Locomotion Speed Etanol Etkilerinin Ölçülmesi için bir Testi
9 Nisan 2015
C. elegans davranış üzerindeki etanol etkilerini incelemek için yararlı bir modeldir. Bu davranış analizi, sürünen solucanların lokomesyon hızındaki etanol etkilerini nicel olarak belirler; bu analiz ile hem başlangıç hassasiyeti hem de etanol için akut fonksiyonel tolerans gelişimi ölçülebilir.
Bu prosedürün genel amacı, farklı genotiplerdeki CL organları üzerinde alkolün etkisini tutarlı bir şekilde ölçmektir. Bu, önce alkol içeren bakır halkaların gömüldüğü bir agar plakası oluşturulması ile başarılır. Ardından, farklı genotipler ayrı ayrı toplanır ve alkole maruz bırakılır. Maruz kalma sırasında, belirli zaman noktalarında video verileri toplanır.
Son adım, her bir genotip hızının nesne tanıma yazılımı kullanılarak ölçülmesidir. Sonunda, erken ve geç zaman noktalarındaki hızların karşılaştırılması, alkole karşı anormal duyarlılık veya tolerans gelişimini ortaya çıkarır. Belirli genotipler.
Bu tekniğin mevcut yöntemlere göre temel avantajı, farklı plakalarda genotiplerin karşılaştırılmasıdır, çünkü çevresel değişim azalır. Genelde, bu yöntemi yeni kullananlar çıplak bir maşa kullanarak solucanları toplamak için mücadele edecektir. Deneyden önceki gün. Dördüncü aşamadaki solucanları taze NGM plakalarına toplayın OP 50 E coli kültürü ile kaplı olarak, gece boyunca 20 derecede plakaları, deney standart oturmayan 60x15 milimetre gerektirir.
NGM plakaları, kullanılacak tüm plakaları 37 derece Celsius'ta iki saat boyunca kapaklar açık halde kurutur. Her deneme dört plaka gerektirir. NGM plakalarının kullanılması burada önemlidir.
Plakaların bileşimindeki farklılıklar. Özellikle, ozmolariteleri davranış üzerindeki doza bağlı etanol üzerinde güçlü bir etkiye sahip olabilir. Bu, en azından kısmen, hayvanlar tarafından biriktirilen etanol miktarındaki değişikliklere bağlıdır. Kurutulduktan sonra, oturmayan her NGM plakanın ağırlığını ölçün.
Bu ağırlığı kullanarak, her iki plakada da 400 milimolarlık ağırlıktan hacim yoğunluğu konsantrasyonunu elde etmek için gereken 100% etanol miktarını belirleyin. Ardından, her bir plakaya 1.6 santimetre iç çapında dört bakır halkayı eritin, böylece kamera tarafından aynı anda görülebilirler. Maşa kullanarak.
Her halkayı yaklaşık üç saniye boyunca bir alevde yakın ve hemen plakaya koyun düşürmeden. Ardından, halkayı çevreden birkaç yerde hafifçe bastırarak sabitleyin. Plakaları, her bir halkada olacak olan suşla etiketleyin.
Şimdi, plakada 400 milimolarlık ağırlıktan hacim yoğunluğu konsantrasyonunu elde etmek için gereken 100% etanol miktarını hesaplayın. Ardından, plakların yarısını etanol ile doldurun, etanolü bir pipet ile damlatarak. Hazırlanan tüm plakaları deney başlamadan önce iki saat boyunca dengeleyin.
Başlamak için, her deney grubundan 10 solucanı, etanol içermeyen bir alışkanlık plakasının bakır halkası merkezine iki dakikadan az bir sürede aktarın. Bu, etanol içermeyen bir plakadır. Solucanlarla birlikte yem taşımamaya dikkat edin, çünkü bu onların hareketlerini azaltır.
Ayrıca, solucanlar kazmayacağı için agar yüzeyine zarar vermeyin. Plakaya yükleme zamanını kaydedin ve her plakaya solucanlarla transferin iki dakikadan fazla arayla yapılmasını sağlayın, böylece her plaka uygun zaman aralığında ayrı ayrı çekilebilir. Her alışkanlık plakasını oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.
Ardından, solucanları alışkanlık plakasındaki solucanları yerleştirme sırasına göre bir deney plakasına aktarın. İnce kenarlı düzleştirilmiş bir solucanla. Bakteri olmadan toplayın. Düzleştirilmiş toplayıcı üzerindeki solucanları toplayın.
Kaşıklama hareketi kullanarak, ardından etilen kaybının buharlaşmasına karşı kaybı en aza indirgemek için laboratuvar filmi ile plakaları sızdırmaz hale getirin. Bu adımda hayvanların transfer hızı çok önemlidir, çünkü hayvanların transferi daha uzun süre etanole maruz kalacaktır, bu nedenle öncelikle hangi suşların plakaya yerleştirildiğini döndürmek iyi bir fikirdir. İlk önce deney tekrarları arasında.
Yüksek çözünürlüklü video kameralı bir mikroskop, solucanları film çekmek için gereklidir. Şimdi, üç inç kare arkadan aydınlatma gibi düzgün bir aydınlatma çok önemlidir. Ardından, karşılaştırmayı korumak için plakayı medya tarafı yukarı bakacak şekilde görüntüleyin, görüntü analizi yazılımını 120'yi yakalamak için hazırlayın.
Saniyede bir kare olan 12 bit gri tonlamalı zaman aşımlı filmler çekin. Çıktı dosya boyutunu küçültmek için, ancak yeterli görüntü çözünürlüğünü korumak için, iki üzeri iki bükülme modunu kullanın. Şimdi, her bir plakadan iki dakikalık filmler kaydedin.
Son solucanların plaka üzerine yerleştirilmesinden 10 dakika sonra. Ardından ikinci iki dakikalık bir kayıt yapın. Solucanların plakaya yerleştirilmesinden 30 dakika sonra bu gösteri görüntüsü için.
Pro plus yazılımı kullanılır, ancak tekniğe uyarlanabilecek çok çeşitli başka yazılımlar da mevcuttur. Filmleri iki dakikalık segmentler halinde analiz edin. Öncelikle, arka planı düzleştiren ve solucan nesnelerin kontrastını artıran bir filtre uygulayın.
Menü altında işlemi seçin. Ardından filtreler, ardından geliştirme ve ardından düzleştir. Karanlık bir arka plan ve 20 piklik bir özellik genişliği için
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu çalışma, etanolün davranışlar ve özellikle hareket hızı üzerindeki etkilerini araştırmak için model organizma olarak C. elegans kullanmaktadır. Hem başlangıç hassasiyetini hem de etanole karşı gelişen akut fonksiyonel toleransı ölçmek için bir davranışsal analiz yöntemi geliştirilmiştir.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Sinirbilim
- Davranışsal Biyoloji
- Alkol Araştırmaları
Arka Plan
- C. elegans, maddelerin nörolojik etkilerini incelemek için yaygın olarak kullanılan bir modeldir.
- Etanolün çeşitli organizmalarda lokomosyon ve davranışı etkilediği bilinmektedir.
- Tolerans gelişimini anlamak, bağımlılık mekanizmaları hakkında içgörüler sağlayabilir.
- Davranışsal analizler, model organizmalarda bu etkilerin nicelleştirilmesi için gereklidir.
Çalışmanın Amacı
- Alkolün farklı C. elegans genotiplerinin lokomosyonu üzerindeki etkilerini nicelleştirmek.
- Etanole karşı başlangıç hassasiyetini ve tolerans gelişimini ölçmek.
- Lokomosyon hızının hassas ölçümü için video analizinden yararlanmak.
Kullanılan Yöntemler
- İçine bakır halkalar yerleştirilmiş, alkol içeren agar plaklarının hazırlanması.
- Farklı C. elegans genotiplerinin alkole maruz bırakılmak üzere ayrı ayrı gruplandırılması.
- Alkol maruziyeti sırasında belirlenen zaman noktalarında video verilerinin toplanması.
- Nesne tanıma yazılımı kullanılarak lokomosyon hızının ölçülmesi.
Temel Sonuçlar
- Erken ve geç zaman noktalarındaki lokomosyon hızlarının karşılaştırılması, duyarlılık farklarını ortaya koymaktadır.
- Belirli genotiplerde akut fonksiyonel tolerans gelişimi gözlemlenmektedir.
- Deney, etanol maruziyetine bağlı davranışsal değişiklikleri etkili bir şekilde nicelleştirmektedir.
- Elde edilen bulgular, alkolün davranış üzerindeki etkilerinin anlaşılmasına katkıda bulunabilir.
Sonuçlar
- Geliştirilen analiz, C. elegans'ta etanol etkilerini incelemek için güvenilir bir yöntemdir.
- Bulgular, alkol duyarlılığı ve tolerans mekanizmalarına dair anlayışı geliştirmektedir.
- Bu araştırma, bağımlılık ve madde kullanım bozuklukları üzerine yapılacak daha geniş kapsamlı çalışmalara temel oluşturabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Yönetici Sektörel İlgililik
C. elegans üzerindeki kantitatif davranışsal analizler, etanolün nöral fonksiyonlar üzerindeki etkilerinin mekanistik olarak risk analizinin yapılmasını sağlayarak, nöroaktif bileşiklerin erken evre hedef doğrulamasını destekler. Bu yaklaşım, hassasiyet ve toleransın genetik belirleyicilerini ayırt etmede öngörülebilir bir güven sağlayarak, MSS ilaç keşfi için portföy önceliklendirmesine bilgi sunar. Analizin tekrarlanabilirliği ve kantitatif çıktıları, onu ilaç yanıtının genetik ve çevresel modülatörlerini değerlendirmek için yeniden kullanılabilir bir platform konumuna getirir.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Etanolle indüklenen davranışsal fenotiplerde gen fonksiyonunun hipotez odaklı sorgulanmasına olanak tanır.
- Akut hassasiyet ve toleransa yönelik genetik katkıları izole ederek biyolojik risklerin azaltılmasını destekler.
- Nörodavranışsal ilaç programları için hedef seçiminde öngörüsel güvenilirliği kolaylaştırır.
Tarama ve Assay Geliştirme
- Genotipler genelindeki lokomotor yanıtları değerlendirmek için standardize, kantitatif bir analiz sağlar.
- Birden fazla genotipi tek bir plakada toplayarak çevresel değişkenliği azaltır.
- Alt akış tarama iş akışlarına uygun, tekrarlanabilir ve video tabanlı lokomosyon verileri üretir.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Davranışsal çıktıları, MSS ilaç hedefleriyle ilgili genetik ve çevresel manipülasyonlarla uyumlu hale getirir.
- Keşif aşamasındaki genetik taramalardan nöroaktif bileşiklerin preklinik doğrulamasına kadar olan sürekliliği sağlar.
- Akut fonksiyonel tolerans gelişimini niceliklendirerek riskten arındırılmış ilerleme kararlarını destekler.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu analiz, erken genetik hedef doğrulamadan CNS-aktif ajanlar için öncü bileşik tanımlamaya kadar olan keşif sürekliliğine entegre olmaktadır.
- Keşif Biyolojisi: Etanol yanıt yolaklarına ilişkin mekanistik hipotezleri test etmek için davranışsal fenotipleri nicelleştirir.
- Tarama: Genotipler arası karşılaştırmalar için standardize edilmiş, kantitatif lokomosyon metrikleri sunar.
- Analiz: Güçlü koşul karşılaştırmaları için hız ve tolerans indeksleri üzerine istatistiksel çıktılar sağlar.
- Translasyonel Araştırma: Genetik bulguları, ilaç kaynaklı davranışsal plastisiteyle ilgili preklinik modellerle ilişkilendirir.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Çeşitli nöroaktif bileşiklerin ve genetik arka planların değerlendirilmesi için ölçeklenebilir ve uyarlanabilir bir platform sunar.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: MSS ilaç keşfi için hedef doğrulamada ve mekanistik risk azaltmada öngörü güvenilirliğini artırır.
- Operasyonel Değer: Araştırma ekipleri arasında analiz standardizasyonunu, tekrarlanabilirliğini ve ölçeklenebilirliğini geliştirir.
- Stratejik Değer: Davranışsal son noktaları nicelleştirerek devam/dur karar verme sürecini ve sermaye verimliliğini iyileştirir.
- Portföy Etkisi: Genetik hedeflerin ve bileşik ilerletmenin riskle uyumlu önceliklendirilmesini destekler.
Uygulama Hususları
- C. elegans yönetimi ve davranışsal analiz düzeneği kurulumu konusunda uzmanlık gerektirir.
- Kantitatif analiz için yüksek çözünürlüklü video kaydı ve nesne tanıma yazılımı gereklidir.
- Plaka hazırlama ve çevresel koşulların ekipler arası standardizasyonunu gerektirir.
- Protokol ayarlamaları ile farklı genotiplere ve çevresel manipülasyonlara uyarlanabilir.
- Plaka ozmolaritesi ve etanol konsantrasyonu gibi analiz değişkenlerinin hassas kontrolüne bağlıdır.
