Bozulmamış neuroepithelium Fare Koku Duyu Nöronlar Delikli Patch-kelepçe Kayıt: Bir Belirlenen Odorant Reseptör ifade Nöronlar Fonksiyonel Analiz

Bu prosedürün genel amacı, koku uyarıcılarına yanıt olarak koku alma duyu nöronlarının zar özelliklerindeki değişiklikleri ölçmektir. Bu, önce koku alma epitelinin diseke edilmesi ve perfüze edilmiş bir odaya aktarılmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım, mikroskop altında ilgilenilen bir OSN'yi bulmak ve seçmektir.

Seçilen OSN'nin dendritik topuzu daha sonra koku vericilerle uyarılırken yama klemplenir ve analiz edilir. Sonuç olarak, OSN dendritik düğmelerinin delikli yama kenetlenmesi, membran seviyesinde OSN fonksiyonel özelliklerini karakterize eder. Bu yöntem, koku alma, duyusal nöronların kaydedilmesi, tanımlanmış koku sanatı reseptörlerinin ifade edilmesi ve ayrıca yama kelepçesi kayıtları gibi koku alma alanlarındaki temel soruların ele alınmasına yardımcı olabilir.

Bu nöronların zar özellikleri hakkında bilgi verin. Uyarıcı pipetleri bir milimetre camdan hazırlayın veya bir alev kullanılarak önceden çekilmiş olarak satın alın. Altı pipeti uçtan yaklaşık bir santimetre 45 derecelik bir açıyla bükün.

Ardından, altı bükülmüş uçlu pipeti, bir deliği kılavuz olarak kullanarak yedinci bir düz pipetin etrafına yerleştirin ve bunları ısıyla daralan makarona sarın. Pipetlerin diğer ucundaki shrink filmi ısıtın. Daha fazla shrink ambalaj uygulayın.

Bu, prepo yedi namlulu uyarıcı bir pipet yapar. Şimdi çok namlulu bir polar kullanarak yedi namlulu uyarıcı pipeti çekin. Çekildikten sonra, deliğin etrafına biraz beyaz yapıştırıcı ile tertibatı güçlendirin.

Daha sonra tutkalın gerekli çözeltilerden gece boyunca kurumasına izin verin. Nystatin çözeltisi kullanılmadan hemen önce taze hale getirilmelidir. Gerektiğinde, üç miligram Nystatin'i tartın ve 50 mikrolitre DMSO'ya ekleyin.

Ardından karışımı 20 saniye boyunca girdaplayın. Daha sonra, tam bir seyreltme sağlamak için karışımı iki ila üç dakika boyunca sonikleştirin. Şimdi beş mililitre hücre içi stok çözeltisine 20 mikrolitre karışım ekleyin.

Vortex'in 20 saniye boyunca karışımı, ardından iki ila üç dakikalık sonikasyon. Daha sonra çalışma solüsyonunu buz üzerinde soğutun ve hazırlanmış ışıktan koruyun. Bu şekilde çalışma çözümü birkaç saat için iyidir.

Çalışma solüsyonu ile mikrofilm donanımlı bir şırınga yükleyin. Kullanılana kadar bir saatlik kullanım için iyi olacaktır. Ancak, yüklü şırıngayı buz üzerinde tutarak koruyun.

Şimdi uzun boyunlu ve iki mikron açıklıklı bazı kayıt elektrotlarını çekin. Amaç, Nystatin çözeltisi ile yüklendikten sonra 15 ila 20 mega ohm'luk bir direnç elde etmektir. Son olarak, uyarıcı pipeti zil sesinde seyreltilmiş koku verici ile yükleyin. Çözüm.

Bu protokol için, iki ila dört haftalık fareler bulundurun. Bu sunumda, fareleri ifade eden fareler veya IRES tau GFP fareleri kullanılarak veya IS tau GFP fareleri kullanılarak kullanılmıştır. İlgilenilen veya ifade eden tüm nöronlar GFP ile etiketlenecektir.

Bu yöntem tüm bölgeler için kullanılabilir veya tüm bölgelerde ifade edilebilir. Bununla birlikte, dorsal bölgede eksprese edilen ameliyathaneler için diseksiyonlar ve kayıtlar daha kolay olacaktır. Bir fareyi uyuşturarak ve ardından kafasını keserek başlayın.

Bu protokolün sonucu diseksiyonun kalitesine bağlıdır. Bu diseksiyon adımları mümkün olduğunca kısa ve kesin olmalıdır. Ameliyata başlamak için, sırt boyunca uzunlamasına bir kesim yapmak için diseksiyon makası kullanın.

Çıkarmak için cildi ayırın. Daha sonra alt çene boyunca kesin ve dişlere paralel bir koronal kesim yapın. Böylece üst kesici dişleri çıkarın.

Şimdi başın etrafında, gözlerin arkasında koronal bir kesim yapın, arka başı atın ve ön kısmı buz gibi soğuk halkalara aktarın. Şimdi bir diseksiyon mikroskobu altında, septumu beş ila 10 dakika içinde izole edin. Ventral taraf boyunca uzunlamasına bir kesim ile başlayın.

Daha sonra sırt kemiklerini burun boşluğunun dorsal lateral tarafı boyunca uzunlamasına kesin. Ardından, kemiklerin ve damağın çoğunu çıkarın. İzole edilmiş septumu aktarın ve epiteli oda sıcaklığında oksijenli bir zil kabına bağlayın.

Beş dakika içinde, kayıttan önce son hazırlıkları yapın. Çözelti çok sıcak olmamalıdır, aksi takdirde hazırlık zarar görmüş görünecektir. Kayıt için nöro epitele erişmek için.

İlk olarak, epiteli alttaki septumdan forseps ile soyun. Daha sonra mikro Vanna makası kullanarak, epiteli serbest bırakmak için septumun ön ucunu kesin. Şimdi vomer burun organını dikkatlice çıkarın.

Sırtına takıldığı yerden kesin. İzole edilen epitel artık mukus tarafı yukarı bakacak şekilde kayıt odasına taşınabilir. Yerleştirildikten sonra, dokuyu düzleştirmek için bir arp kullanın.

Ardından odayı dik bir mikroskoba aktarın. Nöro epiteli 40 x suya daldırma hedefi altında görselleştirirken, oda sıcaklığında taze halkalarla sürekli olarak perfüze edin. Bu durumda EGFP'yi ifade eden ilgili hücreleri aramaya başlamak için, 530 ila 550 nanometre aralığında ışık yayan hücreleri taramak için 480 nanometre ışık kullanılır.

Parlak alan altında 80 ila 160 x'te incelendiğinde hedeflenen dendritik düğmeler ve osn, destekleyici hücrelerden açıkça ayırt edilebilir olmalıdır. Şimdi elektrodu bir S statin çözeltisi ile yükleyin. Oluşan baloncukları hafifçe vurun ve elektrodu tutucuya takın.

Şimdi biraz pozitif baskı uygulayın. Beklenen direnç 15 ile 20 mega ohm arasındadır. Ardından, pozitif basıncı korurken elektrodu hücreye getirin.

Direnç yaklaşık 40 mega ohm'a yükseldiğinde, basıncı serbest bırakın ve hafif bir negatif basınç uygulayın. Bir giga conta yapılırsa, membran potansiyeli yaklaşık negatif 75 milivoltta sıkıştırılmalıdır. Artık hücre açık olduğuna göre, deneye devam edin.

Tek bir koku verici ile test etmek için gerektiğinde farmakolojik tedavilerle stimülasyon, protokoller ve perfüz uygulayın. 200 ila 500 milisaniye spontan aktivite kaydedin. Koku maddesini 500 milisaniye boyunca uygulayın ve ardından açıklanan protokolü kullanarak 10 saniyeye kadar yanıtları ölçün.

EGFP ile etiketlenmiş nöronları eksprese eden MOR 23, yamalandı ve farklı konsantrasyonlarda al ile uyarıldı. Akım kelepçesi modunda, lyal MOR 23 için bir liganddır. Alternatif olarak, hücreler voltaj kelepçesi modu altında simüle edildi.

Gerilim kelepçe modu kayıtlarında farklı karakteristikler izlenmiştir. Elektrofizyolojide maksimum genlik tepkisi kullanılarak klasik olarak gerçekleştirilen yanıtı ölçmek için, doz yanıtı hill denklemi kullanılarak çizildi. Bu sonuçlar, her OSN'nin algılama eşiği, zamansal, dinamik, dinamik aralık ve doygunluk seviyesini içeren kodlama özellikleri hakkında bilgi sağlar.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu tekniğin diseksiyon kısmı 10 ila 15 dakika içinde yapılabilir. Bu videoyu izledikten sonra, farelerde tanımlanmış koku reseptörlerini ifade eden koku alma duyu nöronlarının fonksiyonel özelliklerini nasıl keşfedeceğinizi iyi anlamış olmalısınız.