Name: Zebra balığı Larva Görsel Tepki Elektroetinogram Analizi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: Öğrenin zebra balığı larvalarında elektroretinografi analizi yaparak görsel fonksiyonu in vivo değerlendirme yöntemini. Bu teknik, retina elektrofizyolojisi ve görsel gelişim araştırmaları için güvenilir bir yaklaşım sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

UNC Zebra Balığı Su Ürünleri Yetiştiriciliği tesisi üyelerine zebra balığının bakımı için teşekkür ederiz. ERG cihazının kurulumuna yardımcı olduğu için Diagnosys, LLC'ye de teşekkür ederiz. Elektrofizyolojik yöntemler konusunda yardım için Dr. Portia McCoy'a ve Dr. Ben Philpot'un laboratuvarına ayrıca teşekkür ederiz. Ayrıca Lizzy Griffiths'e larva zebra balığı illüstrasyonu için teşekkür etmek istiyoruz. Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri ödülleri F32 EY022279 (JDC'ye) ve R21 EY019758 (ERW'ye) tarafından desteklenmiştir.

Hayvan bakım ve deneysel protokolleri Chapel Hill&#39;deki North Carolina Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komiteleri tarafından onaylanmış ve Laboratuar Hayvan Refahı NIH Ofisi ve Değerlendirme ve Laboratuar Hayvan Bakımı International Akreditasyon Derneği tüm gereksinimlerini karşılamak bulundu. NOT: Standart Zebra balığı yetiştiriciliği ve bakım için ERG analizi için larvaları elde etmek için, yayınlanmış protokoller 18 kullanılmıştır. Larva doğal yetiştirme yoluyla elde edilen ve 14 saat ışık / 10 saat karanlık döngüsü altında muhafaza edilir. Bu protokol sonrası fertilizasyon (dpf) 5-7 gün larvaları için optimize edilmiştir, ancak ideal prosedüre küçük değişiklikler ile eski balık yapılabildi. Burada, 5 dpf&#39;e yabani tip Zebra balığı larvalarının TL gerginlik kullanın. 1. Mikropipet Üretim <ol><li> Yangın cilalı borosilikat cam kılcal 1.5 x 0.86 mm (iç çapı ile dış çapı) kullanarak birkaç mikropipetler çekinFilament (821 ° C, erime sıcaklığı) ve P-97 Flaming / Brown Mikropipet Çektirme kutusu ısı filament ile donatılmış. Tablo 1&#39;de açıklanan mikropipetler fashioning için programı kullanın. </li><li> Ipuçları çapı 10-15 mikron olmasını sağlamak için uygun bir graticule cetvelle bir mikroskop altında her mikropipet kontrol edin ve düzgün bir ucu açıklığı (yani, hiçbir pürüzlü kenarlar) sahiptir. </li><li> Dikkatle toz ucu hasarı ve maruziyetini önlemek için mikropipetler saklayın. Depolama seçenekleri laboratuvar bant, köpük kaplı kutulara ya da ticari olarak temin edilebilir mikropipet depolama kapları ile Petri kapları bulunmaktadır. Not: diğer mikropipet çekiciler ve cam kılcal kısımların doğru mikropipet çaplı, yüksek kaliteli bir uç elde edildiği sürece kullanılabilir. </li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Basınç </td><td> Isı </td><td> Çek </td><td> Hız </td&gt; <td> Zaman </td></tr><tr><td> 500 </td><td> 560 </td><td> - </td><td> 30 </td><td> 200 </td></tr><tr><td> 500 </td><td> 450 </td><td> - </td><td> 30 </td><td> 200 </td></tr><tr><td> 500 </td><td> 410 </td><td> 55 </td><td> 40 </td><td> 200 </td></tr></tbody></table> Tablo 1: Bir kutu sıcaklık filaman ile donatılmış, bir P-97 alevlenebilirlik / kahverengi bir Mikropipet çekici kullanılarak mikropipetler üretimi için program Mikropipetler filamanlı yangın parlatılmış borosilikat cam kılcal 1,5 x 1,0 mm 2 (iç çapı ile dış çapı) kullanılarak yapılır. (erime sıcaklığı 821 ° C). 2. Tampon hazırlama <ol><li> Mikroelektrot kılcal, oksijenli goldfish Ringer tampon 19 süzülür kullanın ve larva deneyler için yerleştirildiği üzerine polivinil alkol (PVA) sünger doyurmak için. Seçenek olarak ise, E3 kullanımı<html> embriyo medya veya Hank&#39;in Dengeli Tuz Çözeltisi. </li><li> PH değeri 7.8 ayarlayın ve bir 0.22 um filtre kullanılarak sterilize edildi ve 4 ° C&#39;de 10 x stok saklamak Tablo 2&#39;de tarif edildiği gibi 10x balığı Ringer çözeltisi hazırlayın. </li><li> Iyonu giderilmiş, damıtılmış su ile 1x, 10x Ringer çözeltisinin, deney gününde çalışma çözeltisi oluşturmak. 0.22 mikron filtre sistemini kullanarak Filtre. 10 dakika boyunca% 95 O ile 2/5% CO2 gazı geçirilmesi yolu ile oksijenat. Sıkıca sonradan Cap çözümü oksijenli kalmasını sağlamak için. </li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> NaCl </td><td> 1.25 M </td></tr><tr><td> KCI </td><td> 26 mM </td></tr><tr><td> CaCl2 </td><td> 25 mM </td></tr><tr><td> MgCI2 </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> glikoz </td><td> 100 mM </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 100 mM </td></tr></tbody></table>jove_content &quot;&gt; Tablo 2: 10x balığı Ringer çözeltisinin hazırlanması. 3. Elektroetinogram Platformu <ol><li> Sinyal gürültü oranı artırmak için bir Faraday kafesi içinde bir anti-vibrasyon masaya ERG deneyleri. Altıgen somunları kullanılarak anti-vibrasyon masaya özel bir çelik platformu takın. Işık kaynağı altında masaya bir viskoelastik üretan polimer şok emici alt ile bir hareketli plastik platformu yerleştirin. </li><li> Hareketli plastik platformu aşağı amaçlayan bir manyetize standı ile kamera yerleştirin. Hareketli plastik platformunun sağ ikinci manyetize stand ile (kayıt mikroelektrot yapacak) mikromanipülatör yerleştirin. Kamera ve mikromanipülatör diğer ekipmanların hareketi tarafından rahatsız olmayacak ve onlar ışık kaynağından aydınlatmayı bloke etmediğinden emin olun. </li><li> Bir video monitöre bağlayın ve göz görüntülemek için konumlandırmakUygun pozisyonda elektrot yerleştirmek için larva. </li><li> Kurulum düzgün bakır tel ile topraklı emin olun. Gürültü kontrol etmek, Ringer solüsyonu ile dolu bir 35 mm Petri kabındaki kayıt mikroelektrot referans elektrodu ve bahşiş yerleştirin. Bir osiloskop veya ERG aygıtının dahili özelliği ile kurulum elektrik gürültü seviyelerini kontrol edin. Gürültü seviyeleri başlangıçtan itibaren en fazla ± 10 mV olmalıdır. </li></ol> 4. Sünger Hazırlık <ol><li> 35 mm&#39;lik bir Petri tabağına sıkıca oturacak ve kuru PVA sünger küçük bir dikdörtgen kesin. sünger mm çanak derinliğinden daha büyük olmamalıdır. Kesim için temiz bir jilet ile bir maket bıçağı kullanın. </li><li> (Sünger alt veya daha küçük uçlarından biri aracılığıyla dikey kesilmiş bir kelebeğin üzerinde uzunlamasına ya sığ kesim) referans elektrot yerleştirmek için sünger içine ek bir kesim olun. </li><li> Bir kimyasal dirençli işaretleyici kullanınkamerayı konumlandırılması için kullanılabilen bir sünger (larva yerleştirileceği yerde) küçük bir nokta işaretleyin. </li><li> Doyana kadar Ringer solüsyonu PVA sünger batırın. 2-3 kez kaldırın ve bir kağıt havlu üzerine hızla kurulayın. Temiz bir 35 mm Petri kabı içinde sünger yerleştirin. </li><li> Işareti kamera tarafından görüntülendi edilecek şekilde plastik platform üzerinde sünger içeren Petri kabı yerleştirin. </li></ol> 5. Elektrot Hazırlanması Not: zebra balığı kurulum Ringer çözeltisi doymuş PVA sünger ve kornea ile temas halinde bir kayıt elektrotu ile temas halinde olan bir referans elektrot içermektedir. Referans elektrodu, bir Ag / AgCİ pelet oluşur. Kayıt elektrot Ag tel içeren bir mikroelektrot sahibi tarafından Ringer solüsyonu ile doldurulmuş ve tutulan bir çekti cam mikropipet olduğunu. <ol><li> 5 dakika (kayıt micr için% 6-9 sodyum hipoklorit (çamaşır suyu) onları iliklerine elektrotlar Kloritlereoelectrode tel) veya 15 dakika (referans elektrot). 5 dakika boyunca bir Kimwipe Hava kuru. <ol><li> Adım 4.2 yapılan kesme tarzı bağlı olarak, sünger (alt uzunlamasına sığ kesim için) (dikey kelebek kesim için) veya altında içine referans elektrot Ag / AgCl pelet yerleştirin. Kayıt sistemine referans elektrot kurşun takın. </li><li> ERG kurulum alanı kısıtlamaları vardır veya Ag / AgCl elektrot gelen özellikle güçlü fotovoltaik eserler varsa Alternatif, ışık yolu dışına elektrodu taşımak için bir agar tuz köprüsü üzerinden sünger referans elektrodu bağlayın. </li></ol></li><li> 5 ml olmayan Luer kilit şırınga ile ~ uygun büyüklükte boru 40 cm takın. Ringer solüsyonu ile şırınga doldurun. Basınç noktaları genelde adaptörleri ile gemi sahip Mikroelektrod sahipleri, &quot;3/32&quot; 1/8 1/16 iç çapları boru karşılamak &quot;veya 5/32&quot; için. </li><li> Ile 1 ml olmayan Luer kilit şırınga doldurunMikro-fil ile Ringer çözeltisi ve dikkatlice mikroelektrot tutucu doldurun. Kabarcıklarının oluşmasını önlemek. </li><li> Boru ile Mikroelektrot sahibinin basınç portuna 5 ml şırınga takın ve mikroelektrod sahibi Ringer solüsyonu ile dolu olmasını sağlamak için kullanabilirsiniz. Ringer solüsyonu ile dolu mikro-fil ve 1 ml şırınga kullanarak, ucundan mikropipet cam doldurmak ve hiçbir kabarcıklar mevcut olduğundan emin olun. </li><li> Elektrot tel düz tutmak için dikkatli olmak, mikroelektrod tutucu cam mikropipet takın. Bir kez, güvenli çözümün küçük bir miktar ucunda görünür oluncaya kadar dikkatle mikroelektrot yoluyla Ringer çözeltisi zorlamak için 5 ml şırınga kullanın. Mikropipet ucu, toz ya da tuz birikimine bağlı, hava kabarcıkları ve aynı zamanda oklüzyonu oluşumunu önler (kornea yok) şırıngaya basınç sıra uygulaması. <ol><li> Çözüm akışı olarak çıkarsa, g değiştirinlass mikropipet ucu açıklığı çok büyük ya da zarar görmüş gibi. </li></ol></li><li> Dikkatle mikromanipülatör kayıt mikroelektrot yerleştirin ve kayıt sistemine kurşun takın. </li></ol> 6. Elektroetinogram Analizi NOT: Kayıt için hazırlıklar dolaylı beyaz ışığın düşük seviyelerde altında yapılan zaman larva retinanın koni egemenliğine, yüksek kaliteli ERG sonuçlar elde edilebilir dolayı (&lt;1 lux) veya kısa süreler yüksek yoğunlukta (&lt;1 dakika) ( ≤250 lux) çalışma ışığı. Karanlık adaptasyonu kısa süre hala kayıt önce gerekli (adım 6.7 bakınız). Bununla birlikte, deneyler, kızılötesi duyarlı kamera kullanılarak loş, kızıl ötesi ışık altında gerçekleştirilebilir. Bütün deneyler, UNC balığı su ürünleri yetiştiriciliğinde bünyesinden filtre ile sterilize edilmiş (0.22 um) sistemi su yapıldı, ancak alternatif bir embriyo ortam da kullanılabilir. <ol><li> Yaklaşık 1 ölçme Kes kağıt havlu karelercm 2. </li><li> Izole edilmiş bir koni kütle reseptör potansiyelinin ölçümü ise, 5 dakika boyunca, 500 uM, (±) -2-Amino-4-fosfonobütirik asit (APB) sistem suda 3-5 larva inkübe edilir. Not: APB bir aktif (L) &#39;in rasemik karışımı AP4 inaktif (R) form iken, L-AP4 kadar etkili olduğu ve daha az pahalıdır. </li><li> % 0.02 yanıt vermeyen, yaklaşık 1-2 dakika kadar (ağırlık / hacim) Tricaine sistem suda 3-5 larva anestezisi. </li><li> Dikkatli bir şekilde en az bir aydınlatma (&lt;1 dakika boyunca ≤250 lux) ile bir kesme Stereoskop altında kağıt havlu kareleri üzerine tek tek larvalar aktarmak için bir Pasteur pipeti ve pipet pompası kullanın. Her larva konumunu kontrol edin ve bir kapatılmamış gözle dorsal yüzü yukarı bir aday seçmek. <ol><li> Genişletilmiş kayıtları (&gt; 30 dk) için, vücut kadar cam ama ince deve tüyü fırça kullanarak% 3 metilselüloz ile baş dahil değil tarafından nemli larva tutun. </li></ol></li><li> Forseps kullanarak, kağıt havlu squar transferinemli PVA sünger larva e. <ol><li> Genişletilmiş kayıtları (&gt; 30 dk) için, damıtılmış su ihtiva eden bir yan kol şişede airstone üzerinden gaz kabarcıkları geçirmek suretiyle larva üzerinde su ile doyurulmuş% 100 O2 gazı sürekli bir akış uygulanır. Larvaların kafasının yakınında nemlendirilmiş oksijen taşır şişe yan kol çıkan boru yerleştirin. NOT: Adım 6.4.1 ve 6.5.1 adım balık 16 ömrünü uzatacaktır. </li></ol></li><li> Minimal aydınlatma altında, burun ve göz kaudal uçları arasında orta noktada mikroelektrod ucu konumlandırmak için mikromanipülatör ve kamera kullanımı ve korneanın dorsal sınırı üzerine yavaşça bastırın. Not: kornea kadar uzak bölgelere elektrot ucu yanlış yerleştirilmesi ters polarite ERG dalga formları ile sonuçlanabilir. </li><li> Için larva 5-10 dakika karanlık adapte izin verin. </li><li> Lanılabilir kullanarak bir LED ışık kaynağı ya da optik stimülatör sağlanan ışık rekor testi flaş yanıtlarıetikel stimülasyon ve kayıt cihazları. Flash yoğunluğu, flaş uzunluğu, flaş rengi, arka plan yoğunluğu ve deney uygun renkli ve filtre ayarları gibi protokol parametrelerini ayarlayın. </li><li> Deney ile bittiğinde, AVMA / IACUC kurallarına göre larva euthanize. </li></ol>

<ol><li>Dowling, J. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDowling%2C+JE+%22The+retina%3A+an+approachable+part+of+the+brain%22">The retina: an approachable part of the brain</a>. , Harvard University Press. Cambridge, MA. (1987).</li>
<li>Makhankov, Y. V., Rinner, O., Neuhauss, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+inexpensive+device+for+non-invasive+electroretinography+in+small+aquatic+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">An inexpensive device for non-invasive electroretinography in small aquatic vertebrates.</a> J Neurosci. Methods. 135, 205-210 (2004).</li>
<li>Wu, J., Peachey, N. S., Marmorstein, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-evoked+responses+of+the+mouse+retinal+pigment+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Light-evoked responses of the mouse retinal pigment epithelium.</a> J Neurophysiol. 91, 1134-1142 (2004).</li>
<li>Heckenlively, J. R., Arden, G. B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHeckenlively%2C+JR+%22Principles+and+Practice+of+Clinical+Electrophysiology+of+Vision%22">Principles and Practice of Clinical Electrophysiology of Vision</a>. , 2nd edn, The MIT Press. Cambridge, MA. (2006).</li>
<li>Perlman, I. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPerlman%2C+I+%22Webvision%3A+The+Organization+of+the+Retina+and+Visual+System%22">Webvision: The Organization of the Retina and Visual System</a>. Kolb, H., Nelson, R., Fernandez, E., Jones, B. , (1995).</li>
<li>Fadool, J. M., Dowling, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish%3A+a+model+system+for+the+study+of+eye+genetics%5BTitle%5D)+AND+%22ProgRetin.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Zebrafish: a model system for the study of eye genetics.</a> ProgRetin. Eye Res. 27, 89-110 (2008).</li>
<li>Doerre, G., Malicki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+photoreceptor+cell+development+in+the+zebrafish+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Dev%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of photoreceptor cell development in the zebrafish retina.</a> Mech. Dev. 110, 125-138 (2002).</li>
<li>Brockerhoff, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+stimulates+a+transducin-independent+increase+of+cytoplasmic+Ca2%2B+and+suppression+of+current+in+cones+from+the+zebrafish+mutant+nof%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Light stimulates a transducin-independent increase of cytoplasmic Ca2+ and suppression of current in cones from the zebrafish mutant nof.</a> J Neurosci. 23, 470-480 (2003).</li>
<li>Rinner, O., Makhankov, Y. V., Biehlmaier, O., Neuhauss, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knockdown+of+cone-specific+kinase+GRK7+in+larval+zebrafish+leads+to+impaired+cone+response+recovery+and+delayed+dark+adaptation%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Knockdown of cone-specific kinase GRK7 in larval zebrafish leads to impaired cone response recovery and delayed dark adaptation.</a> Neuron. 47, 231-242 (2005).</li>
<li>Harada, T., Harada, C., Parada, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+regulation+of+visual+system+development%3A+more+than+meets+the+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Molecular regulation of visual system development: more than meets the eye.</a> Genes Dev. 21, 367-378 (2007).</li>
<li>Branchek, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+photoreceptors+in+the+zebrafish%2C+brachydaniorerio.+II.+Function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">The development of photoreceptors in the zebrafish, brachydaniorerio. II. Function.</a> J Comp Neurol. 224, 116-122 (1984).</li>
<li>Schmitt, E. A., Dowling, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+retinal+development+in+the+zebrafish%2C+Daniorerio%3A+light+and+electron+microscopic+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Early retinal development in the zebrafish, Daniorerio: light and electron microscopic analyses.</a> J Comp Neurol. 404, 515-536 (1999).</li>
<li>Bilotta, J., Saszik, S., Sutherland, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rod+contributions+to+the+electroretinogram+of+the+dark-adapted+developing+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Rod contributions to the electroretinogram of the dark-adapted developing zebrafish.</a> Dev Dyn. 222, 564-570 (2001).</li>
<li>Wong, K. Y., Adolph, A. R., Dowling, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+bipolar+cell+input+mechanisms+in+giant+danio%5BTitle%5D)+AND+%22I.+Electroretinographic+analysis.+J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Retinal bipolar cell input mechanisms in giant danio.</a> I. Electroretinographic analysis. J Neurophysiol. 93, 84-93 (2005).</li>
<li>Nelson, R. F., Singla, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+spectral+model+for+signal+elements+isolated+from+zebrafish+photopicelectroretinogram%5BTitle%5D)+AND+%22Vis+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A spectral model for signal elements isolated from zebrafish photopicelectroretinogram.</a> Vis Neurosci. 26, 349-363 (2009).</li>
<li>Korenbrot, J. I., Mehta, M., Tserentsoodol, N., Postlethwait, J. H., Rebrik, T. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EML1+%28CNG-modulin%29+controls+light+sensitivity+in+darkness+and+under+continuous+illumination+in+zebrafish+retinal+cone+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">EML1 (CNG-modulin) controls light sensitivity in darkness and under continuous illumination in zebrafish retinal cone photoreceptors.</a> J Neurosci. 33, 17763-17776 (2013).</li>
<li>Gurevich, L., Slaughter, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+waveforms+of+the+ON+bipolar+neuron+and+the+b-wave+of+the+electroretinogram%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Res%22%5BJournal%5D)">Comparison of the waveforms of the ON bipolar neuron and the b-wave of the electroretinogram.</a> Vision Res. 33, 2431-2435 (1993).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+Zebrafish+Book%3A+A+guide+for+the+laboratory+use+of+zebrafish+%28Daniorerio%29%22">The Zebrafish Book: A guide for the laboratory use of zebrafish (Daniorerio)</a>. , 5th edn, University of Oregon Press. Portland, OR. (2007).</li>
<li>Kim, D. Y., Jung, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gap+junction+contributions+to+the+goldfish+electroretinogram+at+the+photopic+illumination+level%5BTitle%5D)+AND+%22Korean+J+PhysiolPharmacol%22%5BJournal%5D)">Gap junction contributions to the goldfish electroretinogram at the photopic illumination level.</a> Korean J PhysiolPharmacol. 16, 219-224 (2012).</li>
<li>Brockerhoff, S. E., Dowling, J. E., Hurley, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+retinal+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Res%22%5BJournal%5D)">Zebrafish retinal mutants.</a> Vision Res. 38, 1335-1339 (1998).</li>
<li>Naka, K. I., Rushton, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((S-potentials+from+colour+units+in+the+retina+of+fish+%28Cyprinidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">S-potentials from colour units in the retina of fish (Cyprinidae).</a> J Physiol. 185, 536-555 (1966).</li>
<li>Naka, K. I., Rushton, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((S-potentials+from+luminosity+units+in+the+retina+of+fish+%28Cyprinidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">S-potentials from luminosity units in the retina of fish (Cyprinidae).</a> J Physiol. 185, 587-599 (1966).</li>
<li>Shao, X. M., Feldman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-agar+salt+bridge+in+patch-clamp+electrode+holder+stabilizes+electrode+potentials%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Micro-agar salt bridge in patch-clamp electrode holder stabilizes electrode potentials.</a> J Neurosci. Methods. 159, 108-115 (2007).</li>
<li>Brockerhoff, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+behavioral+screen+for+isolating+zebrafish+mutants+with+visual+system+defects%5BTitle%5D)+AND+%22ProcNatlAcadSci.+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A behavioral screen for isolating zebrafish mutants with visual system defects.</a> ProcNatlAcadSci. U S A. 92, 10545-10549 (1995).</li>
<li>Fleisch, V. C., Jametti, T., Neuhauss, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroretinogram+%28ERG%29+Measurements+in+Larval+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+protocols%22%5BJournal%5D)">Electroretinogram (ERG) Measurements in Larval Zebrafish.</a> CSH protocols. , (2008).</li>
<li>Seeliger, M. W., Rilk, A., Neuhauss, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ganzfeld+ERG+in+zebrafish+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Doc+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Ganzfeld ERG in zebrafish larvae.</a> Doc Ophthalmol. 104, 57-68 (2002).</li>
<li>Kainz, P. M., Adolph, A. R., Wong, K. Y., Dowling, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lazy+eyes+zebrafish+mutation+affects+M%C3%BCller+glial+cells%2C+compromising+photoreceptor+function+and+causing+partial+blindness%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Lazy eyes zebrafish mutation affects Müller glial cells, compromising photoreceptor function and causing partial blindness.</a> J Comp Neurol. 463, 265-280 (2003).</li>
<li>Lewis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Celsr3+is+required+for+normal+development+of+GABA+circuits+in+the+inner+retina%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS.+genetics%22%5BJournal%5D)">Celsr3 is required for normal development of GABA circuits in the inner retina.</a> PLoS. genetics. 7, e1002239(2011).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Bu protokol larva zebrafish ERG kayıtları için basit bir prosedür ayrıntılı. Akılda tutulmalıdır prosedür boyunca birçok kritik adımlar Bu prosedür görsel function.There hızlı ve kapsamlı bir tahlil için izin verir vardır. Deney potansiyel ilaç tedavileri sırasında ölümleri önlemek ve ERG kayıtları sırasında uzun süreli geçimini sağlamak için önce Zebra balığı larvaları sağlıklı olmalıdır. Buna ek olarak, bu deneylerde kullanılan larva yakın yaş uyumlu olması önemlidir. Bunun nedeni retina (koni alt tiplerinin yani,...

elektroretinogram (ERG), insanlarda retina fonksiyonunu belirlemek için klinikte yaygın olarak kullanılan bir invazif olmayan elektrofizyolojik bir yöntemdir. Bir ışık uyarısına tepki olarak elektrik aktivitesi korneanın dış yüzeyi üzerinde kayıt elektrotları yerleştirilmesiyle ölçülür. uyarıcı paradigması ve tepki dalga özellikleri yanıt katkıda retina nöronlar tanımlar. Bu yöntem, fareler ve zebrabalıkları de dahil olmak üzere, hayvan modellerinde bir çok kullanım için adapte edilmiştir. Tipik omurgalı ERG tepki dört ana bileşeni vardır: fotoreseptör hücre aktivitesi türetilmiş bir kornea negatif potansiyel bir-dalga; b-dalgası, bipolar hücrelerden AÇIK türetilmiş bir kornea-pozitif potansiyeli; D-dalgası, KAPALI bipolar hücrelerin aktivitesi olarak yorumlanır bir kornea-pozitif potansiyeli; b-dalga sonra birkaç saniye içinde gerçekleştiğini ve c-dalga, Müller glia ve ret aktivite yansıtırinal pigment epiteli 1-4. İnsanlarda ve hayvanlarda modeli ERG analiz tarihini ve ilkelerini anlamak için Ek başvurular gibi İlkeleri ve Vizyon 4, 5 Klinik Elektrofizyoloji Uygulama olarak Utah ve metinlerin Üniversitesi&#39;nden çevrimiçi ders kitabı, Webvision vardır. Danio rerio (zebra balığı) uzun nedeniyle organ sistemlerinin, davranışsal testlerin noninvaziv morfolojik analiz ve ileri hem geri ve genetik ekranlar (inceleme için, Fadool ve görmek için izin veren hızlı olgunlaşma ve şeffaflık için, omurgalı gelişimi için bir model olarak tercih edilmiştir Dowling 6). Zebra balığı larvaları, yüksek doğurganlık ile birleştiğinde, onları yüksek verimli biyolojik analizler için mükemmel bir hayvan modeli yapmak genetik ve farmakolojik manipülasyon, son derece müsait. Larva zebrabalıkları çubuklara koni yüksek oranı - yaklaşık 1: 1 farelerinde (~% 3 koni ile karşılaştırıldığındalar) - koni fonksiyonu 7-9 çalışma için özellikle kullanışlı olmasını sağlar. Gözdeki, koni çubuklar 10 önce gelişir. İlginç bir şekilde, zebra balığı koniler Bu aşamada 6, 11,12 koni seçici elektrofizyolojik analizine izin veren erken 4 dpf olarak işlemektedir. Buna karşılık, çubuklar ERG yanıtları 11 ve 21, 13 dpf&#39;e arasında görünür. Bu nedenle, 4-7 de Zebra balığı larvaları dpf&#39;e bir all-koni retina gibi fonksiyonel hizmet vermektedir. Ancak, 4-7 dpf larvaları yerli Fotopik ERG tepki b-dalgası hakimdir. (+) - - 2-amino-4-fosfono-butirik asit (L-AP4), metabotropik glutamat için bir agonist iki kutuplu hücreler üzerindeki tarafından ifade edilen (mGluR6) reseptörü, etkili bir şekilde bloke nesil L gibi farmakolojik ajanların uygulanması b-dalga ve izole koni reseptör potansiyeli kitle, (&quot;a-dalgası&quot;) 14-17 ortaya koymaktadır. Burada basit ve reliabl tarifzebra balığı larvası ile kullanım için adapte edilmiş fareler ile kullanım için tasarlanmış ticari olarak temin ERG ekipman kullanılarak ERG analizi e yöntemi. Bu sistem, görsel duyarlılık ve adaptasyona 16 katkı sinyal yollarının tanımlanması araştırmacılar yardımcı olmak için, bir genetik arka değişen, hem de farmakolojik maddeler ile tedavi gibi bir zebra balığı larva üzerinde kullanılabilir. Bu protokolde belirtilen deneysel prosedürler vizyona ilgili biyolojik soruları çeşitli cevap ERG analiz kullanımı araştırmacıları rehberlik ve esnek bir ERG kurulum inşaatı gösterecektir.

<table><tbody><tr><td>Faraday kafesi</td><td>80/20 Inc</td><td>özel</td><td>Kafes çerçevesi PVA sünger için özel tasarlanmış alüminyum "Endüstriyel Montaj Seti"</td></tr><tr><td></td><td>Amazon</td><td>B000ZOWG1C</td><td>Zebra balığı larvalarının yerleştirilmesi için yumuşak, nemli bir platform sağlar</td></tr><tr><td>150 ml Steril Filtre sistemleri</td><td>Corning</td><td>431154</td><td>Küçük eklemlerin mikropipetleri tıkamasını önlemek için filtreleme çözümleri</td></tr><tr><td>Espion E2</td><td>Diagnosys, LLC</td><td>iletişim</td><td>Herhangi bir stimülatör için görsel uyaranlar üretebilen ve özel yazılım kullanarak yanıtların dijital kaydı ve analizini yapabilen modüler elektrofizyoloji sistemi, http://www.diagnosysllc.com Colordome'da daha fazla bilgi</td></tr><tr><td></td><td>Diagnosys, LLC</td><td>kontağı</td><td>Ganzfeld ERG için RGB LED ve Xenon ışık kaynaklarına sahip ışık stimülatörü, http://www.diagnosysllc.com Micromanipulator'da daha fazla bilgi</td></tr><tr><td></td><td>Drummond</td><td>3-000-024-R</td><td>Kayıt mikroelektrodunun tutulması ve konumlandırılması</td></tr><tr><td>Manyetik halka standı</td><td>Drummond</td><td>3-000-025-MB</td><td>Kameranın ve referans elektrodunun tutulması ve konumlandırılması</td></tr><tr><td>Kurşun uzantıları</td><td>Çim Teknolojileri</td><td>F-LX</td><td>Elektrotları bağlamak için yedek dişi - erkek 1,5 mm kurşun kablolar</td></tr><tr><td>Erkek Pin - Dişi SAFELEAD Adaptörü</td><td>Çim Teknolojileri</td><td>DF-215/10</td><td>2 mm'lik pimlerin 1,5 yatak başlığı pimine bağlanması</td></tr><tr><td>Pencere ekran çerçevesi (metal) ve spline</td><td>Lowes veya Home Depot</td><td>çeşitli</td><td>Faraday kafesi çerçevesine bakır ağ takmak için</td></tr><tr><td>Steriflip 50 ml filtreler</td><td>Kırlangıç SCGP00525</td><td></td><td>Küçük eklemlerin mikropipetleri tıkamasını önlemek için filtreleme çözümleri</td></tr><tr><td>BNC adaptörü</td><td>Monoprice</td><td>4127</td><td>Kamerayı BNC kablosuna bağlama</td></tr><tr><td>BNC kablosu</td><td>Monoprice</td><td>626</td><td>Kamerayı video adaptörüne bağlama</td></tr><tr><td>Kamera lensi</td><td>Navitar</td><td>1582232</td><td>Kayıt mikroelektrodunun larva korneası üzerine konumlandırılmasının görselleştirilmesi</td></tr><tr><td>Kamera kuplörü</td><td>Navitar</td><td>1501149</td><td>Kayıt mikroelektrodunun larva korneası üzerindeki konumunun görselleştirilmesi</td></tr><tr><td>Luna BNC - VGA + HDMI Dönüştürücü</td><td>Sewell</td><td>SW-29297-PRO</td><td>BNC - VGA adaptörü, kamera görüntüsünün bilgisayar monitörüne yansıtılmasına izin verir</td></tr><tr><td>APB</td><td>Sigma</td><td>A1910</td><td>mGluR6 agonisti, izole koni kütle reseptörü potansiyelinin analizine izin veren b dalgasını bloke eder</td></tr><tr><td>Borosilikat cam</td><td>Sutter</td><td>BF-150-86-10</td><td>Ateşle cilalanmış borosilikat cam (ölçüm sıcaklığı = 821 °; C) filament ve 1,5 mm x 0,86 mm boyutları (dış çapa göre iç çap)&nbsp;</td></tr><tr><td>P97 Alevli/Kahverengi çektirme</td><td>Sutter</td><td>P97</td><td>Cam mikropipetleri çekmek için</td></tr><tr><td>Sorbotan levha</td><td>Thorlabs</td><td>SB12A</td><td>Şoku emmek ve kaymayı önlemek için Pasif İzolasyon Bağlantıları ve ERG platformunun altına yerleştirilen sentetik viskoelastik üretan polimer, boyuta göre kesilebilir</td></tr><tr><td>Breadboard</td><td>Thorlabs</td><td>B2436F</td><td>ERG stimülatörü ve zebra balığı numunesi</td></tr> <tr><td>için titreşim izolasyon platformuPasif İzolasyon Bağlantıları</td><td>Thorlabs</td><td>PWA074</td><td>Breadboard'a titreşim yalıtımı sağlar</td></tr><tr><td>Bakır örgü</td><td>TWP</td><td>022X022C0150W36T</td><td>Faraday Kafesi Pipet pompasını hizalamak için</td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>53502-233</td><td>Zebra balığı larvalarını dikkatli bir şekilde aktarmak için Pasteur pipetleriyle birlikte kullanılır</td></tr><tr><td>Pasteur pipetleri</td><td>VWR</td><td>14672-608</td><td>Zebra balığı larvalarını dikkatli bir şekilde aktarmak için Pipet pompası ile birlikte kullanılır</td></tr><tr><td>Kamera</td>: <td>Watec</td><td>WAT-902B</td>: <td>Kayıt mikroelektrodunun larva korneası</td></tr><tr><td>Trikain (MS-222)</td><td></td> üzerindeki konumunu görselleştirme: Western Chemical <td>Tricaine-S,</td><td>Farmasötik dereceli anestezik,</td></tr> <tr><td>Micro-fil</td><td>WPI</td>, <td>MF28G-5</td>, <td>Doldurma mikroelektrot tutucusu ve mikroelektrot camı</td></tr><tr>:<td>Mikroelektrot tutucu</td>, <td>WPI</td><td>MEH2SW15</td><td>Cam mikroelektrodu tutar, ERG ekipmanına bağlanır</td></tr><tr><td>Referans Elektrodu</td><td>WPI</td><td>DRIREF-5SH</td><td>Elektroliti boşaltmak ve sinterlenmiş Ag/AgCl pelet elektrodunu açığa çıkarmak için muhafazanın son santimetresini dikkatlice kırın</td></tr><tr><td>Referans Elektrot (alternatif)</td><td>WPI</td><td>EP1</td><td>DRIREF-5SH'ye alternatif. Bağlantı kablosuna kablolanması/lehimlenmesi gereken Ag/AgCl elektrodu</td></tr><tr><td>Mikroelektrot tutucu için düşük gürültülü kablo</td><td>WPI</td><td>13620</td><td>Kayıt mikroelctrode tutucusunun adaptöre/başlığa bağlanması</td></tr></tbody></table>

zebra balığı larva görsel tepki elektroetinogram analizi

Electroretinogram Analysis of the Visual Response in Zebrafish Larvae

elektroretinogram (ERG) retina fonksiyonunu belirlemek için bir noninvaziv elektrofizyolojik yöntemdir. Kornea yüzeyi üzerinde bir elektrotun yerleşimi sayesinde, elektrik aktivitesi ölçülür ve in vivo olarak retina hücrelerinin faaliyetini değerlendirmek için kullanılabilen ışığa karşılık olarak oluşturdu. Bu makale zebrabalıkları görme fonksiyonu ölçmek için ERG kullanımını tarif eder. Balığı dolayı uzun morfolino oligonükleotitler ve farmakolojik manipülasyonu ile gen bastırma kolaylığı, omurgalı gelişimi için bir model olarak kullanılmıştır. 5-10 dpf&#39;e, sadece konileri larva retinada işlevsel. Bu nedenle, zebra balığı ve diğer hayvanlarda farklı olarak, in vivo olarak koni görme fonksiyonu çalışma için güçlü bir model sistem. Bu protokol, standart anestezi, Mikromanipülasyondan ve zebra balığı araştırma yapmak laboratuvarlarda yaygın olan stereomikroskobi protokolleri kullanır. özetlenen yöntemler standart elektrofizyoloji eq faydalanmakuipment ve düşük ışık kamera larva kornea üzerine kayıt mikroelektrot yerleşimini rehberlik. Son olarak, ilk olarak farelerde kullanılmak üzere tasarlanmış bir ticari olarak temin edilebilir ERG uyarıcısı / kayıt cihazı kolayca zebrabalıkları ile kullanım için adapte edilebilir gösterilmektedir. Larva zebrabalıkları ERG bir morfolino oligonükleotid enjeksiyon ile tadil edilmiş olan hayvanlarda koni görme fonksiyonunu analiz etmek ve mükemmel bir yöntem olarak, örneğin çinko parmak Nükleaz (ZFNs) gibi daha yeni genom mühendislik teknikleri içerir, transkripsiyon aktivatör-gibi efektör Nükleaz (TALENS) ve Düzenli kümelenmiş interspaced Kısa yineleyen tekrarlar (CRISPR) / büyük ölçüde verimlilik ve zebrafish gen hedefleme etkinliğini artırmıştır hepsi Cas9. Ayrıca, biz photoresponse katkıda moleküler bileşenleri değerlendirmek için Zebra balığı larva nüfuz farmakolojik ajanların yeteneği yararlanmak. Bu protokol modifiye ve araştırmacılar tarafından kullanılabilecek bir kurulum özetliyorÇeşitli deneysel gol ile.

Tipik olarak, ERGler bir dizi çalışma bu aşamada 9, 16,20 ile ERG kayıtları yayınlandı beri, 5 dpf&#39;e Zebra balığı larvaları kaydedilir. Larva tepkiler beyaz LED ışık 20 msn uyaran kullanarak arka plan aydınlatma ile karanlık adapte koşullar altında ölçüldü. Biz bir Ganzfeld ışık uyarıcısı ve bilgisayar denetleyici / kaydedici oluşan piyasada mevcut ERG sistemi kullanılmaktadır. stimülatör arka plan ve flaş uyaran hem de parlaklığı kontrol etmek için sıkı bir şekilde kontrol tescilli darbe genişlik modülas...

Zebra balığı larvalarının mikromanipülasyon ve elektroretinografi tekniklerini kullanarak elektroretinografik (ERG) analizi için bir yöntem sunuyoruz. Bu, zebra balığı larvalarının in vivo görsel işlevini test etmek için basit ve anlaşılır bir yöntemdir.

Zebra balığı Larva Görsel Tepki Elektroetinogram Analizi

The electroretinogram (ERG) is a noninvasive electrophysiological method for determining retinal function. Through the placement of an electrode on the ...

Bu prosedürün genel amacı, zebra balığı larvaları üzerinde elektrografik analiz gerçekleştirmek için gerekli adımları göstermektir. Bu işlem, öncelikle uygun şekil ve boyutta cam mikro pipetlerin hazırlanmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım ise referans ve kayıt elektrotları gibi deney için kritik olan ekipmanların dikkatlice kurulmasıdır.Ardından, zebrafish larvası anestezi altına alınır ve stimülasyon ile kayıt ekipmanlarına göre uygun şekilde konumlandırılır. Son adım, cam mikro elektrodun zebrafish larvasının korneasına uygun şekilde yerleştirilmesidir. Sonuç olarak zebrafish larvaları.ERG analizi, tüm konili omurgalı retinasında in vivo olarak koni görsel fonksiyonlarının araştırılması için yararlıdır. Bu yöntem, konilerde görsel hassasiyete ve ışık adaptasyonuna katkıda bulunan sinyal yolaklarının tanımlanması gibi görme bilimi alanındaki temel soruların yanıtlanmasında oldukça kullanışlıdır. Larval zebra balığı gözünün küçük boyutu nedeniyle, kayıt mikro elektrodunun örneğe doğru şekilde yerleştirilmesinin öğrenilmesi zor olduğundan, bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi kritik öneme sahiptir.Bu prosedüre başlamak için, filament kullanarak alevle parlatılmış borosilikat cam kapilerler aracılığıyla birkaç mikro pipet çekin. Uç çaplarının 10 ila 15 mikrometre olduğundan ve görünümünün düzgün olduğundan emin olmak için her bir mikro pipeti uygun bir dereceli cetvel eşliğinde mikroskop altında kontrol edin. Deney günü, 10x Ringer çözeltisini bir kat seyrelterek bir çalışma çözeltisi hazırlayın.Partiküllerin mikropipet ucunu tıkamasını önlemek için çözeltiyi deiyonize distile su filtresiyle sterilize edin. Ardından, %95 oksijen ve %5 karbondioksit ile 10 dakika boyunca oksijenlendirin. Çözeltinin oksijenli kalmasını sağlamak için işlemden sonra kapağı sıkıca kapatın.Şimdi, viskoelastik üretan polimer şok emici tabanlı hareketli bir plastik platformu, ışık kaynağının altındaki titreşim önleyici masaya yerleştirin. Ardından, mıknatıslı bir standa sahip kamerayı konumlandırın ve hareketli plastik platforma yöneltin. Daha sonra, kayıt mikro elektrodunun mikro manipülatörünü ikinci bir mıknatıslı standa yerleştirin.Kamera ve mikro manipülatörün diğer ekipmanların hareketinden etkilenmediğinden ve ışık kaynağından gelen aydınlatmanın engellenmediğinden emin olun. Ardından, kamerayı bir video monitörüne bağlayın ve platforma doğru konumlandırın. Kurulumun bakır tel ile uygun şekilde topraklandığından emin olun.Bu adımda, temiz bir tıraş bıçağıyla, 35 milimetrelik bir Petri kabına sıkıca oturacak küçük, dikdörtgen şeklinde bir kuru PVA sünger parçası kesin. Referans elektrodun yerleştirilebilmesi için süngere ek bir kesik atın. Ardından, larvanın yerleştirileceği noktayı belirtmek için kimyasallara dayanıklı bir kalemle sünger üzerine küçük bir nokta koyun.Ardından, PVA süngeri doygun hale gelene kadar ringer solüsyonunda bekletin. Süngeri çıkarın ve temiz bir 35 milimetrelik Petri kabına yerleştirmeden önce kağıt havlu üzerinde iki üç kez hızlıca kurulayın. Sonrasında, süngeri içeren Petri kabını, işaretin kamera tarafından görüntülenebileceği şekilde plastik bir platform üzerine yerleştirin.Ardından, elektrotları %6 ila 9 sodyum klorür çözeltisine daldırarak klorlayın. Sonra bir Kim wipe üzerinde beş dakika boyunca havada kurutun. Referans elektrodun gümüş klorür pelletini, yapılan kesi tarzına bağlı olarak süngerin içine veya altına yerleştirin ve referans elektrot kablosunu kayıt sistemine bağlayın.Ardından, beş mililitrelik lure lock olmayan bir şırıngaya yaklaşık 40 santimetre tüp takın ve şırıngayı ringer çözeltisi ile doldurun. Sonrasında, bir mililitrelik lure lock olmayan bir şırıngayı ringer çözeltisi ile doldurun. Bir microfill kullanarak, hava kabarcığı oluşumunu önleyerek mikro elektrot tutucuyu dikkatlice doldurun.Ardından, beş mililitrelik şırıngayı microfill kullanarak ve bir mililitrelik şırınga ile Ringer çözeltisi doldurarak borular vasıtasıyla mikro elektrot tutucunun basınç portuna bağlayın. Cam mikro pipeti ucundan doldurun ve içinde hava kabarcığı kalmadığından emin olun. Daha sonra, cam mikro pipeti mikro elektrot tutucuya takın ve elektrot telini düz tutmaya dikkat edin.Sabitledikten sonra, beş mililitrelik şırıngayı kullanarak ringer çözeltisini, ucunda küçük bir miktar çözelti görünene kadar mikro elektrotun içinden dikkatlice itin. Şimdi, kayıt mikro elektrodunu dikkatlice mikro manipülatöre yerleştirin ve sistem gürültüsünü kontrol etmek için kabloyu kayıt sistemine bağlayın. Referans elektrodunu ve kayıt mikro elektrodunun ucunu, ringer çözeltisi ile doldurulmuş 35 milimetrelik bir Petri kabına yerleştirin.Kurulumun elektriksel gürültü seviyelerini bir osiloskopla veya ERG cihazının yerleşik bir özelliğiyle kontrol edin. Gürültü seviyeleri, temel çizgiden artı veya eksi 10 microvolt'tan fazla olmamalıdır. Bu prosedürde, birkaç adet bir santimetrekarelik kağıt havlu karesi kesin, 35 milimetrelik bir Petri kabındaki üç ila beş larvayı, final konsantrasyonu 0.02% olacak şekilde trica ekleyip bir ila iki dakika bekleyerek anesteziye alın.Ardından, düşük aydınlatma altındaki bir diseksiyon stereoskopu altında, tek bir larvayı dikkatlice bir kağıt havlu karesine aktarın. 30 dakikadan uzun sürecek kayıt oturumları için, gözü tıkanmış ve sırtı yukarıya bakan bir aday seçerek larvanın konumunu kontrol edin. İnce bir deve kılı fırçası kullanarak gövdeyi %3 methylcellulose ile kaplayıp larvayı nemli tutun.Ardından, larva ile birlikte kağıt havlu karesini nemli PVA süngerine aktarın. Daha sonra, distile su içeren yan kollu bir balon içindeki hava taşından gazı kabarcıklandırarak, larvaların üzerine %100 oksijenle doyurulmuş sürekli bir su akışı uygulayın. Balon yan kolundan gelen nemlendirilmiş oksijeni, minimal aydınlatma altında, tüp aracılığıyla larvanın baş kısmının yakınına konumlandırın.Mikro manipülatör ve kamerayı kullanarak mikro elektrot ucunu gözün nazal ve kaudal uçlarının orta noktasına yerleştirin ve korneanın dorsal sınırına hafifçe bastırın. Larvaların beş ila 10 dakika boyunca karanlığa adapte olmasını sağlayın. Ardından, bir LED ışık kaynağı veya optik stimülatörden sağlanan ışığa karşı test flaş yanıtlarını kaydedin.Bu şekil, beş DPF'lik larva zebra balığında tipik bir ERG kaydını göstermektedir. Karanlığa adapte edilmiş balıklar, ışık uyaranının sıfırıncı saniyede başlamasıyla birlikte, metrekare başına 1 ile 5.000 kandela arasında değişen yoğunluklarda 20 milisaniye boyunca beyaz LED ışığa maruz bırakılmıştır. Negatif potansiyel a dalgasının ayırt edilmesi zorken, pozitif potansiyel B dalgası dalga formunun baskın pikidir.Bu ek pencere, Naka-Rushton denklemi kullanılarak uydurulmuş ortalama B dalgası yanıt genliklerini göstermektedir. Bu şekil, PB ile işlem görmüş, karanlığa adapte edilmiş beş DPF'lik larva zebra balığında tipik bir ERG kaydını göstermektedir. Balıklar, metrekare başına 1 ila 5.000 kandela arasında değişen yoğunluklarda 20 milisaniye boyunca beyaz LED ışığına maruz bırakılmıştır ve izole koni toplu reseptör potansiyeli, dalga formunun baskın unsurudur. Bu ek pencere, Naka-Rushton denklemi kullanılarak uydurulmuş, PB ile işlem görmüş larva zebra balığının ortalama yanıt genliklerini göstermektedir.Bu şekil, çift flaş paradigması kullanılarak beş D-P-F-A-P-B ile tedavi edilmiş larva zebra balığında kaydedilen tipik bir ERG kaydını göstermektedir. Karanlığa adapte edilmiş balıklar, ardışık 20 milisaniyelik beyaz ışığa maruz bırakılmıştır.LED, metrekare başına 1000 canula yoğunlukta yanıp sönmekte olup flaşlar arasındaki ISI iki saniyedir. Her ışık stimülüsünün başlangıcı burada belirtilmiştir. Bu şekil, artan ISI ile ikinci stimülüsün maksimum izole koni kütlesi reseptör potansiyeli yanıtının başlangıç stimülüsüne oranını göstermektedir; bu durum, fotoreseptör hassasiyetinin kademeli olarak geri kazanıldığını göstermektedir.Bu prosedürü uygularken, kayıtların kalitesinin elektrot-kornea bağlantısının bütünlüğüne ve larvaların sağlığına bağlı olduğunu hatırlamak önemlidir. Bu tekniğin geliştirilmesi, görme bilimleri alanındaki araştırmacıların omurgalı retinasındaki koni adaptasyonunu ve iyileşmesini in vivo olarak inceleme kabiliyetini büyük ölçüde artırmıştır.

electroretinogram-analysis-of-the-visual-response-in-zebrafish-larvae

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Görsel-Motor Yanıt hafif artışlarla ve azaltır yanıt larva zebrafish motor çıkışını ölçmek için geliştirdi. Biz de dahil olmak üzere başka bir görme testi optokinetik refleks tarafından test edildiğinde tamamen kör olduğu düşünülüyordu optokinetik yanıt (NRC) mutantlar, hiçbir zebrafish vizyon mutant inceledi.

Işık Parlaklıkları değişiklikler Zebra balığı, Duyarlılık Tedbir Davranış Testi

Optokinetik yanıt larva zebrafish görsel işlevlerini değerlendirmek için yaygın kullanılır olmuştur. Bununla birlikte, larva balık için standart bir protokol henüz yetişkinler kolayca uygulanabilir...

Zebrafish görme fonksiyonu çalışma optokinetik yanıt

VisioTracker göz hareketlerinin kayıt dayalı larva ve küçük yetişkin balık görsel performans kantitatif analizi için otomatik bir sistemdir. Bu tür görsel sistem gelişimi ve işlevi, farmakoloji, nöral devre çalışmaları ve sensorimotor entegrasyon gibi alanlarda yüksek verimli araştırma sağlayarak, görsel uyarana özellikleri ve gerçek zamanlı analiz üzerinde tam denetime sahiptir.

VisioTracker, Okülomotor Analizi Yenilikçi Otomatik Yaklaşım

Bu videoda, otomatik bir izleme yazılımı kullanılarak zebra balığı ve şişman başlı minnow larvalarının fotomotor yanıt testi açıklanmaktadır. Protokol, aydınlatma durumundaki ani bir değişikliğin ardından larva balığının davranışsal tepkisini ölçer.

Fotomotor Tepki Testi: Larva Zebra Balığının Aydınlatma Durumundaki Ani Bir Değişikliğe Davranışsal Tepkisini Ölçmek İçin Bir Yöntem

Bu videoda zebra balıklarında optokinetik tepki testi açıklanmaktadır. Video, görsel hareketli uyarana dayalı olarak refleksif göz hareketlerini ölçer ve zebra balıklarında görme keskinliğini belirler.

Optokinetik Yanıt Testi: Zebra Balıklarında Görme Keskinliğini Ölçmek İçin Bir Yöntem

Bu video, floresan kalsiyum indikatör komplekslerini eksprese eden nöronları ile kalsiyum indikatör tabanlı floresan görüntüleme kullanarak transgenik zebra balığı larvalarında görsel av tespitini inceleme yöntemini göstermektedir.

Transgenik Zebra Balığı Larvasında Av Tarafından Uyarılan Nöronal Aktivitenin İncelenmesi

Zebra balığı birçok araştırma alanları için değerli bir araç olmuştur. Burada görsel bir yanıt ortaya çıkarmak ve yetişkin Zebrafish fonksiyonel görme keskinliği hesaplamak için bir yöntem ortaya koymaktadır.

Zebra balığı görme keskinliğinin bir nicel ölçü olarak Optokinetik Tepki

Yetişkin zebra balıklarında retinal ganglion hücrelerini (RGC'ler) geriye dönük etiketlemek için etkili bir yöntem sunuyoruz.

Floresan Boyalar Yetişkin Zebra balığı Retina Ganglion Hücreleri retrograd Etiketleme

Burada, DEPDC5 geninin geçici inhibisyonundan kaynaklanan bir zebra balığı epilepsi modelinin geliştirilmesi ve karakterizasyonu için bir protokol sunuyoruz.

Zebra balığı epilepsi modelinde davranışsal ve fizyolojik analiz

Burada, larva Zebra balığı ışık çatışmaya electroretinogram tepkiler ölçüm kolaylaştırır bir iletişim kuralı mevcut. Bir roman koni şeklindeki sünger-uç elektrot larva Zebra balığı electroretinogram ERG güvenilir sonuçlar ve daha düşük maliyet ile elde etmek için daha kolay kullanılmasını görsel geliştirme çalışma yapmak yardımcı olabilir.

Larva A roman koni şeklindeki sünger-uç elektrot kullanarak Zebra balığı Electroretinogram kayıt

Makale, retinal girdinin optik tektum büyümesini ve gelişimini nasıl etkilediğini araştırmaya yönelik ilk adım olarak canlı zebra balığı larvalarından gözlerin cerrahi olarak nasıl çıkarılacağını açıklamaktadır. Ek olarak, makale larva anesteziizasyonu, fiksasyon ve beyin diseksiyonu, ardından immünohistokimya ve konfokal görüntüleme hakkında bilgi vermektedir.

Görsel Sistemin Innervasyona Bağlı Büyümesini ve Gelişimini İncelemek için Canlı Zebra Balığı Larvalarında Göz Çıkarılması

Öğrenin zebra balığı larvalarında elektroretinografi analizi yaparak görsel fonksiyonu in vivo değerlendirme yöntemini. Bu teknik, retina elektrofizyolojisi ve görsel gelişim araştırmaları için güvenilir bir yaklaşım sunar.

Zebra balığı Larva Görsel Tepki Elektroetinogram Analizi

Daha fazla video keşfet