Name: Model Baklagil Erken Embriyo Geliştirme Yönetmeliği incelenmesi için zigotik ve somatik embriyolar Elde protokolleri Medicago truncatula (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: Öğrenin, Medicago truncatula kullanarak bitki embriyogenezinde genetik düzenlemeyi incelemek için zigotik ve somatik embriyo toplama protokollerini. Bu yöntemler, doku kültürü teknikleriyle farklı gelişim aşamalarında embriyolar elde etmeyi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu araştırma, Avustralya Araştırma Konseyi hibe CEO348212 ve Newcastle Üniversitesi tarafından desteklenmiştir. Dr. Sam Zhang'ın yardımı kabul edilmektedir.

1. Zigotik Embriyo Gelişimi <ol><li> Bitki Materyali <ol><li> Büyüme Medicago, bir 14 saatlik aydınlık periyoduyla serada 23 ° C / 19 ° C gündüz / gece sıcaklığı yabani tip Jemalong ya da yüksek oranda yeniden generable onun yakınındaki izogenik, (2HA olarak da bilinir) genotip Jemalong 2HA 13 truncatula. <ol><li> Suyun tohumu girin ve bir gece suda bekletin izin, böylece tohumun ekim önce Pierce (23 G iğne ile), tohum kaplama yüzeyi. Tam tohum örtecek kadar su ekleyin. </li><li> Saksı karışımı içinde her 15 cm çapında pota 3 tohum ekmek (10 kapların toplam) (kaba kum, perlit, lif-turba (1: 1: 1) artı Osmocote Exact Standardı 5 g: Yavaş salimli gübre) ve aktarma sera. Bitki tırmanmak sapları için pot ve çevre başına 1 bitki bir kafes tarafından var bu yüzden çimlenme sonrası sağlıklı fide saklayın. </li></ol></li></ol></li><li> Hasat Bölmeler <ol><li> W gelen bakla toplayınJemalong veya 2HA uygun erken embriyo aşamalarında elde etmek ild türü olarak ilk 9 nitelendirdi. Not: Farklı bölme aşamaları, Şekil 1 &#39;de gösterilmiştir ve karşılık gelen embriyo aşamaları, Şekil 2&#39;de gösterilmiştir. </li><li> Ayrı aşamaları 6 ve 7 (Tablo 2) yardım etmek için sahneye 6 geçen süreyi. Tablo 1 gereğince kriterleri kullanılarak hasat farklı pod aşamalarını kontrol ölçün. </li></ol></li><li> Bölmelerinden ovüllerin Kesme ve embriyo aşaması kontrol <ol><li> Gerekirse tek başına ince forseps kullanarak bakla veya stereo mikroskop ve forseps gelen ovüllerin izole edin. Gerekirse embriyo aşaması hızla standart bileşik mikroskobu (Şekil 3B) kullanılarak kontrol edilebilir. </li><li> Arabic 7.5 g sakız, 100 g klor hidrat, 5 ml gliserol, damıtılmış deiyonize su 60 ml su ihtiva eden Hoyer çözeltisi modifiye hazırlayın. 3-5 saat veya gece boyunca karıştırılarak çözülür. </li><li> Daha fazla rafine içind mikroskopi modifiye Hoyer çözümü 15,16 disseke ovüllerin temizleyin. Dikkatle berrak olana kadar oda sıcaklığında (ovül karşılamak için yeterli) Hoyer çözeltisi, küçük bir hacim içinde sağlam ovüllerin ve yeri al. </li><li> Diferansiyel girişim kontrast (DIC) optik ile örnekleri görüntüleyin. Bir dijital fotoğraf makinesi 9 (Şekil 2) iwth görüntüler çekin. </li><li> Pod merkezi bölgesinde en üniforma ovüllerin edinin ve gerekli sayıda birikir. Bir örnek, Şekil 3A&#39;da gösterilmiştir. Daha fazla analiz için gerekli sıcaklıkta buz ve mağaza ovüllerin (-80 ° C için nükleik asitler) toplayın. NOT: histolojik kesitlerin analizi, transmisyon elektron mikroskobu ile ilgili detaylar için, ve in situ melezleme kağıtları 8,9 bakınız. </li></ol></li></ol> İn Vitro 2. Somatik Embriyo Gelişimi <ol><li> Bir M. kullanın truncatula çeşidi tŞapka kolaylıkla kültür embriyoları meydana edebilmektedir. Yaprak eksplantlarından için bu protokol için 2-4 aylık olduklarında 2HA bitkiler 13,17 kullanın. </li><li> Bir uzatma kök son neredeyse tamamen genişletilmiş üç yapraklı yapraktan broşürler alın. </li><li> Dehidratasyonu önlemek için bir kültür tencerede nemli kağıt havlu üzerinde üç yapraklı yaprakları tutun. NOT: üç yapraklı yaprak hasat edilir sonra da en az gecikmeyle kullanılabilir olması gerekir. </li><li> Kültür ortamının hazırlanması <ol><li> 4: 1: agar 5 orta (ağırlık% 0,8: hacim) içinde 9 cm Petri kapları P4 10 kullanın. Not: P4 10: 4: 1: 5, orta P4 bazal ortamı 18 artı 10 uM 1-naftalenasetik asit (NAA), 4 uM 6-benzilaminopurin (BAP), 1 uM absisik asit (ABA) ve 5 uM gibberellik oluşmaktadır asit (GA). GA + ABA kullanımı embriyo oluşumunu hızlandırır ve embriyo sayısı 14 maddi artışlara neden olmaktadır. </li><li> 1 L P4 bazal ortamı Makyaj; (calciu yaptığı büyük tuzlarından oluşan,) ayrı ayrı m minör tuzları ve vitaminler (Tablo 3), şelatlanmış demir (ayrı makyaj), kazamino asitler (kasein hidrolizat), 30 g sakroz, 8 g agar. </li><li> Uygun parçalar halinde -20 ° C&#39;de ana tuzlar, kalsiyum, kazamino asitler, minör tuzları ve vitaminler mağazası stok çözeltileri. 4 ° C&#39;de şelatlı demir saklayın. </li><li> • 7H FeSO 4 1,853 g eklenirken karıştırılırken iyonu giderilmiş damıtma suyu yaklaşık 900 ml Na2EDTA • 7.44 g 2H 2 O çözündürülmesiyle şelatlı demir (200x) makyaj, daha sonra 98-99 ° C&#39;ye kadar bir çözüm getirmek 2 O. Terkip maddeleri, çözündüğü zaman son olarak 1 L tamamlanır. Amber içinde saklayın 4 ° C&#39;de şişe renkli. </li><li> Tablo 4&#39;de olduğu gibi hisse senedi çözümleri ile P4 bazal ortamı Makyaj. Ortamda hormonlar 10 uM NAA, 4 iM BAP, 1 uM ABA, 5 mcM GA (Tablo 4 ve Tablo Spesifik Malzeme bakınız). NAA Ekleve önceki BAP otoklavda bir şınngaya bağlanmış bir 0.22 um filtre ile filtre sterilizasyonu, otoklav yaklaşık 55 ° C&#39;ye kadar soğutulduktan sonra, ABA ve GA ekleyin. Nazik dönen ile iyice karıştırın. </li><li> Otoklav öncesinde 1 M KOH ile pH 5.8 medyayı ayarlayın. 20 dakika boyunca 121 ° C&#39;de otoklav. </li><li> Filtre sterilize ABA ve GA, ekleme ve bir laminer akış kaputu ya da biyolojik tehlike kabine steril 9 cm Petri kapları içine medya yaklaşık 25 ml dökün otoklav sonra. Serin ve ağar kapaklı kapalı olarak ayarlamanıza olanak tanır. Sonra kapağı üzerine koymak ve kapağın üzerinde hiçbir yoğuşma olmadığından emin olun. (Kapak kondens önlemek için bir karton kutu içinde) 4 ° C&#39;de gerekli ve mağaza gibi etiket. </li></ol></li><li> Yaprak dokusu sterilizasyonu <ol><li> UV-sterilize laminer akış kaputu ya da biyolojik tehlike kabine çalışın. </li><li> Yeri önceden otoklavlanmış yay çay demlik mesh topun içine bırakır. </li><li> Bir cul etanol:% 70 (v v) yaprakları içeren çay demliği daldırın30 saniye boyunca Ture pot. NOT: Bu prosedürde tüm adımları kullanın 250 ml otoklavlanırlar kapak polikarbonat kültür tencere vida. </li><li> Boşaltın ve daha sonra transferi ve 1 yaprak dokusu sokmak: 8 (hac: hac) ile seyreltilmiş ağartma maddesi (% 0.5 klorin), 10 dakika boyunca karıştırılır. Zaman zaman hafifçe karıştırılır. </li><li> Çamaşır suyu boşaltın ve steril deiyonize distile su içeren bir kültür tencerede çay demliği aktarın. Yavaşça girdap ve fazla suyu boşaltın. Steril deiyonize distile su taze kültür pot ile bir kez daha tekrarlayın. </li><li> Steril deiyonize damıtılmış su, taze kültür kap steril forseps çay infüzyon edicinin yaprakları çıkarın. Steril kapağını tekrar ve tersini ve dönen tarafından durulayın. Eksplantlar hazırlamak için hazır olana kadar steril su üzerinde yüzen yapraklar bırakın. </li></ol></li><li> Eksplantlarındaki hazırlanması ve Kaplama <ol><li> Steril teknikleri kullanarak, bir neşter ile kenarından bireysel sterilize broşürler Döşeme ve iki ya da thr içine kalan dikdörtgen kesilmişdikdörtgen eksplantlar her eksplant (Şekil 5A) merkezinde orta damar ile (8-10 x 3-5 mm) ee. NOT: eksplant büyüklüğü ilk Kalluslaştırma başlatılması oldukça önemlidir. Take-away gıda kapları steril kapaklarındaki kesme yürütmek. </li><li> Plaka 9 cm çapında Petri kapları (Şekil 5B) agar-katılaşmış kültür ortamında 6 eksplantlar. Her zamanki yaprak yönünü korumak için aşağı eksplantlar abaxial tarafı Plate. </li><li> Yemeğin etrafında gergin Parafilm (Şekil 5C) ile Petri kapları mühür. Doku şimdi inkübasyon için hazırdır. </li></ol></li><li> Doku Kuluçka <ol><li> Kültür süresi boyunca sıcaklığı kontrol edilen bir oda ya da büyüme odasında 28 ° C&#39;de karanlıkta inkübe edin. NOT: eksplantlar, dediferansiyonunu başlatmak hücre bölünmesi, çoğalması (kallus oluşumu) ve embriyogenez (farklılaşma) uğrayacaktır. </li><li> Farklılaştırarak expla altkültürütaze ortama 3 hafta sonra NTS. Bu altkültür bir laminer akış kaputu ya da biyolojik tehlike kabinede, steril paslanmaz çelik spatula ve forseps kullanılarak tüm eksplant aktarın. Kalluslu oluşur ve kallus Şekil 5C büyük bir boyutunu aşıyor gibi taze ortama alt kültüre zaman bireysel yara dokusunun% 50 transfer. </li><li> Yaklaşık 4 hafta içinde ilk embriyoların uyun. Senkronize bir derece olsa da, 4-8 haftalık kuluçka dönemi boyunca farklı embriyo aşamalarını toplamak (Şekil 6A, B). Deneysel hedefleri doğrultusunda bir mikroskop ve işlem altında toplayın. </li><li> Eksplantlar 3 ay boyunca embriyo üretmeye devam edeceğiz, böylece her 3 haftada bir altkültürü ve periyodik embriyolar kaldırmak. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Gepts, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Legumes+as+a+model+plant+family.+Genomics+for+food+and+feed+report+of+the+cross-legume+advances+through+genomics+conference%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Legumes as a model plant family. Genomics for food and feed report of the cross-legume advances through genomics conference.</a> Plant Physiol. 137 (4), 1228-1235 (2005).</li>
<li>Graham, P. H., Vance, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Legumes%3A+importance+and+constraints+to+greater+use%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Legumes: importance and constraints to greater use.</a> Plant Physiol. 131 (3), 872-877 (2003).</li>
<li>Young, N. D., Udvardi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translating+Medicago+truncatula+genomics+to+crop+legumes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Translating Medicago truncatula genomics to crop legumes.</a> Curr. Opin. Plant Biol. 12 (2), 193-201 (2009).</li>
<li>Young, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Medicago+genome+provides+insights+into+the+evolution+of+rhizobial+symbioses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The Medicago genome provides insights into the evolution of rhizobial symbioses.</a> Nature. 480 (7378), 520-524 (2011).</li>
<li>Gallardo, K., Le Signor, C., Vandekerckhove, J., Thompson, R. D., Burstin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomics+of+Medicago+truncatula+seed+development+establishes+the+time+frame+of+diverse+metabolic+processes+related+to+reserve+accumulation%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Proteomics of Medicago truncatula seed development establishes the time frame of diverse metabolic processes related to reserve accumulation.</a> Plant Physiol. 133 (2), 664-682 (2003).</li>
<li>Verdier, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+profiling+of+M.+truncatula+transcription+factors+identifies+putative+regulators+of+grain+legume+seed+filling%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Gene expression profiling of M. truncatula transcription factors identifies putative regulators of grain legume seed filling.</a> Plant Mol. Biol. 67 (6), 567-580 (2008).</li>
<li>Thompson, R., Burstin, J., Gallardo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-genomic+studies+of+developmental+processes+in+legume+seeds%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Post-genomic studies of developmental processes in legume seeds.</a> Plant Physiol. 151 (3), 1023-1029 (2009).</li>
<li>Wang, X. -D., Song, Y., Sheahan, M. B., Garg, M. L., Rose, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+embryo+sac+to+oil+and+protein+bodies%3A+embryo+development+in+the+model+legume+Medicago+truncatula%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytol%22%5BJournal%5D)">From embryo sac to oil and protein bodies: embryo development in the model legume Medicago truncatula.</a> New Phytol. 193 (2), 327-338 (2012).</li>
<li>Kurdyukov, S., Song, Y., Sheahan, M. B., Rose, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+regulation+of+early+embryo+development+in+the+model+legume+Medicago+truncatula%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Transcriptional regulation of early embryo development in the model legume Medicago truncatula.</a> Plant Cell Rep. 33 (2), 349-362 (2014).</li>
<li>Mansfield, S. G., Briarty, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+embryogenesis+in+Arabidopsis+thaliana.+2.+The+developing+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Can.+J.+Botany%22%5BJournal%5D)">Early embryogenesis in Arabidopsis thaliana. 2. The developing embryo.</a> Can. J. Botany. 69 (3), 461-476 (1991).</li>
<li>Seefried, W. F., Willman, M. R., Clausen, R. L., Jenik, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+regulation+of+embryonic+patterning+in+Arabidopsis+by+microRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Global regulation of embryonic patterning in Arabidopsis by microRNAs.</a> Plant Physiol. 165 (2), 670-687 (2014).</li>
<li>Birnbaum, K. D., Sánchez Alvarado, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slicing+across+kingdoms%3A+regeneration+in+plants+and+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Slicing across kingdoms: regeneration in plants and animals.</a> Cell. 132 (4), 697-710 (2008).</li>
<li>Rose, R. J., Nolan, K. E., Bicego, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+the+highly+regenerable+seed+line+Jemalong+2HA+for+transformation+of+Medicagotruncatula+-+implications+for+regenerability+via+somatic+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">The development of the highly regenerable seed line Jemalong 2HA for transformation of Medicagotruncatula - implications for regenerability via somatic embryogenesis.</a> J. Plant Physiol. 155 (6), 788-791 (1999).</li>
<li>Nolan, K. E., Song, Y., Liao, S., Saeed, N., Zhang, X., Rose, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+unusual+ABA+and+GA+synergism+increases+somatic+embryogenesis%2C+facilitates+its+genetic+analysis+and+improves+transformation+in+Medicago+truncatula%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+ONE%22%5BJournal%5D)">An unusual ABA and GA synergism increases somatic embryogenesis, facilitates its genetic analysis and improves transformation in Medicago truncatula.</a> PloS ONE. 9 (6), e99908(2014).</li>
<li>Liu, C. M., Meinke, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+titan+mutants+of+Arabidopsis+are+disrupted+in+mitosis+and+cell+cycle+control+during+seed+development%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">The titan mutants of Arabidopsis are disrupted in mitosis and cell cycle control during seed development.</a> Plant J. 16 (1), 21-31 (1998).</li>
<li>Nolan, K. E., Kurdyukov, S., Rose, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+the+SOMATIC+EMBRYOGENESIS+RECEPTOR-LIKE+KINASE+1+%28SERK1%29+gene+is+associated+with+developmental+change+in+the+life+cycle+of+the+model+legume+Medicago+truncatula%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Bot%22%5BJournal%5D)">Expression of the SOMATIC EMBRYOGENESIS RECEPTOR-LIKE KINASE 1 (SERK1) gene is associated with developmental change in the life cycle of the model legume Medicago truncatula.</a> J. Exp. Bot. 60 (6), 1759-1771 (2009).</li>
<li>Iantcheva, A., Vlahova, M., Atanassov, A., et al. Somatic embryogenesis from leaf explants. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aIantcheva%2C+A+%22The+Medicago+truncatula+handbook%22">The Medicago truncatula handbook</a>. Mathesius, U. , Available from:
 
 <a target="_blank" href="http://www.noble.org/MedicagoHandbook">http://www.noble.org/MedicagoHandbook</a> (2006).</li>
<li>Thomas, M. R., Johnson, L. B., White, F. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+of+interspecific+somatic+hybrids+of+Medicago+by+using+Agrobacterium+transformed+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">Selection of interspecific somatic hybrids of Medicago by using Agrobacterium transformed tissues.</a> Plant Sci. 69 (2), 189-198 (1990).</li>
<li>Ochatt, S. J. Immature seeds and embryos of Medicago truncatula cultured in vitro. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aOchatt%2C+SJ+%22Plant+Embryo+Culture%3A+Methodsand+Protocols%2C+Methods+in+Molecular+Biology%22">Plant Embryo Culture: Methodsand Protocols, Methods in Molecular Biology</a>. Thorpe, T. A., Yeung, E. C. 710, Springer protocols, Humana press. 39-52 (2011).</li>
<li>Mantiri, F. R., Kurdyukov, S., Lohar, D. P., Sharopova, N., Saeed, N. A., Wang, X. D., VandenBosch, K. A., Rose, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcription+factor+MtSERF1+of+the+ERF+subfamily+identified+by+transcriptional+profiling+is+required+for+somatic+embryogenesis+induced+by+auxin+plus+cytokinin+in+Medicago+truncatula%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">The transcription factor MtSERF1 of the ERF subfamily identified by transcriptional profiling is required for somatic embryogenesis induced by auxin plus cytokinin in Medicago truncatula.</a> Plant Physiol. 146 (4), 1622-1636 (2008).</li>
</ol>

Yazarlar, herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

açıklanan protokoller oldukça yalındır ve tüm çağdaş hücre ve moleküler teknikler ile baklagil embriyogenezde soruşturma izin verir. Bu avantaj ve in vivo ve in vitro yaklaşımlar hem de dezavantajları vardır tanır. Hem olgunlaşmamış tohumlar 19 kültürüne göre erken embriyogenez daha fazla odaklanmak sağlar. In vivo çalışmalarda durumunda neler açıklanan ağırlıklı birçok embriyo çalışmaları için uygundur bölmesinden ovülde izolasyonu olduğunu. Ay...

Hasat alan ve toplam üretim 1&#39;de hububat ikinci baklagiller, yaklaşık 20.000 tür ve Leguminosae (Fabaceae veya) ailesi ile yüksek bitkilerin üçüncü büyük aileyiz vardır. Soya üçüncü büyük kültür bitkisidir. Tahıl baklagiller diyet proteini üçte biri ve insan tüketimine 2 bitkisel yağ üçte biri ile ilgili sağlar. Onların N 2 sabitleme kapasitesi ile Baklagiller ayrıca tohum kotiledonlarında soya, mağazalar protein ve yağ gibi. Sürdürülebilir tarımsal sistemlere Medicago truncatula katkıda önemli genetik ve genomik kaynakların 3,4 ile genetik ve genomik baklagil modelidir. M. iken truncatula giderek baklagil tohum biyolojisi 5-7 ve embriyojenezi 8,9 incelemek için istihdam edilmiştir baklagil-rhizobium simbiyoz 4 anlamada ilerlemeler sağladı. Arabidopsis embryogenesis yoğun 10,11 okudu ama ben olmuştursa olmayan baklagil ve embriyogenez ayrıntıları Medicago&#39;dan 8,10 özdeş değildir. M&#39;de zigotik embryogenesis truncatula farklı bir çok hücreli hipofiz, bir endoployploid uyutucuya ve bazal transferi hücresinin 8, ilginç özelliklere sahiptir. Somatik embriyojenez (SE), yaygın olarak bitkiler 12 rejenerasyonu için kullanılır. Baklagil modelinde M. In truncatula, ebeveyn Jemalong dan geliştirilmiştir tohum çizgisi Jemalong 2HA (2HA) somatik embriyogenez 13 yüksek oranlarına sahip. üretilen embriyoların sayısı son zamanlarda önemli ölçüde köklü orta 14 hem gibberelik asit (GA) ve absisik asit (ABA) eklenerek artış olmuştur. GA ve ABA genellikle antagonistik 14 hareket verilen sıradışı sinerjik bu durumda GA ve ABA hareket içinde. kallustan embriyoların embriyogenez evresi hali hazırda visuall saptanmasına olanak sağlamaktadır yüzeyi üzerinde gelişebiliry ve kolaylıkla hasat edildi. Somatik embriyojenez incelenmesi (Jemalong) (2HA) embriyonik ve embriyonik olmayan olan izojenik hatlarının yakınında kolaylaştırır olması ve in vivo ve farklı deneysel olanaklar sağlar in vitro sistemlerde de sahip. Embriyo gelişimi hücresel ve moleküler mekanizmaların anlaşılması anlayış tohum ve bitki gelişimi için gereklidir. Baklagiller, diğer çeneklilere olduğu gibi, insan beslenmesi için kullanılan ürünler depolamak embriyo kotiledonları olduğunu. Erken embryogenesis hızlı hücre bölünmesi ve doğru embriyo desenlendirme içerir. 8 gün sonra gübreleme, M&#39;de truncatula embriyo erken kotiledon aşamaları ulaşır. morfolojik karakterizasyon tam sera koşullarında döllenme sonrasında gün gösterilmez. Böylece, gelişmekte olan embriyo aşamasına belirtmek için verimli bir standart yaklaşım, genetik REGUL okuyan değerlidirErken zigotik embriyojenezin tirme. Bu yazıda, baklagil modelde M. de embriyogenezin biyolojik çalışmalar için gelişen embriyolar toplamak için iki standart protokolleri sağlamak truncatula. İlki ikinci kolayca erişilen büyük embriyo sayıları sağlamak için kültür yaprak eksplantlarından yoluyla somatik embriyogenesis ise embriyogenez ve pod morfolojisi ilişkilendirerek Zigotik embriyolar toplamaktır.

<table><tbody><tr><td>P4 orta</td><td>Sigma-Aldrich Sigma-Aldrich</td><td></td><td>Kimyasalları veya diğer analitik sınıf tedarikçiyi kullanın</td></tr><tr><td>Ana tuzlar</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Küçük tuzlar</td> Vitaminler Agar Bacto Laboratuvarları <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>214010</td><td>Bacto agar</td></tr><tr><td>Bitki hormonları</td><td></td><td></td><td></td></tr> 1<tr><td></td>-<td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Naftalinasetik asit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N0640</td><td>Az miktarda 1 M NaOH</td></tr><tr><td>Absisik asit</td><td>içinde çözün Sigma-Aldrich</td><td>A1049</td><td>Az miktarda 1 M NaOH</td></tr><tr><td>6-Benzilaminopurin</td><td>içinde çözün Sigma-Aldrich</td><td>B3274</td><td>MQ suda ısıtma ve birkaç damla ile çözün 1N HCl</td></tr><tr><td>Gibberellic Asit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7645</td><td>Az miktarda etanolde çözün</td></tr><tr><td>Ekipman</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stereo diseksiyon mikroskobu</td><td>Leica</td><td>MZFLIII</td><td>Veya benzeri</td></tr><tr><td>Işık mikroskobu</td><td>Zeiss</td><td>Axiophot</td><td>Veya benzeri, uygun optiklerle</td></tr><tr><td>Dijital kamera</td><td>Zeiss</td><td>AxioCam HRc</td><td>Veya benzeri</td></tr><tr><td>Sterilizasyon yaprakları</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>250 mL vidalı kapaklı polipropilen kapaklı polikarbonat kap</td><td>SARSTEDT</td><td>75.9922.519</td><td>Otoklavlanabilir</td></tr></tbody></table>

model baklagil erken embriyo geliştirme yönetmeliği incelenmesi için zigotik ve somatik embriyolar elde protokolleri<em&gt; medicago truncatula</em

Protocols for Obtaining Zygotic and Somatic Embryos for Studying the Regulation of Early Embryo Development in the Model Legume Medicago truncatula

Tek bir hücre zigot başlayarak Erken embryogenesis hızlı hücre bölünmesi ve morfogenez geçer ve morfolojik öncesi küresel, küresel, kalp, torpido ve kotiledon aşamalarında ile karakterizedir. Bu ilerici gelişme karmaşık bir moleküler ağ sıkı yönetmelik altındadır. Benzer bir gelişme aşamasında yeterli bir erken embriyolar Hasat erken embriyogenez hücresel ve moleküler düzenleme incelemek için gereklidir. Medicago&#39;dan örneğin 8 gün erken kotiledon aşamaya ulaşmak için truncatula ise erken embriyogenez kısa hızlı morfolojilerinden uğrar çünkü bu kolay değildir. Burada, iki yaklaşımlarla sorunu gidermek. İlki zigotik embriyo aşamasına işaret yardımcı embriyo gelişimi ve bakla morfolojisi arasında bir bağlantı kurar. Bu, özellikle bakla spiraller ve dikenler geliştirilmesi sayısına dayanır. In vivo s tamamlayacak alternatif bir yoltudies somatik embriyoların üretilmesi için kültür yaprak eksplantlarından yoluyladır. Orta sıra dışı bir hormon kombinasyonu içeren - bir oksin (1-naftalenasetik asit), bir sitokinin (6-benzilaminopurin), absisik asit ve gibberellik asit. farklı aşamalarında diseksiyon olmadan kallus dışında büyüyen ayırt edilebilir.

F - Farklı embriyo aşamaları Şekil 2A gösterilmiştir ise F - Farklı embriyo aşamalarına karşılık gelen zigotik embryogenesis farklı pod yapılarda Şekil 1A gösterilmiştir. Aynı aşamada bakla seçerek, Yumurtacığa örnekleri oldukça tekdüze (Şekil 3A) elde edilebilir ki. RT-qPCR embriyoyu kullanarak belirli genler kolayca algılanır ve zaman derste 9 değerlendirilebilir. Bazı ek diseksiyon embriyo (Şekil 3B) daha ...

Amaç, baklagil Medicago truncatula modelinin, baklagil olmayan Arabidopsis modelini tamamlamak için erken bitki embriyogenezinin düzenlenmesini araştırmak için kolayca kullanılabileceğini göstermektir. Pod morfolojisi, zigotik embriyogenez aşamaları ile bağlantılıdır ve doku kültürü kullanılarak embriyoların toplanması için bir protokol de sağlanır.

Model Baklagil Erken Embriyo Geliştirme Yönetmeliği incelenmesi için zigotik ve somatik embriyolar Elde protokolleri<em&gt; Medicago truncatula</em

Early embryogenesis starting from a single cell zygote goes through rapid cell division and morphogenesis, and is morphologically characterized by ...

Aşağıdaki prosedürlerin genel amacı, bitkilerde embriyogenezin genetik düzenlemesini araştırmak için farklı gelişim aşamalarında ne kadar kargo tula embriyosunun elde edilebileceğini göstermektir; bu, kapsül morfolojisinin farklı zigotik embriyo gelişim aşamalarıyla ilişkilendirilmesi ve farklı aşamalarda somatik embriyolar elde etmek için yaprak eksplanlarının kültüre edilmesiyle gerçekleştirilebilir. Nihayetinde, ilgilenilen spesifik gelişim aşamalarında embriyogenez sırasındaki gen ekspresyonunu değerlendirmek için kantitatif PCR ve beta glukuronidaz kullanılabilir. Bu tekniklerin avantajları, in vivo deneyler için münferit çiçeklerin işaretlenmesinin gerekmemesi ve optimize edilmiş in vitro prosedürlerin birbirini tamamlayan deneysel yaklaşımlar sunmasıdır.Kültür prosedürünün görsel olarak gösterilmesi, manipülasyonların detaylarının daha yakından takip edilmesine olanak tanıdığı için önemlidir. In vivo prosedürünü ing Wang, in vitro prosedürünü ise Kim Nolan gösterecektir. Zigotik embriyo gelişimini kolaylaştırmak için, Monte cargo trinoküler bir bitkiden alınan tohumların tohum kılıfı yüzeyini delin ve tohumları tamamen suyla kaplayarak gece boyunca suda bekletin.Ertesi gün, saksı karışımı içeren 10 adet 15 santimetre çapındaki saksının her birine üçer tohum ekin ve saksıları bir seraya taşıyın. Bitkileri 14 saatlik bir fotoperiyot altında, 23 ila 19 degrees Celsius gündüz gece sıcaklığında yetiştirin; çimlenmeden sonra her saksıda tek bir bitki kalacak şekilde en sağlıklı fideleri seçin ve kapsüller ortaya çıktığında bitki gövdelerinin tırmanabilmesi için fidelerin etrafını destek çıtalarıyla çevreleyin. İstenilen erken embriyo gelişim aşamasını elde etmek için tablo bir ve şekil bir'de belirtilen uygun aşamalarda toplama işlemini gerçekleştirin.Ardından, tohumları kapsüllerden ayırmak için pens kullanın. Alternatif olarak, daha detaylı mikroskopi için, Hoyer solüsyonunda tamamen şeffaflaştırılan embriyo evreleri, standart bir bileşik mikroskop altında görüntülenerek doğrulanabilir. Daha sonra, deney için gereken sayıda UL'yi kapsülün orta bölgesinden toplayın ve somatik embriyo gelişimi için yapılacak alt analizler adına uygun sıcaklıkta saklayın.Kültür ortamında kolayca embriyo oluşturabilen bir *Tetracentron* kültivarının uzayan gövdesindeki en son, neredeyse tamamen genişlemiş taze yapraklardan in vitro hasat yapın. Dehidrasyonu önlemek için taze yaprakları bir kültür saksısı içinde nemli kağıt havlu üzerinde tutun. Ardından, UV ile sterilize edilmiş bir biyogüvenlik kabininde çalışarak yaprakları otoklavlanabilir yaylı bir çay süzgecinin fileli topuna yerleştirin.Otoklavda 250 milliliter vidalı kapaklı polikarbonat kültür saksısı içindeki %70 Ethanol'e daldırılmış infüzör. 30 saniye sonra yaprak dokusunu süzün ve ardından infüzörü 10 dakika boyunca sekize bir oranında seyreltilmiş çamaşır suyu çözeltisine daldırın. Ara ara hafifçe çalkalayarak saksıyı nazikçe sallayın ve fazla suyu süzün.Ardından demleyiciyi durulayın. Yeni bir kapta, taze deiyonize su ile bir kez daha durulama yapın. Şimdi, yaprakları çay demleyicisinden taze bir kültüre, steril deiyonize distile suyla dolu bir kaba aktarmak için steril pens kullanın ve steril kapağı vidalayın.Ardından yaprakları ters çevirip çalkalayarak durulayın. Daha sonra, implantları ekmek için yaprakçıkların steril su üzerinde yüzmesini sağlayın. Steril teknik kullanarak sterilize edilmiş münferit yaprakçıkların kenarlarını kesin.Ardından, kalan dikdörtgeni her bir eksplan plakasının ortasında orta damar bulunacak şekilde, sekiz ila 10 x üç ila beş milimetrelik iki veya üç dikdörtgen eksplane bölün. Normal yaprak yönelimini korumak için, ABA mühürlü kısmı aşağıya gelecek şekilde, dokuz santimetre çapındaki agar katılaştırılmış kültür ortamı içeren Petri kaplarına her birine altı eksplan yerleştirin.Ardından Petri kaplarını parafilm ile mühürleyin ve plakları, sıcaklığı kontrol edilen bir odada, karanlıkta 28 degrees Celsius'de inkübe edin. Üç hafta sonra, farklılaşan delik eksplantlarını taze ortama alt kültüre aktarmak için steril paslanmaz çelik bir spatula ve pens kullanın. Kallus oluşumu meydana geldiğinde ve kallus burada gösterilen en büyük eksplantın boyutunu aştığında, ilk embriyolar yaklaşık dört hafta içinde gözlemlenmelidir.Taze ortama alt kültürleme yaparken, bireysel kallusun yalnızca %50'sini aktarın. Son olarak, eksplantları deneysel amaçlara göre işleyerek, dört ila sekiz haftalık inkübasyon süresi boyunca farklı embriyo aşamalarını toplamak için bir stereo mikroskop kullanın. Gösterildiği üzere zigotik embriyolar hasat edildikten sonra, aşağıda C kısmında belirtilen hibritleştirme veya diğer uygun stratejiler uygulanabilir; bu görsellerde gösterildiği üzere, ekili eksplantlar takip edilerek SSIS ve Spencer arasındaki belirgin farklar gözlemlenebilir.Dördüncü ile sekizinci haftalar arasında, farklı evrelerdeki somatik embriyolar belirlenebilir ve anlık analiz için toplanabilir. Örneğin, bu veriler, erken Olein evresindeki embriyoların bir tip medicago Tula eoin geni ekspresyonu gösterirken diğerini göstermediğini örneklendirmektedir. Somatik embriyo sisteminin özel bir avantajı, kallus transformasyonunun tüm bir bitkiyi yeniden üretmeye gerek kalmadan gerçekleştirilebilmesidir.Nitekim burada gösterildiği üzere, Beta glukuronidaz, embriyogenezin farklı aşamalarındaki gen ekspresyonunu görselleştirmek için kullanılabilir. Videoyu izledikten sonra, Andres elde etmek için podun nasıl seçileceği ve diseke edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.Ayrıca, somatik embriyogenez için steril eksplantların hazırlandığı ve ekildiği yöntemler ile gelişim sonrası süreçler hakkında iyi bir bilgiye sahip olmalısınız. Bu teknikler, embriyo büyümesi, gelişimi ve besin depolanması ile ilişkili olarak embriyogenezin erken aşamalarındaki transkripsiyon regülasyonunun incelenmesine olanak sağlamıştır.

protocols-for-obtaining-zygotic-somatic-embryos-for-studying

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Biz gelen geliştirmenin erken aşamalarında embriyo izole için etkili ve basit bir yöntem...

Erken evre Embriyolar verimli ve hızlı İzolasyon<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Tohumlar

Zebra ispinozu (Taeniopygiaguttata) değerli bir model organizmadır; ancak, zebra ispinozu gelişiminin erken aşamaları kapsamlı bir şekilde çalışılmamıştır. Protokol, gelişimsel ve moleküler uygulamalar için erken embriyoların nasıl inceleneceğini açıklar.

Kalkınma Erken Dönemlerinde Diseksiyon ve Zebra Finch Embriyolar Mansabında Analizi

Morphant embriyolar üretme yöntemleri gelişim düzenleyici mekanizmalarının ve gen ağları incelemek için gereklidir. Deniz yıldızı Patiria miniata bu çalışmalar için gelişmekte olan bir model sistem. Burada bir embriyo kültürleri, gamet elde üretmek için protokol ve bu türlerden zigot hızlı mikroenjeksiyon sunuyoruz.

Mikroenjeksiyonu Bir Yöntem Patiria Minata Zigotların

Organellerin ve diğer hücre altı yapıların dinamik davranışlarını in vivo olarak görüntülemek, fizyolojik ve hastalık durumlarındaki işlevlerine ışık tutabilir. Burada, iki organeli, sentrozomları ve mitokondriyi genetik olarak etiketlemek ve dinamiklerini geniş alan ve konfokal mikroskopi kullanarak canlı zebra balığı embriyolarında görüntülemek için yöntemler sunuyoruz.

Yaşayan Zebra balığı Embriyo Hücre alt yapıları görüntüleme

Bu iletişim kuralı Arabidopsis içinde embriyogenez embriyo Desen oluşumu bir mikroskop altında incelenmesi ve ardından ovule izni ile gözlemlemek için bir yöntem özetliyor.

Embriyogenez Arabidopsis olarak karakterize bir yöntem

Bu el yazması Arabidopsis zigotları ve embriyo canlı hücre görüntüleme sağlar bir vitro ovule yetiştirme yöntemini açıklar. Bu yöntem sırasında zigot polarizasyon hücre içi dinamikleri ve gelişmekte olan embriyo hücre kader belirtimi görselleştirmek için kullanılmaktadır.

Vitro Zigot polarizasyon, Live-hücre görüntüleme ve Arabidopsis thaliana embriyo desenlendirme için ovule ekimi

Bitki morfojenik genler inatçı genotiplerin genetik dönüşümlerini iyileştirmek için kullanılabilir. Burada açıklanan bir Agrobacteriumaracılı genetik dönüşüm (QuickCorn) üç önemli kamu mısır inbred hatları için protokoldür.

Agrobacterium-Rekalsitrant Mısır Inbred Hatları Morfojenik Genler Kullanarak Aracılı Olgunlaşmamış Embriyo Dönüşümü

Bu makale, tek hücrelerin ve çekirdeklerin dizilimi için gastrulasyon yapan fare embriyolarının yüksek kaliteli tek hücreli ve çekirdek süspansiyonları için bir boru hattı oluşturur.

Mutant Bütün Fare Embriyolarının Tek Hücreli RNA Dizilimi: Epiblasttan Gastrulasyonun Sonuna Kadar

Erken embriyogenezde tek hücrelerde zigotik genom aktivasyonu sırasında yeni başlayan transkripsiyonu görselleştirme yöntemlerini açıklıyoruz.

Erken Embriyoların Tek Hücrelerinde Zigotik Genom Aktivasyonunun Görselleştirilmesi

Xenopus laevis 1-hücreli embriyolardan mini embriyolar yapmak için fiziksel bir daraltma yöntemini açıklıyoruz.

Xenopus Mini Embriyoları Üretmek İçin Fiziksel Manipülasyon

Öğrenin, Medicago truncatula kullanarak bitki embriyogenezinde genetik düzenlemeyi incelemek için zigotik ve somatik embriyo toplama protokollerini. Bu yöntemler, doku kültürü teknikleriyle farklı gelişim aşamalarında embriyolar elde etmeyi sağlar.

Model Baklagil Erken Embriyo Geliştirme Yönetmeliği incelenmesi için zigotik ve somatik embriyolar Elde protokolleri Medicago truncatula (Video) | JoVE Journal

Model Baklagil Erken Embriyo Geliştirme Yönetmeliği incelenmesi için zigotik ve somatik embriyolar Elde protokolleri

Daha fazla video keşfet