarih kriyojenik tüpler etiketleyin. Genel bir kural olarak, bir 6-çukurlu bir levhanın her çukuruna için, bir şişe kullanılır. KAYA inhibitörü (10 uM) ile E8 ortamın 9 ml ile dolu bir 15 ml&#39;lik konik bir tüp hazırlanır. % 90 FBS ve% 10 DMSO içeren ortam dondurma hazırlamak ve kullanmak için hazır olana kadar 4 ° C &#39;de orta tutun. </li><li> Kültür ortamı aspire 500 0.5 mM EDTA ul ya da 1 x hücre ayırma çözeltisi eklenmekte ve oda sıcaklığında 2-7 dakika inkübe edilir. EDTA ya da hücre ayırma çözeltisi maruz kalma süresi hücre çizgisi için hücre hattından değişir. </li><li> Aspire EDTA veya hücre dekolmanı çözümü. E8 ortamın 1 ml ilave edilir. </li><li> Yukarı ve aşağı pipetleme ve P1000 pipet ile koloniler kapalı püskürtülerek kuyudaki hiPSC kolonileri yerinden. Koloniler 100&#39;den küçük hücre kümeleri kırık olmamalıdır. E8 içeren hazırlanmış konik tüp askıya hücreleri aktarın. Ar SantrifüjT 200 x g&#39;de 4 dakika karıştırıldı. </li><li> Süpernatant aspire ve pelet soğuk dondurma orta 500 ul ekleyin. 1-2 kez pipetleme pelletini. Hücre canlılığı, iri topaklar hücreleri tutarak artırıldı. </li><li> Etiketlenmiş bir kriyojenik tüp içine yeniden süspansiyon haline getirilmiş hücreler aktarın. Hızlı bir şekilde yavaş yavaş soğutulması için sağlayacak bir dondurma konteyneri içeren izopropanol içine şişeleri hareket eder. Daha sonra uzun süreli saklama için sıvı nitrojen hücreleri transferi, 24 saat süre ile, -80 ° C&#39;de hücrelerle tutun. </li></ol> İnsan IPSC 6. Kardiyak Farklılaşma NOT: ilave bütün ortam oda sıcaklığında en az olmalıdır. <ol><li> EDTA veya 1x hücre ayırma çözeltisi ile ayrıldıktan sonra, yaklaşık olarak 100,000 farklılaşması için ECMlerin kaplanmış 6 oyuklu kültür plakaları, insan iPSCs (hücre pasajı prosedürler ile aynı) adımlarını tohum. Hücreler% 85 confluency ulaştığında, 6 ile insülin orta olmadan RPMI / B27 orta değiştirmekuM GSK3-beta önleyicisi CHIR99021 (CHIR) ve 48 saat boyunca muhafaza edilir. </li><li> 48 saat sonra, insülin ortamı, RPMI / B27 CHIR-içeren kültür ortamı yerine ve (3. gün kadar) 24 saat süre ile, tek başına bırakın. </li><li> 3. günde, 5 mcM Wnt inhibitörü IWR1 ile insülin olmadan RPMI / B27 medya değiştirmek ve (5 gün kadar) 48 saat boyunca muhafaza edilir. Not: Daha önceki çalışmalarda 11&#39;de tarif edildiği gibi, Wnt engelleme, aynı zamanda, diğer küçük molekül bileşikleri kullanılarak denenebilir. IWR1 nedeniyle Wnt 11 sinyal önlenmesinde etkili olduğu gösterilmiş olan artmış dizi diğer küçük molekül önleyicileri, Wnt üzerinde seçildi. </li><li> 5. günde, insülin ortamı olmadan geri RPMI / B27 orta değiştirebilir ve (7 nci gün kadar) 48 saat süre ile bırakın. </li><li> 7. günde, (insülin) ile RPMI / B27 ortamı ile orta yerine ve aynı ortam her bundan 3 gün sonra orta yerine. Kardiyomiyositlerin Spontan dayak ilk günden yaklaşık günde 8 görünür olmalıdır10. </li></ol> Glikoz Açlık ile İnsan kardiyomiyositlerde 7. saflaştırılması <ol><li> 10. günde sonrası farklılaşma olarak, 6-çukurlu plaka 2 mi düşük glukoz ortamı her bir gözündeki aracını değiştirme ve (günlük 13 kadar), 3 gün boyunca bu ortamda hücreleri korumak. </li><li> Gün 13&#39;te, (insülin) ile RPMI / B27 ortamı, hücreleri döndürür. </li><li> İsteğe bağlı olarak, glukoz açlık sırasında sigara kardiyomiyositlerin kolay ayrılması için izin kültür plaka olmayan kardiyomiyositlerde gevşetmek yardımcı glukoz açlık ikinci turda önce kardiyomiyositlerde Replate. <ol><li> 13. günde, aspirat ortam içinde, bir kez PBS ile yıkanır ve 37 ° C&#39;de 5 dakika boyunca, hücre ayrışma enzim 500 ul kullanılarak tek tek hücreler içine hücreleri ayırmak. Özellikle, enzim işlemi, 5 dakika sonra, el ile art arda hücre ayrışma enzim çekerek ve cardiomyo karşı püskürtülerek 6-çukurlu plaka kardiyomiyositlerde ayırmak için 1000 ul pipet kullanıncyte tek tabaka. 30 pipetleme tekrar kadar tek tek hücreler içine kardiyomiyositlerde ayırmak için gerekli olabilir. </li><li> Hücreler ayrılmış ve tek hücreli bir formda olduğu sonra x g 200 ° C&#39;de 4 dakika süreyle hücre ayrışma enzimi ve santrifüj sulandırmak için insülin ile RPMI / B27 ortamı, 5 ml ile dolu bir 15 ml&#39;lik konik bir tüp içine, tüm hücreleri toplamak. Aspire ve süpernatant atın. </li><li> Yeni ECMS kaplı 6-plaka üzerine 2 ml RPMI / B27 orta ve plaka hücreleri yeniden askıya. Tipik olarak, kardiyomiyositlerinin yüksek confluency şarjı sırasında hücre sağkalım ile yardımcı olur. Şarjı sırasında optimum hayatta kalmak için yeni 6-kuyu tabak başına 2 milyon hücre Replate hedefliyoruz. </li></ol></li><li> 14. günde, ikinci bir glikoz yoksunluğu döngüsü için tekrar düşük glikoz ortamında 2 ml orta değiştirin. Kültür 3 gün daha, bu düşük glukoz halinde olan hücreler. Olmayan kardiyomiyositlerin çoğu bu düşük glikoz kültür durumda ölecek. </li><li> Günün 17 at, R orta 2 ml değiştirmekInsülin PMI / B27 ortamıdır. kalan hücreler yüksek derecede saflaştırılmış kardiyomiyositler olacaktır. Bu kardiyomiyositlerde gen ifade analizi, ilaç tarama, metabolik analizi ve çeşitli alt-tahliller için de kullanılabilir. </li></ol>

<ol><li>Sharma, A., Wu, J. C., Wu, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+for+cardiovascular+disease+modeling+and+drug+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for cardiovascular disease modeling and drug screening.</a> Stem Cell Research & Therapy. 4 (6), 150(2013).</li>
<li>Kehat, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+embryonic+stem+cells+can+differentiate+into+myocytes+with+structural+and+functional+properties+of+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Human embryonic stem cells can differentiate into myocytes with structural and functional properties of cardiomyocytes.</a> The Journal of Clinical Investigation. 108 (3), 407-414 (2001).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+cardiomyocytes+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Functional cardiomyocytes derived from human induced pluripotent stem cells.</a> Circulation Research. 104 (4), e30-e41 (2009).</li>
<li>Kattman, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stage-specific+optimization+of+activin%2Fnodal+and+BMP+signaling+promotes+cardiac+differentiation+of+mouse+and+human+pluripotent+stem+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Stage-specific optimization of activin/nodal and BMP signaling promotes cardiac differentiation of mouse and human pluripotent stem cell lines.</a> Cell Stem Cell. 8 (2), 228-240 (2011).</li>
<li>Lian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+cardiomyocyte+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+via+temporal+modulation+of+canonical+Wnt+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (27), E1848-E1857 (2012).</li>
<li>Sharma, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+as+an+in+vitro+model+for+coxsackievirus+B3-induced+myocarditis+and+antiviral+drug+screening+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes as an in vitro model for coxsackievirus B3-induced myocarditis and antiviral drug screening platform.</a> Circulation Research. 115 (6), 556-566 (2014).</li>
<li>Lian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+cardiomyocyte+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+by+modulating+Wnt%2Fbeta-catenin+signaling+under+fully+defined+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/beta-catenin signaling under fully defined conditions.</a> Nature Protocols. 8 (1), 162-175 (2013).</li>
<li>Tohyama, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+metabolic+flow+enables+large-scale+purification+of+mouse+and+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Cell Stem Cell. 12 (12), 127-137 (2013).</li>
<li>Rodin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+self-renewal+of+human+pluripotent+stem+cells+on+human+recombinant+laminin-511%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Long-term self-renewal of human pluripotent stem cells on human recombinant laminin-511.</a> Nature Biotechnology. 28 (6), 611-615 (2010).</li>
<li>Li, X., Meng, G., Krawetz, R., Liu, S., Rancourt, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ROCK+inhibitor+Y-27632+enhances+the+survival+rate+of+human+embryonic+stem+cells+following+cryopreservation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+And+Development%22%5BJournal%5D)">The ROCK inhibitor Y-27632 enhances the survival rate of human embryonic stem cells following cryopreservation.</a> Stem Cells And Development. 17 (6), 1079-1085 (2008).</li>
<li>Burridge, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemically+defined+generation+of+human+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Chemically defined generation of human cardiomyocytes.</a> Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+promotes+highly+efficient+cardiac+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells%3A+the+matrix+sandwich+method%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix promotes highly efficient cardiac differentiation of human pluripotent stem cells: the matrix sandwich method.</a> Circulation Research. 111 (9), 1125-1136 (2012).</li>
<li>Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+de+novo+cardiomyocytes%3A+human+pluripotent+stem+cell+differentiation+and+direct+reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Production of de novo cardiomyocytes: human pluripotent stem cell differentiation and direct reprogramming.</a> Cell Stem Cell. 10 (1), 16-28 (2012).</li>
</ol>

Yazarlar çıkar çatışması beyan etmezler.

Yüksek ölçüde saflaştırılmış hiPSC türetilmiş kardiyomiyositlerin büyük miktarda elde temel kardiyak araştırmalar ve klinik ve çeviri uygulamalar için kritik önem taşır. Kalp farklılaşma protokolleri küçük molekül-modüle ve tek tabaka-temelli yöntemler 5 nihayet kardiyojenik büyümeyi kullanan embriyoid vücut temelli yöntemlerden geçiş, son yıllarda muazzam gelişmeler geçirmiş sandviç yöntemleri 12 matris, 2 faktörleri, ve var. Anılan protokol, burada açıklanan protokol yüksek ve küçük mo...

Primer insan kardiyomiyositler nedeniyle invaziv kardiyak biyopsiler, çünkü kültür yoksul uzun vadeli hücre canlılığı tek hücrelere dissociating zorluk için gereğinin elde etmek zordur. Birincil insan kardiyomiyositler, hastaya özgü insan uyarılmış pluripotent kök hücre kaynaklı kardiyomiyosit bu eksikliği göz önüne alındığında (hiPSC-CM) teknolojisi temel araştırma için güçlü bir alternatif kardiyomiyosit kaynağı yanı sıra hastalık modelleme ve ilaç olarak klinik ve translasyonel uygulamaları olarak kabul edilmiştir keşif 1. Kardiyomiyositlere pluripotent kök hücrelerin ayırt Erken çabaları embriyoid organları (EBS) ile farklılaşma protokolleri istihdam, ama bir EB hücrelerin genellikle az 25 den% kardiyomiyositlerde 2,3 yenerek çünkü bu yöntem üreten kardiyomiyositlerde verimsizdir. Nispeten, A ve BMP4 aktivin sitokinler kullanarak tek tabaka-tabanlı farklılaşma protokolü EBS daha yüksek verimlilik görüntülenen, ancakBu protokol, hala nispeten verimsizdir insan pluripotent kök hücre hatları 4, sınırlı sayıda pahalı büyüme faktörleri ve tek işlevleri gerektirir. Son zamanlarda, bir yüksek verimli, hiPSC tek tabaka-tabanlı kardiyomiyosit farklılaşma protokolü Wnt / β-katenin sinyal 5 modüle tarafından geliştirilmiştir. Bunlar hiPSC-CM&#39;ler kardiyak troponin T ve alfa aktinin, kardiyomiyositlerinin 6 standart belirteçleri iki sarkomerik proteinleri ifade eder. protokol burada açıklamak bu küçük molekül tabanlı, besleyici, hücre içermeyen, tek tabaka farklılaşma yöntemi 5,7 bir uyarlamasıdır. Biz 7-10 gün (Şekil 1) sonra hiPSCs gelen kardiyomiyositlerde yenerek elde edebiliyoruz. Ancak,% 50 hücreleri yenerek sonuçlanan bir kardiyomiyosit farklılaşması takip, sürekli immün, kalp-özel troponin T ve alfa-aktinin olarak kardiyomiyosit-spesifik belirteçler için negatif olmayan kardiyomiyositlerin bir nüfusun varlığını göstermektedir. Fu içinrther kardiyomiyositlerde saflaştırılması olmayan kardiyomiyositlerde ortadan kaldırmak, heterojen farklılaşmış hücre popülasyonları birden fazla gün boyunca son derece düşük bir glikoz kültür ortamı (Şekil 2) ile muamele etmek suretiyle açlık glikoz tabi tutuldu. Bu tedavi seçici düşük glukoz ortamında 8 hayatta kalmak için birincil enerji kaynağı olarak laktat metabolize kardiyomiyositlerin yeteneği nedeniyle sigara kardiyomiyositlerde, ancak sigara kardiyomiyositler, ortadan kaldırır. Bu saflaştırma adımından sonra, sigara kardiyomi kardiyomiyositlerin oranında% 40&#39;lık bir artış (Şekil 3, Şekil 4), görülmektedir ve bu hücreler, aşağı doğru gen ifade analizi, hastalık modelleme ve ilaç tarama deneyleri için de kullanılabilir.

<table><tbody><tr><td>Matrigel (9-12 mg / ml)</td> <td>BD Biosciences</td><td>354277</td><td></td></tr><tr><td>RPMI ortamı</td><td>Invitrogen</td><td>11835055</td><td></td></tr><tr><td>Glikoz içermeyen RPMI ortamı</td><td>Invitrogen</td><td>11879-020</td><td></td></tr><tr><td>B27 Eksi İnsülin</td><td>İnvitrojen</td><td>A1895601</td><td></td></tr><tr><td>B27 Takviyesi (insülin ile)</td><td>İnvitrojen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Pen-strep antibiyotik</td><td>İnvitrojen</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu</td><td>BenchMark</td><td>100-106</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D-2650</td><td></td></tr><tr><td>ROCK inhibitörü Y-27632</td><td>EMD Millipore</td><td>688000</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Thermo Fisher</td><td>508306</td><td></td></tr><tr><td>IWR1</td><td>Sigma</td><td>I0161</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Millipore</td><td>SCR005</td><td></td></tr><tr><td>Hücre kaldırıcı</td><td>Fisher</td><td>08-100-240</td><td></td></tr><tr><td>Cryovial</td><td>Fisher (NUNC tüpleri)</td><td>375418</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Select Enzim</td><td>İnvitrojen</td><td>12563-011</td><td></td></tr></tbody></table>

küçük molekül-modüle farklılaşma ve sonraki glikoz şiddetli açlık kullanma İnsan uyarılmış pluripotent kök hücrelerin yüksek oranda saf kardiyomiyositlerde türetilmesi

Derivation of Highly Purified Cardiomyocytes from Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Small Molecule-modulated Differentiation and Subsequent Glucose Starvation

İnsan uyarılmış pluripotent kök hücre kaynaklı kardiyomiyositler (hiPSC-CM&#39;ler) temel araştırma ve translasyonel uygulamaları için kullanılabilir birincil kardiyomiyositlerinin eksikliği gidermek için önemli bir hücre kaynağı haline gelmiştir. Kardiyomiyositlere hiPSCs ayırt etmek için, embriyoit gövdenin (EB) tabanlı türev ve büyüme faktörü indüksiyonu da dahil olmak üzere çeşitli protokoller geliştirilmiştir. Bununla birlikte, bu protokoller verimsiz ve saflaştırılmış kardiyomiyositlerde oluşturmak için yetenekleri açısından oldukça değişkendir. Son zamanlarda, Wnt / β-katenin sinyal, küçük bir molekül tabanlı bir protokol kullanılarak modülasyonu, yüksek verimlilik ile kardiyak farklılaşmasını teşvik ettiği gösterilmiştir. Bu protokol ile, farklılaşmış hücrelerin% 50&#39;den daha fazla -60% kardiyak troponin pozitif kardiyomiyositler sürekli gözlendi idi. Ayrıca kardiyomiyosit saflığını arttırmak için, farklılaşmış hücre spesifik, metabolik bir fark temelinde-kardiyomiyositlerde ortadan kaldırmak için açlık glikoz tabi tutuldukardiyomiyositler ve non-kardiyomiyositlere arasındaki s. Bu seçim strateji kullanarak, sürekli olarak farklılaşmış bir hücre popülasyonunda olmayan kardiyomi kardiyomiyositlerin oranında% 30&#39;dan fazla bir artış elde edilmiştir. Bu son derece saflaştırılmış kardiyomiyositlerde nitro hastalık modelleme çalışmaları ve ilaç tarama tahlillerinde İnsan iPSC tabanlı sonuçların güvenilirliğini geliştirmek gerekir.

hiPSC farklılaşma sırasında morfolojik değişimler. besleyici içermeyen plakalarda kültürlenmiştir hiPSC olarak düzlemsel ve iki boyutlu koloniler büyüdü. Yaklaşık% 85 konfluent hale geldikten sonra, hiPSCs farklılaşması (Şekil 1A) 6 uM CHIR ile muamele edilmiştir. Hücre ölümü, normal ve normal bir durum, önemli miktarda CHIR tedavi 24 saat sonra gözlenmiştir. CHIR tedavisinin iki gün sonra, hiPSCs bir mezodermal kaderi doğru ayırt devam etti. HiPSC koloniler...

Burada, kardiyovasküler hastalık modellemesi ve ilaç taraması amacıyla saflaştırılmış kardiyomiyositlerin üretimini sağlayan, küçük molekül modülasyonlu kardiyak farklılaşma ve glikoz yoksunluğu aracılı kardiyomiyosit saflaştırmasını birleştiren insan kardiyomiyosit türevi için sağlam bir protokol açıklıyoruz.

Küçük Molekül-modüle Farklılaşma ve sonraki Glikoz şiddetli açlık kullanma İnsan uyarılmış pluripotent kök hücrelerin yüksek oranda saf kardiyomiyositlerde türetilmesi

Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) have become an important cell source to address the lack of primary cardiomyocytes ...

Bu prosedürün genel amacı, insan indüklenmiş pluripotent kök hücrelerinden türetilmiş saflaştırılmış bir kardiyomiyosit popülasyonu oluşturmaktır. İlk olarak, insan indüklenmiş pluripotent kök hücreleri, yaklaşık %85 konfluense ulaşana kadar hücre monokatmanında kültüre edilir. Daha sonra, Wnt hücre sinyal yolunu aktive eden küçük bir molekül bileşik eklenir ve mezoderm oluşumunu indüklemek için hücreler iki gün boyunca inkübe edilir.Ardından, kardiyak mezoderm farklılaşmasını belirlemek için wind hücre sinyal yolunu inhibe eden küçük bir molekül bileşiği hücrelere eklenir. Hücreler daha sonra iki gün daha inkübe edilir. Yedinci güne gelindiğinde, farklılaşmış kardiyomiyositler atmaya başlar; heterojen farklılaşmış hücre popülasyonu, kardiyomiyositleri seçici olarak saflaştırmak için düşük glukozlu bir hücre kültürü besiyerinde inkübe edilir.Son olarak, yüksek düzeyde saflaştırılmış bir atan kardiyomiyosit popülasyonu üretimini doğrulamak için hücreler ışık mikroskobu altında görsel olarak incelenir ve akış sitometrisi ile analiz edilir. Bu tekniğin küçük molekül kullanan diğer kardiyomiyosit farklılaşma protokollerine göre temel avantajı, ek bir glikoz yoksunluğu adımı içermesidir

derivation-highly-purified-cardiomyocytes-from-human-induced

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Biz büyük bir tedarik kardiyovasküler onarım için insan kalp atalarıdır ve fonksiyonel kardiyomiyositlerde türetilmesi sağlayan küçük moleküller ile tanımlanmış koşullar altında tutulan pluripotent insan embriyonik kök hücreleri doğrudan cardioblasts indüksiyonu için bir protokol kurduk.

Küçük Molekül İndüksiyon Pluripotent İnsan Embriyonik Kök Hücreleri İnsan Kardiyak Öncüleri ve kardiyomiyositlerde Verimli türetilmesi

Pluripotent kök hücreler, embriyonik veya uyarılmış pluripotent kök (iPS) hücreleri ya, kardiyomiyositler dahil olmak üzere insan farklılaşmış hücrelerin, değerli bir kaynak oluşturmaktadır. Burada, bir embriyoid organları tabanlı protokol ile fonksiyonel insan kardiyomiyositlerin elde etmek için bunları nasıl kullanacağınızı gösteren, iPS hücrelerin kalp indüksiyon üzerinde durulacak.

İnsan kardiyomiyositleri Üretimi: Besleyici-ücretsiz İnsan Bağlı Pluripotent Kök Hücre A Farklılaşma Protokolü

Makale verimli seçici referans belirteçlerinin analizi nüfusun homojenliği ve kimliğini değerlendirmek için flow sitometri ile takip Wnt yolu, modüle göre kardiyomiyositlere insan pluripotent kök hücreleri ayırt etmek için ayrıntılı yöntem anlatılmaktadır.

Sitometrisi ile Yüksek Verim kardiyomiyositlerde İnsan pluripotent kök hücrelerin Farklılaşma ve Karakterizasyonu

Burada, insan pluripotent kök hücreleri (hPSC'ler) için sağlam, hızlı ve ölçeklenebilir bir kardiyomiyosit farklılaşma protokolü sunuyoruz. Bu büyük ölçekli yöntem kullanılarak türetilen kardiyomiyositler, insan kardiyovasküler hastalık modellemesinde, yüksek verimli ilaç taramasında ve potansiyel olarak klinik uygulamalarda etkili kullanımları için yeterli hücre sayısı sağlayabilir.

Oldukça Tekrarlanabilir Küçük Molekül Tabanlı Farklılaşma Protokolü kullanarak insan pluripotent kök hücreleri gelen kardiyomiyositlerde Büyük Ölçekli Üretim

İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinden (hPSC-CM) türeyen kardiyomiyositlerin elektrofizyolojik karakterizasyonu, kardiyak hastalık modellemesi ve ilaç yanıtlarının belirlenmesi için çok önemlidir. Bu protokol, hPSC-CM'lerin çok elektrotlu diziler üzerinde ayrılması ve plakalanması, alan potansiyelinin ölçülmesi ve QT ve RR aralıklarının analiz edilmesi için gerekli olan bilgileri sağlar.

Çok Elektrodlu Diziler (ÇÇA&#39;lar) Kullanan İnsan Pluripotent Kök Hücresinden Türetilmiş Kardiyomiyositlerin (hPSC-CM&#39;ler) Elektrofizyolojik Analizi

Bu makale, insan kaynaklı pluripotent kök hücre türevi kardiyomiyosit (hiPSC-CM) ağlarının gelişimi için bir dizi protokolün yanı sıra, hücre membranı hareket potansiyeli ölçümleri için ters şekilde electroporate etmek için multiwell MEA plakaları üzerinde kültürlü bir set içerir. Yüksek verimlilik kayıtları aynı hücre sitelerinden gün içinde tekrar tekrar elde edilir.

Tekrarlayan eylem potansiyel kayıtlar için Multiwell mikro elektrot diziler üzerinde insan iPSC-türetilen Kardiyomiyoksit ağları

Burada sürekli olarak sağlam insan kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı kardiyomiyositler üretmek ve işlevlerini karakterize etmek için bir yöntem tanımlamak ve doğrulamak. Bu teknikler sinyal yolları içine mekanistik anlayış geliştirilmesinde yardımcı olabilir, büyük ölçekli ilaç tarama için bir platform sağlamak, ve güvenilir model kalp hastalıkları.

Ventriküler Benzeri HiPSC Türevi Kardiyomiyositlerin Ve Kalsiyum Kullanımı Karakterizasyonu için Yüksek Kaliteli Hücre Preparatlarının Üretimi

Burada, önceden ayırt edilmiş insan kaynaklı pluripotent kök hücre türevli kardiyomiyositler, kardiyak fibroblastlar ve endotel hücrelerinden oluşan 3D kendi kendine monte edilmiş kardiyak mikrotissue dizileri oluşturmak için kullanımı kolay bir metodolojiyi açıklıyoruz. Kardiyak mikrotissues üretmek için teknik gerektiren bu kullanıcı dostu ve düşük hücre, hastalık modellemesi ve ilaç gelişiminin erken aşamaları için uygulanabilir.

İnsan iPSC Türevli Kardiyomiyositler, Kardiyak Fibroblastlar ve Endotel Hücreleri Kullanılarak 3D Kardiyak Mikrotissue Dizilerinin İmalatı

Bu yöntem, floresan etiketli sarkomere proteinleri ile pluripotent kök hücre türevi kardiyomiyositler kullanarak sarkomere kısaltmasını incelemek için kullanılabilir.

Floresan Etiketli Sarkom Proteinleri kullanılarak Pluripotent Kök Hücre Türevli Kardiyomiyositlerin Sarkomer Kısaltılması.

Burada, hasta periferik kan mononükleer hücrelerinden insan kardiyomiyositlerini sağlam bir şekilde üretmek ve genişletmek için bir protokol sunuyoruz.

Hasta Periferik Kan Mononükleer Hücrelerinden İnsan Kardiyomiyositlerinin Üretimi ve Genişlemesi

Keşfedin, insan uyarılmış pluripotent kök hücrelerinden küçük molekül modülasyonu ve glikoz açlığı kullanarak yüksek saflıkta kardiyomiyosit türetme yöntemini. Bu teknik kardiyovasküler hastalık modellemesi ve ilaç taraması için güçlü bir protokol sunar.

Küçük Molekül-modüle Farklılaşma ve sonraki Glikoz şiddetli açlık kullanma İnsan uyarılmış pluripotent kök hücrelerin yüksek oranda saf kardiyomiyositlerde türetilmesi (Video) | JoVE Journal

Küçük Molekül-modüle Farklılaşma ve sonraki Glikoz şiddetli açlık kullanma İnsan uyarılmış pluripotent kök hücrelerin yüksek oranda saf kardiyomiyositlerde türetilmesi

Daha fazla video keşfet