Üç boyutlu (3D) Tümör Sfero Yayılması deneyindeki

Bu prosedürün genel amacı, tümör hücresi istilasının in vitro, yarı otomatik, üç boyutlu bir mikroplaka tahlili sağlamaktır. Bu, ilk olarak, her bir oyukta bir kerede steroid olmak üzere, ultra düşük ataşman yuvarlak alt 96, kuyucuk plakalarında süspansiyon halinde tekrarlanabilir büyüklükte tümör steroidleri üretilerek gerçekleştirilir. İkinci adım, ortamın parçalarını çıkarmak ve tümör hücrelerinin steroid gövdesinden istila ettiği yarı katı bir matris sağlamak için doğrudan her bir oyuğa matris veya BMM gibi bazal membran eklemektir.

Daha sonra, tümör steroid invazyonu, 72 ila 96 saatlik bir süre boyunca aralıklarla izlenir ve bu süre zarfında görüntü elde etmek bir sitometre üzerinde otomatik olarak veya bir mikroskopta manuel olarak gerçekleştirilir. Son adım, otomatik bir sitometre veya görüntüleme yazılımı aracılığıyla tümör hücresi istilasını analiz etmektir. Sonuç olarak, 3D tümör steroid invazyon testi, kanser invazyonunu in vitro olarak fizyolojik olarak daha ilgili ve doğrulama ve ilaç tarama çalışmalarını hedeflemeye uygun bir formatta modellemek için kullanılır.

Bu tekniğin, normalde kanser araştırmalarında hedef doğrulama ve ilaç taraması için kullanılan basit iki boyutlu hücre proliferasyon testlerini tamamlayıcı olduğuna inanıyoruz, çünkü aynı zamanda kanser ilerlemesinin önemli bir yönü olan istilayı fizyolojik olarak ilgili üç boyutlu bir formatta araştırmamıza da olanak tanıyor. Bu yöntem için ilk olarak, mikroplaka üzerindeki büyüme olan 3D tümör phe'sini optimize ettiğimde aklıma geldi. Aynı kurulumu ve istilaya bakışı kullanmanın iyi olacağını düşündüm ve sonuç, her bir kuyucuktan ortamın bir parçasını çıkarmak ve onu bazal membran benzeri matris ile değiştirmek kolaydı.

Bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi önemlidir, çünkü BMM geleneğinden sonra steroidleri her bir kuyucuğun merkezi bir konumunda tutmak başlangıçta zor olabilir. Bu, steroidlerin farklı odak düzlemlerinde olması nedeniyle yetersiz görüntü analizine neden olabilir. Tecrübe ile.

Bu nadiren olur, ancak gerekirse, işlem plakanın nazikçe santrifüjlenmesiyle kolaylaştırılabilir. Gece boyunca ICE üzerindeki tüm BMM'ye başlamak için, P 10 E 200 ve P 1000 pipetleri için bir dizi steril filtre ucu bulundurun ve steril tüpler eksi 20 santigrat derecedir. Ayrıca dört günlük steroidler içeren ultra düşük ataşman 96 oyuklu plakaları buz üzerine yerleştirin.

Çok kanallı bir pipet kullanarak, serçe plakalarından büyüme ortamı kuyusu başına 100 mikrolitreyi nazikçe çıkarın. Bu adım için ucu U tabanının iç duvarına doğru açın. Kuyu dibi ve kürenin yeri ile temastan kaçının.

Buz gibi soğuk uçlar kullanarak steroidlerin bozulmasını en aza indirmek için BMM'yi buz gibi soğuk tüplere aktarın. Sitokin kaynaklı invazyon veya ilaç değerlendirme çalışmaları için, buz gibi soğuk uçlar kullanarak BMM'ye reaktifler ekleyin. Örneğin, Cal S ve kal r skuamöz karsinom hücrelerinin istilasını uyarmak için epidermal büyüme faktörü veya EGF kullanın.

Ardından 100 mikrolitre BMM'yi yavaşça ubo'ya dağıtın. Ucu kuyunun iç duvarına doğru hedefleyin. Bu adım en kritik olanıdır.

Optik görüntü analizine gelince, steroidler kuyunun merkezinde kalmalıdır. Gerekli tüm kuyucuklar için bu adımı tekrarlayın ve koşul başına beş ila altı çoğaltmaya izin verin. Gerekirse, steril bir iğne kullanarak taze soğutulmuş bir uca geçin.

Varsa baloncukları çıkarın. Steroidin merkezi bir konumda olup olmadığını görsel olarak kontrol etmek için bir mikroskop kullanın, eğer değilse, plakayı üç dakika boyunca dört santigrat derece boyunca 300 kez G'de santrifüjleyin. Bu, steroidlerin her bir kuyucuğun merkezinde bulunmasını sağlayacaktır.

Daha sonra, plakayı 37 santigrat derecede bir inkübatöre aktarın ve BMM'nin bir saat sonra katılaşmasına izin verin. Tam büyüme kuyusu başına nazikçe 100 mikrolitre eklemek için çok kanallı bir pipet kullanın. Orta veya sitokin kaynaklı invazyon veya ilaç değerlendirme çalışmaları.

Otomatik görüntü elde etmek için ortama sitokinleri veya inhibitörleri dahil edin. Sitometre üzerindeki plakaları aralıklarla tarayın. Sıfır zamanından başlayarak birleşme uygulamasını seçin.

Ardından steroidin odakta olup olmadığını kontrol edin. Gerekirse, odağı manuel olarak ayarlayın ve odak ofsetini sabitleyin. Örnekleme ayarları altında.

Seçici bir merkezi görüş alanını tarar. BMM ilavesini takiben, tümör steroidleri merkezi bir pozisyonda kalmış olmalıdır. Bu nedenle, yazılımda tüm kuyuyu taramaya gerek yoktur.

Taranacak kuyuları plaka haritası üzerinde vurgulayarak tanımlayın. Ardından taramayı başlat'a tıklayın. Otomatik görüntü analizi için izdiham uygulamasını seçin.

Analiz sekmesinde, hücre süreçleri ve BMM'ye uzanan istilacı podia dahil olmak üzere steroid etrafında kesin bir segmentasyon oluşturmak için uygulama ayarlarını yapın. Her tümör hücresi hattı için ve/veya çeşitli zaman noktalarında ayarları yapın. Birkaç farklı kuyucuğa tıklayarak analiz ayarlarının plakadaki diğer steroidler için uygun olup olmadığını kontrol edin.

Segmentasyon bir steroidi doğru bir şekilde özetlemiyorsa, uygulama ayarlarını daha da ayarlayın. Sonuçlar sekmesinde analizi başlat'a tıklayın. Kuyu seviyesi verilerini bir elektronik tablo programına aktarmadan önce analiz kalitesini doğrulamak için birden fazla kuyuyu kontrol edin.

Analizi tüm zaman noktaları için tekrarlayın, ardından çoğaltılan kuyular için ortalama birleşme yüzdesini ve artı bir çubuk grafikte zamana karşı istilayı hesaplayın. Manuel görüntü elde etmek için tercih edilen bilimsel grafik ve istatistiksel yazılımı kullanarak, her bir tümör steroidi için aralıklarla bir görüntü kaydetmek için 10 x objektif ile donatılmış ters çevrilmiş bir mikroskop kullanın. T'den başlamak sıfıra eşittir, T ise 72 ile 96 saat arasına eşittir.

Söz konusu hücre astarının istila hızına bağlı olarak, işgal edilen bir alan 10 x görüş alanı içinde tamamen yakalanamayacak kadar büyük olduğunda bir Forex hedefi kullanın. Manuel görüntü analizi için alınan her bir görüntüyü kaydedin. Sahne alanı grafik görüntülerini görüntüleme analizine açın.

Kalibrasyon için tercih edilen yazılım, bir sahne grafiğinin görüntüleridir. Hem 10 x hem de dört x hedef kullanma. Grafik ölçümleri, birimleri ve kullanılan hedefleri girin ve kalibrasyonu gerçekleştirin.

Bu adım, sonraki görüntü analizi için yalnızca bir kez gereklidir. Gerekli kalibrasyon ayarlarını yeniden yüklemeniz yeterlidir. Ardından, istila tahlil görüntülerini açın ve görüntüleri elde etmek için kullanılan mikroskop objektifine bağlı olarak kalibrasyon ayarlarını seçin.

Burada kullanılan yazılımdaki steroidlerin kapladığı alanı ölçün. Ölç'e gidin ve sayım boyutunu seçin. Ayarları yüklerken seçin ve önceden belirlenmiş tahlil ayarlarını seçin.

Ardından sayıyı seçin. Steroid daha sonra doğru bir şekilde bölümlere ayrılmalıdır. Ölçümleri bir elektronik tabloya aktarın ve ilgili görüntü bilgilerini elektronik tabloya kaydedin.

Son olarak, bilimsel grafik ve istatistiksel yazılım kullanarak zamana karşı replike steroidlerin veya istilanın ortalama alanını çizin. Burada, beyin tümörü istilasını örneklemek için kullanılabilecek U 87 MG glioblastoma hücre hattında gözlenen kanser hücresi istilasının bir örneği olarak gösterilmiştir. Tipik bir yıldız patlaması istila paterni ile yayılan BMM hücrelerine gömüldükten sonra, süreç 72 saatlik bir süre boyunca takip edilir.

Tam otomatik görüntü analizi. Bir görüntü sitometresi kullanmak, hücre çıkıntıları etrafında bir segmentasyon oluşturur ve tümör hücresi istilasının kesin olarak ölçülmesini sağlar. Bu hücre hattı için, steroid gövdesinin istila edilen alanın ölçümünden çıkarıldığına dikkat edin.

Tam otomatik görüntü analizi kolayca gerçekleştirilir ve zaman içinde tümör hücresi istilasının niceliksel olarak belirlenmesini sağlar. İnsan skuamöz, baş ve boyun izojenik tarafından farklı bir hücre istilası paterni görüntülenir. Kanser hücre hatları Cal S, EG FFR tirozin kinaz inhibitörlerine karşı hassastır ve CAL R'ye dirençlidir.

EGF'nin yokluğunda, Cal ars steroidlerinin ana gövdesinden ekstrüde edilen EGF parmak benzeri çıkıntıların varlığında hiçbir hücre hattı BMM'ye invaze etmedi. Cal hücreleri 72 saat sonra daha az invaziv iken, bu vakadaki görüntüler bir görüntü sitometresi kullanılarak hızlı bir şekilde elde edildi ve alternatif bir yöntemi örneklemek için, invazyon derecesi bağımsız görüntü analiz yazılımı kullanılarak manuel olarak ölçüldü Bu prosedürü denerken, her hücre hattının steroid oluşturma kabiliyeti için optimize edilmesi gerektiğini hatırlamak önemlidir. hücre tohumlama yoğunluğu, matris bileşimi ve görüntü ve analiz ayarları Bu prosedürü takiben. Aynı yöntem, örneğin, karmaşık bir dokuya veya glioma için astrositler veya gastrointestinal kanserler için kript kültürleri gibi diğer organoidlere veya hepatosellüler karsinom ve kolon kanseri metastazı için karaciğere benzemek için embriyo gövdeleri ile kokültür içindeki tümörleri kullanarak bir 3D doku istilasını değerlendirmek için de uyarlanabilir.