Bir

Aşağıdaki deneyin genel amacı, moleküler ve hücresel mekanizmaları incelemek ve biyolojik olarak daha karmaşık in vivo modellerde test edilmek üzere hipotezler üretmek için bu in vitro dormansi modelini uygulamaktır. Bu, östrojen pozitif meme kanseri hücrelerinin, etkileşimlerinin öncelikle birbirleriyle değil substratumla olduğu konjenik yoğunlukta, fibrin boyun kodlu doku kültürü plaklarında kültüre edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci bir adım olarak, kemik iliğindeki meme kanseri hücrelerini temsil eden FGF two ve fibronektin tarafından desteklenen ve sürdürülen bazı östrojen pozitif hücrelerde dormant bir durum aktive edilir.

Ardından, dormant hücrelerin çeşitli fenotipik ve moleküler yönlerini bozmak ve dormant durumun sürdürülmesindeki rollerini belirlemek amacıyla sisteme antikorlar, inhibitörler, peptitler veya nükleik asitler eklenerek sistem pertürbe edilir. Sonuçlar, fibronectin kaplı plaklarda FGF2 ile inkübe edilen hücrelerin işleme tabi tutulması sonucunda ortaya çıkan büyüyen ve dormant kolonilerin sayısını ve görünümünü göstermektedir. Bu yöntem, kemik iliği mikroçevresinde bulunan östrojen bağımlı meme kanseri hücrelerinde dormant durumun gelişimi ve sürdürülmesinden hangi sinyal yolaklarının, adezyon moleküllerinin veya diğer spesifik moleküler mekanizmaların sorumlu olduğu sorusuna yanıt bulmaya yardımcı olabilir.

Başlamak için, yaklaşık %50 konflüans seviyesindeki CF yedi hücre hattı plakalarındaki kültür ortamını aspire edin ve plakaları ön ısıtılmış PBS ile yıkayın. Ardından, fetal sığır serumu içermeyen yüksek glukozlu DMEM ortamında çözünmüş 0,25 trypsin EDTA çözeltisinden bir mililitre ekleyin. Hücreler ayrılmaya başlayana kadar plakaları 37 °C'de bir ila dört dakika inkübe edin.

Hücreler plakadan ayrılıp tek hücre süspansiyonu oluşturmaya başladığında, iki mililitrelik bir pipetle birkaç kez yukarı aşağı pipetleme yaparak kalan tüm hücre kümelerini parçalayın. Dört dakikalık tripsin işleminden sonra hala hücre kümeleri mevcutsa, hücreleri dökün ve yeni kültürler hazırlayın; dört dakika sonra hala birbirine yapışık kalan hücreler, koloni sayıları sayılırken muhtemelen hataya yol açacaktır. Tripsinizasyon işlemi uygulanmış hücreleri pelletleyin ve bunları kültür ortamında mililitre başına 1.500 hücre olacak şekilde yeniden süspande edin. Hücre süspansiyonunu, beş mililitrelik bir pipet kullanarak nazikçe yukarı aşağı pipetleyerek karıştırın; hücreleri sayın ve otomatik bir hücre sayıcı kullanarak süspansiyonun temel olarak tek hücrelerden oluştuğunu doğrulayın.

Bu işlem, faz kontrast mikroskobu altında bir sayım odası kullanılarak manuel olarak da gerçekleştirilebilir. Ardından, hücre süspansiyonundan üç mililitre çekin ve her seferinde 24 kuyucuklu fibronectin kaplı bir plakanın iki kuyucuğuna bir mililitre olacak şekilde dağıtın. Hücrelerin uzaysal dağılımını optimize etmek için süspansiyonu kuyucuğun ortasına pipetlediğinizden emin olun ve hücreler çökelip yapışana kadar plakayı daha fazla hareket ettirmeyin.

Kalan hücre süspansiyonunu ana hücre karışımına geri aktarın ve tekrar üç mililitre daha çekmeden önce hücreleri karıştırın. Hücrelerin tüp içinde sürekli çökmesi nedeniyle bu prosedür hücre sayısı değişkenliğini azaltacaktır; ayrıca hücrelerin oda sıcaklığında ve CO2 konsantrasyonunda süspansiyonda bekletilmesi konjenik potansiyellerini modüle edeceğinden, büyük hücre hacimlerini dağıtmak için pipetleme işlemi hızlıca gerçekleştirilmelidir; hücreleri 37 °C'de %5 CO2 ortamında inkübe edin. Bu aşama, eksi birinci gün olarak kabul edilir.

Deney zaman çizelgesinde. Analizin sıfırıncı gününde, besiyerini bir mililitre taze besiyeri veya mililitre başına 10 nanogram fibroblast büyüme faktörü iki içeren taze besiyeri ile değiştirin; altı gün sonra bir kuyucuktaki az sayıdaki hücre, orijinal besiyerinin besin veya sitokin kompozisyonunu ya da pH değerini önemli ölçüde etkilemeyecektir.

Üçüncü günde; PI üç kinaz inhibitörü, LY 2 9 4 0 0 2, negatif kontrol LY 3 0 3 5 1 1 veya medya kontrolü gibi bir bozucu ajanın nihai hedeflenen konsantrasyonunun 10 katını içeren 100 µL çözeltiyi, kuyucuklarda halihazırda bulunan 1 mL medyumun üzerine ekleyin ve çözeltilerin difüzyon yoluyla karışmasını sağlayın. Plakayı inkübatöre geri yerleştirip üç gün daha bekletin. Altıncı günde, %0,1 kristal viyole'yi %2 etanol ve 10 mM sodyum borat çözeltisi içinde çözün.

pH dokuz değerindeyken, kuyucuklardaki besiyerini aspire edin ve her bir kuyucuğa 20 dakika boyunca bir mililitre kristal viyole çözeltisi ekleyin. Lavaboya bir buz kovası yerleştirip kovaya sürekli su akıtarak yıkama istasyonunu kurun; plakaları, kuyucuk ağızları kovadaki suya doğru dar bir açıyla bakacak şekilde daldırarak yıkayın. Plaka suyun altına girdiğinde, kuyucuk ağızları aşağı bakacak şekilde plakayı yatay bir açıya getirin.

Ardından plakayı tekrar dar bir açıyla eğin ve tek, nazik ve akıcı bir hareketle çıkarın. Kuyucukların altındaki su artık mavi görünmeyene kadar daldırma işlemini iki veya üç kez tekrarlayın. Sonra plakaları kurumaları için tezgah üzerindeki havluların üzerine ters şekilde yerleştirip gece boyunca bekletin.

Kuruma işlemi tamamlandığında, plakayı ters faz kontrast mikroskobunun altına yerleştirin ve her kuyucuktaki büyüyen ve uyku halindeki koloni sayılarını sayın. 40 x büyütmede, 30 hücreden fazla olan kolonileri büyüyen, 12 veya daha az hücreli kolonileri ise uyku halinde olanlar olarak sayın. Gösterilmiştir. Burada, büyüyen ve uyku halindeki bir koloninin tipik görünümü yer almaktadır.

Büyüyen koloniler 30'dan fazla hücre içerirken, dormant koloniler 12 veya daha az hücre içerir; bu hücreler, kültüre FGF two eklenmediğinde, büyük sitoplazma-çekirdek oranlarına sahip oldukları için büyüyen hücrelerden çok daha büyüktür. Koloniler ağırlıklı olarak büyüyen klonlar tarafından temsil edilir. FGF two varlığında klonların büyük çoğunluğu dormantken, ek ajanların etkisi de bu sistem kullanılarak değerlendirilebilir. Burada, önceden belirlenmiş konsantrasyonlarda iki bozucu ajan, Congenic analizinin üçüncü gününde kuyucuklara eklenmiştir.

Şekil, uyuyan klonların PI üç kinaz inhibitörü LY 2 9 4 0 2 ile seçici olarak inhibe edildiğini, ancak negatif kontrol LY 3 0 3 511'in bir etki göstermediğini temsil etmektedir. Bu deneyler, uykuyu ve tedaviye karşı direnci yöneten unsurların anlaşılmasına yardımcı olmak için kullanılabilir. Burada, PI üç kinaz inhibitörü ile tedavi edilen hayatta kalan uyuyan hücreler, yayılmış görünümlerini kaybetmiş, küçük dendritik hale gelmiş ve stresli görünmüştür.

Bu videoyu izledikten sonra, dormant hücrelerin büyütülmesi için bu konjenik assay'in nasıl kurulacağını, dormantlık sağlandıktan sonra spesifik inhibitörler veya perturbasyon ajanları ekleyerek hücrelerin nasıl pertürbe edileceğini ve pertürbe edici ajanların etkisinin nasıl nicelleştirileceğini iyi bir şekilde kavramış olmalısınız; bu assay, dormant kolonilerin sayılmasıyla veya dormant ve pertürbe hücrelerdeki herhangi bir sayıda ultrastrüktürel immünofenotipik veya moleküler olayın ölçülmesiyle hem kantitatif hem de kalitatif sonuçların değerlendirilmesi için kullanılabilir. İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde başarılar dileriz.