Name: Locomotion Speed Etanol Etkilerinin Ölçülmesi için bir Testi Caenorhabditis elegans /em (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 35 s
Description: Öğrenin Caenorhabditis elegans kullanarak etanolün hareket hızı üzerindeki etkilerini ölçmek için davranışsal analiz yöntemini. Bu teknik, alkol duyarlılığı ve tolerans gelişimini niceliksel olarak değerlendirir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

R01AA016837 (JCB) ve P20AA017828 (AGD ve JCB): Bu çalışmalar Ulusal Sağlık Enstitüleri, Ulusal Alkolizm ve Alkol Bağımlılığı Enstitüsü hibe ile desteklenmiştir.

Tahlil önce Günü&#39;nde gerçekleştirin 1. Adım <ol><li> Taze nematod büyüme ortamına L4 aşamada solucanlar almak (NGM) plakaları OP50 E. bir çim ekildi 20 CO / N de coli, ve kültür onları. Her deney koşulu 10 solucan gerektirir; solucanlar O / N kaybı sağlamak için solucan fazlalığı almak. <ol><li> İlk gün yetişkin Yalnızca tahlil hayvanlar; Birçok mutantlar vahşi tip daha yavaş bir hızda büyür. Test edilen tüm hayvanların ilk gün yetişkin böylece gelişimsel gecikmelere sahip suşlar için toplama zamanlamasını ayarlayın. </li></ol></li></ol> 2. Adım Tahlil günü gerçekleştir <ol><li> Deney için hazırlanması: <ol><li> Standart giremeyen 60 x 15 mm NGM plakalar üzerinde tahlilleri gerçekleştirin. Plakalar her kapak kapalı olarak, 2 saat süre ile 37 ° C&#39;de kullanılacak kurutun. Her deneysel deneme için, dört kurutulmuş NGM tabak kullanın; Bu 0 mM ve 400 mM etanol tahlil plakaları ve beraberindeki alıştırma plakaları olacaktır. NOT:NGM plakalar kullanımı Burada önemli olan; plakalarının bileşimin farklılıklar özellikle bunların ozmolarite, güçlü bir davranışı üzerinde etanol doz etkisini etkileyebilir, bu hayvanlar 20 biriken miktarda etanol değişiklikler, en azından kısmen, kaynaklanmaktadır. NGM agar 160 mOsm. </li><li> Kurutma işleminden sonra, giremeyen NGM plakalar, her deneyde kullanılan ve ağırlığı dikkat edilmesi tartın. Boş levha ağırlığına göre plakalarda ortamın hacmini belirler. Hacme agar ağırlıkça dönüşümünü tahmin etmek üzere ortam su, eşit hacimde aynı ağırlığa sahip olduğunu varsayalım. Not: En tutarlı sonuçlar, orijinal 10 ml hacim 8,3-8,9 ml arasında bir post-kurutma hacmi yeterince dehidrate olan NGM ortamı ile tespit edilmiştir. 2 saat kuru zaman bir alternatif plakalar kuluçka farklılıkları hesaba bu hacim aralığı ulaşana kadar kurumaya olduğunu. </li><li> 4 bakır halkaları (1 iç çapı eritin.Ve 6 cm) levhaların her birinin yüzeyi, yaklaşık 3 için bir alev farklı genotipler ve worms.Grasp her forseps ile bir halka, ve ısı ve tedavi grupları için corrals (Bunsen brülör güçlü bir alev çalışır) olarak hareket halinde sn. Hala &#39;atlama&#39; önlemek için forseps ile halka tutarak hemen bir plaka üzerinde halka yerleştirin. <ol><li> Halka halka üzerinde birkaç noktada forseps ile hafifçe bastırarak agar yüzeyine karşı düz aittir emin olun. Halka yerleştirirken, ek bir üç yüzük için odayı terk etmek dikkatli olun. </li><li> Dört kameranın görüş alanı içerisinde olacak şekilde olduğu gibi birbirine yakın zamanda yerleştirmek için özen levhanın yüzeyine üç ek bakır halkalar eritin. NOT: agar ile iyi bir sızdırmazlık yapma tahlil sırasında halkalarda solucanlar tutmak esastır. Plaka etrafında atlamak Yüzükler agar ile doğru mühür yapmak olası değildir vesolucanlar yuva sağlar ve solucanlar görselleştirmek müdahale ağar, yara olabilir. </li><li> Her tahlil plaka için kurutulmuş ve dereceye giremeyen ve hiçbir etanol alacaksınız gereken eşlik eden &quot;alıştırma&quot; plaka hazırlamak. Bu plakalar üzerinde dört bakır yüzük yerleştirin. </li></ol></li><li> Halkanın kendisinin görüş alanında yazma için özen, aşağıdaki halka kullanılacak solucan suşu ile her bir halkada plakaların alt etiketleyin. Eşlik eden aklimasyonundan plaka tahlil plaka üzerindeki etiketleri eşleştirin. </li><li> Nihai konsantrasyon 0 mM ya da 400 mM metanol (hacim için ağırlık), böylece her bir deney plakası eklemek için% 100 etanol miktarını hesaplayın. Her deney için (n = 1), bir 0 mM ve bir 400 mM etanol plaka olacaktır; alışma plakaları etanol almıyorsunuz. Plaka yüzeyinde etrafında pipetleme, etanol ekleyin. Plaka sızdırmaz laboratuar filmi kullanın ve 2 saat süre ile, bir tezgah üstünde dengelenmeye gelmeye bırakın. </li><li> 1.5 saat geçtikten sonra, tahlil, adım 2.2 aklimasyonundan adımını başlar. </li></ol></li><li> Hareket deneyi yapın: Deney plakaları <ol><li> Dikkatle aklimasyonundan plaka üzerinde bir bakır halka merkezine her deney grubu 10 solucanlar aktarmak. Solucan çekme hafifçe kazıyarak bu noktada agar üzerinde görünür herhangi bir gıda çıkarın. Aynı suşları çalışmalar boyunca aynı sırayla plakalar koymak değil böylece deney grubu deneysel çalışmalar boyunca plakalar koymak sırayı Vary. Not: hedef alıştırma levha gıda deney plakasına aktarılır ise solucanlar gıda ve hareket yeteneği üzerindeki ilacın etkisini gizlenir etrafında birikir, çünkü yemek az miktarda plakaya hayvanlar transfer edilmesidir. </li><li> Bu solucanlar yuva sağlayacak ve tahlil bozacak gibi, çekme ile agar yüzeyine kırmak için değil dikkatli olun. 30 dakika boyunca oda sıcaklığında solucanlar inkübe edin. </li><li> Her plaka insiyatifleri arasında uygun bir aralık olduğundan emin olun. Deneyimli bir deneyci 40 hayvan, 4 yüzük &lt;1.5 dakika boyunca 10 / halka taşıyabilirsiniz, ancak 2 dakika kadar herhangi bir aralık kabul edilebilir. Standart tahlil 10-12 dakika ve 0 mM ve 400 mM etanol hem de maruz 30-32 dk kayıt filmleri vardır. </li><li> 0 mM maruz kalma aklimasyonundan plaka ve yaklaşık 2 dk 30 sn dışında ikinci filmi başlamalıdır ilk önce film dosyasının tasarrufu sağlamak için 400 mM maruz kalma aklimasyonundan plaka başlatın. </li><li> 30 dakikalık bir alışma süresinden sonra, deney plakalarına alıştırma levhalarından solucanlar aktarın. Her plakanın tamamlama arasındaki zamanlama takip, alıştırma plakaya ilave edildi sırayla deney plakalarına dişli (0 mM ya da 400 mM etanol) aktarın. Buharlaşma etanol kaybını en aza indirmek için laboratuvar film ile plaka Seal. </li><li> Udüzleştirilmiş çekme üstüne solucanlar toplamak için ince kenarlı basık solucan kıracağıyla bir çekiş hareketi se. Bu çekme solucanı yapıştırıcı yardımcı olarak yaygın solucan aktarılması kullanılan bakteri, kullanılmadan analiz plakasına giremeyen alıştırma plaka solucanlar transferini gerçekleştirir. Not: plaka ilk solucanlar plakaya eklenmiştir son solucanlar daha uzun etanol maruz çünkü hayvanlar bu aşamada transfer edildiği hızı çok önemlidir, ve daha önceki zaman noktalarında, bazı zamana bağlı etkilere sahip olur. Bu suşlar, deneysel çoğaltır genelinde ilk plaka üzerine yerleştirilir döndürülmesi için önemli nedenidir. </li></ol></li><li> Hareket Testi gerçekleştirin: Film Çekme <ol><li> Böyle bir 2048x2048 7.4 ile bir 0.5x mikroskop objektif, 0.8x büyütme ve bir kamera gibi görüş alanı (yaklaşık 42x42 mm 2 kare), tüm dört yüzük eşzamanlı görüntüleme için izin veren bir mikroskop / kamera arada kullanın81 m piksel CCD. </li><li> Yoğunluk eşik adımında nesne tanıma yardımcı olan görüş alanı, üzerinde bile aydınlatma kullanarak (aşağı bakınız). Bir 3 &quot;x3&quot; arka iyi çalışıyor. </li><li> Görüntü ışık kaynağı bulaşan geleneksel mikroskop ile karşılaştırıldığında arka kullanarak kaybolur kontrastı üreten bir plaka yerleştirilmiş medya tarafı yukarı solucanlar (kapak aşağı). </li><li> Hareketli solucanlar zaman atlamalı filmleri yakalamak için görüntü analiz yazılımı hazırlayın. 2-min (120 kare) film olarak, 12-bit gri ölçekli görüntüler, her 1 sn yakalamak için yazılım ayarlayın. Hala yeterli görüntü çözünürlüğü korurken, çıktı dosyasının boyutunu azaltmak için, 1024x1024 piksel görüntü yakalamak için bir 2x2 binning modunu kullanın. </li><li> Film kaydetmek. Son solucanlar 10 dakika sonra o plaka yerleştirildi ilk plaka (0 mM etanol) 120 kare film kayıt başlayın. Film dosyayı kaydedin. </li><li> İkinci plaka (400 mM etanol) kaydedin. Için bu işlemi tekrarlayınSon solucanlar işleminden 30 dakika sonra başlayan, her iki levha her teşhir için, 30-32 dakikalık bir zaman noktaları yakalamak için birinci plaka (0 mM etanol) yerleştirildi. NOT: analiz edilecek bir sonraki plaka kaydı başlamadan önce her yakalama seansından sonra görüntü dosyalarını kaydetmek için yeterli zaman tanıyın. </li><li> Arşivlenmiş film geleceğe prova ve 8-bit 256 gri skala TIFF dosyaları için her filmin bir kopyasını dönüştürmek, bu filmler açıldı ve ImageJ 28 gibi diğer kamu alanı, açık kaynak kodlu yazılım programları görüntüleme, analiz edilecek izin vermek. NOT: Burada anlatılan görüntü analiz yazılımı özel bir dosya biçimini kullanır. </li></ol></li><li> ImagePro yazılımını kullanarak film analizi. <ol><li> Yakalanan kez, Image-Pro yazılımı veya eşdeğer Artı kullanarak film analiz. NOT: Diğer nesne izleme yazılımı çeşitli başarıyla birden C izlemek için kullanılır olmuştur ki mevcut tek seferde 29 ve böyle de elegansYazılım makul nesne tanımlama adımlar benzer ilkelere dayalı olarak burada tarif için yerine olabilir. açıklanan yöntem küçük farklılıklar olabilir Resim-Pro Plus yazılımı sürümleri 6,0-6,3 ve 7.0, Resim-Pro Plus yazılımının yeni sürümlerini ilgilidir. </li><li> 2-min (120 kare) segmentlerde filmleri analiz. İlk olarak, arka plan düzleştirmek ve solucan nesnelerin kontrastı artırmak için görüntülere bir filtre uygulamak. Aşağıdaki gibi filtre seçin: Menü&gt; İşlem&gt; Filtreler&gt; Donanım&gt; Flatten: Parametreler: Arka plan = Karanlık; Genişlik = 20 Pix Özellik. </li><li> Filtreleme aşamasından sonra film yeniden kaydetmek ama her zaman kendi filtresiz formda orijinal film korumak. <ol><li> Yerleştirilir ve bakır halka ile üst üste büyüklükte faiz (ROI) bir dairesel bölge ile ayrı ayrı halka hayvanların lokomosyonu analiz. Belirlemek ve Menü&gt; Tedbir ile solucanlar izlemek&gt; Parça ... komutunu Nesneleri; Bu Takibi D getirirata Tablo penceresi. Takip Seçenekleri düğmesi belirli parçalar hariç olmak üzere ve herhangi bir deneysel eserler sınırlamak için olanak sağlar. </li></ol></li><li> Otomatik Takip sekmesinde, aşağıdaki parametreleri kullanın: Parça Parametreleri: Hız sınırını (arama yarıçapı) = 400 mm / çerçeve, İvme sınırı = Otomatik, Minimum toplam hat uzunluğu = 400 mikron, Baskın hareket type = kaotik; Parça parametreleri nesneler: kısmi parçalar = yes, Min uzunluğu = 21 kare, İzleme tahmin derinliği = 1 çerçeve izin verin. </li><li> Izleme sürecini başlatmak için, otomatik olarak tüm parçalar Bul Kont / Boyut seçenekleri iletişim kutusunu ve İzleme iletişim kutusunu getirmek için düğmeye işlev tıklayın. Analiz için bir solucan nesne vurgulamak ve hafif arka plan pikselleri görmezden solucan piksel gri ölçekli yoğunluğunu kullanan önemli eşik adım sağlar Kont / Boyutu iletişim kutusunda, içinde Intensity Range Seçimi Manuel seçeneğini seçin. <ol><li> Yoğunluk eşik SLI ayarlayınders, tüm karanlık nesneleri vurgular kapsayıcı bir dizi oluşturmak için (bir alt sınırını ayarlamak için, bir üst sınırını ayarlamak için). 0-4,095 bir ölçekte 0-1,500 bir dizi ince ayar için iyi bir başlangıç ​​noktasıdır. </li><li> Bakır halka ve plakalar üzerinde herhangi bir enkaz gibi tek bir solucan nesnesi daha büyük ve daha küçük nesneleri, dışlamak için bir boyut filtresini uygulayın. Tedbir ile duruşlar çeşitli bireysel solucanlar için boyutları kapsayan bunu yapmak için iki boyut parametrelerini ayarlayın&gt; Kont / Boyut seçenekleri iletişim kutusunda seçin Ölçümler menü öğesi. (Alan aralığı: 28,000-120,000 mikron 2 ve Çevre aralığı: 600-2,500 um). </li><li> Bir mutant suş analiz edilecek plaka üzerinde önemli ölçüde daha küçük ya da diğer hayvanlara göre daha büyükse ayarları değiştirilebilir olması gerekmez, böylece ilk hayvanları izleme önce suşları farklı boyutlarda uyum nesne tanıma için filtre ayarları aralığını genişletmek orta analizi. </li></ol> &lt;/ Li&gt; <li> Takip iletişim kutusunda Devam tıklayarak izleme işlemini tamamlayın. Görme otomatik filtre ayarlarına göre bunu dışlamak için geçerli bir neden olmadıkça, her solucan temsil sağlamak için filmde her solucanın ilerleme çıkış parçaları karşılaştırın. Manuel boyutu filtre kriterlerini doğruladı olmayan solucan nesnelerin varlığı ile üretilen parçaları silin. </li><li> Her çerçeve arasındaki her solucanın hızını hesaplamak için yazılımını kullanın (mesafe kareler arasında 1 saniyede bir nesnenin sentroidinden için gitti) ve solucanlar nüfus için tüm parçalar arasında her parça için ortalama hız ve ortalama hızı görüntüler bakır halka. Bu son ortalama deneysel çalışmalarda açısından n = 1 olmak düşünün. İstatistiksel analizler ve veri arşivleme için bir elektronik tablo programı veri ihracat. </li><li> Veri plakasında ilk halka kaydedildi edildikten sonra, bir sonraki halkaya yatırım getirisini taşımak veparametrelerden birini değiştirmeden, izleme işlemini tekrarlayın. </li><li> Lokomosyon ile göreceli hız hesaplayın: </li><li> Bağıl hız (%) = işlenmiş işlenmemiş (400 mM) hız / (0 mM) hız x 100. NOT: Farklı genetik manipülasyonlar genellikle hayvanların bazal lokomosyon oranını değiştirmek. Hayvanların hareket hızına etanol etkiyi tespit etmek ve farklı genotipler ve koşullar arasında, bu etkilerini karşılaştırmak mümkün olması için, göreceli hızını hesaplar. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Prescott, C. A., Kendler, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+and+environmental+contributions+to+alcohol+abuse+and+dependence+in+a+population-based+sample+of+male+twins%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Genetic and environmental contributions to alcohol abuse and dependence in a population-based sample of male twins.</a> Am. J. Psychiatry. 156, 34-40 (1999).</li>
<li>Schuckit, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetics+of+the+risk+for+alcoholism%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Addict.+Article+Review%22%5BJournal%5D)">Genetics of the risk for alcoholism.</a> Am. J. Addict. Article Review. 9, 103-112 (2000).</li>
<li>Heath, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+differences+in+alcohol+sensitivity+and+the+inheritance+of+alcoholism+risk%5BTitle%5D)+AND+%22Psychol.+Med%22%5BJournal%5D)">Genetic differences in alcohol sensitivity and the inheritance of alcoholism risk.</a> Psychol. Med. 29, 1069-1081 (1999).</li>
<li>Rodriguez, L. A., Wilson, J. R., Nagoshi, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Does+psychomotor+sensitivity+to+alcohol+predict+subsequent+alcohol+use%5BTitle%5D)+AND+%22Alcohol.+Clin.+Exp.+Res%22%5BJournal%5D)">Does psychomotor sensitivity to alcohol predict subsequent alcohol use.</a> Alcohol. Clin. Exp. Res. 17, 155-161 (1993).</li>
<li>Schuckit, M. A., Smith, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+8-year+follow-up+of+450+sons+of+alcoholic+and+control+subjects%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Gen.+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">An 8-year follow-up of 450 sons of alcoholic and control subjects.</a> Arch. Gen. Psychiatry. 53, 202-210 (1996).</li>
<li>Kalu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heritability+of+level+of+response+and+association+with+recent+drinking+history+in+nonalcohol-dependent+drinkers%5BTitle%5D)+AND+%22Alcohol.+Clin.+Exp.+Res%22%5BJournal%5D)">Heritability of level of response and association with recent drinking history in nonalcohol-dependent drinkers.</a> Alcohol. Clin. Exp. Res. 36, 522-529 (2012).</li>
<li>Davis, S. J., Scott, L. L., Hu, K., Pierce-Shimomura, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conserved+single+residue+in+the+BK+potassium+channel+required+for+activation+by+alcohol+and+intoxication+in%5BTitle%5D)+AND+%22C.+elegans.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Conserved single residue in the BK potassium channel required for activation by alcohol and intoxication in.</a> C. elegans. J. Neurosci. 34, 9562-9573 (2014).</li>
<li>Raabe, R. C., Mathies, L. D., Davies, A. G., Bettinger, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Omega-3+Fatty+Acid+Eicosapentaenoic+Acid+Is+Required+for+Normal+Alcohol+Response+Behaviors+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">The Omega-3 Fatty Acid Eicosapentaenoic Acid Is Required for Normal Alcohol Response Behaviors in C. elegans.</a> PLoS ONE. 9, e105999(2014).</li>
<li>Topper, S. M., Aguilar, S. C., Topper, V. Y., Elbel, E., Pierce-Shimomura, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alcohol+disinhibition+of+behaviors+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Alcohol disinhibition of behaviors in C. elegans.</a> PLoS ONE. 9, e92965(2014).</li>
<li>Bhandari, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chloride+intracellular+channels+modulate+acute+ethanol+behaviors+Drosophila%2CCaenorhabditis+elegans+and+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Brain+Behav%22%5BJournal%5D)">Chloride intracellular channels modulate acute ethanol behaviors Drosophila,Caenorhabditis elegans and mice.</a> Genes Brain Behav. 11, 387-397 (2012).</li>
<li>Davies, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+central+role+of+the+BK+potassium+channel+in+behavioral+responses+to+ethanol+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A central role of the BK potassium channel in behavioral responses to ethanol in C. elegans.</a> Cell. 115, 655-666 (2003).</li>
<li>Davies, A. G., Bettinger, J. C., Thiele, T. R., Judy, M. E., McIntire, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+variation+in+the+npr-1+gene+modifies+ethanol+responses+of+wild+strains+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Natural variation in the npr-1 gene modifies ethanol responses of wild strains of C. elegans.</a> Neuron. 42, 731-743 (2004).</li>
<li>Kapfhamer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+RAB-3%2FA+in+Caenorhabditis+elegans+and+the+mouse+affects+behavioral+response+to+ethanol%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Brain+Behav%22%5BJournal%5D)">Loss of RAB-3/A in Caenorhabditis elegans and the mouse affects behavioral response to ethanol.</a> Genes Brain Behav. 7, 669-676 (2008).</li>
<li>Speca, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conserved+role+of+unc-79+in+ethanol+responses+in+lightweight+mutant+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Conserved role of unc-79 in ethanol responses in lightweight mutant mice.</a> PLoS Genet. 6, e1001057(2010).</li>
<li>Thiele, T. E., Badia-Elder, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+neuropeptide+Y+in+alcohol+intake+control%3A+evidence+from+human+and+animal+research%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Behav%22%5BJournal%5D)">A role for neuropeptide Y in alcohol intake control: evidence from human and animal research.</a> Physiol. Behav. 79, 95-101 (2003).</li>
<li>Treistman, S. N., Martin, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BK+Channels%3A+mediators+and+models+for+alcohol+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">BK Channels: mediators and models for alcohol tolerance.</a> Trends Neurosci. 32, 629-637 (2009).</li>
<li>Han, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+GWASs+and+human+protein+interaction+networks+identifies+a+gene+subnetwork+underlying+alcohol+dependence%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Hum.+Genet%22%5BJournal%5D)">Integrating GWASs and human protein interaction networks identifies a gene subnetwork underlying alcohol dependence.</a> Am. J. Hum. Genet. 93, 1027-1034 (2013).</li>
<li>Kendler, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomewide+association+analysis+of+symptoms+of+alcohol+dependence+in+the+molecular+genetics+of+schizophrenia+%28MGS2%29+control+sample%5BTitle%5D)+AND+%22Alcohol.+Clin.+Exp.+Res%22%5BJournal%5D)">Genomewide association analysis of symptoms of alcohol dependence in the molecular genetics of schizophrenia (MGS2) control sample.</a> Alcohol. Clin. Exp. Res. 35, 963-975 (2011).</li>
<li>Schuckit, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autosomal+linkage+analysis+for+the+level+of+response+to+alcohol%5BTitle%5D)+AND+%22Alcohol.+Clin.+Exp.+Res%22%5BJournal%5D)">Autosomal linkage analysis for the level of response to alcohol.</a> Alcohol. Clin. Exp. Res. 29, 1976-1982 (2005).</li>
<li>Alaimo, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethanol+metabolism+and+osmolarity+modify+behavioral+responses+to+ethanol+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Alcohol.+Clin.+Exp.+Res%22%5BJournal%5D)">Ethanol metabolism and osmolarity modify behavioral responses to ethanol in C. elegans.</a> Alcohol. Clin. Exp. Res. 36, 1840-1850 (2012).</li>
<li>Morgan, P. G., Sedensky, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+affecting+sensitivity+to+ethanol+in+the+nematode%2C+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Alcohol.+Clin.+Exp.+Res%22%5BJournal%5D)">Mutations affecting sensitivity to ethanol in the nematode, Caenorhabditis elegans.</a> Alcohol. Clin. Exp. Res. 19, 1423-1429 (1995).</li>
<li>Mitchell, P. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+concentration-dependent+effects+of+ethanol+on+Caenorhabditis+elegans+behaviour%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacogenomics+J%22%5BJournal%5D)">The concentration-dependent effects of ethanol on Caenorhabditis elegans behaviour.</a> Pharmacogenomics J. 7, 411-417 (2007).</li>
<li>Vidal-Gadea, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+selects+distinct+crawling+and+swimming+gaits+via+dopamine+and+serotonin%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans selects distinct crawling and swimming gaits via dopamine and serotonin.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 108, 17504-17509 (2011).</li>
<li>Bettinger, J. C., Leung, K., Bolling, M. H., Goldsmith, A. D., Davies, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+environment+modulates+the+development+of+acute+tolerance+to+ethanol+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Lipid environment modulates the development of acute tolerance to ethanol in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS ONE. 7, e35129(2012).</li>
<li>Davies, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+genes+influence+toluene-+and+ethanol-induced+locomotor+impairment+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Alcohol+Depend%22%5BJournal%5D)">Different genes influence toluene- and ethanol-induced locomotor impairment in C. elegans.</a> Drug Alcohol Depend. 122, 47-54 (2012).</li>
<li>Newlin, D., Thomson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alcohol+challenge+with+sons+of+alcoholics%3A+a+critical+review+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Psychol.+Bull%22%5BJournal%5D)">Alcohol challenge with sons of alcoholics: a critical review and analysis.</a> Psychol. Bull. 108, 383-402 (1990).</li>
<li>Ponomarev, I., Crabbe, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+to+assess+initial+sensitivity+and+acute+functional+tolerance+to+hypnotic+effects+of+ethanol%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Exp.+Ther%22%5BJournal%5D)">A novel method to assess initial sensitivity and acute functional tolerance to hypnotic effects of ethanol.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 302, 257-263 (2002).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat Methods. 9, 671-675 (2012).</li>
<li>Husson, S. J., Costa, W. S., Schmitt, C., Gottschalk, A. Keeping track of worm trackers. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHusson%2C+SJ+%22WormBook%22">WormBook</a>. , The C. elegans Research Community. (2012).</li>
</ol>

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yoktur.

C. mevcut basit nörobiyoloji ve genetik araçlar elegans solucan davranışı üzerinde etanol etkilerinin moleküler temellerini incelemek için hangi mükemmel bir model olun. Burada, 8,10,20,24,25 etanol akut davranış tepkisinin farklı moleküler ve çevre mediatörleri tanımlamak için kullanılan bir analiz tanımlamaktadırlar. Bu yöntem, bu arada, memelilerde tepki seviyesine bileşik fenotip modeli, farklılaşması ve iki farklı etanol tepki davranışı fenotipleri ilk duyarlılık ve akut fonksiyonel tol...

Alkol kullanım bozuklukları (AUD) yaygındır ve ciddi sağlık, sosyal ve ekonomik sorunlara yol açar. İnsanlarda, bir AUD geliştirme duyarlılığı hem genetik hem de çevresel faktörler tarafından büyük ölçüde etkilenir1,2. Kötüye kullanım olasılığının güçlü bir fizyolojik belirleyicisi, naif içiciler tarafından gösterilen alkol (etanol) tepkisine (LR) başlangıç seviyesidir3-5. Bu LR fenotipi genetik ve genetik olmayan bileşenlerden etkilenir6. Etanol LR'sini etkileyen moleküler mekanizmaları belirlemek, etanol tepki davranışlarının incelenmesinin önemli bir hedefidir.
Nematod, Caenorhabditis elegans, davranış üzerinde etanol etkilerini incelemek için giderek daha fazla kullanılmaktadır7-9. Solucanlar ve memelilerin sinir sistemi fonksiyonlarının mekanizmasında güçlü moleküler koruma vardır ve solucanlardaki etanol LR'sini etkilediği gösterilen birkaç genin, memelilerde de etanol LR'sini etkilediği gösterilmiştir10-16 ve insanlarda kötüye kullanım olasılığı ile ilişkilendirilmiştir17-19.
Etanol solucanları zehirler, bu da onların lokomosyon hızında bir azalmaya yansır. Birkaç farklı laboratuvar, farklı şekillerde olan davranışsal testler geliştirmiştir, örneğin, inceledikleri lokomosyon davranışı (sürünme versus yüzme11,12,14,20,21) veya testlerin yapıldığı çözeltiler (nematod büyüme ortamı versus Dent’s salin20,22). İlginç bir şekilde, bu çeşitli testler etanolün etkileri üzerinde biraz farklı doz yanıt profilleri ortaya koymuştur. Bu sonuçlar, sürünme ve yüzme davranışlarının altta yatan farklılıklarına9,23 ve etanol yanıtlarında ortam değişkeni ozmolarite rolüne20 işaret etmiş ve çeşitli testlerin deneysel ayrıntılarının tanımlanmasının önemini vurgulamıştır.
Burada, etanolün sürünme davranışındaki akut etkilerini ölçmek için bir test sunulmaktadır. Bu test, etanol LR'sine genetik ve çevresel etkileri incelemek için yaygın olarak kullanılmıştır8,10,20,24,25. Memelilerdeki LR fenotipi, etanolün ilk hassasiyeti ve etanolün akut fonksiyonel toleransı gibi en az iki bileşenin bir bileşimidir26,27. Solucanlarda, LR fenotipi bu davranışsal testin kullanımıyla bu iki bileşene ayrılabilir. Genetik ve çevresel manipülasyonların her iki fenotipte olan etkileri bu tek test kullanılarak incelenebilir. Önemli olan, bu iki fenotipin genetik olarak ayrılabilir olmasıdır.

<table><tbody><tr><td>C. elegans suşları</td><td>Caenorhabditis Genetik Merkezi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>60 x 15 mm Petri plakaları, üçlü havalandırmalı</td><td>Greiner Bio-One</td><td>628161</td><td>Diğer plaka markaları da yeterli olacaktır.</td></tr><tr><td>NGM agar</td><td>Çeşitli</td><td></td><td>NaCl (3 g/L), agar (17 g/L), pepton (2.5 g/L), 1 ml kolestrol (etanol içinde 5 mg/ml), 1 ml (1 M) MgSO4, 1 ml (1 M) CaCl2, 25 ml (1 M) KPO4, pH=6, 975 ml H2O</td></tr><tr><td>Forseps</td><td>Çeşitli</td><td></td><td>örn., Fisher Scientific #10300</td></tr><tr><td>37 &deg;C İnkübatör</td><td>Çeşitli</td><td></td><td>Agar kurutma için</td></tr><tr><td>Dijital denge</td><td>Çeşitli</td><td></td><td>Plaka ağırlıklarını ve agar hacmini belirlemek için</td></tr><tr><td>Bakır halkalar</td><td>Plumbmaster</td><td>STK#35583 (48 başlık dişli conta)</td><td>1.6 cm iç çap, 1.8 cm dış çap bakır halkalar</td></tr><tr><td>100% etanol</td><td>Çeşitli</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>Bemis</td><td>PM996</td><td></td></tr><tr><td>CCD kamera</td><td>QImaging</td><td>RET-4000R-F-M-12</td><td>Bu kamera geniş bir görüş alanına sahiptir.</td></tr><tr><td>C-mount ve 0.5X objektifli stereomikroskop</td><td>Leica</td><td>MZ6</td><td>Üretimi durdurulmuş model, M60 mevcut eşdeğeridir.</td></tr><tr><td>Işık kaynağı</td><td>Schott</td><td>A08923</td><td>Görüş alanında eşit aydınlatma sağlamak için 3&rdquo;x3&rdquo; arka ışık</td></tr><tr><td>Görüntüleme ve izleme yazılımı</td><td>Media Cybernetics</td><td>ImagePro-Plus v6.0-6.3</td><td>Yazılımın yeni sürümlerinde izleme fonksiyonları bulunmaktadır.</td></tr></tbody></table>

locomotion speed ​​etanol etkilerinin Ölçülmesi için bir testi<em&gt; caenorhabditis elegans</em

An Assay for Measuring the Effects of Ethanol on the Locomotion Speed of Caenorhabditis elegans

Alkol kullanma bozuklukları önemli bir halk sağlığı sorunudur ve etkili tedavi stratejilerinin azlığı nedeniyle bu konuda çok az etkili çözüm bulunmaktadır. Daha etkili tedavilerin geliştirilmesini geciktiren bir zorluk, etanolün davranış üzerindeki etkilerinin moleküler temelleri hakkındaki nispi anlayış eksikliğidir. Nematod, Caenorhabditis elegans (C. elegans), etanolün moleküler etkileri hakkında hipotezlerin oluşturulması ve test edilmesi için yararlı bir model sunar. Burada, özellikle etanol üzerindeki davranışsal tepkilerle ilgili belirli genlerin ve çevresel faktörlerin rollerini incelemek için geliştirilmiş ve kullanılan bir analiz yöntemini tanımlıyoruz; bu analiz yönteminde davranışsal çıktı olarak lokomosiyon kullanılmaktadır. Etanol, agar yüzeyinde sürünmeye neden olan akut bir baskılamayı doz bağımlı olarak yapar. Bu etkiler dinamiktir; yüksek konsantrasyonda maruz kalan hayvanlar, burada başlangıç hassasiyeti olarak adlandırılan, başlangıçta güçlü bir sürünme baskılaması gösterir ve ardından ilacın sürekli varlığına rağmen lokomosiyon hızında kısmi bir iyileşme gösterir. Bu etanol kaynaklı davranışsal plastisite burada akut fonksiyonel tolerans gelişimi olarak adlandırılmaktadır. Bu analiz yöntemi, bu iki fenotipin farklı ve genetik olarak ayrılabilir olduğunu göstermek için kullanılmıştır. Burada açıklanan basit lokomosiyon analiz yöntemi, C. elegans'ta etanol üzerindeki bu akut davranışsal tepkiler üzerindeki genetik ve çevresel manipülasyonların etkilerini incelemek için uygundur.

Birkaç farklı genotipleri ve eşleştirilmiş kontrollerden Temsilcisi verileri (Şekil 1) 8,24 sunulmuştur; veri özel tahlil hayvanlarda bu vurgu farklılıkları seçildi. maruziyet 10 dakika sonra etki derecesi Şekil 1B-G sol eksen üzerinde gösterilen bir soyu, ilk duyarlılık olarak kabul edilir. 10 dakika sonra kontrole göre daha büyük bir göreceli hızla mutant suşları, etanol (Şekil 1F, G) karşı dirençli olduğu kabul ederken (Şekil 1D, etanol aş...

C. elegans davranış üzerindeki etanol etkilerini incelemek için yararlı bir modeldir. Bu davranış analizi, sürünen solucanların lokomesyon hızındaki etanol etkilerini nicel olarak belirler; bu analiz ile hem başlangıç hassasiyeti hem de etanol için akut fonksiyonel tolerans gelişimi ölçülebilir.

Locomotion Speed ​​Etanol Etkilerinin Ölçülmesi için bir Testi<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Alcohol use disorders are a significant public health concern, for which there are few effective treatment strategies. One difficulty that has delayed the ...

Bu prosedürün genel amacı, farklı genotiplerdeki CL organları üzerinde alkolün etkisini tutarlı bir şekilde ölçmektir. Bu, önce alkol içeren bakır halkaların gömüldüğü bir agar plakası oluşturulması ile başarılır. Ardından, farklı genotipler ayrı ayrı toplanır ve alkole maruz bırakılır. Maruz kalma sırasında, belirli zaman noktalarında video verileri toplanır.Son adım, her bir genotip hızının nesne tanıma yazılımı kullanılarak ölçülmesidir. Sonunda, erken ve geç zaman noktalarındaki hızların karşılaştırılması, alkole karşı anormal duyarlılık veya tolerans gelişimini ortaya çıkarır. Belirli genotipler.Bu tekniğin mevcut yöntemlere göre temel avantajı, farklı plakalarda genotiplerin karşılaştırılmasıdır, çünkü çevresel değişim azalır. Genelde, bu yöntemi yeni kullananlar çıplak bir maşa kullanarak solucanları toplamak için mücadele edecektir. Deneyden önceki gün. Dördüncü aşamadaki solucanları taze NGM plakalarına toplayın OP 50 E coli kültürü ile kaplı olarak, gece boyunca 20 derecede plakaları, deney standart oturmayan 60x15 milimetre gerektirir.NGM plakaları, kullanılacak tüm plakaları 37 derece Celsius'ta iki saat boyunca kapaklar açık halde kurutur. Her deneme dört plaka gerekti

an-assay-for-measuring-effects-ethanol-on-locomotion-speed

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Etanol sedatif etkilerini ölçmek için basit bir...

Sinekler Etanol Hassasiyet Tedbir Basit Yolu

Araştırmacılar, solucanların algıladığı ve tepki verdiği bir elektrik alanı uygulayarak C. elegans'ta isteğe bağlı hareketi tetikleyebilir. Bu videoda elektrotaktik davranış tanıtılır ve mikroakışkan bir cihazda yapılan örnek bir protokol gösterilir.

Elektrotaksi Deneyi: C. elegans'ta Hareketi Gözlemlemek İçin Bir Yöntem

Bu videoda, bir arenada solucan hareketini kaydetmek için video ve izleme yazılımının kullanımı açıklanmaktadır. Örnek protokol, etanol maruziyetinin solucan hareketi üzerindeki etkisini ölçer.

C. elegans Hareket İzleme: Solucanlarda Hareketi Değerlendirmek İçin Bir Yöntem

Bu video, vahşi tip veya ALS-mutant insan TDP-43 proteinini eksprese eden C. elegans'daki motor disfonksiyonu değerlendirmek için bir radyal hareket testinin kullanımını göstermektedir. Farklı seviyelerde vahşi tip veya mutant TDP-43 ekspresyonuna sahip solucanların sürünmesine izin verilir ve hareketleri, tahlil plakası üzerindeki merkezi noktadan kat edilen radyal mesafe ile ölçülür. Test, farklı C. elegans suşlarının kat ettiği mesafeye bağlı olarak hafif, orta ve şiddetli motor bozukluklar...

C. elegans Modellerinde Motor Bozukluğun Radyal Hareket Testi Kullanılarak Değerlendirilmesi

Niceliksel kemotaktik tepkiyi değerlendirmek için bir...

C. elegans Kemotaksis Deneyi

Içinde isteğe bağlı hareket ikna etmek için bir yarı-otomatik mikro-elektro-akışkan...

On-talep Kantitatif Analiz için mikroakışkan tabanlı Electrotaxis<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; &#39;Locomotion

Bir yumurta-in-solucan (EIW) testi yumurtlama davranışı ölçmek için yararlı bir yöntemdir. Yumurtlama değişiklikler model organizma bir davranış tepki...

Üzerinde Bakterilerin Etkilerinin Ölçme<em&gt; C. Elegans</emBir Yumurta Tutma Testi Kullanma&gt; Davranış

Drosophila'da etanol duyarlılığını ve hızlı toleransı ölçmek için yapılan basit tahliller, etanol ile ilgili bu önemli davranışları araştırmak için bu model organizmanın kullanımını kolaylaştırır. Burada, sineklerde etanol duyarlılığını ve hızlı toleransı ölçmek için nispeten basit, ölçeklenebilir bir test açıklanmaktadır.

Etanol sedasyon Hassasiyet ve hızlı Hoşgörü Ölçüm Ucuz bir, Ölçeklenebilir Davranış Deneyi<em&gt; Drosophila</em

Drosophila alkol duyarlılığını ölçmek için geçerli yöntemler sinek grupları test etmek için tasarlanmıştır. Çok sayıda tek sinekte alkol sedasyon hassasiyetini değerlendirmek için basit, düşük maliyetli, yüksek iş çıkışlı bir çalışma salıyoruz. Yöntem özel araçlar gerektirmez ve ortak malzemeler kullanılarak herhangi bir laboratuvarda yapılabilir.

Bireysel Drosophila melanogaster Alkol Sedasyon Süresini Ölçmek için Yüksek İşLenme Yöntemi

Bu çalışma, C. elegans complex I hastalığı gaz-1(fc21)solucanlarında, yani ZebraLab (orta verimli bir test) ve WormScan'da (yüksek verimli bir test) iki yarı otomatik lokomotor aktivite analizi yaklaşımı için protokoller sunar ve nematod davranışını ve entegre nöromüsküler işlevi ölçmek için çok çeşitli araştırma yöntemleri arasında karşılaştırmalı analiz sağlar.

Caenorhabditis elegans Mitokondriyal Hastalık Modellerinde Hayvan Aktivitesini Ölçmek için Deneysel Yöntemlerin Karşılaştırmalı Analizi

Mevcut protokol, Caenorhabditis elegans asetilkolin reseptörlerinin bir sınıfının farmakolojik agonisti olan levamisole'ye yanıtı belirlemek için bir tahlili açıklamaktadır. Bu sıvı levamisol yüzme testinde, araştırmacılar 24 kuyucuklu plakalarda yetiştirilen hayvanların zamana bağlı felcini görsel olarak gözlemler ve nicelleştirir.

Caenorhabditis elegans Ölçümü Asetilkolin Reseptör Agonisti Levamisol'a duyarlılık

Öğrenin Caenorhabditis elegans kullanarak etanolün hareket hızı üzerindeki etkilerini ölçmek için davranışsal analiz yöntemini. Bu teknik, alkol duyarlılığı ve tolerans gelişimini niceliksel olarak değerlendirir.

Locomotion Speed ​​Etanol Etkilerinin Ölçülmesi için bir Testi

Daha fazla video keşfet

Locomotion Speed Etanol Etkilerinin Ölçülmesi için bir Testi