Havayolu Epitel Hücreleri üzerinde Lenfositik mikrotanecikler ve proapoptotik Etkisi Algılama Üretimi

Bu prosedürün genel amacı, bir T lenfosit hücre hattından lenfositik mikropartiküllerin veya LMP'lerin in vitro üretimini göstermek ve bunların hava yolu epitel hücreleri üzerindeki proapoptotik etkilerini göstermektir. Bu, önce LMP'lerin üretilmesiyle gerçekleştirilir. Daha sonra, izole LMP'ler faks analizi ile karakterize edilir.

Daha sonra bronşiyal doku eksplantları kültürlenir. Son olarak bronşiyal eksplantlarda LMP tedavisi yapılır. Sonuç olarak, hemat, toin ve eozin gibi histopatolojik incelemeler ve NC iki hücre ölümü tespiti LMP'ye bağlı bronşiyal epitel tabakası hasarını ve epitel hücre apoptozisini göstermek için kullanılır.

Bu tekniğin, insan periferik kanından mikropartikülün izolasyonu gibi mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, in vitro eylemde bir hücre hattından türetilen büyük ölçekli mikropartikül üretimini gerçekleştirebilmemizdir. Genel olarak, bu yönteme yeni başlayan bireyler zorlanacaktır çünkü bronş ekplan kültürünün kritik adımlarının hazırlanması kolay değildir. Kültüre başlamak için.

Her biri 150 mililitre taze, orta içeren dört T 1 75 şişesindeki CEMT hücreleri ve 37 santigrat derecede mililitre başına 2 milyon hücre yoğunluğuna kadar inkübe edilir. Hücreleri her bir şişeden beş dakika boyunca 200 kez G'de santrifüjleme ile toplayın ve 300 kez 10'u altı hücreye 150 mililitre taze ortam içeren yeni bir T 1 75 şişesine yeniden bükün. Mililitre yoğunluğu başına 2 milyon hücreyi korumak için, mililitre başına 0.5 mikrogramlık bir nihai konsantrasyonda ortama 37.5 mikrolitre aktin misin D ekleyin ve 24 saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.

Tüm kültür ortamını 50 mililitrelik konik tüplere aktarın ve hücreleri beş dakika boyunca 750 kez G'de döndürün. Daha sonra süpernatanı 50 mililitrelik konik tüplere aktarın ve büyük hücre parçalarını çıkarmak için 15 dakika boyunca 1500 kez G'de santrifüjleyin. Daha sonra, süpernatanı 250 mililitrelik bir şişeye aktarın ve 50 dakika boyunca 12.000 kez G'de ultra santrifüjleyin.

Ardından süpernatanı atın ve peletleri toplayın. LMP ile zenginleştirilmiş peletleri 50 mililitrelik bir tüpte yıkamak için 40 mililitre steril PBS kullanın ve 50 dakika boyunca 12.000 kez G'de santrifüjleyin. Bu adımı iki kez tekrarlayın.

Bir mililitre PBS ile araç kontrolü olarak kullanılmak üzere süpernatanı son yıkamadan toplayın. Peletleri askıya alın ve 1.5 mililitrelik steril bir mikro tüp alikotuna aktarın ve izole LMP'leri eksi 80 santigrat derecede saklayın. Mikropartikülleri faks analizi ile karakterize etmek için, biri kalsiyum klorür ve diğeri kalsiyum içermeyen iki neksin tamponu numunesi hazırlayarak başlayın.

Bir faks tüpünde, bir mikrolitre LMP'yi 44 mikrolitre bir nexin tamponunda kalsiyum klorür ile seyreltin. Kalsiyum klorür içermeyen bir nexin tamponu kullanarak başka bir tüp hazırlayın. Daha sonra, her tüpe beş mikrolitre X ve V sci beş ekleyin ve karanlıkta oda sıcaklığında 15 dakika boyunca iyice karıştırın.

İnkübasyondan sonra 400 mikrolitre faks grip kılıfı sıvısı kullanın. Reaksiyonları durdurmak için, her tüpe dahili bir standart olarak 10 mikrolitre yedi mikron sayma boncuk süspansiyonu ekleyin. Mutlak bir sayım elde etmek için, akış sitometresi üzerinde göreceli boyut, FSCH ve bağıl taneciklik SSCH ve nokta grafiği bulunan kapılar.

Birinci kapı için bir mikrometrelik boyut kalibre edilmiş floresan boncukların kullanılması ve yedi mikrometrede boncukların sayılması. İkinci kapı için, LMP numunesini bir F-S-C-H-S-S-C-H grafiği üzerinde bir F-S-C-H-S-S-C-H grafiği üzerinde, ikinci yürüyüşte 10.000 sayma boncuğuna ulaşılana kadar bir sinyal alarak bir sinyal alarak analiz edin, kalsiyum klorür içeren nexin tamponundaki LMP'lerin ex NV olaylarındaki pozitifliği belirleyin ve kalsiyum klorür içermeyen nexin tamponundaki LMP'lerin olaylarını çıkarın. Aşağıdaki denkleme göre LMP'lerin mutlak sayısını hesaplayın.

Akciğer dokusunu aseptik olarak incelemek için neşter dumont süper ince cımbız ve cerrahi makas kullanır. Parankimi ve kan damarlarını dikkatlice çıkarın. Doku yıkama ortamına batırılmış bronşları daha fazla inceleyin ve bronşları periferik akciğer dokularından bir ila 2,5 milimetre çapında ayırın.

Steril kavisli mikro diseksiyon forsepsleri ile kepçe hareketi kullanarak bronş dokularını yaklaşık beş milimetre kalınlığında bronş sıralarına dilimlemek için bir neşter kullanın. Bronş parçalarını toplayın ve daha önce hazırlanmış bulaşıkların çizik bölgelerine yerleştirin. Metin protokolüne göre, doku yıkama ortamını çıkarın ve parçaları bulaşıklara yapışmalarını sağlamak için oda sıcaklığında yaklaşık beş dakika inkübe edin.

Her yemeğe 10 mililitre tam şifa ortamı ekleyin ve bunları yüksek oksijen gazı karışımına sahip kontrollü bir atmosfer modüler inkübatör odasına yerleştirin, hazneyi yıkayın, ardından bir tezgah üstü orbital inkübatöre yerleştirin ve 37 santigrat derecede 24 saat boyunca dakikada 10 döngüde sallayın ortamın parçalar üzerinde aralıklı olarak akmasına izin vermek için. İnkübasyondan sonra, bir faz kontrastı ve ters çevrilmiş ışık mikroskobu altında doku eksplanını gözlemleyin. Sonraki LMP tedavisi için tam ince saç hareketi ve canlı bronşiyal epitel ile bronşiyal ekplanı seçin.

LMP'leri tedavi etmek için, az önce seçilen bronşiyal ekplanı sayın ve 12 oyuklu bir doku kültürü plakasının her bir oyuğunu işaretleyin. Her explan için 0.5 mililitre tam büyüme ortamını steril bir einor tüpüne aktarın. Daha sonra tedavi başına 25 mikrolitre l ve p stoğu ekleyin veya 25 mikrolitre kontrol aracı ekleyin.

Kontrol için, eksplantlar tüpe hafifçe vurarak iyice karıştırın. Karışık ortamı, kavisli mikro diseksiyon forsepsleri ile işaretlenmiş 12 oyuklu bir doku kültürü plakasının her bir oyuğuna aktarın. Seçilen her bronşiyal x explan'ı doku kültürü plakasının her bir oyuğuna aktarın.

24 saat sonra hafifçe çalkalayarak 37 santigrat derecede kontrollü bir atmosfer modüler inkübatör odasında inkübasyona devam edin. EXPLAN'ı üç kez yıkamak için PBS'yi kullanın ve fiksasyon h ve e boyamaya ve tünel tahliline devam edin. Burada gösterildiği gibi metin protokolüne göre, LMP'ler faks analizi ile bir nexin V boyaması ile karakterize edildi ve mps'nin% 97'sinin nexin V bilimkurgu pozitifinde olduğu bir mikrometre boncuk kullanılarak kapılandı.

Tipik olarak, bu protokolü takiben yaklaşık 2,5 miligram LMP elde edildi. C 57 siyah altı fareden elde edilen bronşiyal doku eksalistine araç ve LMP tedavisi uygulandı. Bu şekilde, bronş kesitlerinin histopatolojik analizi, LMP'lerin bronşiyal epitelin yapısal bütünlüğü üzerindeki etkisini ortaya koymaktadır.

Kontrol altında. Ek olarak, bronşiyal epitel büyük ölçüde hasarsızdı. Bununla birlikte, LMP ile tedavi edilen eksplantlarda, yüzeyel epitel hücre tabakası hasar görmüş veya kaybolmuştur ve burada görüldüğü gibi epitel hücre yüksekliği ve yoğunluğunda önemli düşüşler olmuştur.

Apoptoz için bir belirteç olan tünel pozitif boyama, LMP ile tedavi edilen bronşiyal epitelde kontrol dokusuna kıyasla daha belirgindi. Bu prosedürü denerken, mikropartiküller üretirken ve doku ekzit kültürü yaparken steril koşullarda çalışmayı unutmamak önemlidir.