Name: Enterovirüs Kültür ve RT-qPCR Su Norovirus Oluşum EPA Method 1615 Ölçümü. Bölüm III. RT-qPCR Virüs Algılama (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 32 s
Description: Öğrenin, çevre ve içme sularındaki enterovirus ve norovirus konsantrasyonlarını RT-qPCR ile ölçme yöntemini. Santrifüj ultrafiltrasyon ve gerçek zamanlı amplifikasyon adımlarını keşfedin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar, Standart eğri reaktifinin geliştirilmesinde kullanılan klonları hazırladığı için Dr. Eric Rhodes'a, numune işlemede yardım için Brian McMinn'e, istatistiksel analiz için Larry Wymer'a, bu çalışmada kullanılan Sabin poliovirüs serotip 3'ü sağladığı için ABD Tarım Bakanlığı, Marshfield, WI'dan Dr. Mark Borchardt'a ve Washington Üniversitesi'nden Dr. H. W. Virgin'e teşekkür eder. Louis, MO, murin norovirüsü için. Yazarlar ayrıca, stok laboratuvar reaktiflerinin hazırlanmasında yardım için Gretchen Sullivan'a, murin norovirüs stoklarının çoğaltılması için Dr. Mohammad Karim'e ve su örnekleri toplamamıza izin verdikleri için yerel özel kuyu sahiplerine ve kamu hizmetlerine teşekkür eder. Bu çalışma EPA tarafından gözden geçirilmiş ve yayınlanmak üzere onaylanmış olsa da, resmi Ajans politikasını yansıtmayabilir. Ticari isimlerin veya ticari ürünlerin belirtilmesi, kullanım için onay veya tavsiye teşkil etmez.

Not: kullan veri sayfaları protokol tüm adımları takip etmek; örnek veri sayfaları ek malzemeler Tablo S2-S4 verilmiştir. 1. Standart Eğri hazırlanması <ol><li> (Örneğin, EP-A-Zırhlı RNA 1615) 2.5 x 10 8 parçacık / ml (2.5 x 10 8 GC / ml) TSM kullanılarak bir konsantrasyona kadar üretici tarafından sağlanan konsantrasyondan seyreltilmesi ile standart eğri reaktifi çalışma stok hazırlama III tampon. -20 ° C&#39;de 1.5 ml mikrosantrifüj tüpleri ve mağaza kullanarak 250 ul kısma çalışma stok bölün. NOT: Alternatif standart eğri reaktifler olarak kullanılmak üzere hazırlanıyor çalışma virüsün hisse senetleri ve plazmidler ile ilgili talimatlar için ek malzemeler protokol Adım S1 bakın. </li><li> Bir çalışma stoğu alikotları bir veya daha fazla çözülme. , 2.5 x 10 7 konsantrasyonları veren 2.5 x 10 6, 2,5 x 1,5 ml mikrosantrifüj tüpleri kullanarak beş 10-kat seri dilüsyonları hazırlayın10 5, 2.5 x 10 4, 2.5 x 10 3 GC / ml olmuştur. <ol><li> TSM III tampon 225 ul 2.5 x 10 8 GC / ml çalışma stokunun 25 ul ekleyerek ilk seyreltme hazırlayın. Bir vorteks mikser kullanılarak 5-15 saniye karıştırılır. </li><li> TSM III tampon 225 ul Adım 1.2.1 hazırlanan seyreltme 25 ul ekleyerek sonraki seyreltme hazırlayın. Tekrar karıştırın ve önümüzdeki üç 10 kat dilüsyonları hazırlamak için benzer bir işlem devam ediyor. </li></ol></li><li> Standart eğri çalışma stoktan RNA ve hemen Bölüm 3&#39;te yordamı kullanarak beş dilüsyonları ayıklayın. </li></ol> 2. Tersiyer Konsantrasyon <ol><li> Üst numune odasına 1x PBS en az 10 ml,% 0.2 sığır serum albümini (BSA) eklenmesi ile toplanarak her bir numune için bir santrifüj konsantratör (30.000 molekül ağırlıklı akış kesici) hazırlayın. Bu çözüm ince kanal konsantrasyon odasını doldurdu emin olun ve ardından 4 ° C&#39;de O / N tutun. <ol><li&gt; Sıvıyı atın. Aşırı BSA kaldırmak ve daha sonra su atmak için steril reaktif kalitesindeki su en az 10 ml yoğunlaştırıcı bir kez durulayın. </li></ol></li><li> S, ayrı Santrifügal konsantre halinde Deneyi Örnek Hacmi eşit, her bir test örneğinden ikincil su konsantresi bir miktarını ekleyin. <ol><li> Denklem 1 kullanılarak S hesaplayın <img alt="Denklem 1" src="/files/ftp_upload/52646/52646eq1.jpg" /> D Analiz Edilmiş Orijinal Su Numune hacmi olduğu durumlarda, TSV Toplam Örneklem Hacmi ve FCSV Final Konsantre Numune Hacmi olduğunu. S. hesaplama örneği için ek malzemeler S2 bakın </li></ol></li><li> Santrifüj 20, bir sallanan kepçeli rotor içinde 4 ° C&#39;de 3.000-6.000 xg, her bir test örneği - 30 dakika. İnce kanal konsantrasyon odasında seviyesini kontrol edin. <ol><li> Birim 20 dakika veya daha uzun süre daha fazla 400 ul, santrifüj değilse. Th numune kadar devam santrifüjE ince kanal konsantrasyon odası az 400 ul düşürüldü. Süpernatant çıkarmayın. </li></ol></li><li> Virüs geri kazanımı arttırmak, steril 0.15 M sodyum fosfat 1 ml, pH 7-7,5 olan santrifüjlü konsantre kenarlarını yıkayın. Tekrar santrifüj 3.000-6.000 xg ve 4 ° C &#39;de Örnek az 400 ul&#39;ye indirgendi kadar. Bu yıkama adımı ek süre tekrarlayın. </li><li> Bir 100-200 ul mikropipet kullanarak dikkatlice ölçün ve 1.5 ml mikrosantrifüj tüp (yani, mikrosantrifüj tüp 200 ul transferi ve kalan sıvı tamamen çizilebilir kadar sonra mikropipet ayarlayarak kalan konsantre ölçmek için her konsantre örnek aktarmak ) pipet ucu içine. 400 ± 2 ul nihai ses seviyesini ayarlamak için, 0.15 M sodyum fosfat, pH 7-7,5 ekleyin. </li><li> Hemen 3. Processe edilemez herhangi konsantre örnekleri tutun adıma geçmeden nükleik asit Özüd, hemen fazla 24 saat boyunca 4 ° C &#39;de. </li></ol> 3. Nükleik Asit İzolasyon <ol><li> 1,5 ml mikrosantrifüj tüpleri etiketli ayırmak için Aşama 1.3 Aşama 2.5 veya standart eğri çözücüden, her bir test örneğinden Aşama tertier konsantrenin 3.3 ve 200 ul tarif edildiği gibi hazırlanmıştır ekstraksiyon tamponu 200 ul ekle. Veya -70 ° C&#39;nin altında üçüncül konsantreleri kalan dondurun. Aşağıdaki istisnalar dışında kan örnekleri sıkma protokolü için nükleik asit ekstraksiyon kiti, üreticinin talimatlarına uygun olarak, her numune nükleik asitlerin ekstrakte edin. </li><li> Su numunelerine proteazı eklemek veya nükleik asit ekstraksiyon kiti ile birlikte verilen ekstraksiyon tamponu kullanmayın. </li><li> Taşıyıcı RNA ile ekstraksiyon tamponu hazırlayın <ol><li> Taşıyıcı RNA 310 ug ihtiva eden bir şişeye, taşıyıcı RNA seyreltme tamponu 310 ul ekle. Çözülür ve daha sonra yaklaşık 50 ul ihtiva eden 6 kısma ayırmak için karıştırın. -20 ° C&#39;de saklayın° C. </li><li> 0,027 ug / ul bir taşıyıcı RNA konsantrasyonu elde etmek üzere, ekstraksiyon tamponunda ml&#39;si başına çözülmüş bir taşıyıcı RNA 28 ul ekle. Ekstraksiyon kiti ile birlikte bunun yerine taşıyıcı RNA tadil ekstraksiyon tampon kullanın. </li></ol></li><li> Ribonükleaz ekleyerek elüsyon tamponu, bir ana solüsyonu hazırlayın (RNaz) inhibitörler ekstraksiyon kiti ile birlikte verilen elüsyon tamponuna 400 ünite / ml nihai konsantrasyona seyreltildi. <ol><li> Sütuna RNaz inhibitör ile elüsyon tamponu 50 ul yerleştirerek spin kolon bağlanma nükleik asitten Elute RNA. 1 dakika boyunca bekleyin ve daha sonra oda sıcaklığında 1 dakika boyunca 6000 x g&#39;de santrifüjlenir. </li><li> Tekrarlayın Adım 3.4.1 ve daha sonra çıkarın ve sütun atın. </li></ol></li><li> Adım 3.4.2 RNA ekstrelerinin hacimde hazırlayın. 6 standart eğri çalışma stok hacimde ve en az 15 ul her biri her bir standart eğri seyreltme hazırlayın. En az ihtiva eden diğer bütün RNA örneklerinin 4 alikotları hazırlayın22 ul, her. Bunlar, 4 saat içinde ters transkripsiyon ile işlenebilir halinde 4 ° C &#39;de her bir numune ve standart eğri kontrolleri bir kısım saklayın; Aksi takdirde, ya da -70 ° C altındaki tüm alikotları saklayın. </li></ol> 4. Ters Transkripsiyon (RT) <ol><li> On katına eşit (mikrolitre) bulunan oligonükleotid nanomol (nmol) sayısını bir miktar kullanılarak her bir şişeye PCR dereceli su hacmi eklenerek, Tablo 1 deki her bir oligonükleotid primer ve prob, 100 uM stok çözelti hazırlayın Flakon etiketinde veya örneğin üreticinin özellikler sayfasında (gösterildiği gibi flakon (,) 363 ul 36,3 nmol içeren bir astar tekrar süspansiyon. eritmek için karıştırın. <ol><li> Çözüm çalışan 10 mcM hazırlamak için PCR dereceli su ile 100 mcM çözümler 1:10 seyreltin. </li></ol></li><li> 2. Pipet Tablo kılavuzunu kullanarak bir temiz oda RT Maste 16.5 ul RT Master Mix 1 ve 2 hazırlayınHer PCR plakasına r Mix 1 de çok kanallı pipet kullanarak. </li><li> Çözülme, donmuş ise, her alan numune ve Lab Müstahkem Numune Matrix gelen nükleik asit ekstreleri (LFSM; yani numaralı seribaşı su matris örneği). <ol><li> RNaz inhibitörü 400 ünite / ml içeren elüsyon tamponu içinde 5 ve 01:25: her bir alan ve LFSM örnek 1 seyreltin. </li><li> Lab Reaktif Blank (LRB; yani reaktif dereceli su kullanılarak bir negatif kalite kontrol), Performans Değerlendirmesi (PE, Çözülme, donmuş, ama eğer Lab Müstahkem Blank (yani seribaşı reaktif dereceli su kullanarak olumlu bir kalite kontrol LFB) sulandırmak yok ; yani, numaralı seribaşı reaktif dereceli su numuneleri bir çalışmaya başlamadan önce laboratuvar performansını), Performans Testi (PT değerlendirmek için kullanılan; yani, çalışma sırasında laboratuvar performansını değerlendirmek için kullanılan bir analist bilinmeyen titrelerle seribaşı reaktif dereceli su numuneleri ), NA Toplu negatif çıkarma kontrolü, ya da standart eğri kümesinden çıkarılan RNA. </li></ol&gt; </li><li> , Ayrı PCR plaka kuyu içine her test numunesi, kontrol ve standart eğriden RNA 6.7 ul yerleştirin test örnekleri ve kontroller için üçlü kuyuların kullanma ve standart eğrileri (bir RT plaka örneğin Şekil S1 bakın) kuyu yinelenen. <ol><li> Hiçbir şablon kontrolleri (NTC) için ayrı PCR plaka kuyu içine elüsyon tamponu 6.7 ul yerleştirin. İlk örnek için iki ve her dördüncü ek numune için daha sonra iki tane daha kullanılarak RT plaka başına 2-8 NTC ekleyin. </li><li> Plaka boyunca negatif çıkarma ve NTC kontrolleri dağıtın. </li></ol></li><li> Isıya dayanıklı plaka kapatıcı ile PCR plaka mühür. 5-10 saniye örnekleri karıştırın ve daha sonra ≥ 500 xg kısaca santrifüj. </li><li> 99 ° C&#39;de 4 dakika süreyle plaka inkübe ve daha sonra, bir termal döngü içinde 4 ° C&#39;ye kadar hızlı bir şekilde soğutulur. Santrifüj tekrar ≥ 500 xg kısaca at. </li><li> Dikkatle levhası contasını çıkartın ve sonra her kuyuya RT Master Mix 2 16.8 ul ekleyin. Seal karıştırılması, ardından bir ısıya dayanıklı plaka kapatıcı ile tekrar plaka ve ≥ 500 x g&#39;de kısa bir santrifüjleme. </li><li> 4 ° C tutma döngüsü daha sonra, bir termal döngü plaka koyun ve 99 ° C &#39;de, 42 ° C&#39;de 60 dakika, ardından 25 ° C&#39;de 15 dakika boyunca 5 dakika çalıştırılır ve. </li><li> Proses hemen veya qPCR (Aşama 5), ​​veya mağaza örnekleri ile 8 saat içinde veya altında -70 ° C de işleme tabi kadar. 4 ° C &#39;de 8 saat içerisinde işlenebilir mağazası örnekleri. </li></ol> 5. Gerçek zamanlı Kantitatif PCR (qPCR) <ol><li> Önce herhangi bir test örneklerini çalıştıran hepatit G reaktif her bir lot için ortalama hepatit G Cq değerini belirler. <ol><li> NTC kontroller (Aşama 4.1.1) için tarif edildiği gibi hazırlanmıştır 10 nümuneyle bir RT deneyi çalıştırın. (5.5.3 için 5.2 Adımları) aşağıda tarif edildiği gibi hepatit G qPCR tahlil çalıştırın. 10 çoğaltır ortalama Cq değerini hesaplayın. </li><li> RT Master Mix 1 hepatit G reaktif miktarı (Tablo 2 ayarlayın), Gerekirse, 25 ve 32 birimleri arasında bir ortalama Cq değeri elde edilmiştir. Su hacmini değiştirerek yükseltilmiş ya da alçaltılmış miktar telafi deney başına 16.5 ul RT Master Mix 1 son hacim tutmak ekledi. </li><li> Ayarlanan miktarda yansıtmak için 5.1.2&#39;de ve değişim Tablo 2 Adımlar 5.1.1 tekrarlayarak ayarlamaları onaylayın. </li></ol></li><li> Enterovirüs için Tablo 3&#39;de kılavuzları kullanarak bir temiz oda qPCR usta karışımları hazırlayın, hepatit Tablo 4 ve fare norovirusa (norovirus genogroup V) norovirus genogroup II, Tablo 7 Norovirüs genogroup I, Tablo 6 Tablo 5 ve Tablo 8 G. Mix, her ana karışımı ve daha sonra ≥ 500 xg kısaca santrifüj. </li><li> Her qPCR deneyi için kuyu ve ayrı levhalar başına 14 ul kullanarak, etiketlenmiş bir optik reaksiyon plaka ihtiva eden uygun oyuklara PCR master karışımları ekleyin (bkz Şekil S2 </strong&gt; Şekil S1 RT düzeni dayalı bir qPCR tahlil) için olası bir düzen için. </li><li> Donmuş ise, oda sıcaklığında Adım 4.8 RT plakasını çözülme. Bir tabak karıştırıcı kullanılarak karıştırın ve daha sonra ≥ 500 xg kısaca santrifüj. </li><li> Optik reaksiyon plakasının uygun oyuklarına uygun cDNA 6 ul koyun. ≥ 500 xg kısaca optik reaksiyon plakası ve santrifüj örnekleri karıştırın. <ol><li> Diğer tüm qPCR tahlilleri çalıştırmadan önce, seyreltilmemiş ve sulandırılmış alan ve LFSM örneklerinde hepatit G qPCR deneyi çalıştırın. Alanın ya da LFSM numunesi &lt;Enterovirüs ve norovirus qPCR deneyleri için ortalama Hepatit G Cq değerinden daha büyük 1 Cq değeri düşük seyreltme kullanın. </li><li> Üreticinin talimatlarına göre kantitatif PCR termal döngü yazılımını kurun. Standartlar gibi standart eğri örnekleri tespit ve her bir standart eğri seyreltme için, Tablo 9&#39;da gösterilmiştir genomik kopya değerlerini girin. </li><li&gt; 95 ° C ve 60 ° C &#39;de 1 dakika 15 saniye, 45 döngü, ardından 95 ° C&#39;de 10 dakika boyunca kantitatif PCR termal döngü plaka çalıştırın. </li></ol></li><li> Her bir standart eğri Tablo 10&#39;da verilen kabul edilebilir değerleri karşılayıp karşılamadığını belirlemek. Örnekler için ek malzemeler bölümüne S3 bakın. <ol><li> Denklem 2 kullanılarak standart eğri genel standart sapma (StandartSapma) hesaplayın, <img alt="Denklem 2" src="/files/ftp_upload/52646/52646eq2.jpg" /> Cq her standart eğri çoğaltmak için bildirilen değer olduğu, Cq çoğaltır her set için ortalama değer, #Cq toplam pozitif değerler (yani belirsiz değil) sahip tüm standart kontrol çoğaltır için Cq değerlerin sayısı ve # olduğunu CYBH pozitif değerler var standart kontrollerin sayısıdır. </li><li> Kantitatif PCR termal döngü yazılımı her standart eğri için eğimini hesaplar etmezse, Denklem 3 kullanılarak eğimi hesaplamak60; <img alt="Denklem 3" src="/files/ftp_upload/52646/52646eq3.jpg" /> Cq kullanılan yüksek ve en düşük dilüsyonlarının ortalama değeri ve log nerede GC Tablo 9&#39;dan kullanılan yüksek ve en düşük dilüsyonları için genomik kopya değerinin günlük olduğunu. </li><li> Denklem 4 kullanılarak R2 değerini hesaplayın. <img alt="Denklem 4" src="/files/ftp_upload/52646/52646eq4.jpg" /> Cq tüm Cq değerlerinin ortalaması ve Log GC her tekrar için ortalama Log GC değeridir. </li><li> Denklem 5 ile% Verimliliği hesaplayın: <img alt="Denklem 5" src="/files/ftp_upload/52646/52646eq5.jpg" /></li></ol></li><li> Tablo 10&#39;da belirtilen kriterleri ve her bir numune için ortalama GC değerlerini karşılayan standart eğrileri dayalı tüm test numuneleri için termal döngü yazılımı tarafından hesaplanan GC değerlerini kaydedin. Içinde kriterlerine uymayan, standart eğrileri ile herhangi bir örnekleri yeniden <strong&gt; Tablo 10 ya da herhangi bir negatif kontrol (LRB, NA Toplu negatif çıkarma kontrolü veya NTC) pozitiftir. Rerun sırasında kriterlerini karşılamak için başarısız ya da yanlış pozitif kontroller herhangi bir numune reprocess. </li><li> Denklem 6 kullanılarak her test numunesi için GC litre başına (GC L) belirlenmesi: <img alt="Denklem 6" src="/files/ftp_upload/52646/52646eq6.jpg" /> GC Aşama 5.7 ortalama genomik kopya sayısıdır, faktör &#39;199&#39; tertier konsantrasyon sırasında meydana gelen hacim indirimleri için toplam seyreltme faktörü, RNA ekstraksiyonu ve RT-qPCR adım, DF inhibisyonu için telafi dilüsyon faktörü ve D litre cinsinden Analiz Edilmiş Orijinal Su Numune hacmi olduğunu. GC L hesaplama örneği için ek malzemeler bölüm S4 bakın. </li><li> 199 Adım 5.5 ortalama GC değerini çarparak ve 0.3 bölerek toplam LFB ve GC ve LRB örnekleri hesaplayınız. </li></ol>

<ol><li>Borchardt, M. A., Spencer, S. K., Kieke, B. A., Lambertini, E., Loge, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viruses+in+nondisinfected+drinking+water+from+municipal+wells+and+community+incidence+of+acute+gastrointestinal+illness%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Health+Perspect%22%5BJournal%5D)">Viruses in nondisinfected drinking water from municipal wells and community incidence of acute gastrointestinal illness.</a> Environ. Health Perspect. 120 (9), 1272-1279 (2012).</li>
<li>Ye, X. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+PCR+detection+of+enteric+viruses+in+source+water+and+treated+drinking+water+in+Wuhan%2C+China%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Real-time PCR detection of enteric viruses in source water and treated drinking water in Wuhan, China.</a> Curr. Microbiol. 65 (3), 244-253 (2012).</li>
<li>Williamson, W. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enteric+viruses+in+New+Zealand+drinking-water+sources%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Sci.+Technol%22%5BJournal%5D)">Enteric viruses in New Zealand drinking-water sources.</a> Water Sci. Technol. 63 (8), 1744-1751 (2011).</li>
<li>Lambertini, E., Borchardt, M. A., Kieke, B. A., Spencer, S. K., Loge, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Risk+of+viral+acute+gastrointestinal+illness+from+nondisinfected+drinking+water+distribution+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Sci.+Technol%22%5BJournal%5D)">Risk of viral acute gastrointestinal illness from nondisinfected drinking water distribution systems.</a> Environ. Sci. Technol. 46 (17), 9299-9307 (2012).</li>
<li>Chigor, V. N., Okoh, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+RT-PCR+detection+of+hepatitis+A+virus%2C+rotaviruses+and+enteroviruses+in+the+Buffalo+River+and+source+water+dams+in+the+Eastern+Cape+Province+of+South+Africa%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Environ.+Res.+Public+Health%22%5BJournal%5D)">Quantitative RT-PCR detection of hepatitis A virus, rotaviruses and enteroviruses in the Buffalo River and source water dams in the Eastern Cape Province of South Africa.</a> Int. J. Environ. Res. Public Health. 9 (11), 4017-4032 (2012).</li>
<li>Fout, G. S., Martinson, B. C., Moyer, M. W., Dahling, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multiplex+reverse+transcription-PCR+method+for+detection+of+human+enteric+viruses+in+groundwater%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A multiplex reverse transcription-PCR method for detection of human enteric viruses in groundwater.</a> Appl. Environ. Microbiol. 69 (6), 3158-3164 (2003).</li>
<li>Hewitt, J., Bell, D., Simmons, G. C., Rivera-Aban, M., Wolf, S., Greening, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gastroenteritis+outbreak+caused+by+waterborne+norovirus+at+a+New+Zealand+ski+resort%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Gastroenteritis outbreak caused by waterborne norovirus at a New Zealand ski resort.</a> Appl. Environ. Microbiol. 73 (24), 7853-7857 (2007).</li>
<li>Jack, S., Bell, D., Hewitt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Norovirus+contamination+of+a+drinking+water+supply+at+a+hotel+resort%5BTitle%5D)+AND+%22New+Zealand+Med.+J%22%5BJournal%5D)">Norovirus contamination of a drinking water supply at a hotel resort.</a> New Zealand Med. J. 126 (1387), 98-107 (2013).</li>
<li>Anderson, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+waterborne+outbreak+of+Norwalk-like+virus+among+snowmobilers-Wyoming%2C+2001%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">A waterborne outbreak of Norwalk-like virus among snowmobilers-Wyoming, 2001.</a> J. Infect. Dis. 187 (2), 303-306 (2003).</li>
<li>Parshionikar, S. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Waterborne+outbreak+of+gastroenteritis+associated+with+a+norovirus%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Waterborne outbreak of gastroenteritis associated with a norovirus.</a> Appl. Environ. Microbiol. 69 (9), 5263-5268 (2003).</li>
<li>U.S. Environmental Protection Agency Office of Water. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22820-F-12-058%3A+Recreational+Water+Quality+Criteria%22">820-F-12-058: Recreational Water Quality Criteria</a>. , 1-63 (2012).</li>
<li>Wade, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapidly+measured+indicators+of+recreational+water+quality+and+swimming-associated+illness+at+marine+beaches%3A+a+prospective+cohort+study%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Health%22%5BJournal%5D)">Rapidly measured indicators of recreational water quality and swimming-associated illness at marine beaches: a prospective cohort study.</a> Environ. Health. 9, 66(2010).</li>
<li>Fout, G. S., et al. Method 1615: Measurement of enterovirus and norovirus occurrence in water by culture and RT-qPCR (EPA/600/R-10/181). , U. S. Environmental Protection Agency. 1-91 (2012).</li>
<li>Cashdollar, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+Evaluation+of+EPA+Method+1615+for+Detection+of+Enterovirus+and+Norovirus+in+Water%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Development and Evaluation of EPA Method 1615 for Detection of Enterovirus and Norovirus in Water.</a> Appl. Environ. Microbiol. 79 (1), 215-223 (2013).</li>
<li>Gibson, K. E., Schwab, K. J., Spencer, S. K., Borchardt, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+and+mitigating+inhibition+during+quantitative+real+time+PCR+analysis+of+viral+nucleic+acid+extracts+from+large-volume+environmental+water+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Res%22%5BJournal%5D)">Measuring and mitigating inhibition during quantitative real time PCR analysis of viral nucleic acid extracts from large-volume environmental water samples.</a> Water Res. 46 (13), 4281-4291 (2012).</li>
<li>Fuentes, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardized+multiplex+one-step+qRT-PCR+for+hepatitis+A+virus%2C+norovirus+GI+and+GII+quantification+in+bivalve+mollusks+and+water%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Standardized multiplex one-step qRT-PCR for hepatitis A virus, norovirus GI and GII quantification in bivalve mollusks and water.</a> Food Microbiol. 40, 55-63 (2014).</li>
<li>Coudray, C., Merle, G., Martin-Latil, S., Guillier, L., Perelle, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+two+extraction+methods+for+the+detection+of+hepatitis+A+virus+in+lettuces+using+the+murine+norovirus+as+a+process+control%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Comparison of two extraction methods for the detection of hepatitis A virus in lettuces using the murine norovirus as a process control.</a> J. Virol. Methods. 193 (1), 96-102 (2013).</li>
<li>Sen, K., et al. EPA 815-B-04-001: Quality assurance/quality control guidance for laboratories performing PCR analyses on environmental samples. , U.S. Environmental Protection Agency. 1-56 (2004).</li>
<li>Schlueter, V., Schmolke, S., Stark, K., Hess, G., Ofenloch-Haehnle, B., Engel, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reverse+transcription-PCR+detection+of+hepatitis+G+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Reverse transcription-PCR detection of hepatitis G virus.</a> J. Clin. Microbiol. 34 (11), 2660-2664 (1996).</li>
<li>De Leon, R., Shieh, C., Baric, R. S., Sobsey, M. D. Detection of enteroviruses and hepatitis A virus in environmental samples by gene probes and polymerase chain reaction. Proc. Water Qual. Technol. Conf. 1990 Nov 11-15, , 833-853 (1990).</li>
<li>Monpoeho, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+enterovirus+RNA+in+sludge+samples+using+single+tube+real-time+RT-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Quantification of enterovirus RNA in sludge samples using single tube real-time RT-PCR.</a> BioTechniques. 29 (1), 88-93 (2000).</li>
<li>Jothikumar, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+sensitive+detection+of+noroviruses+by+using+TaqMan-based+one-step+reverse+transcription-PCR+assays+and+application+to+naturally+contaminated+shellfish+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Rapid and sensitive detection of noroviruses by using TaqMan-based one-step reverse transcription-PCR assays and application to naturally contaminated shellfish samples.</a> Appl. Environ. Microbiol. 71 (4), 1870-1875 (2005).</li>
<li>da Silva, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+removal+of+noroviruses+during+wastewater+treatment%2C+using+real-time+reverse+transcription-PCR%3A+different+behaviors+of+genogroups+I+and+II%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of removal of noroviruses during wastewater treatment, using real-time reverse transcription-PCR: different behaviors of genogroups I and II.</a> Appl. Environ. Microbiol. 73 (24), 7891-7897 (2007).</li>
<li>Butot, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+various+real-time+RT-PCR+assays+for+the+detection+and+quantitation+of+human+norovirus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Evaluation of various real-time RT-PCR assays for the detection and quantitation of human norovirus.</a> J. Virol. Methods. 167 (1), 90-94 (2010).</li>
<li>Loisy, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+RT-PCR+for+norovirus+screening+in+shellfish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Real-time RT-PCR for norovirus screening in shellfish.</a> J. Virol. Methods. 123 (1), 1-7 (2005).</li>
<li>Reynolds, K. A., Gerba, C. P., Pepper, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+infectious+enteroviruses+by+an+integrated+cell+culture-PCR+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Detection of infectious enteroviruses by an integrated cell culture-PCR procedure.</a> Appl. Environ. Microbiol. 62 (4), 1424-1427 (1996).</li>
<li>Ming, H. X., Zhu, L., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+quantification+of+infectious+enterovirus+from+surface+water+in+Bohai+Bay%2C+China+using+an+integrated+cell+culture-qPCR%5BTitle%5D)+AND+%22Mar.+Pollut.+Bull%22%5BJournal%5D)">Rapid quantification of infectious enterovirus from surface water in Bohai Bay, China using an integrated cell culture-qPCR.</a> Mar. Pollut. Bull. 62 (10), 2047-2054 (2011).</li>
<li>Parshionikar, S., Laseke, I., Fout, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+propidium+monoazide+in+reverse+transcriptase+PCR+to+distinguish+between+infectious+and+noninfectious+enteric+viruses+in+water+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Use of propidium monoazide in reverse transcriptase PCR to distinguish between infectious and noninfectious enteric viruses in water samples.</a> Appl. Environ. Microbiol. 76 (13), 4318-4326 (2010).</li>
<li>Sanchez, G., Elizaquivel, P., Aznar, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discrimination+of+infectious+hepatitis+A+viruses+by+propidium+monoazide+real-time+RT-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Environ.+Virol%22%5BJournal%5D)">Discrimination of infectious hepatitis A viruses by propidium monoazide real-time RT-PCR.</a> Food Environ. Virol. 4 (1), 21-25 (2012).</li>
<li>Kim, S. Y., Ko, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+propidium+monoazide+to+distinguish+between+viable+and+nonviable+bacteria%2C+MS2+and+murine+norovirus%5BTitle%5D)+AND+%22Lett.+Appl.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Using propidium monoazide to distinguish between viable and nonviable bacteria, MS2 and murine norovirus.</a> Lett. Appl. Microbiol. 55 (3), 182-188 (2012).</li>
<li>Fout, G. S., Schaefer, F. W. 3rd, Messer, J. W., Dahling, D. R., Stetler, R. E. EPA/600/R-95/178: ICR Microbial Laboratory Manual, I.1-ApD-23. , U.S. Environmental Protection Agency. (1996).</li>
<li>Abbaszadegan, M., Stewart, P., LeChevallier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+strategy+for+detection+of+viruses+in+groundwater+by+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A strategy for detection of viruses in groundwater by PCR.</a> Appl. Environ. Microbiol. 65 (2), 444-449 (1999).</li>
<li>Lambertini, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concentration+of+enteroviruses%2C+adenoviruses%2C+and+noroviruses+from+drinking+water+by+use+of+glass+wool+filters%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Concentration of enteroviruses, adenoviruses, and noroviruses from drinking water by use of glass wool filters.</a> Appl. Environ. Microbiol. 74 (10), 2990-2996 (2008).</li>
<li>Rodriguez, R. A., Thie, L., Gibbons, C. D., Sobsey, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reducing+the+effects+of+environmental+inhibition+in+quantitative+real-time+PCR+detection+of+adenovirus+and+norovirus+in+recreational+seawaters%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Reducing the effects of environmental inhibition in quantitative real-time PCR detection of adenovirus and norovirus in recreational seawaters.</a> J. Virol. Methods. 181 (1), 43-50 (2012).</li>
<li>Iker, B. C., Bright, K. R., Pepper, I. L., Gerba, C. P., Kitajima, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+commercial+kits+for+the+extraction+and+purification+of+viral+nucleic+acids+from+environmental+and+fecal+samples%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Evaluation of commercial kits for the extraction and purification of viral nucleic acids from environmental and fecal samples.</a> J. Virol. Methods. 191 (1), 24-30 (2013).</li>
<li>Fey, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+a+real-time+PCR-based+approach+for+accurate+quantification+of+bacterial+RNA+targets+in+water%2C+using+Salmonella+as+a+model+organism%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Establishment of a real-time PCR-based approach for accurate quantification of bacterial RNA targets in water, using Salmonella as a model organism.</a> Appl. Environ. Microbiol. 70 (6), 3618-3623 (2004).</li>
<li>Lee, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+electropositive+filtration+for+recovering+norovirus+in+water%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Water+Health%22%5BJournal%5D)">Evaluation of electropositive filtration for recovering norovirus in water.</a> J. Water Health. 9 (1), 27-36 (2011).</li>
<li>Kim, M., Ko, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+characterization+of+the+inhibitory+effects+of+salt%2C+humic+acid%2C+and+heavy+metals+on+the+recovery+of+waterborne+norovirus+by+electropositive+filters%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Water+Health%22%5BJournal%5D)">Quantitative characterization of the inhibitory effects of salt, humic acid, and heavy metals on the recovery of waterborne norovirus by electropositive filters.</a> J. Water Health. 11 (4), 613-622 (2013).</li>
<li>Karim, M. R., Rhodes, E. R., Brinkman, N., Wymer, L., Fout, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+electropositive+filter+for+concentrating+enteroviruses+and+noroviruses+from+large+volumes+of+water%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">New electropositive filter for concentrating enteroviruses and noroviruses from large volumes of water.</a> Appl. Environ. Microbiol. 75 (8), 2393-2399 (2009).</li>
<li>Gibbons, C. D., Rodriguez, R. A., Tallon, L., Sobsey, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+positively+charged+alumina+nanofibre+cartridge+filters+for+the+primary+concentration+of+noroviruses%2C+adenoviruses+and+male-specific+coliphages+from+seawater%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of positively charged alumina nanofibre cartridge filters for the primary concentration of noroviruses, adenoviruses and male-specific coliphages from seawater.</a> J. Appl. Microbiol. 109 (2), 635-641 (2010).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Kaynak ve içme sularının viral bulaşma Büyük ölçekli ulusal çalışmalar birden analitik laboratuarlar kullanılmasını gerektirir. Bu koşullar altında standart bir yöntemdir birden laboratuvarlar tarafından üretilen veriler karşılaştırılabilir olmasını sağlamak için gereklidir. Virüs tespiti için yayınlanmış birçok moleküler yöntemler, ama çok az standardize moleküler yöntemler vardır. EPA Method 1615, özellikle RT-qPCR su matrislerde Enterovirüs ve norovirusa tespiti için tasarlanmış standart bir yöntemdir. Standardize moleküler yöntemler gıdalarda virüs tespiti için mevcuttur; 16,17 (15216-2 CEN / ISO TS 15216-1 ve CEN / ISO TS 7 Nisan 2013) ve hepatit A virüsü tespit ve norovirus ilkbaharda uygulandı su 16. Tüm standart yöntemler kalite performans kontrolleri ve kriterleri arası en aza indirmek ve içi laboratuvar varyasyonu nedeniyle laboratuvar kontaminasyonu yanlış pozitif verileri içermelidir. Ayrıca, E yanlış veri azaltmak içinPensilvanya Yöntem 1615 işlemci ve tek yönlü iş akışı sırasında iş ayrılmasını öngören moleküler yöntemler üzerinde EPA&#39;nın rehberlik, 18 izler. Bir hepatit G 1,19 iç kontrol nedeniyle RT-qPCR 15 inhibitörleri yanlış negatif sonuç en aza indirmek için prosedürleri içermektedir. Tüm alan veri alanının litre veya su örneklenmiş içme başına genomik kopya ifade edilir, böylece analiz örneklenmiş su ve suyla standardize hacimleri ile birlikte niceliksel tahlilleri kullanır. Etkin tek bir tüp (tek-aşama) RT-PCR deneyleri, ticari olarak mevcut olmakla birlikte, bu yöntem kasıtlı ayrı analizler kullanılır. Bu, her bir reaksiyonda analiz edilebilir numune miktarını minimize etme dezavantajına sahiptir, ancak birden fazla primer kümelerinin kullanımı daha fazla esneklik sağlar. Primerleri ve sondaları kullanılan ve büyük olasılıkla hiçbir astar seti bir grup dahilindeki tüm virüs türevlerini algılamak gibi RT-qPCR deneyleri ile ve sadece iyi sınırlıdır. Enterovirüs primer seti nedeniyle seçildiBu 20,21 enterovirüs serotiplerinin çeşitli algılar korunmuş 5 &#39;kodlamayan bölgeye hedef ve bunun ile tespit virüs, işlemden geçirilmemiş yer altı 1 tüketiminden sağlık etkileri ile ilişkilidir. Iki astar set I 22,23 Noroviruses genogroup saptanması için kullanılır. İlk küçük çocuklarda sağlık etkileri arasındaki güçlü korelasyon nedeniyle seçilmiş ve virüs 1. tespit edildi. Onlar suşları 24,25 geniş çeşitliliği tespit çünkü set edilen primer ikinci genogroup ve genogroup II Noroviruses için kullanılan primer seti seçildi. Su içinde viral RNA saptanması için qPCR RT-qPCR prosedürlerinin en önemli avantajlara rağmen, bazı sınırlamalar vardır. İlk olarak, dezenfektanlar tarafından inaktive de dahil olmak üzere, her iki bulaşıcı ve bulaşıcı olmayan virüs parçacıkları, bu işlemler ile amplifiye edilebilir. Borchardt sonuçları bu tedavi edilmemiş yeraltı f bir sorun daha az olduğunu göstermektedirtopluluklarda benzer rom akiferler dezenfekte yüzey suları 1 den okudu. Kültürlenebilir virüs için bu sorun, kültür 26,27 ile birlikte PCR kullanılarak aşılabilir. Sorun, nükleik asit çapraz bağlama maddeleri 28-30 kullanımı ile, bazı virüs ele alınmıştır. Bu yaklaşım virüs hipokloritin inaktive edilmiş ve UV ile inaktive olanlar için etkili değildir için daha etkilidir. Bu moleküler prosedürlerin İkinci bir kısıtlama tipik olarak analiz edilebilir konsantre edildi numune hacmi kültürü prosedürler 6,31 için kullanılan daha küçük olmasıdır. Bu sorun, genellikle her iki örnek daha küçük bir hacimde yeniden asıldı ve bir üçüncül Örnek konsantrasyonu aşama 6,32,33 eklenerek sağlar Organik flokülasyon standart sekonder konsantrasyonu temin etmek üzere bir polietilen glikol tabanlı bir prosedür ile ikame tarafından işlenir . Yöntem 1615 Santrifüj kullanırugal ultrafiltrasyon tertier konsantrasyonu elde edildi. Santrifüj ultrafiltrasyon su ve test numunelerinde herhangi bir virüsün hem de konsantrasyon ve moleküler deneylerinin küçük molekül ağırlıklı inhibitörlerinin bir azalma ile elde edilen bileşenler daha az 30.000 Dalton kaldırır. Su içinde mevcut olan herhangi bir virüs için&gt; 10 5 genel bir yoğunlaşma katsayısına bu tertier konsantrasyon adımı sonuçları, test edilen. Üçüncü bir kısıtlama çevre numuneleri içinde molekül prosedürlerin önleyicileri varlığıdır. Inhibitörleri kaldırmak için çok sayıda yaklaşımlar geliştirilmiş olmasına rağmen, hiçbir yaklaşım temel inhibisyon seviyesini tahmin etmek için tasarlanmıştır iç kontrollerin yararlanarak, tüm su matrisler ve virüs türleri 6,34,35 için etkilidir. Bu yöntemde kullanılan hepatit G reaktifi bütün reaksiyonlar ve inhibisyon tahmin edilmesi için bir RT-qPCR deneyinde viral RNA sabit bir seviyede sağlayarak bu gereksinimi karşılamaktadır. Ne zaman t iyiO örnek konsantreleri sürece virüs konsantrasyonları konsantrasyonları 14,15 inhibitörü daha yüksek olarak seyreltilmiş olabilir, kaldırma yaklaşımları inhibisyonu kaldırmak için başarısız inhibitör. Burada açıklanan standart eğri prosedürü avantaj ve büyük bir sınırlama hem de sahiptir. Bir avantajı, reaktif madde, tek bir kontrol Tüm deneyler için kullanılacak sağlayan tek bir reaktif içinde Sarf gerekli tüm bileşenlerin kullanılmasıdır. Bu reaktif, özellikle norovirus deneyleri için bir avantajdır. Norovirus partiküllerinin, sadece çok zor standartlar olarak kullanım için, viral parçacıklar elde etmek hale enfekte bireylerden elde edilebilir. En önemli avantaj, bir RNA, standart RNA 36 doğru ölçümü için gerekli olan gibi, tek bir reaktif içinde hedeflenen tüm RNA virüsleri için bir RNA standart sağlamasıdır. Ancak bunun yanında, virüs ölçmek için kabiliyeti matriks etkileri dikkate alınmadığı gerçeği ile sınırlıdır. Bu, genomik kopyasını demektirsayısı değerler, mutlak değerler olarak kabul edilemez ve sadece göreli olarak dikkate alınmalıdır. Bu standart eğri çalışma stok alikotları yeterli sayıda (1.2 adım) tam çalışmaları kapsayacak şekilde hazırlanmış olması tavsiye edilir. Örneğin, her 250 ul alikot 6 RT plakaları için yeterli bir reaktif sağlar. Bir çalışmada, 500 numune analiz gerektirir olacağı biliniyorsa, 12 alikotları en az (500 numune RT plaka başına / 7 numune / alikotundan başına 6 RT plakaları) ihtiyaç olacaktır. EPA Method 1615 performansa dayalı bir yöntemdir. Birçok üretici, burada belirtilen eşdeğer reaktifler yapmak ve bu reaktifler sürece performans kriterleri karşılandığı gibi ikame edilebilir. Ayrıca pozitif bir RT-qPCR kontrol olarak hizmet vermektedir standart eğri, sorun performans sorunları değer taşımaktadır. Performans nedeniyle RNA bozulması, reaktif raf ömrü, dondurucular başarısızlığı, alet kalibrasyon ve teknik hata reddedebilirsiniz. Performans sorunları şüpheli olmalıonlar standart eğrileri için performans özelliklerini karşılamak değilse ed standart eğrileri Şekil 4&#39;te gösterilen bu farklı ya da eğer. RT-qPCR tahlil oldukça sağlamdır; tam bir başarısızlık nedeniyle RNA veya teknik bir hata (örneğin, bir eksik reaktif) yanlış kullanım muhtemeldir. Büyük bir dikkatle çıkarma ve ribonükleazlar RNA bozulmasını azaltmak için RT adım arasında RNA örnekleri ele alınmalıdır. Zemin ve reaktif dereceli suları ve yeraltı fare norovirus rücu Poliovirüs kazanımları EPA Method 1615 performans kabul kriterleri (Tablo 11) tanıştı ve diğerleri 33,37,38 tarafından bildirilen benzemektedir. LFB örneklerinden Murin norovirus kazanımları poliovirus oranla çok daha düşük olduğunu ve polio virüsünün özel kabul kriterleri yerine olmazdı. Reaktif dereceli sudan daha düşük fare norovirus kurtarma nedenleri bilinmemektedir. Bu tarifnamede sonuçlara benzer şekilde, Karim ve colleagues musluk suyu 39% 4 norovirus GI.1 bir iyileşme bildirmiştir. Lee et al. 37 sıçangil norovirusa ve% 18 insan norovirus GII.4 ve sırasıyla disk filtreleri kullanılarak damıtılmış su% 26 için ortalama geri kazanımını bildirilmiştir. Lee ve meslektaşları benzer şartları kullanarak, Kim ve Ko sırasıyla 38, bu virüsler için% 46 ve% 43 geri kazanımını gözlendi. Gibbons ve ark., 40, deniz suyundan, insan norovirus GII.4% 100 geri etrafında çevresel olarak elde ama Kim ve Ko 38 konsantrasyonları, benzer ya da murin virüs önemli ölçüde azaltılmış geri kazanımları deniz suyundan daha yüksek ve damıtılmış su tuz ilavesi sonuçlandığı bulunmuştur GII.4 kurtarma ile ilgili olarak iki kat azalma.

Kantitatif PCR (qPCR; Bu yazıda kullanılan terimlerin tanımları için tamamlayıcı malzemeler) ve transkripsiyon-qPCR (RT-qPCR) sular tespit ve çevre insan enterik virüsler miktarının ve içme değerli araçlardır ve özellikle bunu birçok virüs için ters çoğaltmak ya da hücre kültür sistemlerinde kötü çoğaltma değil. Her iki araç birçok virüs türleri dünyada 1-6 genelinde çevresel ve içme sularında mevcut olduğunu göstermiştir. Onlar içme suyunda bulunan virüs salgını hastaların 7-10 tarafından bu kulübe aynı olduğunu göstermiştir hastalık mihrak araştırmaları sırasında güçlendirilmiş genomik fragmanların sıralama ile birleştiğinde Bunların kullanımı, su bazlı virüs iletimi için kanıt sunmuştur. QPCR ve RT-qPCR Hem kullanışlı halk sağlığı araçlarıdır. Örneğin, ABD Çevre Koruma Ajansı (EPA) tarafından yürütülen çalışmalardan elde edilen veriler güçlü bir ilişki olması gösterdiqPCR ve eğlence sularında sağlık etkileri ile ara gösterge ölçümleri. Bunun bir sonucu olarak, EPA nihai 2012 Dinlenme Su Kalitesi Kriterleri dinlenme plajları 11,12 izlenmesi için bir qPCR yöntemi içerir. RT-qPCR 1 ile ölçülen Borchardt ve arkadaşları da yeraltı suları tedavi edilmemiş yeraltı ve virüs kullanılarak toplumlarda akut gastroenterit arasında güçlü bir ilişki bulunmuştur. Bu yazının amacı, EPA Method 1615 13,14 moleküler tahlil bileşenini tanımlamaktır. Bu deney, bir elektropozitif bir filtreden enterovirüs ve başarılı çevresel veya içme suyu orijinal hacmine dayalı olarak litre başına norovirus genomik kopyalarının (GC) nicel bir tahminde bulunmak için RT-qPCR kullanır. Moleküler prosedürün bir bakış standart eğri hazırlamak için 1. Protokol bölüm Şekil 1 ayrıntıları prosedürler gösterilir. Bu standartlar, RN içeren bir reaktif hazırlanırTüm primer / prob setleri için hedef dizinin bir kopyası. Bölüm 2 üçüncül konsantrasyon prosedürü anlatılmaktadır. Bölüm 3 konsantre su ve kontrol numunelerinin RNA çıkarmak için prosedürü vermektedir. Her bir test numunesi ile ilgili RNA ters üç kopyalı tahliller ve birinci transkripsiyon (Bölüm 4) rasgele primerler kullanılarak transkribe edilmektedir. (Şekil 2, Bölüm 5), her ters transkripsiyon reaksiyonu cDNA qPCR üç kopya halinde analiz edilir Beş ayrı virüse spesifik tahlilleri ayrılmıştır. Deney birçok enterovirüsleri ve Noroviruses RT-qPCR 15 inhibe eden test örneklerini tespit etmek hepatit G RNA ihtiva eden bir reaktif tespit etmek için tasarlanmıştır, bilimsel literatürde (Tablo 1) primerler ve problar kullanılır.

<table><tbody><tr><td>1.5 ml tüp odası</td><td>Çeşitlendirilmiş Biyoteknoloji</td><td>CHAM-3000</td><td></td></tr><tr><td>1 &deg; C soğuk tuğla</td><td>Çeşitlendirilmiş Biyoteknoloji</td><td>BRIK-2501</td><td></td></tr><tr><td>10x PCR Tamponu II ve 25 mM MgCl2</sub</td><td>>Life Technologies</td><td>N8080130-20</td><td></td></tr> <tr><td>ve derece; C dondurucu</td><td>VWR</td><td>97043-346</td><td>Manuel buz çözme</td></tr> <tr><td>dondurucu-70 &°C olmalıdır; C veya daha soğuk dondurucu</td><td>Thermo Scientific</td><td>MBF700LSAO-E</td><td></td></tr><tr><td>96 kuyulu oda</td><td>Çeşitlendirilmiş Biyoteknoloji</td><td>CHAM-1000</td><td></td></tr><tr><td>Mutlak etanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2818-100</td><td></td></tr><tr><td>Zırhlı RNA EPA-1615</td><td>Asuragen</td><td>Özel sipariş</td><td>RT-qPCR testini ölçmek için kullanılır</td></tr><tr><td>Zırhlı RNA Hepatit G virüsü</td><td>Asuragen</td><td>42024</td><td></td></tr><tr><td>Otoklav</td><td>Steris</td><td>Amsco Lab Serisi</td><td></td></tr><tr><td>Biyogüvenlik kabini</td><td>NuAir Laboratuvar Ekipmanları Temini</td><td>Labgard 437 ES</td><td></td></tr><tr><td>Sığır serum albümini (BSA)</td><td>Affymetrix</td><td>10856</td><td>Kristal dereceli veya daha iyisi</td></tr><tr><td>Tampon AVE</td><td>Qiagen</td><td>1026956</td><td>Taşıyıcı RNA seyreltme tamponu</td></tr><tr><td>Tampon AVL</td><td>Qiagen</td><td>19073</td><td>Ekstraksiyonu tampon</td></tr><tr><td>Taşıyıcı RNA</td><td>Qiagen</td><td>Uygulanamaz</td><td>Tampon AVL Santrifüj şişeleri ile birlikte verilen taşıyıcı RNA'yı kullanın</td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>05-562-23 veya 05-562-26</td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj rotorları</td><td>Beckman Coulter</td><td>339080, 336380</td><td></td></tr><tr><td>Soğuk kasa</td><td>Çeşitlendirilmiş Biyoteknoloji</td><td>CSF-BOX</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td> <td>Promega</td><td>P1171</td><td></td></tr><tr><td>LightCycler&reg; 480 Problar Ana kiti</td><td>Roche Diagnostics</td><td>4707494001</td><td></td></tr><tr><td>Mikrosantrifüj tüpleri</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-682-550</td><td>Geçmeli kapaklı ribonükleaz ve deoksiribonükleaz içermeyen tüpler kullanın</td></tr><tr><td>Microcide III</td><td>Fitzgerald</td><td>99R-103</td><td></td></tr><tr><td>Microseal 'A' filmi</td><td>Bio-Rad Laboratuvarları</td><td>HSA5001</td><td>Isı dayanıklı</td></tr><tr><td>Microseal 'F' filmi</td><td>Bio-Rad Laboratuvarları</td><td>MSA1001</td><td>Dondurucuya dayanıklı</td></tr><tr><td>Mini plaka döndürücü</td><td>Labnet International</td><td>MPS1000</td><td></td></tr><tr><td>Çok kanallı pipet</td><td>Rainin</td><td>L8-20</td><td></td></tr><tr><td>Çok tüplü hazne</td><td>Çeşitlendirilmiş Biyoteknoloji</td><td>CHAM-5000</td><td></td></tr><tr><td>Optik reaksiyon plakası</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td></td><td></td>4314320</tr><tr><td>PCR nükleotid karışımı</td><td>Promega</td><td>U1515</td><td></td></tr><tr><td>PCR plakası</td><td>Bio-Rad Laboratuvarları</td><td>HSS9601</td><td></td></tr><tr><td>PCR dereceli su</td><td>Roche</td><td>3315932001</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat tamponlu salin (PBS)</td><td>ABD Biyolojik</td><td>D9820</td><td></td></tr><tr><td>Plaka karıştırıcı</td><td>Bilimsel Endüstriler</td><td>MicroPlate Genie</td><td></td></tr><tr><td>Prionex jelatin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G0411</td><td></td></tr><tr><td>QIAamp DNA Kan Mini Kiti</td><td>Qiagen</td><td>51104</td><td>Tamponları içerir AW1 (ilk yıkama tamponu), AW2 (ikinci yıkama tamponu), AE (elüsyon tamponu); etanol kullanımdan önce AW1 ve AW2 Tamponlarına eklenmelidir; Kit ile birlikte verilen Buffer AL'yi kullanmayın</td></tr><tr><td>Kantitatif PCR termal döngüleyici</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>4351405</td><td></td></tr><tr><td>Rastgele astar</td><td>Promega</td><td>C1181</td><td></td></tr><tr><td>Reaktif Rezervuarı</td><td>Fisher Scientific</td><td>21-381-27E</td><td></td></tr><tr><td>Soğutmalı santrifüj</td><td>Beckman Coulter</td><td>367501</td><td></td></tr><tr><td>RNase İnhibitörü</td><td>Promega</td><td>N2515 veya N2615</td><td></td></tr><tr><td>ROX referans boya</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>12223</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript II veya III Ters Transkriptaz</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>18064-022 veya 18080044</td><td></td></tr><tr><td>Cerrahi eldivenler</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-058-800</td><td></td></tr><tr><td>Termal döngüleyici</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>4314879</td><td></td></tr><tr><td>Trisma tabanı</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Vivaspin 20 santrifüj yoğunlaştırıcı üniteleri</td><td>Sartorius-Stedim</td><td>VS2022</td><td></td></tr></tbody></table>

enterovirüs kültür ve rt-qpcr su norovirus oluşum epa method 1615 Ölçümü. bölüm iii. rt-qpcr virüs algılama

EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. Part III. Virus Detection by RT-qPCR

EPA Metod 1615, çevre ve içme sularında bulunan enterovirüsleri ve norovirüsleri ölçer. Bu yöntem, Düzenlenmemiş Kirletici İzleme Kuralı'nın 3. izleme periyodu sırasında birden fazla analitik laboratuvarda kullanılmak üzere standartlaştırılmış bir yönteme sahip olmak amacıyla geliştirilmiştir. Burada, su numunesi konsantrelerinden viral ribonükleik asidin (RNA) ekstraksiyonu ve ters transkripsiyon-kantitatif PCR (RT-qPCR) kullanılarak enterovirüs ve norovirüs konsantrasyonlarının kantitatif olarak ölçülmesi için protokolü sunuyoruz. Moleküler tahlil için virüs konsantrasyonları, standart bir eğriye dayalı olarak litre başına viral RNA'nın genomik kopyaları cinsinden hesaplanır. Yöntem, veri kalitesini artırmak ve laboratuvarlar arası ve laboratuvar içi varyasyonu azaltmak için bir dizi kalite kontrolü kullanır. Yöntem, insan norovirüsleri için bir vekil olarak poliovirüs tip 3 ve murin norovirüsü ile tohumlanmış toprak ve reaktif dereceli sulardan virüs geri kazanımı incelenerek değerlendirilmiştir. Ortalama poliovirüs geri kazanımları yeraltı sularında %20 ve reaktif dereceli sularda %44 idi. RT-qPCR testi ile ortalama murin norovirüs geri kazanımları yeraltı sularında %30 ve reaktif dereceli suda %4 idi.

Burada, ters transkripsiyon-kantitatif PCR kullanarak çevresel ve içme sularında enterovirüs ve norovirüsü ölçmek için bir prosedür sunuyoruz. EPA Metodu 1615'ten alınan bu standardize prosedürle yeraltı sularından ortalama virüs geri kazanımı, poliovirüs için %20 ve murin norovirüsü için %30 idi.

Enterovirüs Kültür ve RT-qPCR Su Norovirus Oluşum EPA Method 1615 Ölçümü. Bölüm III. RT-qPCR Virüs Algılama

EPA Method 1615 measures enteroviruses and noroviruses present in environmental and drinking waters. This method was developed with the goal of having a ...

Bu prosedürün genel amacı, ters transkripsiyon kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu kullanarak sudaki enterovirüs ve norovirüs konsantrasyonunu ölçmektir. Bu işlem, santrifügal ultrafiltrasyon kullanılarak su örneklerinden virüs partiküllerinin tersiyer konsantrasyonu ile gerçekleştirilir. Ardından, protokolde açıklandığı şekilde standart eğri reaktifleri hazırlanır. Bunu, viral konsantrelerin ve standart eğrinin nükleik asit ekstraksiyonu takip eder. Daha sonra, RNA'nın bir ila beş ve bir ila yirmi beş katlık dilüsyonlarındaki viral RNA, rastgele primerler ve ters transkriptaz kullanılarak ters transkribe edilir. Son olarak, viral cDNA amplifikasyonu, gerçek zamanlı bir termal döngüleyici cihazda virüse özgü primerler ve problar kullanılarak gerçekleştirilir ve ardından standart eğriye dayalı olarak örnek genomik kopya hesaplamaları yapılır.EPA yöntem 1615'in ISO 15216 gibi diğer standartlaştırılmış yöntemlere göre temel avantajı, özellikle su örnekleri için tasarlanmış olması ve bir enterovirüs analizini içermesidir. Bu yöntem, çevre mikrobiyolojisi alanındaki risk değerlendiricilere, içme ve rekreasyonel sularındaki virüslerden kaynaklanan riskin belirlenmesine ilişkin güncel durumu sunabilir. Genel olarak, bu yöntemi ilk kez kullanacak kişiler, yöntemin bünyesindeki standartlaştırma süreçlerinde zorluk yaşayabilirler. Yöntem oldukça detaylıdır ve açıkça takip edilmelidir. Yöntemdeki çok küçük farklılıklar bile olumsuz sonuçlara yol açabileceğinden, yöntemin görsel olarak gösterilmesi kritik önem taşır. Prosedürü bugün Nichole Brinkman, Jennifer Cashdollar, Shannon Griffin ve ben, Shay Fout uygulamalı olarak göstereceğiz. Hepimiz, EPA'nın Cincinnati, Ohio'daki ulusal maruziyet araştırma laboratuvarının profesyonel personel üyeleriyiz.Metin protokolüne uygun olarak bir standart eğrisi hazırladıktan sonra, üst numune haznesine en az 10 milliliters 1X PBS ve %2 BSA ekleyerek toplanan her numune için bir santrifüj konsantratörü hazırlayın. Gece boyunca inkübe edip yıkama işlemini gerçekleştirdikten ve ardından metin protokolünde belirtildiği gibi numuneleri ekledikten sonra, her bir test numunesini salıncak kovalı bir rotorda 3000 ile 6000 times g arasında ve dört degrees Celsius sıcaklıkta yirmi ila otuz dakika boyunca santrifüjleyin.Numune uygun şekilde konsantre edilip taze bir mikrosantrifüj tüpüne aktarıldıktan sonra, final hacmi 400 µL ± 2 µL olacak şekilde 0,15 molar sodyum fosfat tamponu ekleyin. Nükleik asitleri ekstrakte etmek için, negatif ekstraksiyon kontrolü için 200 µL ekstraksiyon tamponunu ve her bir test numunesi veya standart eğri dilüsyonu için 200 µL tersiyer konsantreyi ayrı mikrosantrifüj tüplerine ekleyin ve RNA'yı ekstraksiyon kiti üreticisinin talimatlarındaki metin protokolünde belirtilen modifikasyonlara göre ekstrakte edin. Protokolde belirtildiği şekilde primerlerin ve probların hazırlanmasının ardından, burada gösterildiği gibi temiz bir odada ters transkripsiyon master mix bir ve iki'yi hazırlayın.Çok kanallı bir pipet kullanarak, her bir PCR plakası kuyucuğuna 16,5 µL RT master mix one aktarın. Ardından, nükleik asit ekstraksiyon kitinin mililitre başına 400 ünite RNase inhibitörü içeren elüsyon tamponunu kullanarak, çözülmüş saha ve laboratuvarla zenginleştirilmiş örnek matrisi veya LSFM örneklerini 1/5 ve 1/25 oranlarında seyreltin. Her bir test örneği, kontrol ve standart eğriden gelen nükleik asitlerden 6,7 µL'yi, test örnekleri ve kontroller için üç tekrarlı (triplicate), standart eğriler için ise iki tekrarlı (duplicate) kuyucuklar kullanarak ayrı PCR plakası kuyucuklarına aktarın.Şablon kontrolü olmayan veya NTC kuyucuklarına 6,7 µL elüsyon tamponu ekleyin. RT plaka başına iki ila sekiz NTC dahil edin; ilk örnek için iki adet, ardından her dördüncü ek örnek için iki veya daha fazla NTC kullanarak negatif kontrolleri plaka geneline dağıtın. PCR plakasını kapatmak için ısıya dayanıklı plaka kapatıcı kullanın ve her kuyucuğun sıkıca kapatıldığından emin olun. Ardından, örnekleri beş ila on saniye boyunca karıştırın ve ardından ≥ 500 ×g hızda kısa süreli olarak santrifüjleyin.Bir termosikletörde, plakayı 99 °C'de dört dakika inkübe edin. Plakayı 4 °C'ye getirin ve ardından kısa bir süre ikinci kez santrifüjleyin. Sonra, plaka sızdırmazlık folyosunu dikkatlice çıkarın ve her kuyucuğa 16,8 µL RT master mix two ekleyin. Plakayı mühürleyip kısa süreli karıştırma ve santrifüj işlemini yaptıktan sonra, plakayı termosikletöre yerleştirin ve sırasıyla 25 °C'de 15 dakika, 42 °C'de 60 dakika, 99 °C'de beş dakika çalıştırın ve son olarak 4 °C'de sekiz saate kadar bekletin veya örnekleri daha uzun süreli saklama için -70 °C'de muhafaza edin.Temiz bir oda içerisinde; enterovirüs, norovirüs genogrup bir, norovirüs genogrup iki ve hepatit G kılavuzlarını kullanarak kantitatif PCR master mix'lerini hazırlayın. Her bir master mix'i karıştırın ve kısa süreliğine santrifüjleyin. Ardından, bu örnekte gösterildiği gibi, her bir qPCR analizi için ayrı plakalar kullanarak, etiketlenmiş optik reaksiyon plağının uygun kuyucuklarına 14 µL PCR master mix ekleyin. Uygun kuyucuklara 6 µL uygun cDNA dağıtın. Son olarak örnekleri karıştırın ve kısa süreliğine santrifüjleyin.Termosaykler yazılımını protokolde açıklandığı şekilde ayarlayın ve diğer tüm qPCR analizlerini çalıştırmadan önce, seyreltilmemiş ve seyreltilmiş saha ve laboratuvar güçlendirilmiş örnek matrisi veya LFSM örnekleri üzerinde hepatit G qPCR analizini gerçekleştirin. Her bir örneğin ortalama Cq değerini, her yeni hepatit G reaktif lotu için önceden belirlenmiş olan ortalama hepatit G Cq değeri ile karşılaştırın. Enterovirüs ve norovirüs qPCR analizleri için, saha veya LDF örneğinin, ortalama hepatit G Cq değerinden bir Cq değerinden daha fazla yüksek olmayan en düşük seyreltisini kullanın.Kantitatif PCR termosiklatör yazılımını üretici talimatlarına göre ayarlayın. Standart eğri örneklerini standartlar olarak tanımlayın ve her bir standart eğri dilüsyonu için burada gösterilen genomik kopya değerlerini girin. Plakayı 95 °C'de on dakika boyunca, ardından 90 °C'de 15 saniye ve 60 °C'de bir dakika şeklinde 45 döngü boyunca çalıştırın.Her bir standart eğrinin bu tabloda verilen kabul edilebilir değerleri karşılayıp karşılamadığını belirleyin. Metin protokolündeki denklemlere göre standart sapma, eğim, R kare ve yüzde verimlilik hesaplamalarını yaptıktan sonra, bu tabloda belirtilen kriterleri karşılayan standart eğrilere dayanarak tüm test örnekleri için termosaykler yazılımı tarafından hesaplanan genomik kopya veya GC değerlerini ve her bir örnek için ortalama GC değerlerini kaydedin. GC'nin az önce hesaplanan ortalama genomik kopya sayısı olduğu aşağıdaki denklemi kullanarak, her bir test örneği için litre başına GC değerini belirleyin.199 faktörü, üçüncül konsantrasyonlar, RNA ekstraksiyonu ve RT-qPCR adımları sırasında gerçekleşen hacimsel reaksiyonların toplam dilüsyon faktörüdür. DF, inhibisyonu telafi eden dilüsyon faktörüdür ve D, litre cinsinden orijinal su numunesi analizinin hacmidir.Son olarak, önceden belirlenen ortalama GC değerini 199 ile çarpıp 0.3'e bölerek laboratuvar saha zenginleştirilmiş kör (LFB) veya laboratuvar reaktif körü (LRB) numunelerinin toplam GC değerini hesaplayın. Genel olarak virüs geri kazanımı, üç kamu arıtma tesisinden ve bir özel kuyudan alınan toplam yedi numune setinden elde edilen eşleştirilmiş saha LFSM yer altı suyu numuneleri kullanılarak belirlenmiştir. LSFM numuneleri için ekim seviyeleri, yedi poliovirüs tip 3 için üç milyon MPN ve murin norovirüs için beş milyon PFU olarak belirlenmiştir.Standart eğri reaktifi o sırada mevcut olmadığı için EPA yöntem 1615'in ilk tek laboratuvar değerlendirmesinde fare norovirüsü kullanılmıştır. Yer altı suyu örnekleri için ortalama poliovirüs geri kazanımı %20 (standart hata %2) olurken, ortalama fare norovirüsü geri kazanımı %30 (standart hata %3) olarak gerçekleşmiştir. Her bir LFSM için alınan düzenli saha yer altı suyu örneğinde saptanabilir enterovirüs veya norovirüs bulunmamıştır. Laboratuvarla zenginleştirilmiş kör veya LFB ile laboratuvar reaktif körü veya LRB örnekleri, ekimli ve ekilmemiş reaktif sınıfı su kullanılarak ölçülmüştür.Poliovirüs geri kazanımı ortalama %44 ve %1 standart hata ile gerçekleşirken, fare norovirüsü geri kazanımı ortalama %4 ve %0,5 standart hata ile gerçekleşmiştir. Bu şekil, enterovirüs ve norovirüs genogrup iki için tipik standart eğrileri göstermektedir. Norovirüs genogrup iki eğrisi, 0,9987 R kare değeri, 0,14 genel standart sapma ve %101 verimlilik ile standart eğri kriterlerini karşılamaktadır. Enterovirüs eğrisi, 0,9874 R kare değeri, 0,58 genel standart sapma ve %103 verimlilik ile standart eğri performans kriterlerini karşılamaktadır, ancak norovirüs eğrilerine göre yaklaşık 100 kat daha düşük hassasiyete ve dolayısıyla daha yüksek bir saptama sınırına sahiptir.Bu videoyu izledikten sonra, suyla bulaşan enterovirüs ve norovirüslerin RT-qPCR kullanılarak nasıl konsantre edileceği ve tespit edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Uzmanlaşıldığında, bu teknik düşük bulanıklığa sahip numuneler için yaklaşık sekiz saatte tamamlanabilir. Daha yüksek bulanıklığa sahip numuneler, özellikle üçüncü aşama konsantrasyon adımında ek süre gerektirebilir.Bu prosedür gerçekleştirilirken, ters transkripsiyon öncesinde örneklerin RNaz kontaminasyonundan korunması önemlidir. PCR'ın çok güçlü ve kullanışlı bir teknik olduğunu unutmayın. Yalancı pozitif ve yalancı negatif sonuçları en aza indirmek için çalışma alanlarının ayrılması ve uygun kontrollerin kullanılması gibi önlemler gereklidir.

epa-method-1615-measurement-enterovirus-norovirus-occurrence-water

Research

JoVE Journal

Environment

Çevre

Astar ve açık okuma çerçevesi 1 (ORF1)-ORF2 kavşak bölgesidir Norovirüs genomunun en korunmuş bölgeye özgü TaqMan probları kullanan çocuk tabureleri, gelen algılama ve Norovirüs izolatların genogroup belirlenmesi için Tek Adım RT-PCR nitelendirdi. Bir ticari olmayan, maliyet-etkin RNA ekstraksiyon yöntemi ayrıntılı olarak verilmiştir.

Taqman By Çocuk Tabureler gelen Noroviruses tespiti ve Genogrouping Tek aşamalı RT-PCR

Source: Fout, G. S., Cashdollar, J. L. EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. II. Total Culturable Virus Assay. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the use of a total culturable virus assay to quantify infectious viruses in water samples. It outlines host cell inoculation, observation of cytopathic effect, and statistical quantification of infectious virus concentration.

Quantifying Infectious Viruses in Water Samples Using an In Vitro Total Culturable Virus Assay

EPA Metod 1615, çevre ve içme sularındaki enterovirüsleri ve norovirüsleri konsantre etmek için elektropozitif bir filtre kullanır. Bu el yazması, Yöntem 1615 analizleri için numune toplama prosedürünü açıklamaktadır.

Enterovirus Kültür ve RT-qPCR Su Norovirüs Oluşum EPA Metot 1615 Ölçüm. Virüs Örneklerinin I. Koleksiyonu

Burada, Buffalo Green Monkey böbrek hücresi hattını kullanarak toplam kültürlenebilir virüsleri ölçmek için bir prosedür sunuyoruz. Prosedür, çevresel ve içme sularında bulaşıcı virüslerin oluşumunu ölçmek için standartlaştırılmış bir araç sağlar.

Enterovirus Kültür ve RT-qPCR Su Norovirus Oluşum EPA Metot 1615 ölçülmesi. II. Toplam kültürlenebilir virüs Deneyi

Çevresel sert yüzeylerde norovirüsün tespiti ve miktarının belirlenmesi için makro köpük tabanlı bir örnekleme metodolojisi geliştirilmiş ve değerlendirilmiştir.

Yüzeyler İnsan Norovirus Tespiti sürüntü Örnekleme Yöntemi

İnsan adenovirüsünün sivri uçları kullanılarak küçük hacimli su örnekleri için optimal viral konsantrasyon koşullarını belirlemek için bir yaklaşım geliştirilmiştir. Burada açıklanan teknikler, diğer viral hedefler için konsantrasyon parametrelerini tanımlamak için kullanılır ve büyük ölçekli viral konsantrasyon deneylerine uygulanır.

Sudan Viral Konsantrasyon için Küçük Bir Ses Prosedürü

Üretim kanama suyu (PBW), bakır oksit nanopartikülleri (CuO-NP'ler) ile muamele edildi ve kültürlenmiş insan hücrelerinde hücresel toksisite değerlendirildi. Bu protokolün amacı, doğal çevresel numuneyi, CuO-NP işlemine bağlı toksisitedeki değişiklikleri değerlendiren bir hücre kültürü formatına entegre etmekti.

Uranyum dan Bakır Oksit Nanopartiküller tarafından İz Elementlerin çıkarılması<em&gt; In Situ</em&gt; Kurtarma Bleed Su ve Hücre Canlılığı Üzerine Etkisi

Suyun temiz ve doğru noktadan örneklenmesi için basit, müdahaleci olmayan ve güvenilir bir yöntem olan VacuSIP'i tanıtıyoruz. Sistem, partikül ve çözünmüş bileşiklerin uzaklaştırılmasını ve atılımını temiz bir şekilde ölçmek için bentik süspansiyon besleyiciler tarafından solunan ve solunan suyun yerinde eşzamanlı olarak toplanması için geliştirilmiş ve değerlendirilmiştir.

VacuSIP, bir Geliştirilmiş INEX Yöntemi için<em&gt; In Situ</em&gt; Partikül Ölçümü ve Çözünmüş bileşikler Aktif Süspansiyon besleme üniteleri İşlenmiş

Bu iletişim kuralı Tilapia Gölü virüs (TiLV) RT-PCR yöntemlerini kullanarak tilapia dokularda tanılar. Tüm yöntemi doku diseksiyon toplam RNA emme, ardından cDNA sentezi ve TiLV geleneksel PCR veya kantitatif PCR dsDNA bir floresan bağlama boya bağlama kullanarak tarafından algılanması için tanımlanır.

Tilapia Gölü virüs kullanarak geleneksel RT-PCR ve SYBR yeşil RT-qPCR

15N izleyici araştırması için bir mikroplot tasarımı, mevsiminde birden fazla bitki ve toprak örnekleme olayını barındıracak şekilde tanımlanmıştır. Öğütme ve tartım protokolleri de dahil olmak üzere toprak ve bitki numune toplama ve işleme prosedürleri 15N analiz için konur.

15Azot Analizi için Mikroplot Tasarımı ve Bitki ve Toprak Numune Hazırlama

Öğrenin, çevre ve içme sularındaki enterovirus ve norovirus konsantrasyonlarını RT-qPCR ile ölçme yöntemini. Santrifüj ultrafiltrasyon ve gerçek zamanlı amplifikasyon adımlarını keşfedin.

Enterovirüs Kültür ve RT-qPCR Su Norovirus Oluşum EPA Method 1615 Ölçümü. Bölüm III. RT-qPCR Virüs Algılama

Daha fazla video keşfet