Etanol sedasyon Hassasiyet ve hızlı Hoşgörü Ölçüm Ucuz bir, Ölçeklenebilir Davranış Deneyi

Aşağıdaki deneyin genel amacı, meyve sineklerinin etanol sedasyonuna karşı duyarlılığını değerlendirmektir. Bu, sineklerin viallere yerleştirilmesi ve etanol buharına maruz bırakılmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım, tüm sinekler sedatize olana kadar, tekrarlanan zaman noktalarında her vialde sedatize olan sinek sayısını belirlemektir.

Ardından, zaman noktası interpolle edilir. Her şişe için sineklerin %50'si sedate edildiğinde, sonuçlar meyve sineklerini etanolle sedate etmek için gereken zamanın bir indeksini gösterir; bu prosedürü bugün laboratuvarımdaki bir öğrenci olan Simran Sindu uygulamalı olarak gösterecektir. Deneye başlamak için, tek cinsiyetteki sinekleri taze besin içeren şişelere, beş dakikaya kadar CO2 altında 11'erli gruplar halinde toplayın ve sineklerin çevre kontrollü bir alandaki besin şişelerinde gece boyunca dinlenmelerine izin verin.

Saf %100 etanolü, nihai konsantrasyonu %85 olacak şekilde saflaştırılmış su ile seyrelterek etanol çözeltisini hazırlayın. Çözeltinin gece boyunca oda sıcaklığına dönmesine izin verin. Analizden önce, test tüpü olarak kullanılacak temiz ve boş bir gıda şişesi hazırlayın. Test edilecek her sinek şişesi için yeni bir selüloz asetat tıpa, bir silikon tıpa ve bir mililitre etanol çözeltisi temin edin; oda sıcaklığını 20 ila 25 °C'ye ve bağıl nemi %55 ila %65'e ayarlayın. Her şişe grubuna benzersiz bir kod ataması yapması ve bu kodu daha sonra kayıt altına alması için başka bir çalış görevlendirin; kodlanmış sinek şişelerini alışmaları için birkaç dakika boyunca test odasına yerleştirin. Ardından, boş test şişelerini sinek şişelerindeki kodlarla eşleşecek şekilde etiketleyin.

Bir hesap tablosunda, her tüp için bir sütun olacak şekilde kodları sütunlara girerek basılı bir test günlüğü oluşturun. Test günlüğünü kılavuz olarak kullanarak, sineklerin bulunduğu kodlu besin tüplerini ve boş test tüplerini test odasında eşleşen diziler halinde düzenleyin; ardından sinekleri besin tüplerinden, tek tek, eşleşen ve etiketlenmiş test tüplerine aktarın.

Ardından, selüloz asetat tıkaçlar vial üstlerinden iki santimetre aşağıda kalana kadar hemen test viallerine yerleştirin. Sıfırıncı zaman değerlendirmesi için her bir vialle başparmak ve işaret parmağıyla tek tek tutun.

Sineklerin tüpün dibine düşmesi için masaya üç kez hafifçe vurun. 30 saniye bekleyin ve hareketsiz kalan ve/veya ölü sineklerin sayısını sayın. Her bir tüp için ilgili zamandaki hareketsiz ve ölü sinek sayısını kaydedin.

Sert kopya test günlüğünde sıfır dakika olarak kaydedin. Zamanlayıcıyı sıfır anında başlatın ve hemen selüloz asetatın üzerine bir mililitre etanol ekleyin. Sıradaki ilk dört tüplük set için beş saniyelik aralıklarla dairesel hareketlerle karıştırın.

Setleki dört test tüpünün tamamına etanol eklendiğinde test edileceklerdir. Her tüpü sızdırmaz hale getirmek için 1, 2, 3, 4 ve beşinci dakikalarda birer silikon tıpa yerleştirin. Sırasıyla ikinci, üçüncü, dördüncü, beşinci ve altıncı dörtlü tüp setlerine birer mililitre etanol ekleyin.

Altı dakika olduğunda, her dörtlü vial LS setine etanol ekledikten sonra silikon tıkaçları takmaya devam edin. İlk dörtlü vial setini, her bir vial'i başparmak ve işaret parmağıyla kavrayıp sineklerin vial tabanına düşmesi için masaya üç kez hafifçe vurarak test edin. 30 saniye bekleyin, ardından sedatize olmuş toplam sinek sayısını sayın ve kaydedin.

Sinekleri, birincisi, flakon tabanında durup yürümedikleri veya ikincisi, kanatlarını çırpsınlar ya da çırpmasınlar sırtüstü yattıkları durumlarda sedatize olarak skorlayın. Kümedeki her bir flakonu 7, 8, 9, 10 ve 11. dakikalardaki bu çizelgeye göre beşer saniyelik aralıklarla işleme alın.

İkinci, üçüncü, dördüncü, beşinci ve altıncı şişe setlerini, ilk set için 12. dakikada yapıldığı gibi sırasıyla test edin. İlk dörtlü şişe setini tekrar test edin ve ikinci, üçüncü, dördüncü, beşinci ve altıncı şişe setlerini sırasıyla 13, 14, 15, 16 ve 17. dakikalarda test etmeye devam edin. Sineklerin tamamı sedatize olana kadar test etme işlemine devam edin.

Hard kopya testindeki her bir vialdeki toplam sinek sayısını girin. Sıfırıncı zamandaki hareketsiz veya ölü sinekleri, toplam sinek sayısından düşerek kaydedin. Etanol sedasyon deneyiyle elde edilen ham veriler, zamanın bir fonksiyonu olarak aktif sinek yüzdesine dönüştürülmüştür.

Birincil verilerden elde edilen etanol sedasyonuna duyarlılık, sedasyon süresi 50 veya ST 50 olarak nicelendirilmiştir. Sineklerin %50'sinin sedate olması için gereken süre veya eğri altındaki alan (AUC). Analiz, sinir sistemindeki calnexin 14 D'ye karşı RNAi etkilerini tespit etmiş ve bunun kontrollere kıyasla etanol duyarlılığını körelttiğini; scab ve rouser mutasyonlarının etanol sedasyon duyarlılığını artırdığını ve happy hour mutasyonunun ise kontrollere kıyasla etanol sedasyon duyarlılığını körelttiğini göstermiştir. Yöntem optimize edildikten sonra.

Bu teknik, doğru şekilde uygulandığında bir buçuk saat içinde tamamlanabilir.