Stereotaktik Enjeksiyon Tekniği uygulamak Hayvan Davranışları üzerinde Genetik Etkileri Eğitim için

Bu prosedürün genel amacı, bir hedef bölgedeki bir genin ekspresyonunun modüle edilmesinin hayvan davranışını nasıl etkilediğini değerlendirmektir. Bu, önce hedef genin ekspresyonunu modüle etmek için bir lentivirüs oluşturularak gerçekleştirilir. İkinci adım, lentivirüsü ER kemirgeninin belirli bir beyin bölgesine enjekte etmek için stereotaktik enjeksiyon kullanmaktır.

Anksiyete ve depresyon gibi sonraki davranışlar, yerleşik davranışsal paradigmalar kullanılarak nicel olarak ölçülebilir. Son adım, doğru enjeksiyon bölgesini doğrulamak için histoloji yapmaktır. Sonuç olarak, davranışsal değerlendirme ile eşleştirilmiş stereotaktik enjeksiyon, bir hedef alandaki belirli bir genin fare davranışlarını nasıl etkileyebileceğini gösterebilir.

Bu tekniğin mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, bilim adamlarının hedeflenen küçük bir alanda tek bir genin ekspresyonunu değiştirebilmeleri ve daha sonra farelerdeki davranış değişikliklerini değerlendirebilmeleridir. Bu işleme başlamak için, stereotaktik aparata anestezi uygulanmış bir fare yerleştirin, ön dişleri ön kelepçeye sabitleyin ve çeneyi sabitleyin. Ardından, kafayı tamamen stabilize etmek için kulak çubuklarını kulak kanallarına yerleştirin.

Ardından, vücut ısısını düzenlemek için farenin altına bir ısıtma yastığı yerleştirin. İşlem boyunca, kurumayı önlemek için kemirgenin gözlerine suni gözyaşı yerleştirin. Bundan sonra, önce %10 povidon iyotu bir pamuklu çubukla dairesel hareketlerle ovalayarak cerrahi alanı iyice temizleyin.

Daha sonra cerrahi bölgeye% 70 etil alkolü aynı şekilde sürün. Bu temizleme işlemini iki kez daha tekrarlayın. Fare hazırlandıktan sonra steril ekipman çantasını açın.

Aletlere dokunmadan önce eldivenleri değiştirin. Daha sonra steril bezi çıkarın ve aletleri bezin üzerine yerleştirin. Şimdi farenin derisini kan ucu forseps ile nazikçe kavrayın ve bir neşter kullanarak kesi yapın.

Kesiye kulakların yaklaşık 1,5 santimetre yukarısından başlayın ve bgma'yı ortaya çıkarmak için kulakların yaklaşık 0,5 santimetre altına kadar uzatın. BGMA görüntülendikten sonra, kafatasının yüzeyini kaplayan kanı nazikçe çıkarmak için steril bir pamuklu uç kullanın. Ardından cildi başın yanlarına doğru itmek için iki pamuklu uç kullanın.

Daha sonra, davlumbazda, enjekte edilecek virüsle bir şırınga doldurun. İçeride kabarcık sıkışmadığından emin olun. Ardından, tamamen sabitlendiğinden emin olarak stereotaktik aparata bir şırınga yerleştirin.

Bundan sonra, şırıngayı kafatasının yüzeyinin hemen üzerine gelene kadar yavaşça indirin. Ardından steril şırınga iğnesinin ucunu B bgma ile kırsal kesimdeki hattın kesişme noktasına getirin. Bu noktayı sıfır olarak ayarlayın.

Daha sonra ilgilenilen alanın koordinatlarını ayarlayın. Şırınganın iğnesini delinecek hedef bölgeye hareket ettirin. Ardından matkap ucunu kafatasına 45 derecelik bir açıyla hedef bölgenin hemen üzerine yerleştirin ve delmeye başlayın.

Kortikal hasarı önlemek için beyni delmemeye dikkat edin. Bundan sonra, steril bir pamuklu uçla delikteki kanı temizleyin. Şırıngayı, ucu beynin yüzeyine tam oturacak şekilde indirin.

DV koordinatını sıfıra ayarlayın, ardından şırıngayı istenen derinliğe indirin. Şimdi enjeksiyonu dakikada 0.2 mikrolitre hızında başlatın. Enjeksiyon bittikten sonra, artık virüsün emildiğinden emin olmak için yaklaşık iki dakika bekleyin.

Sonra yavaşça bir şırınga kaldırın. Enjeksiyon bölgesindeki sıvıyı temizlemek için pamuklu bir uç kullanın. Daha sonra cildi dikin ve hayvanı stereotaktik sistemden çıkarın.

Fareyi uyanana kadar ısıtma yastığının üzerinde tutun ve gerektiğinde ek analjezik uygulayın. Bu prosedürde, plastik bir kare arena elde edin. Deneyden önce arenayı %70 etil alkol ile temizleyin.

Ardından arenayı yere yerleştirin ve aydınlatmanın gölgeleri ve parlamayı en aza indirecek şekilde ayarlandığından emin olun. Ardından, algılama ayarlarını fare ekranda görünecek şekilde ayarlayın. Bundan sonra, davranışsal görevi kaydetmek için kamerayı açın ve fareyi duvara bakacak şekilde arenanın orta önüne doğru yerleştirin.

Zamanlayıcıyı beş dakikaya ayarlayın ve arenadan uzaklaşın veya odadan çıkın. Beş dakika sonra fareyi tekrar kafese aktarın. Bir sonraki hayvana geçmeden önce alanı iyice temizlemek için %70 etil alkol kullanın.

Şimdi iki litrelik şeffaf bir kovayı 22 derecede suyla doldurun. Kovayı yere yerleştirin ve aydınlatmanın gölgeleri ve parlamayı en aza indirecek şekilde ayarlandığından emin olun. İzleme yazılımı kullanıyorsanız, kamerayı doğrudan kovanın üzerine yerleştirin.

Yazılım ayarlarını, farenin ekranda kolayca görülebileceği şekilde ayarlayın. Ardından davranışsal görevi kaydetmek için kamerayı açın. Fareyi yavaşça su kovasının ortasına, ön ayakları olacak şekilde yerleştirin.

Önce suya dokunun ve başının suya batmasını önleyin. Daha sonra, davranış alanından uzaklaşmadan önce zamanlayıcıyı altı dakikaya ayarlayın. Altı dakika sonra fareyi kovadan çıkarın, fazla suyu silin ve tekrar kafese yerleştirin.

İşte virüsün dentat girusa başarılı bir şekilde enjekte edilmesini gösteren temsili bir beyin dilimi. Bu şekil, kontrol ve deney farelerinin yeni bir açık alanın merkezinde geçirdikleri süreyi göstermektedir. Deney fareleri, arenanın merkezinde bir anksiyete fenotipini gösteren önemli ölçüde daha az zaman harcadılar ve bu rakam, kontrol ve deney farelerinin zorunlu yüzme testinde hareketsiz kaldığı süreyi göstermektedir.

Deney fareleri, hareketsiz olarak geçirilen süre açısından kontrollerden önemli ölçüde farklı değildi. Bu videoyu izledikten sonra, izleyiciler kemirgen davranışlarını değerlendirmek için stereotaktik enjeksiyonların nasıl kullanılacağı konusunda iyi bir fikre sahip olmalıdır.