Senkronizasyon Caulobacter crescentus Bakteriyel Hücre Döngüsü Soruşturma

Bu prosedürün genel amacı, senkronize bir hücre kültürü oluşturmak için Coob destekçi sürü hücrelerini izole etmektir. Bu, önce karışık bir koob destek hücresi kültürünün büyütülmesi ve daha sonra hücrelerin soğuk ortamda askıya alınmasıyla Resus'un büyümeyi kısa bir süre durdurması ile gerçekleştirilir. İkinci adım, sürü hücrelerini diferansiyel yoğunluk santrifüjleme yoluyla ayırmaktır.

Bir sonraki adım, sürü hücrelerini sıcak ortamda yeniden askıya almaktır, bu da hücrelerin hücre döngüsüne girmesine izin verir. Son olarak, izole edilen sürü hücreleri, biyokimyasal tahliller veya mikroskopi kullanılarak hücre döngüsü boyunca takip edilebilir. Bu tekniğin bebek hücre makinesi gibi diğer yöntemlere göre en büyük avantajı, hücrelerin hızlı bir şekilde izole edilebilmesi ve biyokimyasal çalışmalar için yeterli miktarlarda büyütülebilmesidir.

Bu yöntem, kromozom ayrışmasını ve asimetrik hücre bölünme döngüsünü neyin kontrol ettiği gibi hücre biyolojisi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Başlamak için, beş mililitre PYE ortamını bir colo backer CSIS suşu, NA 1000 plakasından bakteri ile aşılayın. Kültürü gece boyunca 28 santigrat derecede büyütün ve ertesi gün çalkalayın, gece boyunca 0,5 mililitre kültürü 25 mililitre M iki G ortamı içeren bir şişeye aktarın ve kültür 0,5 ile 0,6 arasında bir optik yoğunluğa ulaşana kadar şişeyi 28 santigrat derecede sallayın.

Daha sonra, istenen başlangıç optik yoğunluğunu elde etmek için kültürü bir litre M iki G ortama seyreltin ve kültürün optik yoğunluğu 0.5 dereceye ulaştığında şişeyi 28 santigrat derecede sallayın, kültürün bir mikrolitresini bir slayt üzerine pipetleyin ve ardından sıvıyı bir kapak kayması ile örtün. Hızla yüzen sürü hücrelerinin varlığını doğrulamak için hücreleri faz mikroskobu ile görüntüleyin. Kültürü steril bir santrifüj tüpüne aktarın ve daha sonra hücreleri dört santigrat derecede 15 dakika boyunca 7.000 kez G'de döndürün.

Daha sonra, süpernatanı dökerken gevşek bir şekilde peletlenmiş hücreleri atın ve 180 mililitre soğuk M iki ortam ekleyin. Hücreleri nazikçe yeniden süspanse etmek için serolojik bir pipet kullanın. Daha sonra hücre süspansiyonuna 60 mililitre soğuk kolloidal silika çözeltisi ekleyin ve iyice karıştırın.

Hücre süspansiyonunu sekiz adet 30 mililitrelik tüpe dökün ve 30 dakika boyunca 6.400 kez G'de santrifüjleyin. Dört santigrat derece ayarlayın. Tüpleri santrifüjden yavaşça çıkarın ve tüpte iki farklı bant olup olmadığını kontrol edin.

Alt bant, sürü hücrelerini içerir ve bölünme öncesi hücreler üst banttadır. Ardından, üst bandı ve sıvıyı alt bandın yaklaşık bir santimetre üzerine kadar dikkatlice aspire edin. Sürü bandını çıkarmak ve temiz bir tüpe aktarmak için bir macun pipeti kullanın.

Tüpü soğuk M iki ortamla doldurun ve ardından kolloidal silikayı yıkamak için tüpü santrifüjleyin. Daha sonra, süpernatanı dikkatlice atın ve hücreleri 20 mililitre soğuk M iki orta santrifüjde yeniden süspanse edin. Yine hücreleri peletlemek için, peletleri 30 mililitre soğuk M iki ortamda yeniden süspanse edin ve ardından süspansiyonun optik yoğunluğunu ölçün.

Hücre süspansiyonunun bir mikrolitresini bir mikroskop lamına yerleştirin ve sürü hücrelerini kontrol etmek için faz görüntülemeyi kullanın. Daha sonra, hücreleri santrifüjleyin ve M iki G ortamında 0.3 ile 0.4 arasında bir optik yoğunluğa kadar yeniden süspanse edin. Batı arsa veya gen ekspresyon tahlilleri için kültürü 28 santigrat derecede çalkalayarak kuluçkaya yatırın.

Kültürün optik yoğunluğu iki katına çıkana kadar yaklaşık 140 dakika boyunca her 10 ila 30 dakikada bir mililitre alikotları çıkarın. Hücreleri 30 saniye boyunca döndürmek için bir masa üstü santrifüj kullanın ve ardından orta flaşı hızla aspire edin. Hücre peletlerini sıvı nitrojen içinde dondurun ve küçük ölçekli senkronizasyon için eksi 80 santigrat derecede saklayın, beş mililitre M iki G ortamını NA 1000 hücreleri ile aşılayın ve hücreleri ertesi gün 28 santigrat derecede çalkalanarak gece boyunca büyütün.

Kültürü 15 mililitre M iki G ortamda seyreltin ve optik yoğunluk 0.5 ile 0.6 arasında olana kadar hücreleri büyütün. Hücreleri santrifüjleyin ve ardından bir mililitre soğuk M iki ortamda yeniden süspanse edin. Hücreleri iki mililitrelik bir mikro santrifüj tüpüne aktarın, hücreleri santrifüjleme ile pelet haline getirin ve takviyeyi aspire edin.

Daha sonra tüpü buzun üzerine yerleştirin ve hücre peletini 900 mikrolitre soğuk M iki ortamda yeniden süspanse edin. Daha sonra, 900 mikrolitre soğuk PVP kaplı kolloidal silika ekleyin ve tüpü 20 dakika santrifüjleyin. Üst bölünme öncesi hücre bandını dikkatlice aspire edin ve ardından alt sürü bandını yeni bir mikro santrifüj tüpüne toplayın.

Sürü hücrelerini bir mililitre soğuk M iki ortamda iki kez yıkayın ve son sıkmadan hemen önce her yıkama arasında üç dakika santrifüjleyin. Hücre süspansiyonunu önceden soğutulmuş bir mililitrelik cam test tüpüne yerleştirin ve hücrelerin optik yoğunluğunu ölçün. Daha sonra hücreleri bir mikro füj tüpüne aktarın ve santrifüjden sonra santrifüjleyin.

Reese, son hücre peletini 0.3 ile 0.4 arasında bir optik yoğunlukta Prewarm M iki G ortamında askıya alın ve hücreleri 28 santigrat derecede sallayın. Mikroskopi isteniyorsa, kültürün bir mikrolitresini uygun zaman noktalarında bir M iki G aeros pedi üzerine yerleştirin. Asenkron bir kültürün diferansiyel yoğunluk santrifüjlemesi, iki hücre bandı verir.

Alt bant, daha yüksek yoğunluğa sahip sürü hücreleri içerir ve üst bant, daha düşük yoğunluğa sahip stoklu ve ön bölünmeli hücreler içerir. Kültürün optik yoğunluğu, hücre döngüsü boyunca yaklaşık iki kat artar. Bu süre zarfında, sürü hücreleri stoklanmış hücrelere farklılaşır, stoklanmış hücreler daha sonra çoğalır ve asimetrik hücre bölünmesine uğrar.

Her bölünme yeni bir sürü hücresi ve ana stoklu hücre verirken, hücre döngüsü ana düzenleyicisi CTRA için bir batı lekesi, senkronizasyonu doğrulamak için yararlı bir kontroldür, CTRA, sürü hücrelerinde DNA replikasyonunu bloke eder ve DNA replikasyonu üzerine bozulur. CTRA daha sonra hücre döngüsünde sentezlenir, DNA replikasyonunun yeniden başlatılmasını önler ve birçok gelişimsel genin transkripsiyonunu aktive eder. CTRA protein seviyelerinin bu salınım modeli, başarılı bir senkronizasyonu gösterir.

Bu videoyu izledikten sonra, bakteri hücre döngüsünü araştırmak için geri arama veya NA 1000 hücrelerinin nasıl senkronize edileceğini iyi anlamış olmalısınız. Bu hücre senkronizasyon prosedürü, doğru şekilde gerçekleştirilirse bir ila iki saat içinde yapılabilir. Bu prosedürü gerçekleştirirken hızlı çalışmayı unutmamak önemlidir.