Name: Bozulmamış neuroepithelium Fare Koku Duyu Nöronlar Delikli Patch-kelepçe Kayıt: Bir Belirlenen Odorant Reseptör ifade Nöronlar Fonksiyonel Analiz (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-07-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: Öğrenin, fare koku duyu nöronlarının zar özelliklerini delikli patch-kelepçe tekniğiyle ölçmeyi. Bu yöntem, belirli koku reseptörlerinin işlevsel analizini ve hücresel düzeyde koku işleme mekanizmalarının anlaşılmasını sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Yazarlar, OR-GFP farelerinin cömert hediyesi için Peter Mombaerts'e teşekkür eder; Mükemmel hayvan bakımı için Anne Lefranc ve CSGA hayvan tesisi. Finansman, CNRS tarafından ATIP ve ATIP Plus hibeleri, Conseil Régional de Bourgogne (FABER ve PARI hibeleri), Université de Bourgogne (BQR programı) aracılığıyla sağlandı.

Bu protokol Université de Bourgogne hayvan bakım kuralları takip ve Université de Bourgogne etik kurul tarafından onaylandı. 1. Hayvanlar <ol><li> Jackson Laboratuvarı&#39;nda mevcut genetik olarak OR-IRES-tauGFP fareler kullanın. Bu fareler koku alma sisteminin 19 akson hedefleme ve gelişimini analiz etmek için Dr. Peter Mombaerts &#39;laboratuvarda geliştirilmiştir. Örneğin, MOR23-IRES-tauGFP hattı, stok numarası 006643, resmi gerilme adı B6 taşır; 129P2- Olfr16 tm2Mom / MomJ; Benzer şekilde, SR1-IRES-tauGFP hattı, stok numarası 6717 resmi adı B6 taşır; 129P2- Olfr124 tm1Mom / MomJ. </li><li> Hayvanların yaşı ile ilgili olarak: protokolünün daha iyi bir sonuç için, yaş 2 ve 4 hafta arasında hayvanları kullanın. Bu yaş grubunda, diseksiyon daha kolay (yumuşak kemikler, sıkı koku epiteli) ve dendritik topuzlar bi olmasıdırgger yaşlı hayvanlarda karşılaştırın. </li></ol> Elektrotlar ve Çözümleri 2. Hazırlık <ol><li> Uyarıcı pipetler için: Satın alma pipetler uyarıcı prepulled. Aksi takdirde, elle onları hazırlamak. <ol><li> Bir alevi kullanarak, ucundan yaklaşık 1 cm altı 1 mm cam pipetler bükün. Bir delikten tarafından güçlendirmek 1,5 cm ısıyla daralan boru bu altı pipetler artı düz 7 inci takın. </li><li> Isı birlikte ekli varil korumak için boru küçültmek. Varil diğer ucuna ek bir ısı shrink boru takın. Çok varil çektirmesi ile bu uyarıcı pipet çekin. </li><li> Bükülmüş ipuçları güçlendirmek için deliğinden etrafında bazı beyaz sıvı tutkal ekleyin. Kuru O / N edelim. </li></ol></li><li> Normal Ringer hücre dışı solüsyon, 1 veya 2 L hazırlayın (mM olarak: NaCl 124, KCI 3, MgSO 4 1.3, CaCl2 2, NaHCO 3 26 NaH 2 PO 4 1.25, glükoz 15; pH 7.6, 305 mOsm). 4 ° C&#39;de tutunkullanılıncaya kadar. </li><li> (MM olarak) hücre içi bir stok çözelti hazırlayın: KCI 70, KOH 53, metansülfonik asit, 30 EGTA 5, HEPES 10, sukroz 70; pH 7.2 (KOH) ve 310 mOsm. Kullanılana kadar 4 ° C &#39;de muhafaza edin. Birkaç hafta için iyi. </li><li> Deneyden önce (son dakikada) ekstemporane nystatin ile hücre içi kayıt çözeltisi hazırlayın. <ol><li> DMSO 50 ul ekleyin, nistatin 3 mg tartılır; tamamen seyreltilmiş kadar vorteks 20 sn sonra 2-3 dakika sonikasyon. </li><li> Hücre içi stok çözeltisi, 5 ml DMSO-nistatin çözeltisi 20 ul ekle. Vortex 20 sn, daha sonra 3 dakika sonikasyon. 4 ° C &#39;de, bu çözüm tutun ve doğrudan ışıktan korumak, nistatin ışığa duyarlıdır. Bu çözelti, birkaç saat süre ile kullanılabilir. Her gün değiştirin. </li><li> Koku epiteli hazırlık mikroskop altında sonra, elektrotlar doldurmak için bir alev uzatılmış sarı ucu ile 1 ml şırınga içinde bu çözümün bir kısmını almak; Doğrudan ışıktan korumak. Oda sıcaklığında, nistatin çözelti bir kezsabit değildir; her saat şırınga veya buz tutmak ml, 1 çözüm değiştirin. </li></ol></li><li> İç nystatin çözeltisi ile 15-20 M? Bir direnç ile uzun boyun ve küçük bir ipucu (~ 2 mikron) elde etmek için bir çektirmenin ile kayıt elektrotları çekin. </li><li> Davlumbaz altında DMSO içinde 0.5 M de odorant çözeltisi hazırlayın; eş-payı ve kullanılana kadar -20 ° C&#39;de saklayın. Istenen konsantrasyona kadar, Ringer çözeltisi içinde Deodorantını seyreltin. Uyarıcı pipet doldurun. </li></ol> Koku Epitelinin 3. hazırlanması Not: TD-IRES-tauGFP fareler ya da promotörün kontrolü altında tauGFP ifade eder. Bu farelerde, ilgi OR ifade tüm nöronlar GFP ile etiketlenmiş. Bu protokol tüm bölgeler ifade ameliyathanelerinde için uyarlanmıştır. Ancak, disseksiyonları ve kayıtlar dorsal bölgesinde ifade ameliyathanelerinde için daha kolaydır. <ol><li> Ketamin ve ksilazin (150 mg / kg ve 10 mg / kg Yönetim Kurulu karışımı enjekte edilerek hayvan anestezisiy ağırlık). Dekapitasyon genç farelerde ya da yaşlı fareler için uygun bir şekilde muhafaza kemirgen giyotinle birlikte keskin bir makasla gerçekleştirilebilir. <ol><li> Kullanımı halka diseksiyon makas dorsal deri yoluyla uzunlamasına bir medial kesi yapmak. Bunu dışında çekerek cildi çıkartın. Makas kullanarak, çene eklemi alt çene kesti. Dişlere koronal kesim paralel olarak üst ön dişleri çıkarın. </li><li> Gözlerinin arkasında başın bir koronal kesim olun ve başın sadece ön kısmını tutun. Kapsamında diseksiyon için buz Ringer çözeltisi içinde bunu batırın. </li></ol></li><li> Kapsamında ayır: ventral tarafında, üst çene / diş boyunca uzunlamasına kesim yapmak. Burun boşluğunun dorso-yan tarafında takip, uzunlamasına sırt kemikleri kesin. En kemikleri ve damak kaldır; oda sıcaklığında oksijenli Ringer buna bağlı septum ve epitel aktarın. </li><li> Son diseksiyon için: Sağ kayda başlamadan önceoturum forseps ile altta yatan septum gelen epitel uzak soyun. Forseps ile ve yapışma güçlü septum ön kısmında iki 4-5 mm makas darbeleri (kullanım microvannas makas) ile epitel ayırın. <ol><li> Dikkatle septal epiteline dorsal bağlantısı boyunca dışarı keserek vomeronasal organı çıkarın. Yukarı bakacak şekilde mukus tabakası ile bir kayıt odasına epitel aktarın; Bir harp ile odasında düz tutun. </li></ol></li><li> Floresan optik ve hassas bir kamera ile donatılmış dik bir mikroskop altında odasını takın. 40X su daldırma hedefi (sayısal açıklık 0.8) ve bir büyüteç ile elde ekstra bir 2X veya 4X büyütme ile yüksek büyütmede bilgisayar ekranında hazırlık gözünüzde canlandırın. Oda sıcaklığında oksijenli Ringer (1-2 ml / dakika) sürekli serpmek. </li></ol> 4. Kayıt Oturumu <ol><li> Floresan hücreye Ara: 480 de hazırlık heyecanlandırmak530-550 nm aralığında ışık yayar EGFP nm; floresan ve parlak bir alan altında güvenilir görünür tek dendritik topuzu hedef. </li><li> Nystatin ile hücre içi çözelti ile elektrot doldurun; hafifçe elektrot üzerinde dokunarak kabarcıkları. </li><li> Elektrot tutucu elektrot yerleştirin pipet pozitif basınç uygulayın; Direnç 15-20 M? Olmalıdır. </li><li> Hücreye yakın elektrot getirin; Direnç ~ 40 M? ulaştığında, pozitif basınç serbest bırakın ve bir gigaseal ulaşmak için hafif negatif basınç uygulayın. </li><li> Conta ulaşıldığında, yaklaşık -75 mV zar potansiyeli ayarlanır; </li><li> Hücre açıldıktan sonra, stimülasyon protokolleri, farmakolojik tedaviler ile devam edin. Tek bir odorant stimülasyon, kayıt spontan aktivite 200-500 milisaniye kadar yanıtı ölçmek için, 500 milisaniye boyunca canlandırmayı ve 10 saniye 13 hücre yanıtı ölçmek. Farmakolojik tedaviler için de farmakolojik ajanlar serpmekİstenen bir konsantrasyon, 20. </li></ol> 5. Veri Analizi <ol><li> Olarak takip Odorant uyarılmasıyla ortaya akımları analiz: (msn maksimum genlik% 90 ulaşmak için gerekli zaman,) maksimum genlik, yükselme zamanı, toplam akım (PAS eğrinin altında kalan alan), zaman% 50 (başlangıcı ve msn&#39;de, azami amplitüd% 50 karşılık mahsup arasındaki süre). <ol><li> Çizip Hill denklemi kullanarak bir doz yanıt eğrisi ayarı, farklı konsantrasyonda (maksimum amplitüd ulaştı) tepe iletim akımları kullanılarak: I = Imax / (1 ​​+ (K 02/01 / C) n-i) tepe akımını temsil eder, , maksimum cevabın yarısı erişildiği K1 / 2 konsantrasyonu, C odorant konsantrasyonu ve n Hill katsayısı doyurarak konsantrasyonlarda maksimum cevap IMAX. </li></ol></li><li> Maksimum depolarizasyon için geçerli kelepçe tota membran potansiyeli kayıtları analizl potansiyeli (mVsec eğrinin altında kalan alan) ortaya çıkardı; 30 sn 1 dk kayıtları üzerinde rekor spontan spike aktivitesi; akımlar (5-10 pA) enjeksiyonu ile ortaya sivri aracılığıyla kayıt heyecanlanma. </li></ol>

<ol><li>Lowe, G., Gold, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonlinear+amplification+by+calcium-dependent+chloride+channels+in+olfactory+receptor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Nonlinear amplification by calcium-dependent chloride channels in olfactory receptor cells.</a> Nature. 366 (6452), 283-286 (1993).</li>
<li>Ponissery Saidu, S., Dibattista, M., Matthews, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odorant-induced+responses+recorded+from+olfactory+receptor+neurons+using+the+suction+pipette+technique%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Odorant-induced responses recorded from olfactory receptor neurons using the suction pipette technique.</a> J Vis Exp. (62), e3862(2012).</li>
<li>Moss, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+and+biochemical+responses+of+mouse+vomeronasal+receptor+cells+to+urine-derived+compounds%3A+possible+mechanism+of+action%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Senses%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological and biochemical responses of mouse vomeronasal receptor cells to urine-derived compounds: possible mechanism of action.</a> Chem Senses. 23 (4), 483-489 (1998).</li>
<li>Kaur, A., Dey, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+cell+calcium+imaging+of+dissociated+vomeronasal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Live cell calcium imaging of dissociated vomeronasal neurons.</a> Methods Mol Biol. 1068, 189-200 (2013).</li>
<li>Ma, M., Chen, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+characterization+of+rat+and+mouse+olfactory+receptor+neurons+from+an+intact+epithelial+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological characterization of rat and mouse olfactory receptor neurons from an intact epithelial preparation.</a> J Neurosci Methods. 92 (1-2), 31-40 (1999).</li>
<li>Axel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+multigene+family+may+encode+odorant+receptors%3A+a+molecular+basis+for+odor+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A novel multigene family may encode odorant receptors: a molecular basis for odor recognition.</a> Cell. 65 (1), 175-187 (1991).</li>
<li>Bozza, T., Feinstein, P., Zheng, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odorant+receptor+expression+defines+functional+units+in+the+mouse+olfactory+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Odorant receptor expression defines functional units in the mouse olfactory system.</a> J Neurosci. 22 (8), 3033-3043 (2002).</li>
<li>Bozza, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+of+class+I+and+class+II+odorant+receptors+to+glomerular+domains+by+two+distinct+types+of+olfactory+sensory+neurons+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Mapping of class I and class II odorant receptors to glomerular domains by two distinct types of olfactory sensory neurons in the mouse.</a> Neuron. 61 (2), 220-233 (2009).</li>
<li>Vassalli, A., Rothman, A., Feinstein, P., Zapotocky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minigenes+impart+odorant+receptor-specific+axon+guidance+in+the+olfactory+bulb%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Minigenes impart odorant receptor-specific axon guidance in the olfactory bulb.</a> Neuron. 35 (4), 681-696 (2002).</li>
<li>Feinstein, P., Bozza, T., Rodriguez, I., Vassalli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axon+guidance+of+mouse+olfactory+sensory+neurons+by+odorant+receptors+and+the+beta2+adrenergic+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Axon guidance of mouse olfactory sensory neurons by odorant receptors and the beta2 adrenergic receptor.</a> Cell. 117 (6), 833-846 (2004).</li>
<li>Mombaerts, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+and+ligands+for+odorant%2C+vomeronasal+and+taste+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Genes and ligands for odorant, vomeronasal and taste receptors.</a> Nat Rev Neurosci. 5 (4), 263-278 (2004).</li>
<li>Grosmaitre, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SR1%2C+a+mouse+odorant+receptor+with+an+unusually+broad+response+profile%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">SR1, a mouse odorant receptor with an unusually broad response profile.</a> J Neurosci. 29 (46), 14545-14552 (2009).</li>
<li>Grosmaitre, X., Vassalli, A., Mombaerts, P., Shepherd, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odorant+responses+of+olfactory+sensory+neurons+expressing+the+odorant+receptor+MOR23%3A+a+patch+clamp+analysis+in+gene-targeted+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Odorant responses of olfactory sensory neurons expressing the odorant receptor MOR23: a patch clamp analysis in gene-targeted mice.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (6), 1970-1975 (2006).</li>
<li>Lam, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odorant+responsiveness+of+embryonic+mouse+olfactory+sensory+neurons+expressing+the+odorant+receptors+S1+or+MOR23%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Odorant responsiveness of embryonic mouse olfactory sensory neurons expressing the odorant receptors S1 or MOR23.</a> Eur J Neurosci. 38 (2), 2210-2217 (2013).</li>
<li>Zhang, J., Huang, G., Dewan, A., Feinstein, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uncoupling+stimulus+specificity+and+glomerular+position+in+the+mouse+olfactory+system%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Uncoupling stimulus specificity and glomerular position in the mouse olfactory system.</a> Mol Cell Neurosci. 51 (3-4), 79-88 (2012).</li>
<li>Zhang, J., Pacifico, R., Cawley, D., Feinstein, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasensitive+detection+of+amines+by+a+trace+amine-associated+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Ultrasensitive detection of amines by a trace amine-associated receptor.</a> J Neurosci. 33 (7), 3228-3239 (2013).</li>
<li>Lee, A. C., Tian, H., Grosmaitre, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+patterns+of+odorant+receptors+and+response+properties+of+olfactory+sensory+neurons+in+aged+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Senses%22%5BJournal%5D)">Expression patterns of odorant receptors and response properties of olfactory sensory neurons in aged mice.</a> Chem Senses. 34 (8), 695-703 (2009).</li>
<li>Cadiou, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postnatal+odorant+exposure+induces+peripheral+olfactory+plasticity+at+the+cellular+level%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Postnatal odorant exposure induces peripheral olfactory plasticity at the cellular level.</a> J Neurosci. 34 (14), 4857-4870 (2014).</li>
<li>Mombaerts, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+wiring+in+the+mouse+olfactory+system%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Axonal wiring in the mouse olfactory system.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 22, 713-737 (2006).</li>
<li>Grosmaitre, X., Santarelli, L. C., Tan, J., Luo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+functions+of+mammalian+olfactory+sensory+neurons+as+odor+detectors+and+mechanical+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Dual functions of mammalian olfactory sensory neurons as odor detectors and mechanical sensors.</a> Nat Neurosci. 10 (3), 348-354 (2007).</li>
<li>Duchamp-Viret, P., Chaput, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odor+response+properties+of+rat+olfactory+receptor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Odor response properties of rat olfactory receptor neurons.</a> Science. 284 (5423), 2171-2174 (1999).</li>
<li>Heydel, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odorant-binding+proteins+and+xenobiotic+metabolizing+enzymes%3A+implications+in+olfactory+perireceptor+events%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Rec+%28Hoboken%29%22%5BJournal%5D)">Odorant-binding proteins and xenobiotic metabolizing enzymes: implications in olfactory perireceptor events.</a> Anat Rec (Hoboken). 296 (9), 1333-1345 (2013).</li>
<li>Pelosi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perireceptor+events+in+olfaction%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Perireceptor events in olfaction).</a> J Neurobiol. 30 (1), 3-19 (1996).</li>
<li>Spehr, M., Wetzel, C. H., Hatt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3-phosphoinositides+modulate+cyclic+nucleotide+signaling+in+olfactory+receptor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">3-phosphoinositides modulate cyclic nucleotide signaling in olfactory receptor neurons.</a> Neuron. 33, 731-739 (2002).</li>
<li>Chen, S., Lane, A. P., Bock, R., Leinders-Zufall, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blocking+adenylyl+cyclase+inhibits+olfactory+generator+currents+induced+by+%27IP%283%29-odors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Blocking adenylyl cyclase inhibits olfactory generator currents induced by 'IP(3)-odors.</a> J Neurophysiol. 84 (1), 575-580 (2000).</li>
<li>Savigner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+spontaneous+and+odorant-evoked+activity+of+rat+olfactory+sensory+neurons+by+two+anorectic+peptides%2C+insulin+and+leptin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Modulation of spontaneous and odorant-evoked activity of rat olfactory sensory neurons by two anorectic peptides, insulin and leptin.</a> J Neurophysiol. 101 (6), 2898-2906 (2009).</li>
<li>Ukhanov, K., Brunert, D., Corey, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphoinositide+3-kinase-dependent+antagonism+in+mammalian+olfactory+receptor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Phosphoinositide 3-kinase-dependent antagonism in mammalian olfactory receptor neurons.</a> J Neurosci. 31 (1), 273-280 (2011).</li>
</ol>

Yazarlar, rekabet eden herhangi bir mali çıkarları olmadığını beyan ederler.

doğru, sağlıklı OSNs özelliklerini izlemek için bu protokolün yeteneği hazırlık kalitesine büyük ölçüde bağlıdır. Bu nedenle, diseksiyon adımlar önemlidir. Önce kalite (pH, osmolarite), oksijenasyon ve sıcaklık (buz-soğuk ama dondurulmuş değil) diseksiyon orta dikkat etmek önemlidir. İkincisi, diseksiyon araçları ile epitel manipülasyon olarak zarar görmemesi için mümkün olduğunca sınırlı olmalıdır. Son olarak, mümkün olduğunca büyük OSN popülasyonu erişmek amacıyla, mümkün olduğu kadar düz bir preparat elde etmek için ...

Koku alma duyu nöronları (OSN) koku algı ilk adımı temsil etmektedir. Kemirgenlerde burun boşluğunu çevreleyen koku epiteli bulunan beyinle kendi akson yoluyla gönderilen aksiyon potansiyelleri içine koku kimyasal bilgi dönüşümü. Daha iyi koku kodlama mekanizmaları anlamak için, OSNs iletimi ve membran özelliklerini karakterize etmek gereklidir. Yakın zamana kadar, memeli OSNs özelliklerini karakterize etmek için kullanılan teknikler çok ayrışmış OSNs 1-4 üzerinde gerçekleştirilmiştir. ayrışma süreci çevrelerinden OSNs boşaltmak için çeşitli mekanik ve kimyasal (yani enzimler) süreçleri kullanır. Bu işlemler, kayıtlar için uygun bir hücre, düşük uyarmaktadır. Bu az sayıda GFP etiketli hücrelerin durumunda daha da kritik öneme sahip olabilir. Aynşması da OSNs ve Surviv artırabilir koku epitel başka hücreler arasındaki yerel hücre-hücre etkileşimleri ortadan kaldırırEl ve OSNs &#39;özelliklerinin modülasyonu. Ayrışma işlemini atlamak için, sağlam bir preparat 5 geliştirilmiştir. Her OSN büyük bir çoklu gen ailesi 6 arasından seçildiği (OR), bir koku reseptörü ifade eder. Fare ana koku epiteli olarak ifade 1,000 OR ~ vardır. Nedeniyle vahşi tip hayvanlarda OR çok sayıda, büyük ihtimalle aynı ifade OSNs kayıt YA çok düşük etmek. Bu sınırlamaları aşmak için, gen hedeflenen fareler mevcut olduğu bir tespit VEYA floresan proteini 7-9 ile etiketlenmiş ifade tüm OSNs. Bu etiketli OSNs ayrışmış hazırlıkları Daha önce de belirttiğimiz sakıncaları ile 7,10,11 fonksiyonel analiz yapmak için kullanıldı. Genetik etiketli farelerden alınan sağlam bir epitel hazırlık 5 Dolayısıyla bu sorunları circumvents. Vi yakın olarak bir ortamda tam olarak tanımlanmış ORs ifade OSNs aktivitesi izlenmesine olanak sağlarmümkün olduğunca vo. Ayrıca, OSNs patch-kelepçe kayıtları da zar özellikleri, iletim yolu farmakoloji, ligand / VEYA etkileşimlerinin hassas analiz sağlar. Bütün bu konular pek dışı kayıtları kullanılarak analiz edilebilir. Biz koku reseptörü SR1 ve MOR23 12,13 ifade OSNs yanıtları izlemek için bu tekniği kullanılır. teknik fizibilite nöronlar 15,16 ifade OSNs 14 eksprese eden MOR23 üzerinde diğer gruplar yanı sıra, diğer ORs ile teyit edilmiştir. OSNs tanımlanmış bir nüfus izleme 17 yaşlanma, böyle bir gelişme 14 gibi pek çok farklı bağlamlarda özelliklerinin analizi yol açabilir, odorant indüklenen plastisite 18 ve 15 kodlama koku odorant reseptörün dizilimindeki rolü. Bu protokol, böylece zar düzeyinde tanımlanan OSNs fonksiyonel özelliklerini izlemek için güçlü bir araç sağlar.

<table><tbody><tr><td>Faraday kafesli titreşim masası</td><td>TMC</td><td>63-500 SERİSİ</td><td>gereklidir: kayıt sistemini çevre tarafından indüklenen titreşimlerden izole eder (deneycinin hareketleri, bilgisayarları soğutmak için fanlar gibi ekipmanların titreşimleri, vb.); ayrıca bir Faraday kafesi ile satın alınabilir veya özel yapım bir Faraday kafesi ile donatılabilir; Bu kafes, çevre optiklerinden</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>kaynaklanan elektrik gürültüsünü önlemek için önerilirmikroskop</td><td>Olympus</td><td>BX51WI</td><td>epifloresan ile donatılmış dik mikrokop; kullanıcının tercihine bağlı olarak sabit veya hareketli aşama</td></tr><tr><td>Olympus</td><td></td><td>LUMPLFL40XW</td><td>en az 2 hedef gereklidir: hücreye kaba yaklaşım için 4X veya 10X; ve 40X daldırma uzun mesafe örneği Olympus LUMPLFL40XW / IR /0,8 / WD:3.3 MM</td></tr><tr><td>büyüteç</td><td>Olympus</td><td>U-TVCAC</td><td>KESİNLİKLE GEREKLİ: objektif ile kamera arasındaki ışık yoluna yerleştirilir; kayıt elektrot kamerası Olympus DP72 ile düğmeye tam olarak ulaşmak için ekrandaki görüntüyü büyütmeye izin verir</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>, nöronları floresan ve parlak alanda görmek için iyi bir kamera gereklidir; Kontrol yazılımı basittir ve elektrotun hücreye yaklaşımını izlemek için fotoğraf çekmeye ve canlı kamera görüntüsü yapmaya izin verir. Ultra hassas bir kamera gerekli değildir</td></tr><tr><td></td><td>, farelerde kullanılan floresan proteine bağlı olarak Olympus/Chroma'yı filtreler; GFP için örnek: uyarma : BP460-490: emisyon: HQ530 / 50m</td><td></td> amplifikatör HEKA EPC10 USB, kayıt elektrodundan geçen akımları izler ve ayrıca spritzer'a bir TTL sinyali göndererek şişirmeyi kontrol eder; EPC10 kurulumu bilgisayar yazılımı tarafından kontrol edilir <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>HEKA</td><td>Patchmaster</td>, <td>deney mikromanipülatörü sırasında amplifikatörü kontrol eder</td></tr><tr><td></td><td>Sutter</td><td>MP225</td><td>hassas mikromanipülatör, bir mikrometrenin 1 / 10'una kadar hassas hareketlere izin verir; bu model çok kararlı; sürüklenebilecek hidrolik manipülatörlerden kaçının</td></tr><tr><td>elektrot çektirmesi</td><td>Sutter</td><td>P97</td><td>FT345-B geniş oluk filamenti ile; &nbsp; yaklaşık 2& mikro'luk kayıt pipetleri hazırlamak için; hücrelere ulaşmak için uzun bir ucu olan m çapında; Direnç, delikli yama kelepçesi çözelti</td></tr><tr><td>camı</td><td>Sutter</td><td>BF120-69-10</td> ile 15 ila 20Mohm olmalıdır<td>, kayıt koşullarımızda, bu cam pipetleri kaydetmek için idealdir</td></tr>, <tr><td>kayıt odası</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-26G</td><td>, preparasyonu mikroskop altında ayarlamak için bir odaya ihtiyaç vardır. Hazırlığı odanın merkezinde tutmak için bir ağ/ankraj kullanılmalıdır.</td></tr>7'li gruplar halinde <tr><td>takılan stimülasyon</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>camı</td><td>WPI</td><td>TW100F-4</td><td>, bu pipetler önceden çekilmiş uyarıcı pipetler hazırlamak için kullanılır</td></tr><tr><td>çok namlulu çektirme</td><td>MDI</td><td>PMP-107-Z</td><td>çekme ve bükme ile birlikte, bu çektirme 7 varil hassas basınç enjektörü ile şişirme elektrotları hazırlamamızı sağlar</td></tr><tr><td>;</td><td>Toohey Company</td><td>P/N T25-1-900 Tek Kanal&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Bu hassas basınç enjektörü ve nbsp; çok namlulu çektirmede çıkarılan basıncı kontrol eder; manuel olarak veya amplifikatör tarafından 5V &nbsp ile kontrol edilir; TTL'lerin</td></tr><tr><td>mikro manipülatörü</td><td>Narishige</td><td>YOU-1</td>, <td>kaba bir manipülatör, şişirme elektrodunu kayıt yeri borularına yaklaştırmak için yeterlidir,</td></tr><tr><td></td><td>Yok</td><td></td><td>tygon hortumu, kirpi balığından gelen basıncı şişirme pipetine getirmek için çözeltiler</td></tr><tr><td>/perfüzyon/kimyasallar</td><td></td><td></td><td></td></tr>, <tr><td>vakum pompası</td><td>Gardner Denver</td><td>300 serisi</td><td>titreşimli bir membran pompası, diğer pompa türlerinden daha sessiz ve verimlidir</td></tr>, <tr><td>perfüzyon sistemi</td>, <td>N/A</td><td>, N/A,</td><td>harici çözeltiyi kayıt odasından içeri ve dışarı getirmek için polietilen borulu yerçekimi perfüzyon sistemi</td></tr>, <tr><td>nystatin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N3503</td>, <td>delikli yama kelepçesi için iç çözeltiyi uygulamak için zorunludur</td></tr>, <tr><td>DIMETIL SÜLFOKSIT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5879</td><td>Delikli yama için dahili çözelti için nistatini çözmek için kullanılır&nbsp;</td></tr><tr><td>Sodyum klorür</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9625</td><td>hücre dışı çözelti</td></tr><tr><td>Potasyum klorür</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4504</td><td>hücre içi/hücre dışı çözelti</td></tr><tr><td>Kalsiyum klorür dihidrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7902</td><td>hücre dışı çözelti</td></tr><tr><td>Sodyum fosfat monobazik monohidrat (NaH2PO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9638</td><td>hücre dışı çözelti</td></tr><tr><td>Magnezyum sülfat heptahidrat (MgSO<alt>4</alt> 7H<alt>2<>O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>63140</td><td>hücre dışı çözelti</td></tr><tr><td>Glikoz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td>hücre dışı çözelti</td></tr><tr><td>Sodyum bikarbonat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6297</td><td>hücre dışı çözelti</td></tr><tr><td>EGTA (Etilen glikol-bis (2-aminoetileter) -N, N, N ve asal;, N ve asal; -tetraasetik asit)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>E3889</td><td>iç çözelti</td></tr><tr><td>Potasyum hidroksit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1767</td><td>iç çözelti</td></tr><tr><td>Metil Sülfoksit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W387509</td><td>hücre içi çözelti</td></tr><tr><td>Hepes-Na</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H7006</td><td>hücre içi çözelti</td></tr><tr><td>Sükroz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td>hücre içi çözelti</td></tr></tbody></table>

bozulmamış neuroepithelium fare koku duyu nöronlar delikli patch-kelepçe kayıt: bir belirlenen odorant reseptör ifade nöronlar fonksiyonel analiz

Perforated Patch-clamp Recording of Mouse Olfactory Sensory Neurons in Intact Neuroepithelium: Functional Analysis of Neurons Expressing an Identified Odorant Receptor

Özel bağ ile uyarıldıkları zaman koku duyu nöronlarının fizyolojik tepkilerini (OSN) analiz koku tahrikli davranışları ve modülasyon temelini anlamak önemlidir. Bu kodlama özellikleri koku molekülleri ve koku reseptörü (OR) arasındaki ilk etkileşim ağır bağımlı OSNs olarak ifade edilmiştir. ifade YA kritik kimliği, özgünlüğü ve ligand spektrumu. OR ligandı bulmak için olasılık epitel içinde rastgele seçilen bir OSN çok düşüktür dile getirdi. Bu sorunu çözmek için, bu protokol, genetik olarak tanımlanmış ORs promoterinin kontrolü altında floresan protein GFP ifade isim levhası fareler kullanır. OSNs komşu hücrelerin olgunlaşması ve fonksiyonu etkileyen ile burun boşluğuna astar sıkı ve organize epitel yer almaktadır. Burada OSNs e özelliklerini sağlam bir koku epiteli izole ve patch-kelepçe kayıtları ile kaydetmek için bir yöntem tariftanımlanan koku reseptörü xpressing. protokol komşu dokuya etkisi tutarken tek OSN membran özelliklerini karakterize sağlar. Patch-kelepçe sonuçlarının analizi ligand / VEYA etkileşimleri, iletim yollarının ve farmakoloji, OSNs &#39;kodlama özellikleri ve membran düzeyde modülasyon kesin miktarının verir.

Bu protokolün sonuç diseksiyon kalitesine bağlıdır. Bu diseksiyon adımlar kısa (en az 10 dk 15) ve (yani, epitel zarar görmemesi için) kesin olmalıdır. Şekil 1 ideal hazırlık farklı büyütme seviyelerinde nasıl göründüğünü göstermektedir. Parlak saha altında düşük büyütme (bu tür hücreleri desteklemek OSNs tokmakları gibi), farklı hücre tipleri ayırt (Şekil 1A) &#39;dir. En yüksek büyütme düzeyinde, genellikle 80X 160x, aydınlık alanda, OSNs dendritik topuzlar destekleyen hücrel...

Koku alma duyusal nöronlarının fizyolojik özelliklerini analiz etmek hala teknik sınırlamalarla karşı karşıyadır. Burada, gen hedefli farelerde koku alma epitelinin sağlam bir preparasyonu içinde delikli yama klempi yoluyla kaydediyoruz. Bu teknik, membran özelliklerinin karakterizasyonuna ve tanımlanmış koku alma reseptörlerini eksprese eden nöronların spesifik ligandlarına verilen yanıtlara izin verir.

Bozulmamış neuroepithelium Fare Koku Duyu Nöronlar Delikli Patch-kelepçe Kayıt: Bir Belirlenen Odorant Reseptör ifade Nöronlar Fonksiyonel Analiz

Analyzing the physiological responses of olfactory sensory neurons (OSN) when stimulated with specific ligands is critical to understand the basis of ...

Bu prosedürün genel amacı, koku uyaranlarına yanıt olarak olfaktor duyusal nöronların membran özelliklerindeki değişimleri ölçmektir. Bu işlem, öncelikle olfaktor epitelin diseke edilmesi ve perfüzyon odasına aktarılmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım ise mikroskop altında ilgilenilen bir OSN'nin tespit edilmesi ve seçilmesidir.Ardından, seçilen OSN'nin dendritik düğümü patch clamp yöntemiyle sabitlenir ve koku maddeleriyle uyarılırken analiz edilir. Nihayetinde, OSN dendritik düğümlerinin perforize patch clamp yöntemiyle incelenmesi, OSN fonksiyonel özelliklerini membran düzeyinde karakterize eder. Bu yöntem; tanımlı koku reseptörleri eksprese eden olfaktör duyusal nöronların kayıt altına alınması ve patch clamp kayıtları gibi koku alma alanlarındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.Bu nöronların membran özellikleri hakkında bilgi sağlayın. Bir milimetrelik camdan stimülasyon pipetlerini hazırlayın veya alevle önceden çekilmiş olanları satın alın. Altı pipeti, uçtan yaklaşık bir santimetre uzaklıktan 45 derecelik bir açıyla bükün.Ardından, bir halkayı kılavuz olarak kullanarak altı adet eğik uçlu pipeti yedinci bir düz pipetin etrafına yerleştirin ve bunları ısı

perforated-patch-clamp-recording-mouse-olfactory-sensory-neurons

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Electroolfactogram (EOG) kayıt koku epiteli düzeyinde koku alma fonksiyonu değerlendiren bir bilgilendirme yapmak için kolay ve güvenilir bir yoldur. Bu protokol bir kayıt kurulum, fare doku hazırlanması, veri toplama ve temel veri analizi açıklar.

Hava-faz Electroolfactogram Kayıt Fare Koku Duyu Nöronlar analizi Yanıtları

Olfaktör reseptör nöronları (ORNs) bir reseptör içine ilk sırayla koku ampul içinde ikinci dereceden nöronlara iletilir aksiyon potansiyelleri tetikleyen güncel koku sinyalleri dönüştürmek. Burada aynı anda odorant bağlı reseptör fare ORNs mevcut ve aksiyon potansiyelleri kaydetmek için emme pipet tekniği tarif.

Emme Pipet Tekniği kullanılarak Olfaktör Reseptör Nöronlar Kaydedilmiş odorant bağlı Cevapları

Bu video, farelerde koku alma duyusal nöronlarının (OSN'ler) delikli bir yama kelepçesi tekniği kullanılarak elektrofizyolojik kaydını göstermektedir. Florofor etiketli koku reseptörlerine sahip OSN'leri içeren koku alma epiteli, bir fareden izole edilir ve bir kayıt odasında sabitlenir. Bir kayıt pipeti, bir OSN'nin dendritik topuzuna kenetlenir ve pipet içindeki nistatin, hücre ile elektriksel bağlantı oluşturmak için zarı deler. Son olarak, bir koku uyarıcısı vermek için başka bir pipet...

Farelerde Koku Alma Duyu Nöronlarının Delikli Yama-Kelepçe Kaydı

Protokol videosu, farelerde vomeronazal organın (VNO) duyusal nöronlarından elektrofizyolojik kayıt için bir tam hücre yama kelepçesi oluşturmayı açıklar. Floresan olarak işaretlenmiş duyusal nöronlara sahip bir koronal VNO dilimi, bir kayıt kurulumuna yerleştirilir. Etiketli bir nöron, kimyasal uyaranlara yanıt olarak elektrofizyolojik kayıt için tüm hücre konfigürasyonunda bir kayıt pipeti ile yamalanır.

Vomeronazal Duyusal Nöronlardan Elektrofizyolojik Kayıt için Tam Hücre Yama Kelepçesi Oluşturulması

Biz omurgasız koku yolunun ilk üç aşamada koku-uyarılmış yanıtlar karakterize etmek ekstraselüler çoklu ünite kayıt tekniği varyasyonları göstermektedir. Bu teknikler kolayca başka sinir sistemlerinin topluluk etkinliği incelemek için adapte edilebilir.

Locust Sinir Aktivitesi Karakterize Multi-ünite Kayıt Yöntemleri (<em&gt; Schistocerca Americana</em&gt;) Olfaktör Devreler

Korunan Anatomik Örgütü ile bozulmamış Fare Burun Doku hazırlamak için etkili bir Manuel kemik sıyırma Yöntemi

Koku alma duyusal nöronlarının kirpikleri, sinyal iletim kaskadının proteinlerini içerir, ancak kriyoseksiyonlarda dağılımlarının ayrıntılı bir uzamsal analizi zordur. Burada, siliyer proteinlerin tüm montaj etiketlemesi ve yüz görselleştirmesi için optimize edilmiş bir yaklaşımı açıklıyoruz.

Fareler Ana Koku Sistemde Cilia Whole Dağı Etiketleme

Burada, tüm hücre yama-klemp kayıtlarını kullanarak fare vomeronazal organının akut koronal doku dilimlerinde tanımlanmış bir duyusal nöron popülasyonunun tanımlanmasına ve derinlemesine analizine izin veren fizyolojik bir yaklaşımı açıklıyoruz.

Fare Vomeronazal Organ Akut Doku Dilimleri Tanımlı hücre popülasyonlarının derinlemesine Fizyolojik Analizi

Işlev propil reseptörlerinin karakterize vazgeçilmez bir parçası deorphanization süreç içinde hizmet vermektedir. Biz gerçek zamanlı bir kamp tahlil kullanarak propil reseptörleri aktivasyonu ölçmek için bir yöntem açıklanmaktadır.

Canlı hücre ölçüm propil reseptörü harekete geçirmek kullanımı gerçek zamanlı bir kamp tahlil

Koku duyu nöronları, uygun sinirsel devreleri oluşturmak için çok çeşitli akson sıralama moleküllerini ifade eder. Bu protokol, olfaktör duyu nöronlarının akson ucunda akson sıralama moleküllerinin kombinatoryal ifadelerini görselleştirmek için bir immünohistokimyasal boyama yöntemi tarif eder.

Koku Meşfatının Olfaktör Duyusal Akson Moleküler Kimlik Kodlarının Görselleştirilmesi İçin Dörtlü İmmün Sulanması

Öğrenin, fare koku duyu nöronlarının zar özelliklerini delikli patch-kelepçe tekniğiyle ölçmeyi. Bu yöntem, belirli koku reseptörlerinin işlevsel analizini ve hücresel düzeyde koku işleme mekanizmalarının anlaşılmasını sağlar.

Bozulmamış neuroepithelium Fare Koku Duyu Nöronlar Delikli Patch-kelepçe Kayıt: Bir Belirlenen Odorant Reseptör ifade Nöronlar Fonksiyonel Analiz (Video) | JoVE Journal

Bozulmamış neuroepithelium Fare Koku Duyu Nöronlar Delikli Patch-kelepçe Kayıt: Bir Belirlenen Odorant Reseptör ifade Nöronlar Fonksiyonel Analiz

Daha fazla video keşfet