Zebra balığı Larva Görsel Tepki Elektroetinogram Analizi

Bu prosedürün genel amacı, zebra balığı larvaları üzerinde elektrografik analiz gerçekleştirmek için gerekli adımları göstermektir. Bu işlem, öncelikle uygun şekil ve boyutta cam mikro pipetlerin hazırlanmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım ise referans ve kayıt elektrotları gibi deney için kritik olan ekipmanların dikkatlice kurulmasıdır.

Ardından, zebrafish larvası anestezi altına alınır ve stimülasyon ile kayıt ekipmanlarına göre uygun şekilde konumlandırılır. Son adım, cam mikro elektrodun zebrafish larvasının korneasına uygun şekilde yerleştirilmesidir. Sonuç olarak zebrafish larvaları.

ERG analizi, tüm konili omurgalı retinasında in vivo olarak koni görsel fonksiyonlarının araştırılması için yararlıdır. Bu yöntem, konilerde görsel hassasiyete ve ışık adaptasyonuna katkıda bulunan sinyal yolaklarının tanımlanması gibi görme bilimi alanındaki temel soruların yanıtlanmasında oldukça kullanışlıdır. Larval zebra balığı gözünün küçük boyutu nedeniyle, kayıt mikro elektrodunun örneğe doğru şekilde yerleştirilmesinin öğrenilmesi zor olduğundan, bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi kritik öneme sahiptir.

Bu prosedüre başlamak için, filament kullanarak alevle parlatılmış borosilikat cam kapilerler aracılığıyla birkaç mikro pipet çekin. Uç çaplarının 10 ila 15 mikrometre olduğundan ve görünümünün düzgün olduğundan emin olmak için her bir mikro pipeti uygun bir dereceli cetvel eşliğinde mikroskop altında kontrol edin. Deney günü, 10x Ringer çözeltisini bir kat seyrelterek bir çalışma çözeltisi hazırlayın.

Partiküllerin mikropipet ucunu tıkamasını önlemek için çözeltiyi deiyonize distile su filtresiyle sterilize edin. Ardından, %95 oksijen ve %5 karbondioksit ile 10 dakika boyunca oksijenlendirin. Çözeltinin oksijenli kalmasını sağlamak için işlemden sonra kapağı sıkıca kapatın.

Şimdi, viskoelastik üretan polimer şok emici tabanlı hareketli bir plastik platformu, ışık kaynağının altındaki titreşim önleyici masaya yerleştirin. Ardından, mıknatıslı bir standa sahip kamerayı konumlandırın ve hareketli plastik platforma yöneltin. Daha sonra, kayıt mikro elektrodunun mikro manipülatörünü ikinci bir mıknatıslı standa yerleştirin.

Kamera ve mikro manipülatörün diğer ekipmanların hareketinden etkilenmediğinden ve ışık kaynağından gelen aydınlatmanın engellenmediğinden emin olun. Ardından, kamerayı bir video monitörüne bağlayın ve platforma doğru konumlandırın. Kurulumun bakır tel ile uygun şekilde topraklandığından emin olun.

Bu adımda, temiz bir tıraş bıçağıyla, 35 milimetrelik bir Petri kabına sıkıca oturacak küçük, dikdörtgen şeklinde bir kuru PVA sünger parçası kesin. Referans elektrodun yerleştirilebilmesi için süngere ek bir kesik atın. Ardından, larvanın yerleştirileceği noktayı belirtmek için kimyasallara dayanıklı bir kalemle sünger üzerine küçük bir nokta koyun.

Ardından, PVA süngeri doygun hale gelene kadar ringer solüsyonunda bekletin. Süngeri çıkarın ve temiz bir 35 milimetrelik Petri kabına yerleştirmeden önce kağıt havlu üzerinde iki üç kez hızlıca kurulayın. Sonrasında, süngeri içeren Petri kabını, işaretin kamera tarafından görüntülenebileceği şekilde plastik bir platform üzerine yerleştirin.

Ardından, elektrotları %6 ila 9 sodyum klorür çözeltisine daldırarak klorlayın. Sonra bir Kim wipe üzerinde beş dakika boyunca havada kurutun. Referans elektrodun gümüş klorür pelletini, yapılan kesi tarzına bağlı olarak süngerin içine veya altına yerleştirin ve referans elektrot kablosunu kayıt sistemine bağlayın.

Ardından, beş mililitrelik lure lock olmayan bir şırıngaya yaklaşık 40 santimetre tüp takın ve şırıngayı ringer çözeltisi ile doldurun. Sonrasında, bir mililitrelik lure lock olmayan bir şırıngayı ringer çözeltisi ile doldurun. Bir microfill kullanarak, hava kabarcığı oluşumunu önleyerek mikro elektrot tutucuyu dikkatlice doldurun.

Ardından, beş mililitrelik şırıngayı microfill kullanarak ve bir mililitrelik şırınga ile Ringer çözeltisi doldurarak borular vasıtasıyla mikro elektrot tutucunun basınç portuna bağlayın. Cam mikro pipeti ucundan doldurun ve içinde hava kabarcığı kalmadığından emin olun. Daha sonra, cam mikro pipeti mikro elektrot tutucuya takın ve elektrot telini düz tutmaya dikkat edin.

Sabitledikten sonra, beş mililitrelik şırıngayı kullanarak ringer çözeltisini, ucunda küçük bir miktar çözelti görünene kadar mikro elektrotun içinden dikkatlice itin. Şimdi, kayıt mikro elektrodunu dikkatlice mikro manipülatöre yerleştirin ve sistem gürültüsünü kontrol etmek için kabloyu kayıt sistemine bağlayın. Referans elektrodunu ve kayıt mikro elektrodunun ucunu, ringer çözeltisi ile doldurulmuş 35 milimetrelik bir Petri kabına yerleştirin.

Kurulumun elektriksel gürültü seviyelerini bir osiloskopla veya ERG cihazının yerleşik bir özelliğiyle kontrol edin. Gürültü seviyeleri, temel çizgiden artı veya eksi 10 microvolt'tan fazla olmamalıdır. Bu prosedürde, birkaç adet bir santimetrekarelik kağıt havlu karesi kesin, 35 milimetrelik bir Petri kabındaki üç ila beş larvayı, final konsantrasyonu 0.02% olacak şekilde trica ekleyip bir ila iki dakika bekleyerek anesteziye alın.

Ardından, düşük aydınlatma altındaki bir diseksiyon stereoskopu altında, tek bir larvayı dikkatlice bir kağıt havlu karesine aktarın. 30 dakikadan uzun sürecek kayıt oturumları için, gözü tıkanmış ve sırtı yukarıya bakan bir aday seçerek larvanın konumunu kontrol edin. İnce bir deve kılı fırçası kullanarak gövdeyi %3 methylcellulose ile kaplayıp larvayı nemli tutun.

Ardından, larva ile birlikte kağıt havlu karesini nemli PVA süngerine aktarın. Daha sonra, distile su içeren yan kollu bir balon içindeki hava taşından gazı kabarcıklandırarak, larvaların üzerine %100 oksijenle doyurulmuş sürekli bir su akışı uygulayın. Balon yan kolundan gelen nemlendirilmiş oksijeni, minimal aydınlatma altında, tüp aracılığıyla larvanın baş kısmının yakınına konumlandırın.

Mikro manipülatör ve kamerayı kullanarak mikro elektrot ucunu gözün nazal ve kaudal uçlarının orta noktasına yerleştirin ve korneanın dorsal sınırına hafifçe bastırın. Larvaların beş ila 10 dakika boyunca karanlığa adapte olmasını sağlayın. Ardından, bir LED ışık kaynağı veya optik stimülatörden sağlanan ışığa karşı test flaş yanıtlarını kaydedin.

Bu şekil, beş DPF'lik larva zebra balığında tipik bir ERG kaydını göstermektedir. Karanlığa adapte edilmiş balıklar, ışık uyaranının sıfırıncı saniyede başlamasıyla birlikte, metrekare başına 1 ile 5.000 kandela arasında değişen yoğunluklarda 20 milisaniye boyunca beyaz LED ışığa maruz bırakılmıştır. Negatif potansiyel a dalgasının ayırt edilmesi zorken, pozitif potansiyel B dalgası dalga formunun baskın pikidir.

Bu ek pencere, Naka-Rushton denklemi kullanılarak uydurulmuş ortalama B dalgası yanıt genliklerini göstermektedir. Bu şekil, PB ile işlem görmüş, karanlığa adapte edilmiş beş DPF'lik larva zebra balığında tipik bir ERG kaydını göstermektedir. Balıklar, metrekare başına 1 ila 5.000 kandela arasında değişen yoğunluklarda 20 milisaniye boyunca beyaz LED ışığına maruz bırakılmıştır ve izole koni toplu reseptör potansiyeli, dalga formunun baskın unsurudur. Bu ek pencere, Naka-Rushton denklemi kullanılarak uydurulmuş, PB ile işlem görmüş larva zebra balığının ortalama yanıt genliklerini göstermektedir.

Bu şekil, çift flaş paradigması kullanılarak beş D-P-F-A-P-B ile tedavi edilmiş larva zebra balığında kaydedilen tipik bir ERG kaydını göstermektedir. Karanlığa adapte edilmiş balıklar, ardışık 20 milisaniyelik beyaz ışığa maruz bırakılmıştır.

LED, metrekare başına 1000 canula yoğunlukta yanıp sönmekte olup flaşlar arasındaki ISI iki saniyedir. Her ışık stimülüsünün başlangıcı burada belirtilmiştir. Bu şekil, artan ISI ile ikinci stimülüsün maksimum izole koni kütlesi reseptör potansiyeli yanıtının başlangıç stimülüsüne oranını göstermektedir; bu durum, fotoreseptör hassasiyetinin kademeli olarak geri kazanıldığını göstermektedir.

Bu prosedürü uygularken, kayıtların kalitesinin elektrot-kornea bağlantısının bütünlüğüne ve larvaların sağlığına bağlı olduğunu hatırlamak önemlidir. Bu tekniğin geliştirilmesi, görme bilimleri alanındaki araştırmacıların omurgalı retinasındaki koni adaptasyonunu ve iyileşmesini in vivo olarak inceleme kabiliyetini büyük ölçüde artırmıştır.