Name: Senkronizasyon Caulobacter crescentus Bakteriyel Hücre Döngüsü Soruşturma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 2 s
Description: Öğrenin Caulobacter crescentus hücre döngüsünü araştırmak için yoğunluk santrifüjasyonu ile senkronizasyon protokolü. Bu yöntem biyokimyasal analizler ve mikroskopi çalışmaları için hızlı hücre izolasyonu sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar, el yazması hakkındaki yorumları için Shapiro laboratuvarı üyelerine ve Erin Schrader'e teşekkür eder. Yazarlar, NIH doktora sonrası bursu F32'nin JMS'ye GM100732 ve NIH'nin LS'ye R01 GM51426 ve R01 GM32506 hibeleri olduğunu kabul eder.

1. Büyük ölçekli Synchrony - Western Blot, Mikroarray / RNA-Sek, ve Diğer Malzeme Yoğun Tahliller için optimal <ol><li> Bir dondurucu stok veya bir plaktan, pye ortamı içinde 28 ° C&#39;de çalkalama ile streyn NA1000 5 ml&#39;lik bir O / N kültürünün yetiştirilmesi. </li><li> M2g 25 ml (Tablo 1-2) &#39;de, adım 1 hücreleri, 0.5 ml inoküle ve Kültür 0.5 ve 0.6 arasında bir OD 600 ulaşıncaya kadar 28 ° C&#39; de çalkalanır. </li><li> M2g 1 L hücreleri ile inoküle ve 28 ° C de çalkalanır. </li><li> OD 600 0,5-0,6 ulaştığında, sıvı monte faz mikroskobu kullanarak hücrelerin swarmer varlığını doğrulamaktadır. Faz mikroskobu ile bir cam slayt üzerinde hücrelerin 1 ul, bir kapak kayma ile kapak Noktası, ve görüntü. Nüfusun hızla yüzme hücrelerin görselleştirerek swarmer hücrelerinin varlığını doğrulamak. </li><li> JA-10 rotor içinde 4 ° C&#39;de 7 KXG 15 dakika boyunca hücreler dönerler. </li><li> Süpernatantı atın ve soğuk M2 180 ml ekleyin (Tablo 1-2) ve yavaşça resserolojik bir pipet kullanılarak tüm hücreleri uspend. Gevşek pelet hücreleri atın; bunlar predivisional ve saplı hücrelerdir. </li><li> Soğuk Kolloidal silika çözeltisi 60 ml ekleyin ve iyice karıştırın hücre süspansiyonu (iyi hücrelere eklemeden önce Kolloidal silika süspansiyonu karıştırmak için emin olun). </li><li> Sekiz 30 ml tüpler içinde hücre süspansiyonu dökün ve bir JA-20 rotor içinde 4 ° C&#39;de 6.4 KXG C&#39;de 30 dakika boyunca dönerler. NOT: Bir iki ayrı bantları görmelisiniz; saplı / predivisional hücreler üst bant (Şekil 1B) iken swarmer bant alt grubudur. </li><li> Dikkatle kapalı üst bandı aspire ve swarmer bant (alt bant) Yukarıda ~ 1 cm sıvıyı çıkarmak. </li><li> Pasteur pipeti kullanarak (Kritik), dikkatlice swarmer bandı çıkarın ve temiz bir tüpe yerleştirin. JA-20 rotor içinde 4 ° C&#39;de 6.4 KXG 10 dakika boyunca koloidal silis, iyi soğuk M2 ile tüp kapalı ve spin aşındırmak için. </li><li> Dikkatle süpernatant atmak ve tekrar süspansiyon20 soğuk M2 ml JA-20 rotor içinde 4 ° C&#39;de 6.4 KXG 10 dakika boyunca bir dönüş hücreler. </li><li> Soğuk M2 30 ml içine tüm pelet yeniden süspanse ve bir spektrofotometre kullanılarak OD 600 ölçmek ve soğuk M2 ortamı kullanarak boş. Hücreler swarmer kontrol etmek için faz görüntüleme için 1 ul kaydedin; Hücrelerin% 90-95 diğer canlılar olmalıdır. </li><li> JA-20 rotor içinde 4 ° C&#39;de 6.4 KXG 5 dakika boyunca hücreler dönerler. 28 ° C M2G ortam içinde yeniden süspanse edilen hücreler, 600 ~ 0.3-0.4 ve 28 ° C&#39;de çalkalanarak başlar, böylece. NOT: Tipik verimler 30 ve eşitlenmemiş hücrelerin 1L den swarmer hücre kültürü 60ml arasındadır. </li><li> Zaman noktaları (vahşi tip kültür bölmek için yaklaşık 135-140 dakika sürecektir) 8,9 alarak başlayın. Her zaman noktasında, OD 600 ölçer. Bölünmeden sonra OD 600 yaklaşık 2X başlangıç ​​OD 600 olduğunu kontrol edin. </li><li> Western blot ya da gen sentezleme tahlilleri için, cu 1 ml alikotları kaldırmaİstenen zaman noktalarında lture, hızlı bir şekilde 30 saniye için bir masa üstü santrifüjü içinde maksimum hızda aşağı spin süzün veya orta havalandırın, ve sıvı nitrojen içinde hücre pelletini dondurma. Alt baş analiz edilinceye kadar -80 ° C&#39;de hücreler saklayın. </li></ol> 2. Küçük ölçekli Synchrony - Mikroskopi için Optimal <ol><li> Bir dondurucu stok veya bir plaktan, 5 ml&#39;lik bir O / N kültür m2g 28 ° C&#39;de çalkalanarak büyür. </li><li> M2G 15 ml (Tablo 1-2) sulandırmak ve orta-log (OD = 0.5-0.6 600) kadar büyür. </li><li> 1 ml soğuk M2 (Tablo 1-2) ve 2 ml&#39;lik bir mikrosantrifüj tüpüne transfer JA-20 rotor içinde 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 6.4 KXG dönerler ve süspansiyon haline getirin. </li><li> Süpernatantı aspire, hücreler topak haline getirilip, bir mikrosantrifüj tüpü içinde, 3 dakika için 15 KXG Spin soğuk M2 900 ul buz üzerinde pelet ve tekrar süspansiyon koydu. </li><li> Bir mikrofon 4 ° C&#39;de 15 KXG C&#39;de 20 dakika koloidal silis ve spin kaplama soğuk PVP 900 ul eklerocentrifuge tüp. </li><li> (Kritik) aspire garnitürü saplı / predivisional hücre bandı kapalı pipetlemeyin ve yeni bir mikrosantrifüj tüp içine bant swarmer alt toplamak veya. </li><li> 3 dakika boyunca 15 KXG santrifüj edilirken, M2, 1 ml swarmer hücreler iki kez yıkayın. </li><li> Son sıkma önce, önceden soğutulmuş bir 1 ml&#39;lik bir cam deney tüpü içine hücreleri taşımak ve M2 bir boşluk ile karşılaştırıldığında hücrelerin OD 600 ölçer. </li><li> 0,3 arasında bir OD 28 ° C M2G içine son hücre pelletini - 0.4 ve 28 ° C&#39;de / rulo hücreleri sallayın. Not: Tipik verimler swarmer hücre kültürünün 2 ila 4 ml dir. </li><li> Görüntüleme için bir M2G agaroz ped üzerine hücrelerin istenilen zaman noktaları yer 1 ul mikroskopi deneyleri için. </li></ol>

<ol><li>McAdams, H. H., Shapiro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((System-level+design+of+bacterial+cell+cycle+control%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">System-level design of bacterial cell cycle control.</a> FEBS Lett. 583, 3984-3991 (2009).</li>
<li>McAdams, H. H., Shapiro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+architecture+and+conservation+pattern+of+whole-cell+control+circuitry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The architecture and conservation pattern of whole-cell control circuitry.</a> J. Mol. Biol. 409, 28-35 (2011).</li>
<li>McAdams, H. H., Shapiro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bacterial+cell-cycle+regulatory+network+operating+in+time+and+space%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A bacterial cell-cycle regulatory network operating in time and space.</a> Science. 301, 1874-1877 (2003).</li>
<li>Ptacin, J. L., Shapiro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initiating+bacterial+mitosis%3A+understanding+the+mechanism+of+ParA-mediated+chromosome+segregation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Initiating bacterial mitosis: understanding the mechanism of ParA-mediated chromosome segregation.</a> Cell Cycle. 9, 4033-4034 (2010).</li>
<li>Evinger, M., Agabian, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Envelope-associated+nucleoid+from+Caulobacter+crescentus+stalked+and+swarmer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Envelope-associated nucleoid from Caulobacter crescentus stalked and swarmer cells.</a> J. Bacteriol. 132, 294-301 (1977).</li>
<li>Tsai, J. W., Alley, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteolysis+of+the+Caulobacter+McpA+chemoreceptor+is+cell+cycle+regulated+by+a+ClpX-dependent+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Proteolysis of the Caulobacter McpA chemoreceptor is cell cycle regulated by a ClpX-dependent pathway.</a> J. Bacteriol. 183, 5001-5007 (2001).</li>
<li>Marks, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetic+basis+of+laboratory+adaptation+in+Caulobacter+crescentus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">The genetic basis of laboratory adaptation in Caulobacter crescentus.</a> J. Bacteriol. 192, 3678-3688 (2010).</li>
<li>Ely, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetics+of+Caulobacter+crescentus%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Genetics of Caulobacter crescentus.</a> Methods Enzymol. 204, 372-384 (1991).</li>
<li>Williams, B., Bhat, N., Chien, P., Shapiro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ClpXP+and+ClpAP+proteolytic+activity+on+divisome+substrates+is+differentially+regulated+following+the+Caulobacter+asymmetric+cell+division%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">ClpXP and ClpAP proteolytic activity on divisome substrates is differentially regulated following the Caulobacter asymmetric cell division.</a> Mol. Microbiol. 93, 853-866 (2014).</li>
<li>Quon, K. C., Yang, B., Domian, I. J., Shapiro, L., Marczynski, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+control+of+bacterial+DNA+replication+by+a+cell+cycle+regulatory+protein+that+binds+at+the+chromosome+origin%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Negative control of bacterial DNA replication by a cell cycle regulatory protein that binds at the chromosome origin.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 95, 120-125 (1998).</li>
<li>Laub, M. T., Chen, S. L., Shapiro, L., McAdams, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+directly+controlled+by+CtrA%2C+a+master+regulator+of+the+Caulobacter+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Genes directly controlled by CtrA, a master regulator of the Caulobacter cell cycle.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99, 4632-4637 (2002).</li>
<li>Quon, K. C., Marczynski, G. T., Shapiro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cycle+control+by+an+essential+bacterial+two-component+signal+transduction+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cell cycle control by an essential bacterial two-component signal transduction protein.</a> Cell. 84, 83-93 (1996).</li>
<li>Ferullo, D. J., Cooper, D. L., Moore, H. R., Lovett, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cycle+synchronization+of+Escherichia+coli+using+the+stringent+response%2C+with+fluorescence+labeling+assays+for+DNA+content+and+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Cell cycle synchronization of Escherichia coli using the stringent response, with fluorescence labeling assays for DNA content and replication.</a> Methods. 48, 8-13 (2009).</li>
<li>Degnen, S. T., Newton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+replication+during+development+in+Caulobacter+crescentus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Chromosome replication during development in Caulobacter crescentus.</a> J. Mol. Biol. 64, 671-680 (1972).</li>
<li>Bates, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Escherichia+coli+baby+cell+column%3A+a+novel+cell+synchronization+method+provides+new+insight+into+the+bacterial+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The Escherichia coli baby cell column: a novel cell synchronization method provides new insight into the bacterial cell cycle.</a> Mol. Microbiol. 57, 380-391 (2005).</li>
<li>Abel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bi-modal+distribution+of+the+second+messenger+c-di-GMP+controls+cell+fate+and+asymmetry+during+the+caulobacter+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Bi-modal distribution of the second messenger c-di-GMP controls cell fate and asymmetry during the caulobacter cell cycle.</a> PLoS Genet. 9, e1003744(2013).</li>
<li>Johnson, R. C., Ely, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+spontaneously+derived+mutants+of+Caulobacter+crescentus%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Isolation of spontaneously derived mutants of Caulobacter crescentus.</a> Genetics. 86, 25-32 (1977).</li>
<li>Britos, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+response+to+carbon+starvation+in+Caulobacter+crescentus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Regulatory response to carbon starvation in Caulobacter crescentus.</a> PLoS One. 6, e18179(2011).</li>
<li>Boutte, C. C., Crosson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+complex+logic+of+stringent+response+regulation+in+Caulobacter+crescentus%3A+starvation+signalling+in+an+oligotrophic+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The complex logic of stringent response regulation in Caulobacter crescentus: starvation signalling in an oligotrophic environment.</a> Mol. Microbiol. 80, 695-714 (2011).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Bakteri hücre döngüsü, yaşamda temel bir süreçtir ve büyüme çalışmaları için ve yeni nesil antibiyotikler için bir hedef olarak önemlidir. Burada, bakteriyel hücre döngüsü ve asimetrik hücre bölünmesi çalışması için bir model organizma olan C. crescentus NA1000 için hızlı senkronizasyon prosedürlerini detaylandırdık. Bu yöntem, bakteri hücre döngüsünün uzay-zamansal düzenlemesini araştırmak için western blot, gen ekspresyon profili oluşturma ve floresan mikroskobu deneyleri ile değiştirilebilir. 
<p class='...

bakteriyel hücre döngüsü genomunun çoğaltma ve kızı hücrelerinin bölünmesini kontrol eder. Antibiyotik direnci halk sağlığı için büyüyen bir tehdit olarak önemlisi, bakteri hücre döngüsü antibiyotik gelişimi için bir hedef kullanılmayan sunuyor. Bakteri Caulobacter crescentus, her bir hücre döngüsü Farklı kaderi (Şekil 1A) 1,2 iki kız hücre sağlar, asimetrik bölünmesi yol açar. Bir yavru hücre, bir kamçı miras ve diğer kızı sap miras ve sapsız ise hareketlidir. Entegre devre genetik transkripsiyon regülasyonu, fosfor-sinyalizasyon ve düzenlenmiş proteoliz 3 hücre döngüsü ilerlemesini ve hücre kaderi kontrol eder. Buna ek olarak, kromozom replikasyonu ve eşzamanlı ayrımcılık verim kızı hücreleri kromozom 4 tam bir kopyasını içeren. Önemli bir şekilde, bu iki hücre tipi hızla collo ile ayrılabiliryüksek verim (Şekil 1B) ile nüfusun geri kalanından swarmer hücrelerinin izolasyonu sağlayan synchronizable NA1000 suşu 5-7 idal silika parçacık yoğunluğu santrifüj. Hücrelerin swarmer İzole sonra asimetrik hücre bölünmesi yoluyla eşzamanlı devam edin. Burada, biz detay protokolü Caulobacter suşu NA1000 senkronize etmek için kullanılır. Biz protokolleri ve büyük ve küçük ölçekli her iki eşitleme için ortak sorun giderme ipuçları sağlar. Bu deneysel prosedür Caulobacter hücre döngüsü ve hücre kaderinin kontrolünü zamanmekansal sorgulamak için güçlü bir araç sağlar.

<table><tbody><tr><td>PVP Kaplı Kolloidal Silika (Percoll)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4937</td><td></td></tr><tr><td>Kolloidal Silika (Ludox AS-40)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>420840</td><td></td></tr><tr><td>JA10 Rotor</td><td>Beckman-Coulter</td><td>369687</td><td></td></tr><tr><td>JA20 Rotor</td><td>Beckman-Coulter</td><td>334831</td><td></td></tr><tr><td>Demir Sülfat Şelat Çözeltisi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0518</td><td></td></tr><tr><td>30 ml Santrifüj Tüpleri</td><td>Corning</td><td>8445</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>EMD</td><td>SX0720-1</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>VWR</td><td>BDH9268-500G</td><td></td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>Amresco</td><td>0621-500g</td><td></td></tr></tbody></table>

senkronizasyon<em&gt; caulobacter crescentus</em&gt; bakteriyel hücre döngüsü soruşturma

Synchronization of Caulobacter Crescentus for Investigation of the Bacterial Cell Cycle

Hücre döngüsü, tüm hücrelerde büyüme, genom replikasyonu ve gelişme için önemlidir. Bakterilerde, hücre döngüsü çalışmaları büyük ölçüde senkronize edilmemiş hücrelere odaklanmıştır ve bu da hücre döngüsü ilerlemesi, genom replikasyonu ve bölünmesi için gerekli zamansal olayların sıralanmasını zorlaştırmıştır. Caulobacter crescentus, hücrelerin yoğunluk santrifüjleme ile G0 durumunda hızlı bir şekilde senkronize edilebildiği bakteri hücre döngüsü için mükemmel bir model sistem sağlar. Hücre döngüsü senkronizasyon deneyleri, kromozom replikasyonunu ve ayrışmasını yöneten moleküler olayları belirlemek, hücre döngüsü ilerlemesini kontrol eden genetik bir düzenleyici ağı haritalamak ve asimetrik hücre bölünmesi için gerekli polar sinyal komplekslerinin oluşumunu belirlemek için kullanılmıştır. Burada Caulobacter NA1000 hücrelerinin hızlı senkronizasyonu için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Senkronizasyon, gen ekspresyon profili oluşturma ve western blot testleri için büyük ölçekli bir formatta ve ayrıca mikroskopi veya FACS tahlilleri için küçük ölçekli bir formatta gerçekleştirilebilir. Caulobacter'in hızlı senkronizasyonu ve yüksek hücre verimi, bu organizmayı bakteri hücre döngüsü çalışmaları için güçlü bir model sistem haline getirmektedir.

Daha yüksek bir yoğunluğa sahip swarmer bandı, ve daha düşük yoğunluklu bir saplı / predivisional hücre bandı: eşitleme genellikle hücrelerin iki bant (Şekil 1B) verir. Etkili bir senkronizasyon ortak kontrol OD 600 izleme ve farklı hücre döngüsü zaman noktalarında western blot ile CtrA&#39;nın protein seviyelerinin ölçülmesi dahildir sağlamak. OD 600, hücre döngüsü sırasında (Şekil 2) boyunca, yaklaşık 2 kat artış gerekir. hücre döngüsü ana regülatör CtrA&#39;nın ...

Bakteri hücrelerinin senkronizasyonu, bakteri hücre döngüsü ve gelişimi ile ilgili çalışmalar için esastır. Caulobacter crescentus, yoğunluk santrifüjleme yoluyla senkronize edilebilir ve bakteri hücre döngüsü çalışmaları için hızlı ve güçlü bir araç sağlar. Burada Caulobacter hücrelerinin senkronizasyonu için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz.

Senkronizasyon<em&gt; Caulobacter crescentus</em&gt; Bakteriyel Hücre Döngüsü Soruşturma

The cell cycle is important for growth, genome replication, and development in all cells.  In bacteria, studies of the cell cycle have focused largely on ...

Bu prosedürün genel amacı, senkronize bir hücre kültürü oluşturmak için Coob backer swarmer hücrelerini izole etmektir. Bu işlem, öncelikle karma bir coob backer hücre kültürü büyütülerek ve ardından hücrelerin soğuk besiyerinde süspande edilmesiyle büyümenin kısa süreliğine durdurulmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım, swarmer hücrelerinin diferansiyel yoğunluk santrifüjasyonu yoluyla ayrıştırılmasıdır.Bir sonraki adım, hücrelerin hücre döngüsüne girmesini sağlayan sıcak besiyerinde swarm hücrelerini yeniden süspanse etmektir. Son olarak, izole edilen swarm hücreleri biyokimyasal analizler veya mikroskopi kullanılarak hücre döngüsü boyunca takip edilebilir. Bu tekniğin baby cell machine gibi diğer yöntemlere göre temel avantajı, hücrelerin hızlı bir şekilde izole edilebilmesi ve biyokimyasal çalışmalar için yeterli miktarlarda çoğaltılabilmesidir.Bu yöntem, kromozom ayrılmasını ve asimetrik hücre bölünme döngüsünü nelerin kontrol ettiği gibi hücre biyolojisi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Başlamak için, beş mililitre PYE besiyerine bir plak üzerindeki colo backer CSIS suşu, NA 1000 bakterilerini inoküle edin. Kültürü 28 °C'de çalkalayarak gece boyunca büyütün; ertesi gün, gece boyunca büyütülen kültürden 0,5 mililitreyi 25 mililitre M two G besiyeri içeren bir erlene aktarın ve kültürün optik yoğunluğu 0,5 ile 0,6 arasına ulaşana kadar erleni 28 °C'de çalkalayın.Ardından, istenen başlangıç optik yoğunluğunu elde etmek için kültürü bir litre M2G besiyeri ile seyreltin ve erleni 28 °C'de çalkalayın; kültürün optik yoğunluğu 0,5'e ulaştığında, kültürden bir mikrolitre pipetle bir lam üzerine aktarın ve ardından sıvının üzerini bir lamelyle kapatın. Hızla yüzen swarm hücrelerinin varlığını doğrulamak için hücreleri faz kontrast mikroskopisi ile görüntüleyin. Kültürü steril bir santrifüj tüpüne aktarın ve ardından hücreleri 4 °C'de 15 dakika boyunca 7.000 ×g hızında santrifüjleyin.Ardından, süpernatan dökülürken gevşek şekilde çökmüş hücreleri uzaklaştırın ve 180 mililitre soğuk M two besiyeri ekleyin. Hücreleri nazikçe resüspande etmek için serolojik pipet kullanın. Daha sonra hücre süspansiyonuna 60 mililitre soğuk kolloidal silika çözeltisi ekleyin ve iyice karıştırın.Hücre süspansiyonunu sekiz adet 30 mililitrelik tüpe aktarın ve 4 °C'de, 30 dakika boyunca 6.400 ×g'de santrifüjleyin. Tüpleri santrifüjden nazikçe çıkarın ve tüplerde iki belirgin bant olup olmadığını kontrol edin.Alt bant swarmer hücrelerini içerirken, bölünme öncesi hücreler üst bantta yer alır. Ardından, üst bandı ve alt bandın yaklaşık bir santimetre üzerindeki sıvıyı dikkatlice aspire edin. Swarm bandını uzaklaştırmak için bir pastör pipeti kullanın ve bandı temiz bir tüpe aktarın.Tüpü soğuk M iki besiyeri ile doldurun ve ardından kolloidal silikayı uzaklaştırmak için tüpü santrifüjleyin. Sonrasında, süpernatanı dikkatlice dökün ve hücreleri 20 mililitre soğuk M iki besiyeri içinde yeniden süspande ederek santrifüjleyin. Hücreleri çöktürmek için işlemi tekrarlayın, pelletleri 30 mililitre soğuk M iki besiyeri içinde yeniden süspande edin ve ardından süspansiyonun optik yoğunluğunu ölçün.Lam üzerine bir mikrolitre hücre süspansiyonu yerleştirin ve swarm hücrelerini kontrol etmek için faz kontrast görüntüleme kullanın. Ardından, hücreleri santrifüjleyin ve 0,3 ile 0,4 arasında bir optik yoğunluğa ulaşana kadar M two G besiyerinde yeniden süspande edin. Western blot veya gen ekspresyon analizleri için kültürü 28 °C'de çalkalamalı inkübasyona bırakın.Kültürün optik yoğunluğu iki katına çıkana kadar yaklaşık 140 dakika boyunca, her 10 ila 30 dakikada bir bir mililitrelik alikotlar alın. Hücreleri 30 saniye boyunca çöktürmek için bir masaüstü santrifüj kullanın ve ardından ortamı hızla aspire edin. Hücre peletlerini sıvı azot içerisinde dondurun ve negatif 80 derece santigrat sıcaklıkta saklayın; küçük ölçekli senkronizasyon için beş mililitre M2G ortamına NA1000 hücreleri inoküle edin ve hücreleri ertesi güne kadar 28 derece santigrat sıcaklıkta çalkalamalı olarak büyütün.Kültürü 15 mililitre M iki G ortamı ile seyreltin ve hücreleri optik yoğunluk 0.5 ile 0.6 arasına gelene kadar büyütün. Hücreleri santrifüjleyin ve ardından bir mililitre soğuk M iki ortamı içinde yeniden süspanse edin. Hücreleri iki mililitrelik bir mikro santrifüj tüpüne aktarın, santrifüjasyon ile hücreleri peletleyin ve süpernatantı aspire edin.Ardından tüpü buza yerleştirin ve hücre peletini 900 µL soğuk M2 ortamında yeniden süspande edin. Sonra, 900 µL soğuk PVP kaplı kolloidal silika ekleyin ve tüpü 20 dakika boyunca santrifüjleyin. Üstteki pre-divizyonel hücre bandını dikkatlice aspire edin ve ardından alttaki swarmer bandını yeni bir mikro santrifüj tüpüne toplayın.Swarmer hücrelerini, her yıkama arasında üç dakika santrifüjleyerek, son döndürme işleminden hemen önce bir mililitre soğuk M iki besiyerinde iki kez yıkayın. Hücre süspansiyonunu önceden soğutulmuş bir mililitrelik cam test tüpüne yerleştirin ve hücrelerin optik yoğunluğunu ölçün. Ardından hücreleri bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve santrifüj işlemi sonrası santrifüjleyin.Reese, son hücre peletini 0,3 ile 0,4 arasındaki bir optik yoğunluğa gelecek şekilde önceden ısıtılmış M two G ortamında süspande et ve hücreleri 28 °C'de çalkala. Mikroskopi isteniyorsa, uygun zaman noktalarında kültürden bir µL'yi bir M two G aeros pedine yerleştir. Asenkron bir kültürün farklı yoğunluktaki santrifüjle ayrıştırılması, iki hücre bandı oluşturur.Alt bant, daha yüksek yoğunluğa sahip swarmer hücrelerini içerirken; üst bant, daha düşük yoğunluğa sahip stocked ve bölünme öncesi hücreleri içerir. Kültürün optik yoğunluğu, hücre döngüsü boyunca yaklaşık iki kat artar. Bu süre zarfında, swarm hücreleri stocked hücrelere farklılaşır, ardından stocked hücreler replike olur ve asimetrik hücre bölünmesine girer.Her bölünmenin yeni bir swarmer hücre ve ana stok hücre üretmesiyle, hücre döngüsünün ana regülatörü CTRA için yapılan bir western blot, senkronizasyonu doğrulamak için yararlı bir kontroldür; CTRA, swarmer hücrelerde DNA replikasyonunu engeller ve DNA replikasyonu üzerine degrade olur. CTRA daha sonra hücre döngüsünün ilerleyen aşamalarında sentezlenerek DNA replikasyonunun yeniden başlamasını önler ve birçok gelişimsel genin transkripsiyonunu aktive eder. CTRA protein seviyelerindeki bu osilasyon paterni, başarılı bir senkronizasyonu gösterir.Bu videoyu izledikten sonra, bakteriyel hücre döngüsünü araştırmak amacıyla callback veya NA 1000 hücrelerinin nasıl senkronize edileceği konusunda iyi bir anlayış kazanmış olmalısınız. Bu hücre senkronizasyon prosedürü, doğru şekilde uygulandığında bir ila iki saat içinde tamamlanabilir. Bu prosedürü gerçekleştirirken hızlı çalışmayı hatırlamak önemlidir.

synchronization-caulobacter-crescentus-for-investigation-bacterial

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Biz son zamanlarda basit bir bakteriyel tespiti için floresan assay "mix-ve-okuma" kurmak için uygulanabilir Flourogenik DNAzyme probları üretmek için yeni bir yaklaşım bildirdin. Bu özel DNA sondaları böylece floresans sinyali kuşağa bakteriyel algılama çevirme belirli bakteri tarafından üretilen ham hücre dışı karışımı (CEM) varlığında, bir kromofor-değiştirilmiş-DNA RNA kimerik substratın bölünme katalize. Bu yazıda, "RFD-EC1" ifade belirli bir DNAzyme prob modeli bakterinin tespiti için...

Flourogenik DNAzymes kullanarak Bakterilerin Tespiti

Bir sentetik operon kodlama hem salgı cihaz ve curli liflerin yapısal monomerlerin tasarımı açıklanmaktadır. Bu amiloidleri ve yapışık polimerlerin aşırı bir bağlılık ölçülebilir bir kazanç...

Tek Sentetik Curli Operon Oluşturma tarafından Mühendislik Bağlanan Bakteriler

Kaynak: Murata, K. ve diğerleri, Siyanobakterilerde DNA Sıkışmasının Yüksek Voltajlı Kriyo-elektron Tomografisi ile Görselleştirilmesi. J. Vis. Uzm. (2018)Bu video, sirkadiyen tarafından düzenlenen DNA sıkışmasını incelemek için aydınlık-karanlık döngüler altında siyanobakterilerin eşzamanlı olarak yetiştirilmesini göstermektedir. Floresan mikroskobu, tanımlanmış zaman noktalarında yoğunlaştırılmış DNA'yı ortaya çıkararak popülasyon genelinde hücre döngüsü hizalamasını doğrular.

Siyanobakteriyel Kültür Senkronizasyonu ve Aydınlık-Karanlık Döngüleri Tarafından Yönlendirilen DNA Sıkıştırma

Bakterilerde temel süreçleri işlevini anlamak zordur. Floresans mikroskobu hedef özel boyalar ile mikrobiyal hücre büyüme ve hücre döngüsü ilerleme içine anahtar anlayışlar sağlayabilir. Burada, Agrobacterium tumefaciens yöntemleri canlı hücre görüntüleme için gerekli işlemleri karakterizasyonu için vurgulamak için bir model bakteri kullanılmaktadır.

Temel işlemler sırasında mikrobiyal hücre büyümesini gözlemlemek için hücre Floresans mikroskobu canlı

Bakteri hücreleri son derece dağınık şekilde düzenlenir. Yavaş büyüyen Myxococcus xanthus hücreler zamanla bu organizasyonda takip etmek için bir tuzak birçok nesiller boyunca yüksek kronolojik zamanmekansal çözünürlük ile floresan canlı hücre görüntüleme için geliştirilmiştir. Bu yöntemi kullanarak, kromozom segregasyon ve hücre bölünmesi için önemli proteinlerin kronolojik zamanmekansal dynamics tespit edilemedi.

Floresans Live-hücre görüntüleme, tam bitkisel hücre döngüsü yavaş büyüyen sosyal bakteri Myxococcus xanthus

Burada açıklanan bakteri gen ekspresyonu hayvan dokularında hücresel düzeyde analiz etmek için bir yöntemdir. Bu yöntem ve doku ortamındaki bakteriyel bir nüfus enfeksiyon sırasında içinde meydana gelen fenotipik çeşitlilik eğitimi için bir kaynak sağlar.

Bakteriyel gen düzenlemesi enfekte dokularda çalışmaya bir floresan tabanlı yöntemi

Bu makalede, protein subselliyerizasyon dinamiklerini araştırmak ve Bacillus subtilis ve Staphylococcus aureus'ta yüksek çözünürlüklü floresan mikroskobu kullanarak morfolojik değişiklikleri izlemek için adım adım kılavuz verilmektedir.

Bakterilerde Hücre Altı Protein Lokalizasyonu ve Hücre Morfolojisi Değişikliklerini Araştırmak Için Canlı Hücre Floresan Mikroskobu

Bu çalışma, sentetik gen devrelerinin stokastik davranışının analizi ve nicelleştirilmesi için tek bir Escherichia coli hücresinin canlı görüntülenmesini sağlayan bir mikroskopi yöntemi sunun.

Zaman Atlamalı Mikroskopi Kullanılarak Escherichia Coli'de Biyolojik Gürültünün Sürekli Ölçümü

Birçok bakteri, çevrelerinde gezinmek ve hem bireysel hem de kolektif olarak elverişli çevreyi kolonileştirmek için flagella tahrikli hareketliliği kullanır. Burada, yüzmeye ve kaynayan hareketliliklere katkıda bulunan bileşenleri / yolları tanımlamak için hareketliliği bir seçim aracı olarak kullanan üç yerleşik yöntemin kullanılması gösterilmiştir.

Bir Seride Üç Yerleşik Teknik Uygulayarak Escherichia coli'de Flagella Odaklı Hareketliliği Araştırmak

Antibiyotik kalıcılığı, hassas bir izojenik popülasyondaki küçük alt popülasyonların yüksek dozda bakterisidal antibiyotikleri geçici olarak tolere etme yeteneğini tanımlar. Bu protokol, Escherichia coli'yi ölümcül ofloksasin dozlarına maruz bıraktıktan sonra moleküler ve hücresel seviyelerde antibiyotik kalıcılık fenotipini karakterize etmek için yaklaşımları birleştirmektedir.

Escherichia coli'de Antibiyotik Kalıcılığının Popülasyon ve Tek Hücre Analizi

Senkronize zaman serisi deneylerini analiz etmenin bir zorluğu, deneylerin genellikle senkronizasyondan ve hücre döngüsü periyodundan kurtarma uzunluğunda farklılık göstermesidir. Bu nedenle, farklı deneylerden elde edilen ölçümler toplu olarak analiz edilemez veya kolayca karşılaştırılamaz. Burada, faza özgü karşılaştırmalara izin vermek için deneyleri hizalamak için bir yöntem açıklanmaktadır.

Çapraz deney karşılaştırmaları için hücre döngüsü senkron modelinin karakterizleştirici kaybı kullanılarak senkronize zaman serisi verilerinin hizalanması

Öğrenin Caulobacter crescentus hücre döngüsünü araştırmak için yoğunluk santrifüjasyonu ile senkronizasyon protokolü. Bu yöntem biyokimyasal analizler ve mikroskopi çalışmaları için hızlı hücre izolasyonu sağlar.

Senkronizasyon

Daha fazla video keşfet