Otomatik Jel Boyut Seçimi Çevre Su Örneklerinden hazırlanmıştır nesil Sıralama Kütüphaneler Kalitesi Geliştirmek için

Bu video, yeni nesil dizileme platformlarında daha iyi okumalar elde etmek için otomatik bir jel boyut seçme cihazının kullanımını göstermektedir. İlk olarak çevresel su örnekleri toplanır ve ökaryotik, bakteriyel ve viral boyutlardaki partikülleri sistematik olarak ayırmak için bir dizi filtreden geçirilir. Tutulan bakteriler, santrifüjleme ile daha fazla konsantre edilir.

Ardından bakteriyel DNA ekstrakte edilir. Ekstrakte edilen DNA, adaptör ve indekslerin fragmente DNA'ya dahil edildiği kütüphanelerin hazırlanmasında kullanılır. DNA daha sonra PCR ile amplifiye edilir ve örnekler elektroforez iş istasyonuna yüklenir.

Ardından belirli bir aralıktaki DNA fragmanları otomatik olarak seçilir. Çip tabanlı kapiler elektroforezden elde edilen izlerin analizi ve ek biyoinformatik veriler, bu yöntemin 200 baz çiftinin altındaki istenmeyen fragmanların minimum kümelenmesiyle, sonraki analizler için uygun miktarlarda DNA fragmanı sağladığını göstermektedir. Otomatik elektroforez kare istasyonunun veya paramanyetik boncukların ve diğer ticari sistemlerin temel avantajı, tek bir çalışmada 96 örneğe kadar işlemin gerçekleştirilebildiği daha sıkı ve dar bir seçim aralığına izin vermesidir.

Bu yöntem tatlı su örneklerindeki mikrobiyal topluluklar hakkında bilgi sağlayabilse de; deniz suyu, atık su arıtımı, bitki örnekleri, sediman toprağı veya mikrobiyal matlar gibi diğer sistemlere, esasen belirli bir boyut aralığında dar bir seçim yapmak istediğimiz her türlü DNA örneğine uygulanabilir. Bu yöntemle ilgili ilk fikri, MySEQ platformu sekanslarında kısa fragmanlar gördüğümüzde edindik. Farklı para boncuk türleri ve oranlarının yanı sıra manuel jel boyut seçimi yaklaşımı da dahil olmak üzere çeşitli boyut seçme yöntemlerini denedik.

Ardından, Ranger teknolojisini sunan, British Columbia merkezli özel bir şirket olan Coastal Genomics ile iş birliği yapmaya başladık ve prosedürün uygulamasını gerçekleştirdik. Bugün bizlere laboratuvarımdan araştırma teknisyeni Michael Chan, laboratuvarımdan doktora sonrası araştırmacı Miguel Yi ve Coastal Genomics'ten mühendis Jared Sloan eşlik edecek. Bu videoda, yalnızca 0.2 mikronluk filtrelerde toplanan ve öncelikle serbest yaşayan bakterilerden oluşan materyalin saflaştırılmasını ve analizini açıklayacağız; ancak filtrelerden elde edilen diğer partiküller için de benzer yaklaşımların kullanılabileceğini unutmayın.

Bu prosedüre, sterilize edilmiş 20 litrelik karboylar kullanarak çeşitli çevresel alanlardan toplam 40 litre tatlı su örneği toplayarak başlayın. Örnekleri, 105 mikrometre spektrum mesh polipropilen filtre kullanarak yerinde ön filtrelemeden geçirin. Burada örnekler, kentsel ve tarımsal etkiler altındaki su havzalarından toplanmıştır.

Toplama işleminin ardından, örnekleri soğutuculara yerleştirin ve laboratuvara geri taşıyın. Örnekleri dört derece Celsius'ta saklayın. Ertesi gün.

Numune toplama karboyunun bir peristaltik pompa aracılığıyla bir mikronluk bir enviro check örnekleme kapsülüne bağlandığı bir filtrasyon sistemi kurun. Örnekleme kapsülünü 0,2 mikronluk bir disk filtreye ve bunu da ikinci bir peristaltik pompa yardımıyla 30 kilodaltonluk bir tanjansiyel akış filtresine bağlayın. Numuneleri bir dizi filtreden geçirmek için peristaltik pompaları çalıştırın; ökaryotik hücreler örnekleme kapsülünden geçerken izole edilecektir.

Bakteriyel fraksiyon membran disk filtre üzerinde, viral partiküller ise tanjantiyel akış filtresi üzerinde izole edilecektir. Su filtrasyon sistemindeki 0.2 µm membran filtreyi veya filtreleri çıkarın. Ardından filtreyi ikiye katlayıp 50 mL'lik bir tüpe yerleştirin.

Açık tarafı yukarı gelecek şekilde tutun. Tüpe beş mililitre tween içeren PBS ekleyin. Filtrasyon sırasında birden fazla filtre kullanıldıysa, her filtre için farklı bir tüp kullanın.

Filtreler daha sonra 4 °C'de saklanabilir veya aşağıdaki gibi hemen işleme alınabilir. Ardından, steril pens yardımıyla membran filtreyi 50 mL'lik tüpten çıkarın ve steril pens ve steril makas kullanarak bir Petri kabına yerleştirin. Örnekler arasını ayıracak şekilde filtreyi 1 cm x 1 cm boyutlarında parçalara bölün.

Enstrümanları %70 isopropanol içinde bekleterek, bir DNA yüzey dekontaminantı ile silerek ve ardından tip 1 ultra saf su ile durulayarak dezenfekte edin. Filtre parçalarını tekrar aynı 50 mililitrelik tüpe yerleştirin. Steril pensler kullanarak, toplam tampon hacmini 15 mililitreye tamamlamak için 10 mililitre tweenli PBS ekleyin.

Her bir 50 mililitrelik tüpe, üç milimetre çapında altı adet temiz tungsten boncuk ekleyin. Tüpü parafilm ile kapatın ve 20 dakika boyunca şiddetli bir şekilde vortekslenmeye bırakın.

Vorteksledikten sonra, her örnek için tüm süspansiyonları tek bir temiz 50 mililitrelik tüpte birleştirin. Tüpleri 4 °C'de 15 dakika boyunca 3.300 g'de santrifüjleyin. Santrifüj işleminden sonra süpernatanı uzaklaştırın ve peleti yeniden süspande edin.

Beş mililitre PBS çözeltisi içindeki bakteriyel hücreleri, 1,7 mililitrelik mikrosantrifüj tüplerine birer mililitrelik alikotlar halinde dağıtın ve bir mikrosantrifüjle 10.000 g'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin. Santrifüj işleminin ardından, bir pipet kullanarak süpernatantın 200 µL'den fazlasını uzaklaştırın. Örnekleri -80 °C'de saklayın veya ticari olarak temin edilebilen bir DNA izolasyon kiti kullanarak bakteriyel DNA ekstraksiyonuna geçin.

Bakteriyel DNA ekstraksiyonu sırasında, negatif ekstraksiyon kontrolü olarak PBS veya su, pozitif ekstraksiyon kontrolü olarak ise e coli kullanın. DNA ekstraksiyon prosedürünün ardından, aynı örneğe ait alikotları 10 millimolar tris tamponu içeren bir adet iki mililitrelik tüpte birleştirin. Ardından, %10 üç molar sodyum asetat çözeltisi, iki hacim %100 etanol ve beş mikrolitre lineer akrilamid ekleyerek gece boyunca çöktürme işlemini gerçekleştirin. Örnekleri negatif 80 derece santigrat sıcaklıkta saklayın.

Ertesi gün, örnekleri 4 °C'de 30 dakika boyunca 17,000 GS'de santrifüjleyin. Santrifüj işleminin ardından, peleti 1 ml buz soğukluğundaki %70 etanol ile yıkayın ve peletin bir biyogüvenlik kabininde beş dakikadan fazla olmamak kaydıyla havada kurumasına izin verin.

Ardından DNA peletini 10 millimolar tris-HCl içinde yeniden süspande edin. Son olarak, yüksek hassasiyetli floresan nükleik asit miktar tayini analizi ve ardından mikro hacim spektrometrisi gerçekleştirerek DNA miktarını ve kalitesini belirleyin. Her örnekteki DNA miktarı belirlendikten sonra, konsantrasyonu yaklaşık 0.2 nanograms per microliter seviyesine getirmek için her tüpe uygun miktarda su ekleyin.

Ticari olarak mevcut bir kit kullanarak, bir nanogram bakteriyel DNA'dan indekslenmiş fragmanlardan oluşan bir DNA kütüphanesi hazırlayın. Burada, DNA'yı eş zamanlı olarak fragmante etmek ve adaptör dizilerini dahil etmek için "tagmentation" olarak bilinen transpozaz tabanlı bir yöntem uygulanır. Ardından, DNA örneklerini eş zamanlı olarak amplifiye etmek ve indekslemek için PCR gerçekleştirilir; böylece her fragmanda spesifik barkodlar ve sekanslama platformu tarafından okunabilen küme oluşumu için gerekli diziler sağlanır.

PCR tamamlandıktan sonra, standart PCR sonrası temizleme adımını atlayın ve toplam hacim 28.5 µL olacak şekilde her örneğe 3.5 µL yükleme tamponu ekleyin. Ardından örnekleri 96 kuyucuklu bir plakaya aktarın. Ranger yazılım kullanıcı arayüzü üzerinden, önceden hazırlanmış %1.5 agaroz kaseti bulunan bir elektroforez istasyonuna 96 kuyucuklu plakayı yerleştirin.

500 ila 800 baz çifti arasında bir boyut seçim hedefi belirleyin. Ekstraksiyon hacmini 300 µL olarak ayarlayın. Çalışmayı başlatın.

Elektroforez iş istasyonu, örnekleri aros kasetlerine otomatik olarak yükleyecektir. Ardından kasetlere voltaj uygulanır ve aros içindeki örnek DNA'nın konumunu belirlemek için gantry montajlı bir görüntüleme sistemi kullanılır. Çalışma boyunca.

Ranger yazılımı görüntüler yakalar ve dahili standartları kullanarak her bir örnekteki boyut seçimli hedefin konumunu tahmin eder. Hedefler tanımlandıktan sonra, Ranger yazılımı hedeflerin kaset ekstraksiyon kuyucuklarına varışını senkronize etmek için her bir örneğe uygulanan voltajı değiştirir.

Son olarak, elektroforez iş istasyonu, TBE içindeki hedefleri ekstraksiyon kuyucuklarından aspire eder ve ham çıktı materyalini konsantre etmek için yeni bir 96 kuyucuklu plakaya dağıtır; ardından ham elüsyon hacmini sodyum asetat ve etanol ile lineer akrilamid kullanarak -80 °C'de gece boyunca çöktürür. Örnekleri 17.000 ×g'de 30 dakika boyunca tekrar santrifüjleyin. Santrifüj işleminden sonra süpernatanları atın ve DNA plağını 1 mL buz gibi soğuk %70 etanol ile yıkayıp santrifüjleyerek işleme devam edin.

Numuneler 30 dakika boyunca 17.000 g'de santrifüj edilir, süpernatan atılır, numuneler kurutulur ve son olarak DNA peleti 10 millimolar tris CL içinde yeniden süspanse edilir. Ardından, transpose on base kütüphane hazırlama kitinde bulunan kütüphane normalizasyon boncukları kullanılarak numunelerin normalizasyonuna geçilir. Son olarak, yeni nesil dizileme platformlarında daha bilgilendirici okumalar elde etmek amacıyla yeni nesil dizileme platformu kullanılarak DNA dizilemesi gerçekleştirilir. Bu işlem, dizileme kütüphanelerinin kalitesini artırarak sağlanır.

Su örnekleri sekiz farklı havza alanından alınmış ve izole edilen bakteriyel fraksiyondan indeks DNA kütüphaneleri hazırlanmıştır; bu durum ekteki elektroferogramda gösterilmiştir. PCR sonrası ancak otomatik boyut seçiminden önce tatlı su örneklerinden elde edilen DNA kütüphaneleri, boyutları 50 baz çiftinden 3000 baz çiftine kadar değişen fragmanlardan oluşmaktaydı. Yüksek verimli otomatik platform kullanılarak yapılan boyut seçiminin ardından, örnekler 500 ile 800 baz çifti arasında dar bir DNA fragman aralığına sahip olmuştur. Böylece, bu otomatik jel boyut seçim platformunun kullanımı uygun verimler sağlanmasını sağlamış ve 200 baz çiftinin altındaki istenmeyen fragmanların kümelenmesini en aza indirmiştir.

Bu kütüphanenin alüminyum MiSeq cihazında DNA dizilemesi, milimetrekare başına 1198 K'lık bir küme yoğunluğu oluşturmuştur. Filtreleri geçen kümelerin yüzdesi %84,2 olup tahmini verim 9,2 gigabayt olarak belirlenmiştir. Dahası, okumaların 7,4 gigabaytı veya %82,8'i 30'a eşit veya 30'dan büyük bir kalite skoruna sahipti.

Bu, bu modifiye protokol ile dizilen ve çevresel su örneklerine uygulanan bazların yaklaşık %83'ünün en az %99,9'luk bir baz çağırma doğruluğuna sahip olduğu anlamına gelir. Bu videoyu izledikten sonra, dizileme kütüphanelerinden nasıl daha bilgilendirici veriler elde edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Bu prosedürü gerçekleştirirken, hedeflediğiniz mikrobiyal fraksiyonun; kütüphane hazırlığı seçimini, hedef fragman uzunluğunu ve dizileme platformlarını belirlemede önemli olduğunu hatırlamak gerekir.