Model Baklagil Erken Embriyo Geliştirme Yönetmeliği incelenmesi için zigotik ve somatik embriyolar Elde protokolleri Medicago truncatula

Aşağıdaki prosedürlerin genel amacı, bitkilerde embriyogenezin genetik regülasyonunu araştırmak için farklı gelişim aşamalarında kaç tane kargo tula embriyosu elde edilebileceğini göstermektir, bu, bakla morfolojisini farklı zigotik embriyo gelişim aşamaları ile ilişkilendirerek ve farklı aşamalarda somatik embriyolar elde etmek için yaprak dışını kültürleyerek gerçekleştirilebilir. Sonuç olarak, kantitatif PCR ve beta glukuronidaz, ilgilenilen spesifik gelişim aşamalarında embriyogenez sırasında genlerin ekspresyonunu değerlendirmek için kullanılabilir. Bu tekniklerin avantajları, in vivo deneyler için tek tek çiçeklerin etiketlenmesinin gerekli olmaması ve in vitro prosedürlerin optimize edilmesi, ücretsiz deneysel yaklaşımlar sağlamasıdır.

Kültür prosedürünün görsel olarak gösterilmesi önemlidir çünkü manipülasyonların ayrıntılarının daha yakından takip edilmesini sağlar. İn vivo prosedürü göstermek Wang'ı gösterecek, Kim Nolan ise in vitro prosedürü gösterecek. Zigotik embriyo gelişimini kolaylaştırmak için, bir Monte kargo trinoküler bitkisinden tohumların tohum kabuklarının yüzeyini delin ve tohumları gece boyunca tamamen suyla kaplı olarak ıslatın.

Ertesi gün, saksı karışımındaki 10 adet 15 santimetre çapındaki saksıların her birine üç tohum ekin ve saksıları cam bir eve aktarın. Bitkileri 23 ila 19 santigrat derece gündüz gece sıcaklığında 14 saatlik bir fotoğraf periyodu altında büyütün, çimlenmeden sonra en sağlıklı fideleri koruyun, böylece saksıda bir bitki olur ve baklalar göründüğünde bitki saplarının tırmanması için fideleri kafes ile çevreleyin. İstenen erken embriyo gelişim aşamasını elde etmek için tablo birde ve şekil bir'de belirtilen uygun aşamalarda toplayın.

Ardından, les'i bölmelerden izole etmek için forseps kullanın. Alternatif olarak, Hoyer çözeltisinde tamamen açık olan daha rafine mikroskopi için, embriyo aşamaları, embriyoların standart bir bileşik mikroskop altında görüntülenmesiyle doğrulanabilir. Daha sonra, kapsülün merkezi bölgesinden deney için gerekli olan UL sayısını toplayın ve bunları somatik embriyo gelişimi için aşağı akış analizi için uygun sıcaklıkta saklayın.

İn vitro olarak, kültürde kolayca embriyo oluşturabilen bir tran atula çeşidinin uzayan bir sapının en son, neredeyse tamamen genişletilmiş tate yaprağından broşürler toplayın. Dehidrasyonu önlemek için tate yapraklarını nemli kağıt havlu üzerinde bir kültür kabında tutun. Daha sonra UV ile sterilize edilmiş bir biyogüvenlik kabininde çalışarak, yaprakları bir otoklav bahar çayı demlik makinesinin ağ topuna yerleştirin.

Otoklavda 250 mililitrelik vidalı kapakta %70 Etanol içine daldırılmış bir demlik. Polikarbonat kültür kabı 30 saniye sonra, yaprak dokusunu boşaltın ve ardından demliği 10 dakika boyunca bir ila sekiz seyreltilmiş ağartıcı solüsyonuna daldırın. Ara sıra hafifçe döndürerek, tencereyi hafifçe döndürün ve fazla suyu boşaltın.

Ardından demliği durulayın. Yeni bir tencerede taze deiyonize suda bir kez daha. Şimdi yaprakları çay demliğinden taze bir kültüre aktarmak için steril forseps kullanın, steril deiyonize damıtılmış su kabı steril kapağı vidalayın.

Daha sonra yaprakları ters çevirerek ve döndürerek durulayın. Daha sonra implantları kaplamak için broşürlerin steril su üzerinde yüzmesine izin verin. Sterilize edilmiş broşürlerin kenarlarını steril teknik kullanarak kesin.

Daha sonra kalan dikdörtgeni, orta damar her bir X explan plakasının merkezinde olacak şekilde iki veya üç, sekiz ila 10 x üç ila beş milimetre dikdörtgen explan şeklinde kesin. Dokuz santimetre çapında agar katılaşmış kültür ortamı başına altı x eksplant. Her zamanki yaprak yönünü korumak için ABA conta tarafı aşağı bakacak şekilde petri kapları.

Daha sonra Petri kaplarını perfil ile kapatın ve plakaları karanlıkta 28 santigrat derecede kontrollü bir sıcaklık odasında inkübe edin. Üç hafta sonra, steril bir paslanmaz çelik spatula ve forseps kullanarak ayırt edici deliğin taze ortama ekstrakte edilmesini alt kültüre alın. İlk embriyolar, nasırlaşma meydana geldikçe ve kallus burada gösterilen en büyük explan'ın boyutunu aştığından yaklaşık dört hafta içinde gözlemlenmelidir.

Alt kültür olduğunda bireysel nasırın sadece% 50'sini taze ortama aktarın. Son olarak, dört ila sekiz haftalık bir kuluçka süresi boyunca farklı embriyo aşamalarını toplamak için bir stereo mikroskop kullanın ve eksplantları deneysel hedeflere göre işleyin. Zigotik embriyoların C'de aşağı akışta gösterildiği gibi hasat edilmesinden sonra, bu görüntülerde gösterildiği gibi özellikle ilgi çekici iki hibridizasyon veya diğer uygun stratejiler kullanılabilir, SSIS ve Spencer'ın ayırt ediciliği, kaplanmış X planları izlenerek gözlemlenebilir.

Haftalar boyunca, gizli aşamalardaki dört ila sekiz somatik embriyo bulunabilir ve hemen analiz için toplanabilir. Örneğin, bu veriler, erken Olein evresindeki embriyoların bir tür medicago Tula eoin geninin ekspresyonunu nasıl sergilediğini, ancak başka bir şeyin ekspresyonunu nasıl sergilemediğini göstermektedir. Somatik embriyo sisteminin özel bir avantajı, nasırın dönüşümünün bütün bir bitkiyi yenilemeden gerçekleştirilebilmesidir.

Nitekim, burada gösterildiği gibi. Beta glukuronidaz, embriyogenezin farklı aşamalarında gen ekspresyonunu görselleştirmek için kullanılabilir. Videoyu izledikten sonra, Andres'i elde etmek için pod'u nasıl seçeceğinizi ve böleceğinizi iyi anlamış olmalısınız.

Ayrıca, gelişimlerinden sonra somatik embriyogenez için steril explan'ın nasıl hazırlanacağı ve tabaklanacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Bu teknikler, embriyogenezin erken evrelerinin transkripsiyon regülasyonunun embriyo büyümesi, gelişimi ve besin depolanması ile ilgili olarak araştırılmasını sağlamıştır.