Name: Otomatik Jel Boyut Seçimi Çevre Su Örneklerinden hazırlanmıştır nesil Sıralama Kütüphaneler Kalitesi Geliştirmek için (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 26 s
Description: Öğrenin otomatik jel boyut seçimi yöntemiyle çevre su örneklerinden yüksek kaliteli DNA kütüphaneleri hazırlamayı. Bu yöntem, nesil sıralama verilerinin okuma kalitesini artırır ve yüksek verimli analiz sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Genome BC, Genome Canada ve Coastal Genomics tarafından finanse edildi. Yazarlar, numune toplama ve işleme konusundaki yardımları için Kirby Cronin ve Michael Chan'a teşekkür eder. Ayrıca biyoinformatik yardımları için Thea Van Rossum ve Dr. Fiona Brinkman'a teşekkür ederiz.

1. Su Toplama ve Filtrasyon <ol><li> Çeşitli sitelerde (Şekil 1) tatlı su örnekleri toplamak. Bir filtre dizi örnekleri belirtilebilir: 1 mikron filtre, 0.2 um&#39;lik bir filtre ve 30 kDa kesme teğetsel akış filtresi, sırasıyla sistematik olarak ayrılması ökariyotik ve bakteriyel ve viral ölçekli parçacıkları için. Not: sadece saflaştırma ve 0.2 um filtre (serbest yaşayan bakteriler) karşılanan malzemenin analizi, bu raporda tarif edilmektedir, ancak benzer yaklaşımlar filtreleri elde diğer partiküller için kullanılabilir. </li></ol> 2. Bakteriyel Konsantrasyon, DNA Ekstraksiyon ve Arıtma <ol><li> Su filtre sisteminden (şematik bir diyagramı, Şekil 2) 0.2 um membran filtre (ler) çıkarın. Yarısında 0,2 mikron disk filtre katlayın ve açık tarafı yukarı bir 50 ml tüp içine yerleştirin. Içine 1x Fosfat tamponlu solüsyon 5 ml (PBS) ve% 0.01 Tween, pH 7.4 eklemetüp. Birden fazla filtre işlemi sırasında kullanıldığında, filtre başına farklı bir tüp kullanır. 4 ° C&#39;de filtreyle deposu boru (lar) kadar işlendi. Aksi takdirde, 2.2 adıma geçin. </li><li> Steril forseps ile 50 ml tüp 0.2 mikron membran filtreyi çıkarın. Bir petri üzerine yerleştirin filtre (ler) (tüp PBS tampon bırakın). <ol><li> Steril forseps ve steril makaslar ile küçük şeritler halinde filtre (1 cm x 1 cm) kesildi. % 70 izopropanol nemlendirici bir DNA yüzey temizleyici ile silinerek farklı numuneler arasında tip 1 aşırı saf su ile durulama ile Forseps ve makas dezenfekte. </li></ol></li><li> Tekrar aynı 50 ml tüp içine şeritler halinde kesilmiş filtreyi yerleştirin. 50 ml tüp içinde tampon, 15 ml olmak üzere toplam yani filtreye 1x PBS, 10 ml ve% 0.01 Tween, pH 7.4 ekleyin. </li><li> Her 50 ml tüp 6 temiz tungsten boncuk (3 mm çapında) ekleyin 20 dakika (50 ml tüpler vorteks adaptörü kullanın) için şiddetle Parafilm ile tüp, ve vorteks kapsayacak. Daha fazla Eğeriple filtreleri temiz bir 50 ml tüp içine bir örnek, transfer ve havuz tüm homojenattan işlenir. 4 ° C&#39;de 15 dakika boyunca 3300 x g&#39;de tüpler santrifüjleyin. </li><li> 1.7 ml mikrosantrifüj tüplerine pelet ve kısım bakteriyel hücreler (~ 1 ml&#39;lik eş payları,) yeniden süspanse edin. Numune başına 5 mikrosantrifüj tüpleri olacağını not edin. </li><li> 10 dakika boyunca 10.000 x g&#39;de mikrosantrifüj tüpler aşağı Spin ve 200 ° &#39;ye kadar ul işareti aşağı süpernatant en çıkarmak. </li><li> -80 ° C&#39;de örnekleri saklayın, ya da üreticinin talimatlarına göre bir piyasada mevcut DNA izolasyon kiti kullanılarak bakteriyel DNA ayıklayın geçin. Bakteriyel DNA ekstraksiyon kullanımı ya PBS veya su negatif kontrol olarak ekstraksiyon ve E. sırasında Pozitif kontrol olarak ekstraksiyon coli. </li><li> Birden tüpler DNA ayıklanır ediliyor Çünkü, bir 2 ml tüp içine aynı örnekten paralel alt alikotları havuz. Daha sonra 0.1 müteşekkil bir çözelti kullanılarak bir O / N çökelmesini yapmak3 M sodyum asetat,% 100 etanol içinde 2 hacim ve 5 ug / ml doğrusal akrilamid 5 ul hacmi. İyice karıştırın ve mağaza örnekleri -80 ° C&#39;de. </li><li> 4 ° C&#39;de 30 dakika maksimum hızda (17,000 xg) santrifüjleyin. 10 mM Tris-Cl, pH 8.5, 34 ul en fazla 5 dakika ve tekrar süspansiyon DNA pelet bir biyo-güvenlik kabini içinde buz-soğuğu% 70 etanol, kuru hava içinde 1 ml pelet yıkayın. Not: Doğrusal akrilamid O / N yağış sonrası DNA pelet görselleştirmek için yardımcı olacaktır. </li><li> Üreticinin talimatlarına (Malzeme Tablo bakınız), sırasıyla, yüksek hassasiyet floresan nükleik asit kantitasyon tahlil ve microvolume spektrofotometre kullanarak aşağıdaki DNA miktarını ve kalitesini belirleyin. Not: birden çok numune anda hazırlanır, dsDNA ve plaka bazlı florimetre / spektrofotometre ölçülmesi için ultra-hassas bir floresan nükleik asit tahlil bunun yerine kullanılabilir. </li></ol> 3. DNA Kütüphanesi hazırlanması <ol><li&gt; 0.2 ng / ul ~ bir konsantrasyona su örneklerinden çıkarılan genomik bakteriyel DNA normalize edilir. </li><li> Bir transpozon-tabanlı bir yöntem (tagmentation) kullanılarak bakteriyel DNA&#39;nın enzimatik fragmanı bir nanogram. Üreticinin talimatlarına takip parçalanmış DNA üzerine adaptör ve dizin dizileri ekleyin. Dizileme endeksler dahil edilmiştir, bu noktada, üreticinin talimatlarına, belirtildiği gibi tabi PCR 12 döngü numuneleri tagmented. </li></ol> 4. Otomatik Jel Boyut Seçimi <ol><li> Üreticinin talimatlarına açıklanan standart PCR sonrası temizleme adımı atlayın (Malzeme Tablo bakınız). Boyut seçin PCR sonrası numuneler doğrudan otomatik jel bazlı boyutu seçimi platformu kullanarak. <ol><li> Her bir örnek için yükleme tamponu 3.5 ul ekleyin. </li><li> Imalatçının protokolü izlenerek, 300 ul özü, 500-800 bp&#39;lik bir boyut seçim hedefi belirterek, elektroforez iş istasyonunda örnekleri yükBir ön-döküm% 1.5 agaroz kaseti kullanarak iyon hacmi,. </li><li> Etanol çökeltme ile 25 ul kadar ham çıkış malzemesi (300 ul) konsantre edin. Not: Alternatif olarak, filtre plakası ve vakum manifoldunun yoluyla örneklerin büyük sayılar için konsantrasyonu otomatikleştirmek için elektroforez iş istasyonu kullanın. <ol><li> 3 M sodyum asetat ve 0.1 hacminde,% 100 etanol içinde 2 hacim ve 5 ug / ml doğrusal akrilamid 5 ul kullanarak ham elüsyon hacmi çökeltilmesi. -80 ° CO / N de, iyi bir yerde örnekleri karıştırın. Santrifüj numuneler 30 dakika için 17,000 x g&#39;de. </li><li> Süpernatantlar atın ve buz gibi soğuk% 70 etanol 1 ml DNA pelet yıkayın geçin. </li><li> Santrifüj numuneleri yine 30 dakika süre ile 17,000 x g de, üst fazlar, kuru hava atmak ve son olarak 10 mM Tris-Cl, pH 8.5, 25 ul DNA pelletini. </li></ol></li></ol></li><li> (İsteğe bağlı) bir beş yapmak için otomatik jel boyutu seçimi platformu ile seçilen DNA kütüphaneleri boyutu 1 ul kullanınTris-EDTA tampon çözeltisi, pH 8.0 kullanılarak kat seyreltme. Üreticinin talimatlarına göre dsDNA kalitesini analiz etmek için bir çip tabanlı kapiller elektroforez aleti kullanılarak kütüphaneleri analiz. </li></ol> 5. Kütüphane Normalleştirme ve Sıralama <ol><li> Üreticinin hazırlık kılavuzunda açıklandığı gibi (transpozon-tabanlı kütüphane hazırlık seti dahil) kütüphane normalleştirme boncuklar kullanarak örnekleri normalleştirmek için devam edin. <ol><li> Seçenek olarak ise, 2 nM&#39;lik, bir nihai konsantrasyona ulaşmak için dsDNA eşit molar oranlarda bir araya getirerek ve ardından, yüksek hassasiyetli floresan nükleik asit niceleme deneyi kullanılarak dsDNA kütüphaneleri ölçer. Toplanmış kütüphaneler 10 ul ve 0.2 N NaOH, 10 ul kullanarak kütüphane denatüre etmek için devam oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edilir. 11:05 son bir 1 ml hacmi ve konsantrasyonu (transpozon tabanlı hazırlık seti ile birlikte) melezleme tamponu kullanılarak denatüre kütüphaneleri sulandırmak. </li></ol></li><li> Yük örneğiüreticinin standart sıralama protokollerini takip ederek bir nesil dizileme platformu s. </li></ol>

<ol><li>Siuda, W., Chrost, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concentration+and+susceptibility+of+dissolved+DNA+for+enzyme+degradation+in+lake+water+-+some+methodological+remarks%5BTitle%5D)+AND+%22Aquatic+Microbial+Ecology%22%5BJournal%5D)">Concentration and susceptibility of dissolved DNA for enzyme degradation in lake water - some methodological remarks.</a> Aquatic Microbial Ecology. 21, 195-201 (2000).</li>
<li>Butler, J. M., Hill, C. R. Scientific Issues with Analysis of Low Amounts of DNA. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.promega.ca/resources/profiles-in-dna/2010/scientific-issues-with-analysis-of-low-amounts-of-dna">http://www.promega.ca/resources/profiles-in-dna/2010/scientific-issues-with-analysis-of-low-amounts-of-dna</a> (2010).</li>
<li>Ficetola, G. F., Miaud, C., Pompanon, F., Taberlet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Species+detection+using+environmental+DNA+from+water+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+letters%22%5BJournal%5D)">Species detection using environmental DNA from water samples.</a> Biology letters. 4, 423-425 (2008).</li>
<li>Liles, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recovery%2C+purification%2C+and+cloning+of+high-molecular-weight+DNA+from+soil+microorganisms%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+environmental+microbiology%22%5BJournal%5D)">Recovery, purification, and cloning of high-molecular-weight DNA from soil microorganisms.</a> Applied and environmental microbiology. 74, 3302-3305 (2008).</li>
<li>Bey, B. S., Fichot, E. B., Dayama, G., Decho, A. W., Norman, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extraction+of+high+molecular+weight+DNA+from+microbial+mats%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Extraction of high molecular weight DNA from microbial mats.</a> BioTechniques. 49, 631-640 (2010).</li>
<li>Tebbe, C. C., Vahjen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interference+of+humic+acids+and+DNA+extracted+directly+from+soil+in+detection+and+transformation+of+recombinant+DNA+from+bacteria+and+a+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+environmental+microbiology%22%5BJournal%5D)">Interference of humic acids and DNA extracted directly from soil in detection and transformation of recombinant DNA from bacteria and a yeast.</a> Applied and environmental microbiology. 59, 2657-2665 (1993).</li>
<li>Solonenko, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequencing+platform+and+library+preparation+choices+impact+viral+metagenomes%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+genomics%22%5BJournal%5D)">Sequencing platform and library preparation choices impact viral metagenomes.</a> BMC genomics. 14, 320(2013).</li>
<li>Aird, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+and+minimizing+PCR+amplification+bias+in+Illumina+sequencing+libraries%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+biology%22%5BJournal%5D)">Analyzing and minimizing PCR amplification bias in Illumina sequencing libraries.</a> Genome biology. 12, R18(2011).</li>
<li>Quail, M. A., Swerdlow, H., Turner, D. J., et al. Improved protocols for the illumina genome analyzer sequencing system. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aQuail%2C+MA+%22Current+protocols+in+human+genetics+%2F+editorial+board%2C+Jonathan+L.+Haines+..+%5Bet+al.%5D%22">Current protocols in human genetics / editorial board, Jonathan L. Haines .. [et al.]</a>. 18, 18(2009).</li>
<li>Head, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Library+construction+for+next-generation+sequencing%3A+overviews+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Library construction for next-generation sequencing: overviews and challenges.</a> BioTechniques. 56, 61-64, 66, 68 (2014).</li>
<li>Dijk, E. L., Jaszczyszyn, Y., Thermes, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Library+preparation+methods+for+next-generation+sequencing%3A+tone+down+the+bias%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+cell+research%22%5BJournal%5D)">Library preparation methods for next-generation sequencing: tone down the bias.</a> Experimental cell research. 322, 12-20 (2014).</li>
<li>Grunenwald, H., Baas, B., Caruccio, N., Syed, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid%2C+high-throughput+library+preparation+for+next-generation+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid, high-throughput library preparation for next-generation sequencing.</a> Nature Methods. 7, (2010).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+cloning+%3A+a+laboratory+manual%22">Molecular cloning : a laboratory manual</a>. , 3rd edn, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring, NY. (2001).</li>
<li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agarose+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+DNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments%22%5BJournal%5D)">Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments.</a> Journal of visualized experiments. , (2012).</li>
<li>Quail, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+large+genome+center%27s+improvements+to+the+Illumina+sequencing+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+methods%22%5BJournal%5D)">A large genome center's improvements to the Illumina sequencing system.</a> Nature methods. 5, 1005-1010 (2008).</li>
<li>Marine, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+a+transposase+protocol+for+rapid+generation+of+shotgun+high-throughput+sequencing+libraries+from+nanogram+quantities+of+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+environmental+microbiology%22%5BJournal%5D)">Evaluation of a transposase protocol for rapid generation of shotgun high-throughput sequencing libraries from nanogram quantities of DNA.</a> Applied and environmental microbiology. 77, 8071-8079 (2011).</li>
<li>Rohland, N., Reich, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cost-effective+high-throughput+DNA+sequencing+libraries+for+multiplexed+target+capture%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+research%22%5BJournal%5D)">Cost-effective high-throughput DNA sequencing libraries for multiplexed target capture.</a> Genome research. 22, 939-946 (2012).</li>
<li>Lamble, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+workflows+for+high+throughput+library+preparation+using+the+transposome-based+nextera+system%5BTitle%5D)+AND+%22Bmc+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Improved workflows for high throughput library preparation using the transposome-based nextera system.</a> Bmc Biotechnology. 13, (2013).</li>
<li>Picelli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tn5+transposase+and+tagmentation+procedures+for+massively+scaled+sequencing+projects%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+research%22%5BJournal%5D)">Tn5 transposase and tagmentation procedures for massively scaled sequencing projects.</a> Genome research. , (2014).</li>
<li>Rhodes, J., Beale, M. A., Fisher, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Illuminating+Choices+for+Library+Prep%3A+A+Comparison+of+Library+Preparation+Methods+for+Whole+Genome+Sequencing+of+Cryptococcus+neoformans+Using+Illumina+HiSeq%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Illuminating Choices for Library Prep: A Comparison of Library Preparation Methods for Whole Genome Sequencing of Cryptococcus neoformans Using Illumina HiSeq.</a> PloS One. 9, e113501(2014).</li>
</ol>

Jared R. Slobodan ve Matthew J. Nesbitt hem Kıyı Genomics, Ranger Teknolojisi sunan bir özel sektöre ait British Columbia şirketin hisse sahibi.

adaptör dimerleri ve tercihen mevcut platformlarda sıralandı olan küçük ekleme boyutları kümelenme varlığı kullanılabilir verimleri ve altı-kullanımı cihazlarının kapasitesi 15 bir azalma temsil eder. kitaplıkları hazırlanması için bir transpozon bazlı yaklaşım ile birlikte damla çırpma yöntemlerin kullanılması ekstre 4,5 &#39;diğer yöntemlere kıyasla daha fazla DNA kesme neden olabilir. Dizileme dağılımı 8,16 okur Yine, ekstraksiyon ve kütüphane hazırlık tüm yöntemler potansiyel önyargı...

Metagenomik, mevcut mikrobiyal toplulukları karakterize etmek için bir örnekteki tüm genetik materyalin dizilenmesini içerir. Ekstrakte edilen nükleik asitlerin DNA kütüphanelerine dönüştürülmesini ve ardından yeni nesil dizilemeyi içeren karmaşık ve pahalı bir süreçtir. Maksimum veri çıktısı ve doğru metagenomik analiz için yüksek kaliteli kütüphaneler gereklidir. Su örnekleri gibi çevresel örnekler,1-3 oranında bozunabilen düşük miktarda DNA ve PCR4-6 inhibitörlerinin varlığı nedeniyle genellikle yüksek kaliteli kütüphaneler oluşturmada önemli zorluklar oluşturur. 
Yüksek kaliteli kütüphaneler ideal olarak dar bir uzunluk aralığında daha uzun DNA segmentlerinden oluşur. Dizileme çalışması başına üretilen yararlı veri miktarını en üst düzeye çıkarmak için, kitaplıktaki DNA'nın uzunluğu en az kullanılan dizileme yönteminin maksimum okuma uzunluğu kadar uzun olmalıdır. Illumina MiSeq gibi bir sentez yoluyla dizileme teknolojisi kullanıldığında, DNA parçalarının boyutu, akış hücresinde kümelerin oluşturulma verimliliğini etkiler. Örneğin, bir kütüphane hem daha kısa hem de daha uzun DNA parçaları içerdiğinde, daha kısa olanlar dizileme verilerinde aşırı temsil edilecektir7,8. Buna karşılık, benzer büyüklükte DNA parçalarına sahip bir kütüphane, dizileme verilerinde orantılı olarak temsil edilecektir. Birçok kütüphane hazırlama kiti, DNA parçalarına adaptörler eklemek için ligasyon tabanlı yöntemler kullanır ve bir ek içermeyen adaptör dimerlerini çıkarmak için boyut seçimi gereklidir9,10. Bunu başarmak için çok sayıda yöntem11,12 vardır, ancak en tutarlı sonuçları veren teknik, DNA'nın elektroforetik olarak ayrılması ve ardından istenen DNA uzunluklarının geri kazanılmasıdır13,14. Bu işlem az sayıda numune için manuel olarak gerçekleştirilebilir, ancak yüzlerce numunenin işlenmesiyle karşı karşıya kalındığında otomatik çözümler gereklidir. Otomatik jel boyutu seçimi için şu anda mevcut olan platformlar düşük verimlidir ve dizileme için çok sayıda numuneyi işlemek için yeni platformlara ihtiyaç vardır. Ranger Teknolojisi, günümüzün yüksek verimli ortamını karşılayan bir ölçekte boyut seçimi ve analitik amaçlar için agaroz jel elektroforezinin kullanılmasını sağlamak için mevcut sıvı işleme iş istasyonlarıyla entegre edilebilir.

<table><tbody><tr><td>Peristaltik pompa Masterflex P/S 1400 Serisi</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>1400-1620</td><td></td></tr><tr><td>0.2 ve mikro; m Supor Membran</td><td>VWR</td><td>CA28143-969</td><td>Pall Corporation, Ann Harbor, MI</td></tr><tr><td>Tungsten karbür boncuklar 3 mm (200)</td><td>Qiagen</td><td>69997</td><td></td></tr><tr><td>İzopropil alkol %70</td> <td>Jedmon Ürünleri</td><td>825751</td><td>Healthcare Plus</td></tr><tr><td>DNA uzakta</td><td>VWR</td><td>7010</td><td>Molecular BioProducts, Inc. San Diego, CA</td></tr><tr><td>Milli-Q su arıtma sistemi</td><td>Fisher Scientific</td><td>ZMQS6VF0Y</td><td>Merck Millipore. Bu sistem kullanımdan kaldırıldı.</td></tr><tr><td>20x PBS pH 7.5</td><td>VWR</td><td>E703-1L</td><td>Amresco, Inc., Solon, OH</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-100</td><td>Fisher kimyasalları</td></tr><tr><td>2 için Vorteks adaptörü (50&nbsp; ml) tüpler</td><td>VWR</td><td>13000-V1-50</td><td>MoBio, Carlsbad, CA</td></tr><tr><td>Vortex-Genie 2, 120&nbsp; V (Model G560)</td><td>VWR</td><td>SI-0236</td><td>Bilimsel Endüstriler, Inc.</td></tr><tr><td>Beckman Santrifüj</td><td>Raeyco Lab Equipment Systems Management Ltd</td><td>Model J-6B</td><td></td></tr><tr><td>PowerLyzer Powersoil DNA izolasyon kiti</td><td>VWR</td><td>12855-100</td><td>MoBio, Carlsbad, CA</td></tr><tr><td>24 (1.5-2 ml) tüp için vorteks adaptörü</td><td>VWR</td><td>13000-V1-24</td><td>MoBio, Carlsbad, CA</td></tr><tr><td>Mikrofüj 18 santrifüj</td><td>Beckman Coulter</td><td>367160</td><td></td></tr><tr><td>Nimbus Select iş istasyonu ile Ranger Technology</td><td>Hamilton Robotics</td><td>92720-01</td><td>Sıvı işleme iş istasyonunu ve entegre Ranger Tech (elektroforez donanımı) içerir</td></tr> <tr><td>Ranger reaktif kiti</td><td>Coastal Genomics</td><td>CG-10600-150-12-21</td><td>Yükleme tamponu ve kasetleri içerir</td></tr><tr><td>Etil alkol (susuz)</td> <td>Ticari Alkoller</td><td>P016EAAN</td><td>Greenfield</td></tr><tr><td>Etanol Sodyum asetat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2889-250G</td><td></td></tr><tr><td>Lineer akrilamid (5&nbsp; mg / ml)</td> <td>Yaşam Teknolojileri</td><td>AM9520</td><td>Ambion</td></tr><tr><td>Eppendorf soğutmalı santrifüj</td><td>Raeyco Lab Equipment Systems Management Ltd.</td><td>5417R</td><td></td></tr><tr><td>Tampon EB (250 ml)</td><td>Qiagen</td><td>19086</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 1000 Spektrofotometre</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-1000</td><td></td></tr><tr><td>Qubit florometre</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>Q32857</td><td>Invitrogen. Bu ürünün üretimi durduruldu.</td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS tahlil kiti</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>Q32854</td><td>Invitrogen</td></tr><tr><td>Yüksek hassasiyetli DNA reaktifi</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-4626</td><td></td></tr><tr><td>Yüksek hassasiyetli DNA çipleri</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-4626</td><td></td></tr><tr><td>Agilent 2011 Biyoanalizör</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2938B</td><td></td></tr><tr><td>Nextera XT DNA numune hazırlama kiti</td><td>Illumina</td><td>FC-131-1024</td><td></td></tr><tr><td>Nextera XT indeks kiti</td><td>Illumina</td><td>FC-131-1001</td><td></td></tr><tr><td>MiSeq reaktif kiti v2 (500 döngü)</td><td>Illumina</td><td>MS-102-2003</td><td></td></tr><tr><td>Miseq sistemi</td><td>Illumina</td><td>SY-410-1003</td><td></td></tr></tbody></table>

otomatik jel boyut seçimi Çevre su Örneklerinden hazırlanmıştır nesil sıralama kütüphaneler kalitesi geliştirmek için

Automated Gel Size Selection to Improve the Quality of Next-generation Sequencing Libraries Prepared from Environmental Water Samples

Çevresel örneklerin yeni nesil dizilimi, bu örneklerdeki değişken DNA miktarı ve kalitesi nedeniyle zor olabilir. Yeni nesil dizilemeden en iyi sonuçları almak için yüksek kaliteli DNA kütüphanelerine ihtiyaç vardır. Su gibi çevresel numuneler, düşük kalite ve miktarlarda DNA'nın yanı sıra DNA ile birlikte çökelen kirleticilere sahip olabilir. Ekstraksiyon ve kütüphane hazırlamada yer alan mekanik ve enzimatik süreçler DNA'ya daha fazla zarar verebilir. Jel boyutu seçimi, dizileme uygulamaları için tanımlanmış bir boyuttaki DNA fragmanlarının saflaştırılmasını ve geri kazanılmasını sağlar. Bununla birlikte, bu görev, DNA kütüphanesi hazırlama iş akışındaki en çok zaman alan adımlardan biridir. Burada açıklanan protokol, agaroz jel yüklemesinin, elektroforetik analizin ve hedeflenen DNA parçalarının geri kazanılmasının tam otomasyonunu sağlar. 
Bu çalışmada, tatlı su örneklerinden diğer çevresel örneklere de uygulanabilecek yüksek kaliteli DNA kütüphaneleri hazırlamak için yüksek verimli bir yaklaşım tanımlanmıştır. Çevresel tatlı su örneklerinden bakteri hücrelerini konsantre etmek için dolaylı bir yaklaşım kullandık; DNA, ticari olarak temin edilebilen bir DNA ekstraksiyon kiti kullanılarak ekstrakte edildi ve DNA kütüphaneleri, ticari transpozon tabanlı bir protokol kullanılarak hazırlandı. 500 ila 800 bp'lik DNA fragmanları, otomatik bir elektroforez iş istasyonu olan Ranger Teknolojisi kullanılarak seçilen jel boyutundaydı. Boyut olarak seçilen DNA kütüphanelerinin dizilenmesi, dizileme okumalarının okuma uzunluğu ve kalitesinde önemli gelişmeler gösterdi.

DNA Konsantrasyon ve Kalite Değerlendirmesi Bakteriyel DNA konsantrasyonları 0.01 ila 0.11 ng ​​/ farklı havza sitelerinin su numune başına mi (Tablo 1) arasında değişmektedir. Bakteriyel fraksiyondan izole edilmiş DNA sırası ile, 1.6 A 260/280 ve 1,4-1,8 arasında bir 260/230 oranı ve 0.3 vardı. Bir 260/230 oranları bazı nispeten düşük iken, belirgin bir inhibisyon hazırlanan kütüphane ve diğer alt uygulamalarda görülmektedir...

Bu el yazması, yeni nesil dizileme için DNA parçalarını saflaştırmak için otomatik bir jel boyutu seçim yaklaşımını açıklamaktadır. Ranger Teknolojisi, agaroz jel yükleme, elektroforetik analiz ve hedeflenen DNA parçalarının geri kazanılması sürecinin tamamının tam otomasyonunu sağlayarak yüksek verimli ve yüksek kaliteli yeni nesil dizileme kitaplıklarına olanak tanır.

Otomatik Jel Boyut Seçimi Çevre Su Örneklerinden hazırlanmıştır nesil Sıralama Kütüphaneler Kalitesi Geliştirmek için

Next-generation sequencing of environmental samples can be challenging because of the variable DNA quantity and quality in these samples. High quality DNA ...

Bu video, yeni nesil dizileme platformlarında daha iyi okumalar elde etmek için otomatik bir jel boyut seçme cihazının kullanımını göstermektedir. İlk olarak çevresel su örnekleri toplanır ve ökaryotik, bakteriyel ve viral boyutlardaki partikülleri sistematik olarak ayırmak için bir dizi filtreden geçirilir. Tutulan bakteriler, santrifüjleme ile daha fazla konsantre edilir.Ardından bakteriyel DNA ekstrakte edilir. Ekstrakte edilen DNA, adaptör ve indekslerin fragmente DNA'ya dahil edildiği kütüphanelerin hazırlanmasında kullanılır. DNA daha sonra PCR ile amplifiye edilir ve örnekler elektroforez iş istasyonuna yüklenir.Ardından belirli bir aralıktaki DNA fragmanları otomatik olarak seçilir. Çip tabanlı kapiler elektroforezden elde edilen izlerin analizi ve ek biyoinformatik veriler, bu yöntemin 200 baz çiftinin altındaki istenmeyen fragmanların minimum kümelenmesiyle, sonraki analizler için uygun miktarlarda DNA fragmanı sağladığını göstermektedir. Otomatik elektroforez kare istasyonunun veya paramanyetik boncukların ve diğer ticari sistemlerin temel avantajı, tek bir çalışmada 96 örneğe kadar işlemin gerçekleştirilebildiği daha sıkı ve dar bir seçim aralığına izin vermesidir.Bu yö

automated-gel-size-selection-to-improve-quality-next-generation

Research

JoVE Journal

Environment

Çevre

Mikrobiyal topluluğu karakterize etmek, çevresel mikrobiyolojide uzun süredir devam eden bir hedef olmuştur. Yeni nesil dizileme yöntemleri artık mikrobiyal toplulukların minimum maliyet ve iş gücü ile benzeri görülmemiş bir derinlikte karakterizasyonuna izin veriyor. Burada, bir tezgah üstü dizileyici kullanarak bakteriyel 16S ribozomal RNA genlerini dizileme yaklaşımımızı detaylandırıyoruz.

16S Ribozomal RNA Gen amplikonlarının nesil Sıralama

Geliştirilmiş İndirgenmiş Temsil Bisülfit Dizileme, sitozin bisülfit dönüşümü ile birleştirilmiş restriksiyon enzim sindirimine dayalı DNA metilasyon analizi için dizileme kitaplıklarının hazırlanması için bir yöntemdir. Bu protokol 50 ng başlangıç materyali gerektirir ve GC açısından zengin genomik bölgelerde baz çifti çözünürlük verileri verir.

Baz Çifti Çözünürlük DNA metilasyon Değerlendirme Temsil bisülfit sıralamayı İndirimli pekiştirilmiş

Bisülfit amplikon dizilemesi (BSAS), hedeflenen genomik ilgi bölgelerinde sitozin metilasyonunu ölçmek için bir yöntemdir. Bu yöntem, baza özgü bir seviyede DNA metilasyonunun mutlak kantitasyonunu üretmek için yeni nesil dizilemeden önce hedef bölgelerin PCR amplifikasyonu ile eşleştirilmiş bisülfit dönüşümünü kullanır.

DNA Metilasyon Analizi nesil Dizilimine tarafından hedef

Onkoloji örneklerinin hedeflenen yeni nesil dizilimi için entegre bir sistem tanımlanmıştır. Bu çapraz platform sistemi, düşük kaliteli ve düşük miktarlı tümör biyopsileri için optimize edilmiştir, düşük DNA girdilerini barındırır, iyi karakterize edilmiş çok varyantlı kontroller içerir ve kantitatif pre-analitik kalite kontrol önlemleriyle bilgilendirilen yeni bir varyant arayan içerir.

Düşük kaliteli ve düşük miktar Tümör Biyopsilerinde ve Islak ve kuru Bench Süreçleri Entegrasyonu Hedefli optimize eder nesil Sıralama

Biz 16S rRNA gen sıralama amplikon kullanarak bakteri topluluklarının karakterizasyonu için sürüntü nükleik asidin çıkarmak için etkili, sağlam ve uygun maliyetli bir yöntem açıklanmaktadır. yöntem birden fazla örnek türleri için ortak bir işleme yaklaşımı sağlar ve alt analitik süreçlerin bir dizi barındırmaktadır.

Bakteriyel Topluluk Karakterizasyonu Verimli Nükleik Asit Ekstraksiyonu ve 16S rRNA gen Sıralama

En yaygın bağırsak içeriği macroinvertebrates, görsel analizlerdir. Av organizmaların morfolojik çeşitlilik hakkında yoğun bilgi gerektiren, onlar yumuşak gövdeli yırtıcı özledim ve, nedeniyle güçlü ezme yırtıcı solungaçlarınızı de dahil olmak üzere bazı organizmalar için neredeyse imkansız. Biz macroinvertebrate için detaylı, yeni genetik yaklaşımlar diyet tanımlaması solungaçlarınızı av sağlar.

Su Macroinvertebrates kullanma gruba özel rDNA astar genetik Gut içerik analizleri için laboratuvar iletişim kuralı

Jel-seq kitaplıkları için her iki DNA - ve RNA-seq basit hidrojel aygıtı kullanarak 100-1000 hücreden başlayarak ihmal edilebilir ek maliyetle aynı anda hazırlamak araştırmacılar sağlar. Bu kağıt eşleştirilmiş kitaplıkları oluşturmak için biyolojik Protokolü yanı sıra cihazın imalatı için detaylı bir yaklaşım sunar.

Jel-seq: DNA ve RNA hidrojel matrisleri kullanarak eşzamanlı sıralama kitaplığı hazırlanması için bir yöntem

Tam uzunlukta bireysel proviral sıralama (döndürür) amplifikasyon ve sıralama tek, tam uzunlukta (sağlam ve arızalı) HIV-1 proviruses yakınındaki bir verimli ve yüksek işlem hacmi yöntemi sağlar ve potansiyellerini belirlenmesi için izin verir çoğaltma-yetkinlik. DÖNDÜRÜR önceki deneyleri gizli HIV-1 rezervuar sıralamak için tasarlanmış sınırlamalar üstesinden gelir.

Amplifikasyon tam uzunlukta HIV-1 Proviruses yakınındaki yeni nesil sıralama için

Genlerin ve onların düzenleyici elemanlarının arasındaki fiziksel etkileşimleri tanımlaması zordur ama kromozom conformation yakalama yöntemleri tarafından kolaylaştırdı. Bu değişiklik 4C-seq protokolü için PCR önyargı yanında en aza indirgemek PCR şablonları aşırı amplifikasyon azaltır ve bir ek Restriksiyon enzimi Özet adım dahil ederek okur mappability en üst düzeye çıkarır.

Gen düzenleyici dizileri dairesel kromozom Conformation yeni nesil sıralama kullanarak yüksek üretilen iş tanımlaması yakalama (4C-seq)

Genel olarak, bir dezenfeksiyon yöntemiyle bulaşıcı olmayan hale getirilmiş virüslere veya diğer benzer virüslere değil, yalnızca bulaşıcı virüslere bağlanan belirli aptamerlere uygulanabilecek bir protokol sunuyoruz. Bu, taşınabilir ve hızlı testlerde bulaşıcılık durumunu belirleme olasılığını açar.

Enfeksiyöz ve Enfeksiyöz Olmayan Virüsleri Ayırt Etmek için Aptamerlerin İn Vitro Seçimi

Bu protokol, ilgilenilen biyolojik bir numune için standartlaştırılmış ekipman kullanarak poli(A) RNA saflaştırması, bisülfit dönüşümü ve kütüphane hazırlığı yapmak için takip edilmesi kolay bir iş akışı sağlar.

Yeni Nesil Dizileme için mRNA ve Bisülfit-mRNA Kütüphanesinin Zenginleştirilmesi Hazırlığı

Öğrenin otomatik jel boyut seçimi yöntemiyle çevre su örneklerinden yüksek kaliteli DNA kütüphaneleri hazırlamayı. Bu yöntem, nesil sıralama verilerinin okuma kalitesini artırır ve yüksek verimli analiz sağlar.

Otomatik Jel Boyut Seçimi Çevre Su Örneklerinden hazırlanmıştır nesil Sıralama Kütüphaneler Kalitesi Geliştirmek için

Daha fazla video keşfet