Name: Chicken İnsan Multipl Miyelom Xenograftlarında Modeli Kurulması Tümör Büyüme, Invasion ve Anjiogenez Eğitim için (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 4 s
Description: Öğrenin, tavuk embriyosu modelinde insan multipl miyeloma hücrelerinin tümör büyümesi, invazyon ve anjiogenez üzerindeki etkilerini incelemek için 3D in vitro ve in vivo yöntemleri. Bu teknik, kanser ilaçlarının hızlı preklinik taramasını sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar, immünohistokimya ve tavuk embriyolarının hazırlanmasındaki mükemmel teknik yardımı için Bayan Cornelia Heis'e teşekkür etmek istiyor. Bu çalışma, Avusturya Bilim Fonu (FWF Hibe No. P19552) ve Avrupa Birliği (AB FP7 projesi Optatio No: 278570) tarafından desteklenmiştir.

Laboratuar Hayvan Refah hatching.The NIH Ofisi, bu alanda (http yazılı kılavuzu sağlamıştır kadar Avusturya hukuk ve ABD kamu sağlık hizmeti kuş embriyo Laboratuvarı Hayvan Refahı Dairesi&#39;ne göre, canlı omurgalı hayvanlar olarak kabul edilmez: // www.grants.nih.gov/grants/olaw/references/ilar91.htm ve NIH Yayın No .: 06-4515). 1. Hücre Kültürü ve lentiviral transfeksiyonu <ol><li> Kültür MM hücre çizgileri OPM-2, RPMI-8226 ve RPMI1640 ortam maddesi, kemik iliğinden insan mezenkimal kök hücreleri, varlığında,% 10 sığır cenin dana serumu ve 100 IU / ml penisilin, 100 ug / ml streptomisin ve 2 mM glutamin ile desteklenmiş 37 ° C&#39;de% 5 CO2 içinde. </li><li> Transfect 5 x 10 ila 30 ul, lipozomal transfeksiyon reaktifi ve transfeksiyon ortamı (10 mi) kullanılarak viral paketleme karışımı (9 ug) DNA ve 3 ug pLenti6 / V5 hedef EGFP vektörü ile 6 HEK 293FT hücreleri. 12 saat sonra, transfeksiyon aracı maddesi çıkarın veve% 10 buzağı serumu ve% 1 temel olmayan amino asitler (NEAA), 10 ml DMEM ortamı ilave edin. </li><li> 5 gün sonra, yüzme hücreleri (1000 xg, 5 dakika) santrifüje edilmesinden sonra HEK293FT hücre süpernatantlar toplamak. Başka bir yerde 28 açıklandığı gibi, gerçek zamanlı PCR ile viral titresi belirleyin. </li><li> Tam büyüme ortamı içinde 24 oyuklu bir plaka içerisinde EGFP lentiviral parçacıklar (1 x 10 5 parçacıklar) 1 x 10 6 MM hücreleri transfekte. 3 gün sonra, 2 ug / ml kültür ortamına blastisidin ekleyerek seçim süreci başlar. Ticari olarak temin edilebilen EGFP lentivirüs için, 500 ug / ml neomisin kullanın. </li><li> Seçimin 2 hafta sonra, MM hücrelerini ifade eGFP kümeleri görünecektir; santrifüj (1000 xg, 5 dk) tarafından hücreleri toplamak ve deneyler için OPM-2 eGFP ve RPMI-8226 eGFP alt hatları olarak genişletmek (bölüm 2 ve 3). </li></ol> 2. 3D-Multipl Miyelom Sferoid Modeli <ol><li> Chill kollajen tip I çözümü ve 10 x DMEM on buz. </li><li> Kollajen matrisi içine 10 x DMEM ortamı içinde 1/10 hacim karıştırın; 7.4 arasında bir pH değerine, asidik kolajen çözeltisi nötralize etmek için NaOH (0.2 N) ilave et; Mağaza kollajen / buz üzerinde, orta bir çözüm. </li><li> Transgenik MM hücre hatları (OPM-2 eGFP veya RPMI-8226 eGFP; sfero başına 250.000) karıştırın insan mezenkimal hücreler (50,000 hücre / sfero, yani 30 ul damla) ile. </li><li> 15 ml tüpler (1000 xg, 5 dakika) Santrifüj hücre karışımı, hücre peleti soğuk hazırlanan kollajen karışımı (1 mL) ekleyin ve (1.000 ul ucu) ile iyice karıştırın. </li><li> Hemen steril parafın film üzerinde 24 oyuklu bir plaka (100 | il ucu ile) kollajen / hücre karışımından 30 ul pipet ve hücre / kollajen karışımı 37 ° C&#39;de (Şekil 1A bakınız), 30 dakika boyunca polimerize izin verir. </li><li> 1, 10 ve 100 nM Bortezomibin ihtiva eden 1 ml kültür ortamı ile Bindirme MM sferoidler (Şekil 1B&#39;ye bakınız). </li><li> 37 ° C&#39;de inkübasyondan 72 saat sonra, belge tarafından sferoidlerfloresan stereomikroskobi (Şekil 1C bakınız). </li><li> GFP ölçümü için, bir reaksiyon tüpü içinde geniş düz çeneli forseps kullanılarak her bir sfero aktarın (Şekil 1D bakınız). </li></ol> CAM 3. 3D Multipl Miyelom Ksenograft Modeli <ol><li> Üç gün için özel bir 37 ° C &#39;de kuş yumurtaları için inkübatöre ve% 70 nemde tavuk yumurtası inkübe edin. </li><li> Bundan sonra, açık yumurta ve embriyo transferi hücre kültürü plaka kapağı ile etanol, kare, 10 cm plastik tartım tekneler sterilize etmek ve CAM (Şekil 2A) geliştirmek mümkün olduğu, böylece daha altı gün boyunca &quot;ex ovo&quot; kuluçkaya yatmaktadır. </li><li> Hissedilen kolajen tip-I çözeltisi ve buz üzerinde 10 x DMEM, 7.4 olan bir pH değerine asidik kolajen çözeltisi nötralize edilmesi için (N 0.2) NaOH ekleyin, kollajen matris 10 x DMEM ortamı içinde 1/10 hacim karışımı; Mağaza kollajen / buz üzerinde, orta bir çözüm. </li><li> Transgenik MM hücre hatları (OPM-2 eGFP veya MixRPMI-8226 eGFP; Insan mezenkimal hücreler ile sfero) başına 250.000 (50.000 hücre / sfero). </li><li> 15 ml tüpler Santrifüj hücreleri (1,000 x g, 5 dk; her bir test bileşiği 1 şişe için) hücre pelletine (istenilen çalışma konsantrasyonunda) ilaç ile 1 ml soğuk hazırlanan kollajen karışımı ekleyin ve iyice karıştırın (1000 ul ucu ile birlikte). </li><li> 37 ° C&#39;de hücre dışı matrisin polimerizasyonun izin vermek için 30 dakika süreyle de Pate, bir 6 kolajen damla Parafilm (30 ul her) yerleştirin. </li><li> (2 cm uzakta embriyodan) 9 gün eski tavuk embriyolarının CAM işlem görmemiş yüzeyine forseps kullanımı ile adım 3,6 Transferi &quot;onplants&quot; (her tavuk embriyo için 4 onplants, Şekil 2B bakınız) </li><li> Floresan stereomikroskobi in vivo 37 ° C&#39;de bir yumurta inkübatör büyüme ve% 70 nem, belge ksenograftlarının 5 gün sonra (bakınız Şekil 2c). 5 saat buzdolabında 4 ° C&#39;de hipotermi ile tavuk embriyoları Euthanize. </li><li> Bir göz makas ile alttaki CAM dokusu ile xenografts çıkarın ve geniş düz çeneleri ile forseps. GFP ölçümü için bunları kullanın (bölüm 4, Şekil 2D) ya da kan damarları ve / veya işgalci tümör hücreleri (bölüm 5) immünohistokimyasal analizi için. </li></ol> ELISA ile EGFP Protein Niceleme 4. <ol><li> 0.5 mi, RIPA tamponunun 200 ug / ml proteaz inhibitörleri ihtiva eden her bir AA sfero veya kesilmiş xenograft aktarın. </li><li> Buz üzerinde bir doku homojenleştirici ile sfero / xenograft homojenize. </li><li> Sıvı nitrojen içinde üç dondurma / çözülme-döngüleri ve 37 ° C su banyosu gerçekleştirin. </li><li> 20 dakika (12,000 g), ve mağaza süpernatanları 4 ° C&#39;de santrifüje homojenat. </li><li> Numuneleri ELISA kiti deney tamponu (200 ul) içinde 1:20 seyreltilir. Üreticinin protokolüne uygun olarak, biyotinile edilmiş anti-GFP antikorları kullanılarak ticari bir GFP ELISA kiti ile GFP düzeyleri ölçülür. </li></ol> 5. ImmunohiKan gemiler ve istila Tümör Hücrelerinin stochemical Analizi <ol><li> 4 ° C&#39;de /% 4 paraformaldehit O&#39;da N CAM alanı ile eksize ksenograftları sabitleyin. </li><li> Gömme kasetlerin içine sabit xenografts yerleştirin ve artan kademeli alkol serisi (% 50,% 70,% 80,% 95 etanol, ksilol ve parafin, her adım 60 dk) ile bir doku gömme istasyonu içine aktarabilirsiniz. </li><li> Bir Benchtop döner mikrotom kullanılarak Bölüm ksenogrefleri (5 um). 56 ° C&#39;de cam slaytlar O / N üzerinde parafin kesitler pişirin. </li><li> Iki kez damıtılmış su ile azalan bir kademeli alkol serisi ile Deparaffinize bölümler (ksilol,% 95,% 80,% 70,% 50 etanol, iki kez damıtılmış su, her bir adım, 10 dakika). </li><li> Bir antijen alma çözeltisi bir su banyosu (95 ° C, 20 dakika) içinde antijen alımı gerçekleştirmek (sitratla tamponu; pH 7.0; hacim 100 ul). </li><li> 30 dakika boyunca 100 ul% 3 H 2 O 2 / metanol endojen peroksidaz etkinliğini bloke eder. </li><li> PBS içeren Blok bölümleri45 dakika boyunca (hacim 100 ul)% 10 fetal dana serumu. </li><li> PBS oda sıcaklığında% 1 fetal buzağı serumu ihtiva eden seyreltilmiş primer antikor (1 ug / ml) 100 ul ile 1 saat için leke. </li><li> PBS içinde 3-kere yıkandıktan sonra, oda sıcaklığında PBS,% 1 fetal buzağı serumu ihtiva eden biyotinile edilmiş ikincil antikor (0.1 ug / ml) ile 1 saat süreyle inkübe edin. </li><li> PBS içinde 3-kere yıkandıktan sonra, üreticinin talimatlarına uygun olarak, avidin / biyotin-kompleksi (ABC) ve diaminobenzidin (DAB) alt-tabaka çözeltisi ile renk reaksiyonu gerçekleştirmek. </li><li> 5.11. Hematoksilen ile çifte damıtılmış su, karşıt Bölümleri aktararak reaksiyonu durdurmak ve sentetik montaj ortamı ile bölümleri monte edin. </li></ol>

<ol><li>Kuehl, W. M., Bergsagel, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+myeloma%3A+evolving+genetic+events+and+host+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.Rev.Cancer%22%5BJournal%5D)">Multiple myeloma: evolving genetic events and host interactions.</a> Nat.Rev.Cancer. 2 (3), 175-187 (2002).</li>
<li>Kumar, S. K., Gertz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Risk+adapted+therapy+for+multiple+myeloma%3A+back+to+basics%5BTitle%5D)+AND+%22Leuk.Lymphoma%22%5BJournal%5D)">Risk adapted therapy for multiple myeloma: back to basics.</a> Leuk.Lymphoma. , (2014).</li>
<li>Prideaux, S. M., Conway, O. E., Chevassut, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetic+architecture+of+multiple+myeloma%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.Hematol%22%5BJournal%5D)">The genetic architecture of multiple myeloma.</a> Adv.Hematol. 2014, 864058(2014).</li>
<li>Chauhan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+orally+active+proteasome+inhibitor+ONX+0912+triggers+in+vitro+and+in+vivo+cytotoxicity+in+multiple+myeloma%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">A novel orally active proteasome inhibitor ONX 0912 triggers in vitro and in vivo cytotoxicity in multiple myeloma.</a> Blood. 116 (23), 4906-4915 (2010).</li>
<li>Kuehl, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+can+predict+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Mouse models can predict cancer therapy.</a> Blood. 120 (2), 238-240 (2012).</li>
<li>Nefedova, Y., Gabrilovich, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+and+clinical+prospects+of+Notch+inhibitors+in+the+therapy+of+hematological+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Resist.Updat%22%5BJournal%5D)">Mechanisms and clinical prospects of Notch inhibitors in the therapy of hematological malignancies.</a> Drug Resist.Updat. 11 (6), 210-218 (2008).</li>
<li>Yaccoby, S., Barlogie, B., Epstein, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+myeloma+cells+growing+in+SCID-hu+mice%3A+a+model+for+studying+the+biology+and+treatment+of+myeloma+and+its+manifestations%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Primary myeloma cells growing in SCID-hu mice: a model for studying the biology and treatment of myeloma and its manifestations.</a> Blood. 92 (8), 2908-2913 (1998).</li>
<li>Dazzi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+and+chronic+phase+CML+hematopoietic+cells+repopulate+NOD%2FSCID+bone+marrow+with+different+kinetics+and+cell+lineage+representation%5BTitle%5D)+AND+%22Hematol.J%22%5BJournal%5D)">Normal and chronic phase CML hematopoietic cells repopulate NOD/SCID bone marrow with different kinetics and cell lineage representation.</a> Hematol.J. 1 (5), 307-315 (2000).</li>
<li>Lock, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nonobese+diabetic%2Fsevere+combined+immunodeficient+%28NOD%2FSCID%29+mouse+model+of+childhood+acute+lymphoblastic+leukemia+reveals+intrinsic+differences+in+biologic+characteristics+at+diagnosis+and+relapse%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The nonobese diabetic/severe combined immunodeficient (NOD/SCID) mouse model of childhood acute lymphoblastic leukemia reveals intrinsic differences in biologic characteristics at diagnosis and relapse.</a> Blood. 99 (11), 4100-4108 (2002).</li>
<li>Feuring-Buske, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+engraftment+of+human+acute+myeloid+leukemia+progenitor+cells+in+beta+2-microglobulin-deficient+NOD%2FSCID+mice+and+in+NOD%2FSCID+mice+transgenic+for+human+growth+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Improved engraftment of human acute myeloid leukemia progenitor cells in beta 2-microglobulin-deficient NOD/SCID mice and in NOD/SCID mice transgenic for human growth factors.</a> Leukemia. 17 (4), 760-763 (2003).</li>
<li>Pearce, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AML+engraftment+in+the+NOD%2FSCID+assay+reflects+the+outcome+of+AML%3A+implications+for+our+understanding+of+the+heterogeneity+of+AML%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">AML engraftment in the NOD/SCID assay reflects the outcome of AML: implications for our understanding of the heterogeneity of AML.</a> Blood. 107 (3), 1166-1173 (2006).</li>
<li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+inhibition+of+Notch+signaling+and+Bcl-2%2FBcl-xL+results+in+synergistic+antimyeloma+effect%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.Cancer+Ther%22%5BJournal%5D)">Combined inhibition of Notch signaling and Bcl-2/Bcl-xL results in synergistic antimyeloma effect.</a> Mol.Cancer Ther. 9 (12), 3200-3209 (2010).</li>
<li>Tassone, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+clinically+relevant+SCID-hu+in+vivo+model+of+human+multiple+myeloma%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">A clinically relevant SCID-hu in vivo model of human multiple myeloma.</a> Blood. 106 (2), 713-716 (2005).</li>
<li>Ranga, A., Gjorevski, N., Lutolf, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+discovery+through+stem+cell-based+organoid+models%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.Drug+Deliv.Rev%22%5BJournal%5D)">Drug discovery through stem cell-based organoid models.</a> Adv.Drug Deliv.Rev. 69-70, 19-28 (2014).</li>
<li>Pereira, R. F., Barrias, C. C., Granja, P. L., Bartolo, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+biofabrication+strategies+for+skin+regeneration+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine.%28Lond%29%22%5BJournal%5D)">Advanced biofabrication strategies for skin regeneration and repair.</a> Nanomedicine.(Lond). 8 (4), 603-621 (2013).</li>
<li>Fischbach, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+tumors+with+3D+scaffolds%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.Methods%22%5BJournal%5D)">Engineering tumors with 3D scaffolds).</a> Nat.Methods. 4 (10), 855-860 (2007).</li>
<li>Boulland, J. L., Halasi, G., Kasumacic, N., Glover, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenotransplantation+of+human+stem+cells+into+the+chicken+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22J.Vis.Exp%22%5BJournal%5D)">Xenotransplantation of human stem cells into the chicken embryo.</a> J.Vis.Exp. (41), (2010).</li>
<li>Deryugina, E. I., Quigley, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+2.+Chick+embryo+chorioallantoic+membrane+models+to+quantify+angiogenesis+induced+by+inflammatory+and+tumor+cells+or+purified+effector+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Chapter 2. Chick embryo chorioallantoic membrane models to quantify angiogenesis induced by inflammatory and tumor cells or purified effector molecules.</a> Methods Enzymol. 444, 21-41 (2008).</li>
<li>Deryugina, E. I., Quigley, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chick+embryo+chorioallantoic+membrane+model+systems+to+study+and+visualize+human+tumor+cell+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem.Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Chick embryo chorioallantoic membrane model systems to study and visualize human tumor cell metastasis.</a> Histochem.Cell Biol. 130 (6), 1119-1130 (2008).</li>
<li>Kern, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GRP-78+secreted+by+tumor+cells+blocks+the+antiangiogenic+activity+of+bortezomib%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">GRP-78 secreted by tumor cells blocks the antiangiogenic activity of bortezomib.</a> Blood. 114 (18), 3960-3967 (2009).</li>
<li>Ribatti, D., Nico, B., Vacca, A., Presta, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+gelatin+sponge-chorioallantoic+membrane+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.Protoc%22%5BJournal%5D)">The gelatin sponge-chorioallantoic membrane assay.</a> Nat.Protoc. 1 (1), 85-91 (2006).</li>
<li>Ribatti, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chick+embryo+chorioallantoic+membrane+as+a+model+for+tumor+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.Cell+Res%22%5BJournal%5D)">The chick embryo chorioallantoic membrane as a model for tumor biology.</a> Exp.Cell Res. , (2014).</li>
<li>Dohle, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chick+ex+ovo+culture+and+ex+ovo+CAM+assay%3A+how+it+really+works%5BTitle%5D)+AND+%22J.Vis.Exp%22%5BJournal%5D)">Chick ex ovo culture and ex ovo CAM assay: how it really works.</a> J.Vis.Exp. (33), (2009).</li>
<li>Kobayashi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chick+embryo+model+for+metastatic+human+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.Urol%22%5BJournal%5D)">A chick embryo model for metastatic human prostate cancer.</a> Eur.Urol. 34 (2), 154-160 (1998).</li>
<li>Koop, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fate+of+melanoma+cells+entering+the+microcirculation%3A+over+80%25+survive+and+extravasate%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Fate of melanoma cells entering the microcirculation: over 80% survive and extravasate.</a> Cancer Res. 55 (12), 2520-2523 (1995).</li>
<li>Martowicz, A., Spizzo, G., Gastl, G., Untergasser, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotype-dependent+effects+of+EpCAM+expression+on+growth+and+invasion+of+human+breast+cancer+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22BMC.Cancer%22%5BJournal%5D)">Phenotype-dependent effects of EpCAM expression on growth and invasion of human breast cancer cell lines.</a> BMC.Cancer. 12, 501(2012).</li>
<li>Martowicz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EpCAM+overexpression+prolongs+proliferative+capacity+of+primary+human+breast+epithelial+cells+and+supports+hyperplastic+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.Cancer%22%5BJournal%5D)">EpCAM overexpression prolongs proliferative capacity of primary human breast epithelial cells and supports hyperplastic growth.</a> Mol.Cancer. 12, 56(2013).</li>
<li>Geraerts, M., Willems, S., Baekelandt, V., Debyser, Z., Gijsbers, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+lentiviral+vector+titration+methods%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Comparison of lentiviral vector titration methods.</a> 6, 34(2006).</li>
<li>Farnoushi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+in+vivo+testing+of+drug+response+in+multiple+myeloma+made+possible+by+xenograft+to+turkey+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Br.J.Cancer%22%5BJournal%5D)">Rapid in vivo testing of drug response in multiple myeloma made possible by xenograft to turkey embryos.</a> Br.J.Cancer. 105 (11), 1708-1718 (2011).</li>
<li>Wunderlich, M., Krejci, O., Wei, J., Mulloy, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+CD34%2B+cells+expressing+the+inv%2816%29+fusion+protein+exhibit+a+myelomonocytic+phenotype+with+greatly+enhanced+proliferative+ability%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Human CD34+ cells expressing the inv(16) fusion protein exhibit a myelomonocytic phenotype with greatly enhanced proliferative ability.</a> Blood. 108 (5), 1690-1697 (2006).</li>
<li>Hideshima, T., Mitsiades, C., Tonon, G., Richardson, P. G., Anderson, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+multiple+myeloma+pathogenesis+in+the+bone+marrow+to+identify+new+therapeutic+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.Rev.Cancer%22%5BJournal%5D)">Understanding multiple myeloma pathogenesis in the bone marrow to identify new therapeutic targets.</a> Nat.Rev.Cancer. 7 (8), 585-598 (2007).</li>
<li>Parikh, M. R., Belch, A. R., Pilarski, L. M., Kirshner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+three-dimensional+tissue+culture+model+to+study+primary+human+bone+marrow+and+its+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22J.Vis.Exp%22%5BJournal%5D)">A three-dimensional tissue culture model to study primary human bone marrow and its malignancies.</a> J.Vis.Exp. (85), (2014).</li>
<li>Schuler, J., Ewerth, D., Waldschmidt, J., Wasch, R., Engelhardt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+models+of+multiple+myeloma%3A+a+critical+appraisal%5BTitle%5D)+AND+%22Expert.Opin.Biol.Ther%22%5BJournal%5D)">Preclinical models of multiple myeloma: a critical appraisal.</a> Expert.Opin.Biol.Ther. 13, Suppl 1. S111-S123 (2013).</li>
<li>Kirshner, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+unique+three-dimensional+model+for+evaluating+the+impact+of+therapy+on+multiple+myeloma%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">A unique three-dimensional model for evaluating the impact of therapy on multiple myeloma.</a> Blood. 112 (7), 2935-2945 (2008).</li>
<li>Jilani, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+binding+of+lectins+to+embryonic+chicken+vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22J.Histochem.Cytochem%22%5BJournal%5D)">Selective binding of lectins to embryonic chicken vasculature.</a> J.Histochem.Cytochem. 51 (5), 597-604 (2003).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarını var

Refrakter MM için yeni terapötik maddelerin geliştirilmesi ilaçların insan MM hücrelerinin duyarlılığını değerlendirmek için daha az zaman alıcı ve pahalı in vivo sistemlerini gerektirmektedir. Şimdiye kadar, sadece birkaç in vivo sistem yeni bir anti-miyeloma terapisi klinik öncesi değerlendirilmesi için kullanılabilir. Bunların hepsi birleşik kütüphaneler 29 büyük ölçekli tarama için kendi sınırlamaları vardır. İnsan MM hücreleri için en iyi güncel modeller oldukça bağışıklık eksikli...

Multipl miyelom (MM), kemik iliğinde malign plazma hücrelerinin proliferasyonu, kemik lezyonları ve immün yetmezlik 1 ile karakterizedir. Proteazom inhibitörleri (bortezomib) ve immün modülatör ilaçlar (pomalidomid ve lenalidomid) gibi yeni tedavi seçenekleri mevcut olmasına rağmen, MM hala korkunç bir prognoz ile tedavi edilemez bir malignite olmaya devam etmektedir 2. Kötü prognoz, özellikle uzun süreli tedavi ve MM klonlarının seçim baskısı altında, tedaviye değişken yanıtlara katkıda bulunan MM hücre klonlarının olağanüstü heterojenliği ile açıklanabilir 3.
Yeni ilaçların ve bunların kombinasyonlarının in vitro ve in vivo klinik öncesi testleri, gelecekteki ilaç geliştirme için kritik ve zaman alıcı bir adımdır. Bu nedenle, hastalığın biyolojisini daha iyi anlamak ve yeni ilaçların keşfedilmesini sağlamak için yararlı in-vivo MM modelleri gereklidir. Aslında, hematolojik maligniteler ve terapötikler için en iyi ksenotransplantasyon modelleri, şiddetli kombine immün yetmezlik (SCID) fareleri 4-7, obez olmayan diyabetik / SCID (NOD / SCID) fareleri 8,9 veya β-mikroglobulin nakavt NOD / SCID fareleri 10,11 gibi bağışıklık eksikliği olan farelerdir.
İnsan MM'nin fare modelleri bazı yönlerden insan hastalığının fenotipine benzeyebilse de, bağışıklık eksikliği olan fareler akraba evlidir, bu nedenle bir ilaca yalnızca bir bireysel yanıtı simüle eder ve maliyetler çok yüksektir. İmmünosupresyon nedeniyle hayvanlar özel bakım koşulları gerektirir ve farelerde insan MM'sinin aşılanması 6 hafta ila 2 ay gerektirir 9,12, hücreler daha düşük hayvan sağkalım oranları ile teknik olarak zorlu bir prosedür kullanılarak doğrudan kemik iliğine aşılanmadıkça 7,13. Bu nedenle, kök hücre bazlı organoid modelleri 14, doku mühendisliği 15 veya sofistike 3D hücre kültürü modelleri 16 kullanan yeni yöntemler oluşturulmuştur. Yakın gelecekte klinik öncesi ilaç testleri için klasik hayvan deneyleri ile rekabet edecekler, ancak canlı organizmalarda sistemik toksisite testlerinin yerini alamayacaklar.
Tavuk embriyosunun, yumurtadan 17-19 çıkana kadar adaptif immün yanıt eksikliği nedeniyle insan hücrelerinin ve dokularının ksenotransplantasyonu için uygun bir organizma olduğu daha önce gösterilmiştir. Ayrıca, her tavuk embriyosu, tavuk popülasyonundaki genetik çeşitlilik nedeniyle uygulanan ilaçlara veya tümör hücrelerine karşı bireysel bir reaksiyonu yansıtır. Koryoallantoik membran (CAM), tümöre bağlı anjiyogenez 20-22'yi incelemek için iyi kurulmuş bir sistemdir. Solid tümörler TAT'a aşılandığında, proliferasyon, invazyon, anjiyogenez ve metastaz dahil olmak üzere in vivo kanserlerin birçok özelliğini gösterirler 23-27. 
Grubumuzun CAM ksenogreft modelleri20,26,27 ile önceki deneyimlerine dayanarak, bir insan 3D kültür sisteminin avantajını ex ovo gelişmekte olan tavuk embriyoları modeliyle birleştiren bir insan MM modeli oluşturulmuştur. Bu MM model sistemi, MM büyüme ilerlemesinin gerçek zamanlı olarak izlenmesine, hücre kütlesinin miktarının belirlenmesine ve klinik öncesi ilaç testine izin verir.

<table><tbody><tr><td>RPMI-8226 hücreleri</td><td>DSMZ</td><td>ACC 9</td><td>STR profilli</td></tr><tr><td>OPM-2 hücreleri</td><td>DSMZ</td><td>ACC 50</td><td>STR profilli</td></tr><tr><td>İnsan mezenkimal kök hücreleri&nbsp;</td><td>PromoCell</td><td>PC-C-12974</td><td></td></tr><tr><td>HEK293FT hücreleri&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>R700-07</td><td></td></tr><tr><td>RPMI1640 Orta Sigma</td><td>Aldrich</td><td>R0883</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu&nbsp; HyClone</td><td>ThermoScientific</td><td>SH30070.03</td><td></td></tr><tr><td>L-Glut-Pen-Strep solüsyonu</td><td>Sigma</td><td>G6784</td><td></td></tr><tr><td>DMEM Medium</td><td>Gibco</td><td>31966</td><td></td></tr><tr><td>NEAA</td><td>Sigma Life Sciences</td><td>M7145</td><td></td></tr><tr><td>Transfeksiyon Ortamı/Opti-MEM&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>51985</td><td></td></tr><tr><td>eGFP lentiviral partiküller</td><td>GeneCopoeia</td><td>LPP-EGFP-LV105</td><td>Kullanıma hazır viral partiküller</td></tr><tr><td>pLenti6/V5Dest6 eGFP vektörü</td><td>Invitrogen</td><td>PN 35-1271</td><td>yazarlardan</td></tr><tr><td>ViralpowerTM ambalaj karışımı&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>P / N 35-1275</td><td></td></tr><tr><td>Transfeksiyon reaktifi / Lipofectamin 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668-027</td><td></td></tr><tr><td>Blasticidin</td><td>Invitrogen</td><td>R210-01</td><td></td></tr><tr><td>Neomisin Biochrom</td><td></td><td>A2912</td><td></td></tr><tr><td>Kollajen Tipi1 &nbsp; Sıçan Kuyruğu</td><td>BD Biosciences</td><td>354236</td><td></td></tr><tr><td>DMEM tozu</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>Art.Nr. 10338582</td><td></td></tr><tr><td>plitidepsin</td><td>Pharmamar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>bortezomib</td><td>LKT Lab., Inc.</td><td>B5871</td><td></td></tr><tr><td>SPF-beyaz tavuk yumurtası</td><td>Charles Nehri</td><td></td><td>Döllenmiş&nbsp; beyaz Leghorn&nbsp; tavuk yumurtası</td></tr><tr><td>Plastik tartı tekneleri</td><td>neoLab</td><td>Art.Nr. 1-1125</td><td>ex-ovo kültürü için</td></tr><tr><td>Petridish kare (Kapaklar)</td><td>Simport</td><td>Ex-ovo kültürü için</td><td>D210-16</td></tr><tr><td>RIPA Tamponu (10x)</td><td>Hücre Sinyali</td><td>#9806</td><td></td></tr><tr><td>Proteaz İnhibitör Tabletler</td><td>Roche</td><td>11 836 170 001</td><td></td></tr><tr><td>Komple Mini EDTA içermeyen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GFP ELISA</td><td>Cell Biolabs, Inc.</td><td>AKR-121</td><td></td></tr><tr><td>Histocette II</td><td>İthalat</td><td>M493-6</td><td></td></tr><tr><td>PFA&nbsp; %37</td> <td>Roth</td><td>7398.1</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Lonza</td><td>BE17-512F</td><td></td></tr><tr><td>Etanol absolut</td><td>Normapur</td><td>20,821,321</td><td></td></tr><tr><td>Roti-Histol</td><td>Roth</td><td>Art.Nr.6640.4</td><td></td></tr><tr><td>Paraplast</td><td>Sigma</td><td>A6330</td><td></td></tr><tr><td>SuperFrost Mikroskop Slaytları</td><td>R. Langenbrinck&nbsp;</td><td>Ürün No.</td><td></td></tr><tr><td>Labor- u. Medizintechnik</td><td>03-0060</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DakoCytomation Yıkama Tamponu 10x</td><td>DakoCytomation</td><td>Code-No-Nr.</td><td></td></tr><tr><td>S 3006</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hedef Alma Çözeltisi (10x)&nbsp; pH 6,1</td><td>DAKO</td><td>Kod-Nr.</td><td></td></tr><tr><td>S 1699</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>H2O2</td><td>Merck</td><td></td><td></td></tr><tr><td>m-a-hu ASMA klonu 1A4</td><td>DAKO</td><td>M0851</td><td></td></tr><tr><td>m-a-hu CD138 klonu MI15</td><td>DAKO</td><td>M7228</td><td></td></tr><tr><td>m-a-hu Vimentin klonu V9</td><td>DAKO</td><td>M0725</td><td></td></tr><tr><td>m-a-hu Desmin klonu D33</td><td>DAKO</td><td>&nbsp; M0760</td><td></td></tr><tr><td>m-a-hu Ki67&nbsp; klon MIB-1&nbsp; &nbsp;</td><td>DAKO</td><td>&nbsp; M7240</td><td></td></tr><tr><td>biyotinile keçi anti-fare IgG</td><td>Vektör Laboratuvarları A.Ş.</td><td>BA-9200</td><td></td></tr><tr><td>Vectastain Elite ABC Kiti</td><td>Vektör Laboratuvarları A.Ş.</td><td># PK-6100</td><td></td></tr><tr><td>HIZLI DAB Tablet Seti.</td><td>Sigma Biyokimyasallar</td><td># D4293</td><td></td></tr><tr><td>Mayer' s haemalaun solüsyonu</td><td>Merck</td><td>1,092,490,500</td><td></td></tr><tr><td>Roti Histokitt</td><td>Roth</td><td>Art.Nr.6638.2</td><td></td></tr><tr><td>Tezgah üstü döner mikrotom</td><td>Thermo Electron, Shandon Finesse ME+</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Doku gömme istasyonu</td><td>Leica, TP1020</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Yumurta Kuluçka Makinesi</td><td>Grumbach&nbsp;</td><td>BSS160</td><td></td></tr><tr><td>Stereo floresan mikroskobu, bir dijital kamera (Olympus E410) ve esnek soğuk ışık ile donatılmıştır.</td><td>Olympus, SZX10</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultra Turrax&nbsp;</td><td>IKA T10</td><td></td><td>Homojenizatör</td></tr></tbody></table>

chicken İnsan multipl miyelom xenograftlarında modeli kurulması tümör büyüme, invasion ve anjiogenez eğitim için

Establishment of a Human Multiple Myeloma Xenograft Model in the Chicken to Study Tumor Growth, Invasion and Angiogenesis

Multipl miyelom (MM), malign plazma hücre hastalığı, çaresiz kalır ve yeni ilaçlar hastaların prognozu iyileştirmek için gereklidir. Nedeniyle, kemik mikro-ve oto / parakrin büyüme faktörlerinin eksikliği insan MM hücrelerinin yetiştirilmesi güçtür. Bu nedenle, insan MM hücreleri üzerinde yeni bir terapötik etkisini incelemek için in vitro ve in vivo kültür sistemlerinde uygun kurmak için acil bir ihtiyaç vardır. Burada, in vitro ve in vivo olarak kompleks 3 boyutlu bir ortamda insan multipl miyeloma hücrelerinin büyümesi için bir model sunmaktadır. MM hücre hatları OPM-2 ve RPMI-8226 transgen GFP ifade transfekte edildi ve insan mezenkimal hücreler ve kolajen varlığında yetiştirilmiştir tip-I üç boyutlu küremsi olarak matris. Buna ek olarak, sferoidler, tavuk embriyo koriyoalantoik membran ı (CAM) üzerinde aşılandı ve tümör büyümesi stereo flöresanlı mikroskobu ile kontrol edilmiştir. Her iki model de yeni terapötik dru çalışma izinkarmaşık bir 3D ortamı ve bir transgen özgü GFP-ELISA greft homojenizasyon sonrası tümör hücre kitlesinin nicelleştirmesinde gs. Ayrıca, onun altında bulunan bir konukçu dokusuna ev ve tümör hücrelerinin invazyonu anjiyojenik tepkilerin bir stereo mikroskop ile günlük olarak takip edilmekte ve insan tümör hücreleri (Ki-67, CD138, vimentin) ya da ana duvar hücreleri kapsayan kan damarları karşı immunohistokimyasal lekeleme ile analiz edilebilir (desmin / ASMA). Sonuç olarak, onplant sistem karmaşık bir 3D ortamda MM hücre büyümesini ve anjiyogenez okuyan izin verir ve MM hücrelerinin hayatta kalma ve çoğalmasını hedefleyen yeni terapötik bileşikler için tarama sağlar.

3D multipl miyelom küremsi deneylerinde hedef bileşiklerin in vitro analizlerde In vitro olarak, birincil insan AA hücrelerin kültürlenmesi sınırlama kemik iliğinden hücre dışı büyüme matrisi ve destekleyici primer insan mezenkimal hücreler kullanarak, insan MM hücre hatları için yeni 3D, in vitro kültür modellerinde kuruldu (Şekil 1A, B). EGFP transgenik MM hücre hatları küremsilerde 3D büyüme sonrası görselleştirme ve MM tümör ki...

İnsan multipl miyeloma (MM) hücreler, mezenkimal hücreler ve hayatta kalma ve proliferasyon için hücre dışı matris bileşenlerinin destek mikro-gerektirir. Biz tümör büyümesi, işgali ve anjiyogenez üzerine kanser ilaçlarının etkilerini incelemek için engrafted insan miyelom ve mezenkimal hücreler ile in vivo tavuk embriyo modelini kurdu.

Chicken İnsan Multipl Miyelom Xenograftlarında Modeli Kurulması Tümör Büyüme, Invasion ve Anjiogenez Eğitim için

Multiple myeloma (MM), a malignant plasma cell disease, remains incurable and novel drugs are required to improve the prognosis of patients. Due to the ...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, kanser ilaçlarının tümör büyümesi, invazyonu ve anjiyogenez üzerindeki etkilerini incelemek için insan miyelom ve mezenkimal hücrelerin aşılandığı bir in vivo tavuk embriyosu modeli oluşturmaktır. Bu, 3D in vitro ve in vivo modellerde analiz edilmek üzere transgenik insan multipl miyelom hücreleri üretilerek gerçekleştirilir. Hücreler, görselleştirme için GFP ve transfekte edilen hücrelerin seçimi için blastin direnci sağlayan lentivirüs ile transfekte edilir.İkinci adım olarak 3B viroidler kullanılır. Transfekte edilen hücrelerle, karmaşık bir 3B in vitro ortamda anti-kanser ilaçlarının geniş ölçekli taranmasına olanak tanıyan mezenkimal hücreler ve hücre dışı matris oluşturulur. Ardından 3B tümöre geçilir.Yeni ilaçların tümör büyümesi, invazyon ve anjiyogenez üzerindeki etkilerini test etmek amacıyla PHE, tavuk embriyolarında in vivo olarak büyütülebilir. Nihayetinde, tümör boyutu ve anjiyojenik yanıtlar günlük olarak ve ötanazi sonrası belgelenebilir. Tümörler GFP, Eliza ve immünohistokimya ile incelenebilir.Bu tekniğin, aynalama ksenogreft modelleri gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, insan tümörlerinin ECX üzerinden işlenmesi ve görüntülenmesidir. Destekleyici insan stromal hücreleri ve hücre dışı matris bileşenleri içeren insan tümör hücreleri, henüz adaptif bağışıklık yanıtları gelişmemiş olan tavuk embriyolarında in vivo olarak büyüyebilmektedir. Bu yöntem, yeni tedavilerin geliştirilmesine yardımcı olabilir ve multipl miyelom hastalarının tedavisi için hızlı preklinik tarama imkanı sağlar.Bu yöntemin görsel gösterimi kritik öneme sahiptir; çünkü insan multipel miyelom hücreleri stres nedeniyle kolayca apoptoza girebilir ve yanak embriyoları, uygun ex vivo kültür koşulları sağlanmadığında yanlış işlem görmeleri durumunda ölebilir. Prosedürü ve tüm kritik adımlarını, laboratuvarımızdan deneyimli bir teknisyen olan Cornelia Hes gösterecektir. Bu protokol için, OPM2 ve RPMI 8226 multipel miyelom hücre hatlarının ve kemik iliğinden elde edilen insan mezenkimal kök hücrelerinin kültürlerini hazırlayın; hücreleri, metin protokolünü takip ederek desteklenmiş besiyerinde normal şekilde inkübe edin; bir milyon multipel miyelom hücresini 100.000 lentiviral partikül ile transfekte edin.Üç gün sonra, tamamlayıcı büyüme ortamı içeren 24 kuyucuklu plakada, her bir mililitre kültür ortamı için iki mikrogram blastisin ekleyerek transfekte hücrelerin seçimine başlayın veya ticari olarak temin edilen EGFP lentivirüsü için mililitre başına 500 mikrolitre neomisin kullanın; iki haftalık seçim sürecinden sonra EGFP eksprese eden hücre kümelerini arayın. Yüzen veya yapışık hücre kümelerini dikkatlice toplayıp bir santrifüj tüpünde resüspande edin, EGFP hücrelerini 1000 GS'de beş dakika boyunca pelletleyin ve bunları alt hatlar olarak genişletin. GFP eksprese eden multipl miyelom hücrelerinin seçimi ve propagasyonundan sonra, hücreleri daha ileri deneylerde kullanmadan önce her zaman yeteneklerini kontrol edin.Başlamak için, bir miktar tip 1 kolajen çözeltisini ve 10X DMEM'i buz üzerinde soğutun. Soğuduktan sonra, 10X DMEM ortamından bir onluk hacmi kolajen çözeltisiyle karıştırın. Ardından, çözeltiyi pH 7.4 değerine nötralize etmek için 0.2 normal sodyum hidroksiti damla damla ekleyin.Çözeltiyi buz üzerinde tutun ve pH değerini bir test şeridi ile doğrulayın. Ardından, transgenik multipl miyelom hücre hatlarını insan mezenkimal hücreleri ile karıştırın. Şimdi hücre karışımını 15 mililitrelik tüplerde 1000 Gs hızında santrifüjleyin. Beş dakika sonra süpernatanı dökün ve bir P 1000 pipet kullanarak peleti bir mililitre soğuk kolajen karışımı içinde yeniden süspanse edin.Bir P 100 uç kullanarak karışımın 30 µL'lik alikotlarını hemen steril parafin üzerine aktarın. 24 kuyucuklu bir kültür plakasında, karışımın 37 °C'de 30 dakika boyunca polimerize olmasını sağlayarak steroidleri oluşturun. Ardından, steroidlerin üzerine farklı işlemler uygulanmış hazırlanmış medyadan 1 mL ekleyin.Örneğin, bir ilaç farklı konsantrasyonlarda uygulanabilir. 37 °C'de 72 saatlik inkübasyonun ardından, PHE floresan stereo mikroskopi ile belgeleyin. Ardından, geniş düz ağızlı pens kullanarak, GFP ekspresyonunu ölçmek için her bir steroidi bir reaksiyon tüpüne aktarın.Bu prosedürün hazırlığı için tavuk yumurtalarını bir yumurta inkübatöründe 37 °C sıcaklıkta ve %70 nemde üç gün boyunca inkübe edin. Ardından yumurtaları açın ve ex ovo kültüründe tavuk embriyolarının daha yüksek hayatta kalma oranlarını elde etmek için embriyoları sterilize edilmiş kare 10 cm plastik tartım kaplarına ve hücre kültürü plakalarına aktarın. 10 cm kültür dokusu yerine plastik tartım kapları kullanın.Ayrıca, kullanmadan önce sterilize edin ve uzun süre PBS içeren bekletme kaplarında ön işlemden geçirin. CAM'in gelişeceği altı gün boyunca yumurtaları in ovo inkübe etmeye devam edin. Şimdi, önceki prosedürde olduğu gibi multipl miyelom ve mezenkimal hücre PHE'lerini hazırlayın, ancak bunu altı kuyucuklu bir plaka içerisinde yapın; ardından pens kullanarak, steroidli bitkileri dokuz günlük tavuk embriyolarının embriyosundan yaklaşık iki santimetre uzaklıktaki CAM'in işlenmemiş yüzeyine transfer edin.Her bir tavuk embriyosu üzerine dört adet bitki yerleştirin. Bitkilerin yerleştirildiği ex ovo embriyoları yumurta inkübatöründe beş gün boyunca bekletin. Ardından, ksenogreftleri floresan stereo mikroskopi ile belgeleyin.Dokümantasyonun ardından, ksenogreftleri çevreleyen bir miktar kamp dokusuyla birlikte çıkarmak için oftalmik makas ve pens kullanın. GFP ekspresyonunu ölçmek veya immünohistokimyasal analiz yapmak için, her bir multipl miyelom steroid veya eksize ksenogrefti proteaz inhibitörleri içeren 0,5 milliliters RIPA içerisine aktararak başlayın. Ardından, dokuları karıştırmak için buz üzerinde bir homojenizatör kullanın; dokular homojenize edildikten sonra, homojenatları önce sıvı azot ve ardından 37 degrees Celsius su banyosu kullanarak dondurup çözdürün.Bu işlemi üç kez tekrarlayın, ardından homojenatları 4 °C'de 20 dakika boyunca 12,000 G'de santrifüjleyin ve süpernatantları saklayın. Sonra, bir miktar süpernatantı ELISA kitinin analiz tamponu ile 1/20 oranında seyreltin. Ardından, bir kit kullanarak biyotinlenmiş anti-GFP antikorları ile GFP seviyelerini ölçün.Eksize edilen xenograftların paraformaldehit ile gece boyu fiksasyonu ile başlayın. Ertesi gün, fikse edilmiş xenograftlarıy dehidre edin ve gömün. İlk olarak, bunları kasetlere yerleştirin.Ardından kasetleri dereceli bir alkol serisinden geçirin. Her banyoyu tam bir saat boyunca bekletin ve işlemi parafin gömme ile sonlandırın. Daha sonra, masaüstü döner mikrotom kullanarak beş mikron kalınlığında ksenogreft kesitler alın ve toplanan parafin kesitleri cam lamlar üzerinde gece boyunca 56 °C'de fırınlayın.Ertesi gün, azalan dereceli alkol serisinden çift distile suya kadar olan geçişlerle kesitlerin parafinini giderin. Lamlar her bir banyoda sadece 10 dakika bekletilmelidir. Ardından, ilgili birincil ve ikincil antikorlarla inkübasyon yapmak için metin protokolünü izleyin ve antikor boyamasından sonra enzim ve substrat ile kolorimetrik deteksiyon gerçekleştirin; hematin ile karşıt boyama yapın ve kesitleri sentetik bir montaj ortamı ile kapatın.EGFP eksprese eden iki multipl miyelom hücre hattı, ilacın varlığında üç gün boyunca kültüre edildi. Bortezomib ve steroidlerin tümör hücreleri üzerindeki etkileri, ardından stereo floresan mikroskobunda GFP ekspresyonu aracılığıyla görselleştirildi.İlaç tedavisinden sonraki tümör hücre kütlesi, PHE'nin homojenizasyonunun ardından EGFP içeriklerinin A GFP Eliza ile ölçülmesiyle nicelleştirilmiştir. Başka bir deneyde, üç günlük tavuk embriyoları altı gün boyunca ex ovo kültüre edilmiştir. Dokuzuncu günde, multipl miyelom hücrelerinden oluşan PHE nakledilmiştir.Her embriyoya dört adet bitki grefti yerleştirildi. Hedef madde olan bortezomib, beş gün sonra 1 mol konsantrasyonda topikal olarak uygulandı; kontrol grubuyla karşılaştırıldığında bitkilerde tümörler oluştu. Floresan tümör kütlesinin görüntülenmesine dayanarak, bortezomibin greftteki multipl miyelom hücrelerinin büyümesini inhibe ettiği belirlendi.Üç farklı hayvandan tekli greftler çıkarıldı, homogenize edildi ve ardından GFP Eliza ile ölçüldü. Kontrol gruplarıyla karşılaştırıldığında, bortezomib ile tedavi edilen dokuda miyelom hücre kütlesinin önemli ölçüde daha az olduğu görüldü. Bu videoyu izledikten sonra, tümör büyümesini, oluşumunu ve gelişim sonrası konak dokuya invazyonunu analiz etmek amacıyla, ilgilendiğiniz kanser hücrelerini tavuk embriyoları üzerinde nasıl kültüre edip deneyler gerçekleştireceğiniz konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.Bu teknik, multipl miyelom alanındaki araştırmacıların, preklinik ilaç testleri için gerekli olan ve yönetimi kolay bir model organizma üzerinden yeni bileşikleri veya ilaçları keşfetmelerinin yolunu açmıştır.

establishment-human-multiple-myeloma-xenograft-model-chicken-to-study

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Kantitatif PCR kullanarak, köklü civciv CAM modeli, uzak organlara insan tümör hücreleri metastaz kantitatif analiz etmek için nasıl kullanılabileceğini göstermektedir.

Kuş Embriyo Model kullanarak Kanser metastaz Kantitatif Analiz

Bu video, bir CAM kanseri metastaz modeli oluşturmak için kanser hücrelerinin tavuk koryoallantoik membran damar sistemine intravenöz olarak enjekte edilmesi prosedürünü göstermektedir. Enjekte edilen hücreler sonunda dağınık tek kanser hücresi kolonileri oluşturur ve bu da kanser istilası ve metastazı çalışmasına izin verir.

Kanser Hücrelerinin Tavuk Korioallantoik Membran Damar Sistemine İntravenöz Enjeksiyonu: Kanser İstilasını ve Metastazı İncelemek için Korioallantoik Membran Kanseri Modeli Oluşturma Prosedürü

Immünyetmezligi farelerde insan tümör ksenogratflardır kanser biyolojisi okumak için değerli araçlardır. Insan hepatoselüler karsinoma hücreleri ya da tümör fragmanlarından deri altı ve intrahepatik ksenograftları oluşturmak için özel protokolleri açıklanmıştır. Alıcı farede hepatektomiden tarafından uyarılan karaciğer rejenerasyon intrahepatik naklini kolaylaştırmak için bir strateji olarak sunulmuştur.

Bağışıklık yetersizliği olan farelere subkutan olarak ve intrahepatik insan hepatoselüler karsinoma ksenograftlarının Üretimi

Birincil invaziv kadavradan mesane kanseri zenograftlarını aşılamak için kurulan teknik laparotomi ve mesane seferberlik gerektirir. Bu prosedür, fareler üzerinde önemli morbidite uğratan teknik açıdan zor ve zaman alıcıdır. Bu nedenle perkütan yaklaşım ultrason rehberlik kullanarak, yüksek hassasiyet geliştirdi.

Kemirgen Ortotopik Mesane ksenogratflarının Minimal İnvaziv kurulması

Civciv koryoallantoik membran (CAM) immün yetmezliklidir ve oldukça vaskülarizedir, bu da onu doğal bir in vivo tümör büyümesi ve anjiyogenez modeli yapar. Bu protokolde, CAM testi kullanılarak üç boyutlu, vaskülarize hepatosellüler karsinom (HCC) tümörlerinin büyütülmesi için güvenilir bir yöntem tanımlanmıştır.

<em&gt; Ovo</emHepatosellüler karsinom Verimli Xenograftlarında Modeli olarak&gt; Piliç Chorioallantoic Membran (CAM) Deneyi

Prostat kanseri, Amerika Birleşik Devletleri'nde kansere bağlı ölümlerin en sık ikinci nedenidir. Ortotopik bir kanser modeli, prostat kanserinin biyolojisini anlamak ve terapötik rejimlerin etkinliğini değerlendirmek için yararlı bir yaklaşım sağlar. Bu protokol, ortotopik bir prostat kanseri fare modeli oluşturmak için gerekli ayrıntılı adımları açıklar.

İnsan Prostat Kanseri klinik öncesi Ortotopik murin modeli

Metastatik berrak hücreli renal hücreli karsinom kapsamlı bir klinik öncesi araştırma için kapsamlı bir hayvan modeli olmayan bir hastalıktır. Bu protokol hastalık için iki yeni hayvan modelini göstermektedir: ortonik olarak implante edilmiş fare modeli ve tavuk koryoallantoik membran modeli, her ikisi de klinik olgulara benzeyen akciğer metastazı göstermektedir.

Fare Böbreği ve Tavuk Koryoallantoik Membranda Kurulan Metastatik Berrak Hücreli Renal Hücreli Karsinom Modelinin Karşılaştırılması

Tavuk koryoallantoik membran modelini jinekolojik ve ürolojik kanser hücre hatlarının ve hasta kaynaklı tümörlerin engraftment için alternatif, nakledilebilir, in vivo modeli olarak sıyoruz.

Jinekolojik ve Ürolojik Kanserleri Incelemek Için Vivo Modelinde Tavuk Chorioallantoic Membran Kullanma

Bu, kanser metastazının baskılayıcılarını veya sürücülerini taramak için etkili bir yöntemdir. Bir ifade kütüphanesi ile transdüklenen hücreler, metastatik koloniler oluşturmak için tavuk chorioallantoic membran vaskülatürüne enjekte edilir. İnvazivliği azalmış veya artmış koloniler, fenotiplerini doğrulamak için ekscised, genişletilmiş, reenjected ve son olarak, yüksek verim sıralaması kullanılarak analiz edilir.

Hızlı ve Nicel Intravital Chick Chorioallantoic Membran Modeli Kullanılarak Metastatik Regülatörlerin Keşfi

Bu protokol, enjeksiyondan 4 gün sonra meydana gelen, hasta kaynaklı B ve T akut lenfoblastik lösemi (ALL) hücrelerinin in ovo ksenogreftlemesini tanımlar.

Burada: Ovo Hasta Kaynaklı Akut Lenfoblastik Lösemi (ALL) Hücrelerinin Ksenogreftlenmesi (PDX-ALL)

Öğrenin, tavuk embriyosu modelinde insan multipl miyeloma hücrelerinin tümör büyümesi, invazyon ve anjiogenez üzerindeki etkilerini incelemek için 3D in vitro ve in vivo yöntemleri. Bu teknik, kanser ilaçlarının hızlı preklinik taramasını sağlar.

Chicken İnsan Multipl Miyelom Xenograftlarında Modeli Kurulması Tümör Büyüme, Invasion ve Anjiogenez Eğitim için

Daha fazla video keşfet