Farelerde Tekrarlanan Hipoksik Önkoşullanma ve Geçici Orta Serebral Arter Tıkanıklığı ardından Nörovasküler Koruma Kantitasyonu

Aşağıdaki deneyin genel amacı, infarkt hacmini ve kan-beyin bariyeri bütünlüğünü eş zamanlı olarak ölçerek, tekrarlayan hipoksi ön koşullaması (RHP) sonrası nöroproteksiyonu nicelleştirmektir. Bu, inmeye karşı nörovasküler koruma sağlamak amacıyla farelerin, hem süre hem de yoğunluk açısından değişkenlik gösteren dokuz stokastik hipoksi maruziyetine tabi tutulmasıyla gerçekleştirilir. Ardından farede inme indüklenir ve bunu Evan's blue enjeksiyonu takip eder.

Evan's blue seçici olarak albümine bağlanır ve hayvanın sakrifiye edilmesinin ardından kan-beyin bariyeri bozulmasının miktarının belirlenmesine olanak tanır. Beyin çıkarılır ve enfarkt hacmini belirlemek için TTC ile boyanır. Sonuçlar, tekrarlayan hipoksi ön koşullandırmasının iskemik inme geçiren farelerde nöroprotektif faydalar sağladığını göstermektedir.

Bu tekniğin, tekli maruziyet hipoksik ön koşullandırma gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, RHP'nin farelerde en az sekiz hafta boyunca nöroproteksiyon sağlamasıdır. Bu çift nicelleştirme yöntemi, kan-beyin bariyeri bozulmasındaki enfarkt hacimlerinin nasıl eş zamanlı olarak ölçüleceği gibi inme araştırmalarındaki temel sorulara yanıt verebilir. Bu yöntem iskemik inmeye dair içgörüler sağlamak için kullanılabilse de, RHP aynı zamanda diğer MSS tabanlı ve sistemik pro-inflamatuar hastalık durumlarına da uygulanabilir. Başlamak için fareleri iki gruba ayırın.

%8 ve %11 oksijene maruz kalan RHP grubu ile aynı anda %21 oksijene maruz kalan kontrol grubunun her bir kafesinin üst filtre kapağını çıkarın ve yem ve su şişeleriyle birlikte kafesi, ilgili oksijen tanklarına bağlı bölmelere yerleştirin. Bölmenin kapağını kapatıp sabitleyin. Tankların ana gaz vanasını açın ve her bir indüksiyon bölmesi için başlangıç akış hızını dakikada iki litre veya LPM olarak ayarlayın.

Beş dakikalık maruziyetten sonra, maruziyetin geri kalanı için akış hızını 1 LPM'ye düşürün. Maruziyet sonunda akışı 0 LPM'ye indirin ve gaz valfini kapatın. Tanklar için.

Kabin kapaklarını açın ve her kafesin filtreli üst kapağını yerine takın. Bir sonraki hipoksik maruziyete kadar kafesleri standart barındırma alanına yerleştirin. Her kullanımdan sonra her bir indüksiyon kabinini bir dezenfektan ve koku giderici ile püskürtme yöntemiyle temizleyin.

Protokolün iki haftalık süresi boyunca hem RHP hem de kontrol farelerini günün aynı saatinde maruz bırakın. Ardından, metinde açıklandığı şekilde geçici orta serebral arter oklüzyonu veya A-T-M-C-A-O gerçekleştirin. EB enjeksiyonu reperfüzyondan 22 saat sonra yapılmalı ve sakrifiye sonrası NTTC boyaması öncesinde kan dolaşımında iki saat boyunca kalmalıdır.

Enjeksiyon için gerekli miktarda EB hazırlayın. Ardından, oda sıcaklığındaki çözeltiden istenen miktarı 0,3 cc'lik bir insülin şırıngasına çekin. 29 gauge bir iğne kullanarak, fareyi düz tabanlı bir sabitleyici ile sabitleyin.

Kuyruğu, lateral ven üstte kalacak şekilde tutun. Lateral venler, kuyruğun orta hattının her iki yanında yer alır. Enjeksiyon sırasında fareyi sabit tutmak için kuyruğun ucundan tutun.

İğneyi yaklaşık üç ila beş milimetre boyunca damara yerleştirin. Damarı delmemeye dikkat ederek, boyanın tamamını bir dakika içinde enjekte edin. Çözelti damara giriyorsa, şırıngaya basınç uygulandığında direnç minimum düzeyde olmalıdır.

Kuyruk ekstremitelerinde ve farenin gözlerinde meydana gelen anlık renk değişimi ile EB'nin başarılı bir şekilde sistemik venöz yolla verildiğini doğrulayın. Kanamayı durdurmak için iğneyi kuyruktan çıkarın ve temiz bir gazlı bezle nazikçe baskı uygulayın. Zamanlameyi başlatın.

Fareyle derisi maviye döndüğünde, EB'nin zayıflamış kan-beyin bariyerine nüfuz etmesi için iki saat boyunca dolaşmasına izin verin. Perfüzyon ve TTC boyaması, reperfüzyondan 24 saat sonra, T-M-C-A-O işleminden 24 saat sonra ve EB uygulamasından iki saat sonra gerçekleştirilmelidir; hayvanı küçük bir indüksiyon odasında izofloran aşırı dozu ile sakrifiye edin. Ölüm sonrası oksijen yokluğunda başlayan otolizi minimize etmek için perfüzyon, sakrifiyeyi takiben derhal başlatılmalıdır.

Hayvanı, ön kolları patilerinden sabitlenmiş şekilde bir strafor platforma hızlıca sabitleyin. Kaburga kafesinin hemen altındaki orta hattan başlayarak karın duvarı boyunca lateral bir insizyon yapın. Kalbi açığa çıkarmak için diyaframı dikkatlice kesin.

27 gauge kanatlı infüzyon iğnesine bağlı, buz gibi soğuk 0,01 molar fosfat tamponlu salin (PBS) ile doldurulmuş 60 cc'lik bir şırınga kullanarak, perfüzyon pompasını dakikada beş mililitre akış hızıyla çalıştırın. İğnenin ucunu kalbin sol ventrikülüne yaklaşık 0,5 santimetre girecek şekilde yerleştirin ve sağ atriumu kesin. Perfüzyon sırasında, venöz kan görünene kadar atriumdan kademeli olarak seyreltilmiş venöz kan akmalıdır. Kalpten 30 mililitre 0,01 molar PBS transkardiyak olarakle perfüze edilince sıvı renksiz hale gelir.

Ardından, şeffaf 20 sayımlama şişesine beş mililitre TTC çözeltisi ekleyin. Perfüzyonu takiben hayvanları hemen giyotininle kesin ve gerekirse küçük makaslar ve bir spatula kullanarak beyinleri çıkarın. Tıkalı orta serebral arterin kontralateral hemisferinin, belirgin bir EB sızıntısı veya ödem olmaksızın soluk göründüğünü kontrol edin.

Ardından, fare beyninden 1,0 milimetre kalınlığında koronal kesitler almak için tasarlanmış akrilik bir beyin matrisine PBS dökün. Beyni dorsal tarafı yukarı bakacak şekilde matrise yerleştirin ve hemen üzerine PBS dökün. Beyni nemli tutun.

Matrisin rostral tarafından ikinci slota 0,21 mm kalınlığında paslanmaz çelik bir bıçak yerleştirerek olfaktor bulbları çıkarın. Ardından, matrisin caudal tarafından dördüncü slota bir bıçak yerleştirerek serebellumu çıkarın. Matriste kalan slotların orta slotuna bir bıçak yerleştirin.

Ardından, dilimleme sırasında dokunun en eşit şekilde dağılmasını sağlamak için kalan bıçakları, geri kalan dokuyu eşit şekilde ikiye bölecek şekilde yerleştirin. Tüm bıçaklar yerleştirildiğinde, beyni nemlendirmek için üzerine bir ila iki damla PBS ekleyin. Sonrasında, bıçakları rostral bölgeden başlayarak matristen teker teker çıkarın.

İlk yedi kesiti TTC analizi için ayırın. T-M-C-A-O sonrası, kesitleri bıçaktan TTC ile doldurulmuş şişeye dikkatlice aktarmak için küçük bir spatula kullanın. Tüm kesitler şişeye girdikten sonra, şişeyi kapatın ve kesitler pembe renge dönene kadar sıcak su banyosuna yerleştirin.

Kesitlerin üst üste binmesini ve buna bağlı olarak boyamanın düzensiz olmasıyla sonuçlanabilecek durumları önlemek için, gerekirse şişeyi banyo içinde nazikçe döndürün. Ardından TTC'yi dökün ve beyin kesitlerini kaplayacak şekilde şişeye %4'lük paraformaldehit çözeltisi ekleyin. Bu işlem TTC kimyasal reaksiyonunu sonlandırır.

Kesitleri hemen temiz, bir inç çarpı üç inç boyutundaki bir cam lam üzerine yerleştirin ve kesitler lama dizildiğinde rostralden kaudal yöne doğru yönlendirin. Lamı tarayın. Görüntü analizi için standart bir tarayıcı kullanarak çözünürlüğü minimum 600 DPI olarak ayarlayın.

Taranan görüntüye hayvanın adını ve metrik bir cetvel eklediğinizden emin olun. Son olarak, tüm verilerin toplandığından emin olmak için lamı ters çevirin ve arka yüzünü tarayın. RHP, kontrol farelerine kıyasla enfarkt hacimlerini %46 oranında azaltır, ancak aynı hayvanlardan elde edilen TTC verilerine göre hemisferik şişme üzerinde herhangi bir etkisi yoktur.

RHP, contralateral hemisferle normalize edilmiş Evans Blue sızıntısı ile tanımlanan kan-beyin bariyeri bozulmasını azaltır; burada RHP uygulanmış ve %21 oksijene maruz bırakılmış kontrol grubuna ait temsili TTC boyamaları yer almaktadır. Fareler, her bir örneğin altında listelenen ilgili enfarkt hacimleri ve Evans blue sızıntılarıyla birlikte gösterilmiştir. İpsilateral, beynin iskemik hemisferini; contralateral ise beynin etkilenmemiş tarafını ifade eder.

Bu prosedürü uygularken, füzyondan 22 saat sonra Evans blue enjekte etmeyi ve hayvan sakrifikasyonundan önce, gelişimin ardından iki saat boyunca dolaşıma izin vermeyi unutmamak önemlidir. Bu teknik, preklinik inme araştırması alanındaki araştırmacıların, farelerde inmeye karşı endojen korunma mekanizmalarını keşfetmelerinin yolunu açmıştır. Bu videoyu izledikten sonra, kan-beyin bariyeri bütünlüğü ve enfarkt hacimlerinin çift yönlü kantifikasyonu yoluyla RHP'nin nöroprotektif etkisinin nasıl ölçüleceği konusunda net bir anlayışa sahip olmalısınız.