Name: Basitleştirilmiş İnsan Nötrofil Ekstrasellüler Tuzaklar (NET) İzolasyon ve Taşıma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 43 s
Description: Öğrenin, insan tam kanından nötrofil ekstraselüler tuzakların (NET) basit izolasyon yöntemini. Bu protokol, kanser hücrelerinin yapışmasını değerlendirmek için kullanılan hücre içermeyen NET izolatının hazırlanmasını gösterir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Yazarlar, bu çalışmanın inşasında merkezi olan rehberliği ve akıl hocalığı için Dr. Paul Kubes'e teşekkür eder.

NOT: Tüm deneyler yerel kurumsal etik kurallarına uygun olarak yapılmıştır. 1. Kan Alma <ol><li> Antekubital damardan aracılığıyla yeşil kapaklı (heparinize edilmiş) tüplere sağlıklı gönüllü kan 14 tüpleri toplamak ve buz üzerinde yerleşmeden önce, her tüp ters. Optimal nötrofil verimi sağlamak için deney 15 dakika - 10 içinde kan toplayın. </li></ol> Tüm Blood 2. Nötrofil İzolasyon <ol><li> Kan sulandırmak için Ca ve Mg olmadan 5 ml PBS ile yapılan her bir kan yeşil kapaklı tüp yıkayın. 4 x 50 ml konik boruların her birinde, oda sıcaklığında, Limfosit Ayırma Ortamı (LSM), 15 ml ekleyin. Keskin LSM-kan arayüzü oluştururken, dikkatle LSM üzerine seyreltilmiş kan katman, 60 ml şırınga üzerine monte edilmiş bir 18 G iğne kullanarak. Not: mümkün olduğu kadar tabakalar karıştırma kaçının. </li><li> Ara vermeden, 21 ° C&#39;de 30 dakika boyunca 800 x g&#39;de santrifüjleyin. NOT: Ani sonları canFarklı katmanların karıştırma neden olur. </li><li> Altındaki eritrositler ve nötrofiller tortu gözlemleyin. Aspire ve sadece alt kırmızı tabaka bırakarak, lenfositler ve mononükleer hücreleri içeren bu katmanlar arasındaki arayüzü kurtulmak için emin üst 2 katmanları (plazma ve EKK) yapım atın. </li><li> Her bir tüpe, fosfat tamponlu salin (PBS) ve 20 ml 6% Dekstran çözeltisine 20 ml ekleyin. Yavaşça eritrosit ve nötrofillerin tabakası ile karıştırın ve 30 dakika boyunca oda sıcaklığında oturmasına olanak sağlamak için her bir tüp ters. NOT: Bu kırmızı kan hücreleri (eritrositler) alt sediment sağlayacaktır. </li><li> 30 dakika sonra, taze tüp içine nötrofil zengin süpernatant aktarmak ve RBC pelet atın. 5 dakika boyunca 4 ° C&#39;de 450 x g&#39;de santrifüjleyin yüzer. Santrifüj işleminden sonra, süpernatant atılır. pelet çoğunlukla nötrofil ve birkaç eritrositlerde içerecektir. </li><li> Steril su, 4.5 ml tampon lize 0.5 ml ilave etmek suretiyle, bir yokedici çözelti hazırlayın. Lyse t RBC kalano bir tüp içine tüm yeniden süspanse pelet transfer, çözüm parçalama 5 ml hazırlanmış. 10 dakika süre ile karanlıkta, oda sıcaklığında erimesini izin verir. </li><li> 5 dakika boyunca 4 ° C&#39;de 450 x g&#39;de santrifüjleyin. Süpernatant atılır ve kalan yokedici çözeltisi kurtulmak için 4 ° C&#39;de 450 x g hızında tekrar Ca ve Mg ve santrifüj olmadan 5 ml PBS ile yıkayın pelet. bu noktada elde edilen topak nötrofilleri içerir. Soğuk% 3 RPMI 30 ml pelletini tekrar ve buz koymak. Not:% 3 RPMI RPMI ortamı ilave etmek suretiyle yapılır% 3 fetal sığır serumu (FBS) </li><li> Metilen mavisi boyama kullanılarak numunenin saflığını doğrulayın. &gt; Hücrelerin% 95 çok-lober çekirdekleri ile granülositler olmalıdır. &gt; Doğrulamak hücrelerin% 95 canlılığı ve son nötrofil verimi saymak Trypan mavi boyama kullanın. 5 x 10 6 nötrofil / ml&#39;lik bir son konsantrasyon elde etmek için buz gibi soğuk% 3 RPMI nötrofilleri seyreltin. </li></ol> 3. Nesil NET&#39;ler <ol><li> 500 n nötrofillerin teşvikPMA M (nötrofil çözeltisi, 30 ml için) ve 37 ° C&#39;de,% 5 CO2 de 4 saat süre ile, 20 mm ızgara ile bir 150 x 25 mm, düz doku kültürü çanağı üzerinde inkübe edin. Bu NETosis sağlayacaktır. </li><li> Stimülasyon 4 saat sonra, yavaşça alt yapıştırılmış NET&#39;ler ve nötrofillerin tabakası bırakarak aspire ve ortam atılır. Bu katmanı bozabilir etmeyin. </li><li> Tabak başına Ca ve Mg olmadan soğuk PBS, 15 ml toplam kullanarak, alt kısmında bulunan tüm yapışkan malzemeyi kaldırmak üzere çanak alt PBS 15 ml pipetle her çanağın tabanı yıkayın. </li><li> 4 ° C&#39;de 450 x g&#39;de 10 dakika boyunca 15 ml konik bir tüp ve santrifüj her çanak (adım 3.3) yıkama elde edilen çözelti toplayın. Nötrofiller ve kalan hücreler, hücre içermeyen bir NET-zengin yüzer bırakarak alt pelet olacaktır. </li><li> Bölme 1.5 mi mikro santrifüj tüplerine süpernatan 4 ° C&#39;de 18000 x g&#39;de 10 dakika boyunca santrifüj. Bu, tüm DNA pelleti, izin verir. NOT: Büyük tu Santrifüjbes aksi yüksek hızlı mikro-santrifüj kullanmak için küçük tüplerde Süpernatantlar bölmek gerekir, yüksek hızları normal santrifüj ulaşılabilir olup olmadığını tüketen kolay ve daha az zaman. </li><li> 100 ul PBS başına 2 x 10 7 nötrofil tekabül eden bir konsantrasyona kadar buz soğukluğunda PBS içinde, elde edilen bütün topaklar Süpernatant atılır ve yeniden süspanse edin. Bu, daha sonraki deneyler için kullanılan hücre içermeyen NET stok verecektir. </li><li> Spektrofotometri veya alternatif DNA miktar aracını kullanarak elde edilen numune DNA konsantrasyonu ölçün. 180 ng / ul - numune içinde yeterli bir konsantrasyonu 140 arasında olmalıdır. </li></ol> 4. NET-Kanser Hücre Statik Yapışma Deneyi <ol><li> Karanlıkta 4 ° C&#39;de kaplama kuyu O / N 96 gözenekli düz tabanlı plaka içinde gözenek başına daha önce elde edilen NET stokunun 100 ul ilave edin ve izin verir. </li><li> Daha sonra saat 12 ila 20, hücrenin düzgün bir tek tabaka oluşumunu doğrulamakmikroskop altında oyuklara altındaki serbest fileler (Şekil 1). Bu noktada, hafifçe alt NET tek tabaka bozmaya değil emin yapma, kuyuların dışında tüm yapışmayan malzeme aspire. </li><li> Her bir% 1 Sığır Serum Albümini (BSA) ile bloke çözeltisinin 100 ul ilave edin ve oda sıcaklığında 1 saat bekletin. </li><li> % 0.25 tripsin solüsyonu 2 ml kullanılarak bir T-75 balonuna A549 kanser hücrelerini ayırın. Bir kez, bağımsız 5 dakika boyunca 4 ° C&#39;de 450 x g&#39;de tripsinize edilmiş hücre ve santrifüj A549 ortam 10 ml ekleyin. 100 ul ortam başına 2 x 10 4, kanser hücrelerinin bir konsantrasyonu elde etmek üzere ortam içinde yüzer ve tekrar süspansiyon hücreleri atın. Not: A549 hücreleri, ayrıca büyütülmüştür. Kısaca, hücreler kültürlendi ve tekrar% 10 FBS ve% 1 penisilin streptomisin ve 37 ° C&#39;de% 5 CO2 ile inkübe içeren DMEM F12 ortamında muhafaza edilmiştir. 70 kere -% 80 hücre birleşme elde edildi, bunlar,% 0.25 tripsin-EDTA kullanılarak ayınlmış ve aynı ortam içinde yeniden süspansiyon haline getirilmiştirYukarıda tarif edilen. </li><li> Ortam ml&#39;si başına CFSE 1 ul ilave edilmesi ve 10 dakika boyunca oda sıcaklığında leke bırakın tarafından CFSE ile Leke kanser hücreleridir. 5 dakika boyunca 4 ° C&#39;de 450 x g&#39;de boyama, santrifüj aşağı sonra daha sonra 100 ul ortam başına 2 x 10 4, kanser hücrelerinin bir konsantrasyonu elde etmek üzere ortam başlangıç ​​hacminin supernatant ve tekrar süspansiyon hücreleri atmak. </li><li> Yavaşça aspire bloke etme çözeltisi ve oyuk başına NET tek tabaka üzerinde, 100 ul eş bir ortam, 2 x10 4, kanser hücreleri eklemek ve 37 ° C&#39;de% 5 CO2 ile 90 dakika süreyle yapışmaya izin bloke NET&#39;ler 1 saat sonra. Yavaşça hücreler aspire ve herhangi bir bitişik olmayan Hücreleri yıkamak için her bir oyuğa 100 ul PBS ilave edin. </li><li> Bazı kuyularda, ağlar indirgeme yıkamadan önce 10 dakika boyunca oyuk başına DNAse1 bölgesinin 1000U ekleyin. Bu gibi negatif kontrol görev yapacak. Kuyu, araç kontrolü (VC) olarak görev yapacak 10 dakika boyunca oyuk başına steril su, 100 ul ilave edin. NOT: 3 conditio başına çoğaltırn genellikle numune boyutunu artırmak için yapılır. </li><li> Aspire kuyuları altındaki tek Nets ve yapışık kanser hücrelerini bırakarak tüm çözüm atmak ve. (Şekil 1) AĞLARINDA yapışık kanser hücreleri düzeltmek ve flöresanlı mikroskop altında tahlil okuma oyuk başına% 4 formaldehid çözeltisi 100 ul ekle. Arsa ve sonuçları analiz (Şekil 3). </li></ol>

<ol><li>Saitoh, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+mediate+a+host+defense+response+to+human+immunodeficiency+virus-1%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps mediate a host defense response to human immunodeficiency virus-1.</a> Cell Host Microbe. 12 (1), 109-116 (2012).</li>
<li>Bruns, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+extracellular+traps+against+Aspergillus+fumigatus+in+vitro+and+in+infected+lung+tissue+is+dependent+on+invading+neutrophils+and+influenced+by+hydrophobin+RodA%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Production of extracellular traps against Aspergillus fumigatus in vitro and in infected lung tissue is dependent on invading neutrophils and influenced by hydrophobin RodA.</a> PLoS Pathog. 6 (4), e1000873(2010).</li>
<li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).</li>
<li>Papayannopoulos, V., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NETs%3A+a+new+strategy+for+using+old+weapons%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">NETs: a new strategy for using old weapons.</a> Trends Immunol. 30 (11), 513-521 (2009).</li>
<li>McDonald, B., Urrutia, R., Yipp, B. G., Jenne, C. N., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravascular+neutrophil+extracellular+traps+capture+bacteria+from+the+bloodstream+during+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Intravascular neutrophil extracellular traps capture bacteria from the bloodstream during sepsis.</a> Cell Host Microbe. 12 (3), 324-333 (2012).</li>
<li>Pilsczek, F. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+mechanism+of+rapid+nuclear+neutrophil+extracellular+trap+formation+in+response+to+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">A novel mechanism of rapid nuclear neutrophil extracellular trap formation in response to Staphylococcus aureus.</a> J Immunol. 185 (12), 7413-7425 (2010).</li>
<li>Villanueva, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Netting+neutrophils+induce+endothelial+damage%2C+infiltrate+tissues%2C+and+expose+immunostimulatory+molecules+in+systemic+lupus+erythematosus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Netting neutrophils induce endothelial damage, infiltrate tissues, and expose immunostimulatory molecules in systemic lupus erythematosus.</a> J Immunol. 187 (1), 538-552 (2011).</li>
<li>Khandpur, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NETs+are+a+source+of+citrullinated+autoantigens+and+stimulate+inflammatory+responses+in+rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">NETs are a source of citrullinated autoantigens and stimulate inflammatory responses in rheumatoid arthritis.</a> Sci Transl Med. 5 (178), 178ra140(2013).</li>
<li>Demers, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancers+predispose+neutrophils+to+release+extracellular+DNA+traps+that+contribute+to+cancer-associated+thrombosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Cancers predispose neutrophils to release extracellular DNA traps that contribute to cancer-associated thrombosis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (32), 13076-13081 (2012).</li>
<li>Hahn, S., Giaglis, S., Hoesli, I., Hasler, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+NETs+in+reproduction%3A+from+infertility+to+preeclampsia+and+the+possibility+of+fetal+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Neutrophil NETs in reproduction: from infertility to preeclampsia and the possibility of fetal loss.</a> Front Immunol. 3, 362(2012).</li>
<li>Cools-Lartigue, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+sequester+circulating+tumor+cells+and+promote+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps sequester circulating tumor cells and promote metastasis.</a> J Clin Invest. , (2013).</li>
<li>Cools-Lartigue, J., Spicer, J., Najmeh, S., Ferri, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+in+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps in cancer progression.</a> Cell Mol Life Sci. , (2014).</li>
<li>Brinkmann, V., Laube, B., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps%3A+how+to+generate+and+visualize+them%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps: how to generate and visualize them.</a> J Vis Exp. (36), (2010).</li>
<li>Maqbool, M., Vidyadaran, S., George, E., Ramasamy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimisation+of+laboratory+procedures+for+isolating+human+peripheral+blood+derived+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22Med+J+Malaysia%22%5BJournal%5D)">Optimisation of laboratory procedures for isolating human peripheral blood derived neutrophils.</a> Med J Malaysia. 66 (4), 296-299 (2011).</li>
<li>Boyum, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+lymphocytes%2C+granulocytes+and+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Scand+J+Immunol.+Suppl%22%5BJournal%5D)">Isolation of lymphocytes, granulocytes and macrophages.</a> Scand J Immunol. Suppl. 5, 9-15 (1976).</li>
<li>Calado, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex+hormones%2C+acting+on+the+TERT+gene%2C+increase+telomerase+activity+in+human+primary+hematopoietic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Sex hormones, acting on the TERT gene, increase telomerase activity in human primary hematopoietic cells.</a> Blood. 114 (11), 2236-2243 (2009).</li>
<li>Zhong, C., Qu, X., Tan, M., Meng, Y. G., Ferrara, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+regulation+of+bv8+in+human+blood+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Characterization and regulation of bv8 in human blood cells.</a> Clin Cancer Res. 15 (8), 2675-2684 (2009).</li>
<li>Wu, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+leukocyte+labeling+with+intravenous+ferumoxides%2Fprotamine+sulfate+complex+and+in+vitro+characterization+for+cellular+magnetic+resonance+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">In vivo leukocyte labeling with intravenous ferumoxides/protamine sulfate complex and in vitro characterization for cellular magnetic resonance imaging.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 293 (5), C1698-C1708 (2007).</li>
<li>Saffarzadeh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+directly+induce+epithelial+and+endothelial+cell+death%3A+a+predominant+role+of+histones%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps directly induce epithelial and endothelial cell death: a predominant role of histones.</a> PLoS One. 7 (2), e32366(2012).</li>
<li>Fuchs, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+cell+death+program+leads+to+neutrophil+extracellular+traps%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps.</a> J Cell Biol. 176 (2), 231-241 (2007).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok

Bu videoda gösterildiği Nötrofil Ekstrasellüler Tuzak izolasyon protokolü nötrofil izolasyonu ve NET oluşumu için literatürde kullanılan farklı teknikler birleştirir. Bu oldukça karmaşık ve değişken sürecini basitleştiren ve diğer protokoller daha az adımlarla saflaştırılmış hücre-serbest Nets izole etmek çok güvenilir ve tekrarlanabilir bir yol sunar. Ayrıca, hazır reaktifler protokolleri basitlik ekleyerek istihdam edilmekte ve önemli ölçüde maliyetini azaltmak. statik yapışma deneyinde karşı NET&#39;ler uygulama NET ...

Nötrofil hücre dışı trans (NET) yeni protein ve histon yüzlerce edilmiş hücre dışı DNA kordonlarından teşekkül nötrofil türevi elemanların keşfedilir. Onlar belirli uyaranlara aşağıdaki enfeksiyon ve inflamasyon bağlamında nötrofiller tarafından salgılanan ve onlar başlangıçta enfeksiyonlara karşı nötrofil savunma mekanizmalarının bir parçası olarak kabul edilmiştir. İlk bakteriler, virüsler ve mantarlar 1-3 dahil olmak üzere çeşitli mikrobik işgalciler yakalama teşvik gösterilmiştir. Mikrop Yakalama sonra kendi yıkımına hem doğrudan NET-ilişkili proteinler 3,4 ile ve dolaylı fagositik hücrelerin 5,6 yerel istihdam yoluyla yol açacak. NET&#39;ler rolü ancak savunma barındırmak için sınırlı görünmüyor. Daha yakın zamanda, bu, 9 trombozu, otoimmün hastalıklar 7,8 önemli bir rol oynadığı için, gebelik ile ilgili bozukluklar 10 ve hatta kanser ilerlemesinin gösterilmiştir11,12. Bu duruma göre, bu NET&#39;ler çeşitli fizyolojik süreçlerin bir çok sayıda çok önemli bir rol oynar gibi görünmektedir. Ancak, bu tür araştırmaların yeni doğası göz önüne alındığında, çok NET&#39;ler etkilerini gösterirler hangi mekanizmalar ile ilgili olarak aydınlatılamamıştır gerekmektedir. Burada, nötrofillerin yokluğunda NET&#39;ler izolasyonu için basit bir yöntem sunulmaktadır. Aşağıdaki videoda, insan tam kandan Nets izole etmek basitleştirilmiş ve kolay bir tekniği göstermek. Hücresiz NET&#39;ler daha sonra yapışma, çoğalma ve yer değiştirme gibi bir takım tahlillerin yanısıra kurutma, boyama, imuunofluorescence da dahil olmak üzere, in vitro deneylerde, bir dizi kullanılabilir. Diğer protokoller ancak onlar genelde, uzun, karmaşık, pahalı ve sık sık, düşük verim 13 olan, 13, 19 var. Bu basitleştirilmiş protokol nedenle procedu uzunluğunu minimize, temel reaktifler kullanır ve nötrofillerin izole etmek için gerekli adımların sayısını azaltırverimi en üst düzeye çıkarırken yeniden. Aşağıdaki yöntem, nötrofil izolasyonu için farklı teknikler, daha önce, canlı nötrofil çok saf bir örnek elde edildi basit bir protokol elde etmek için literatürde tarif edilen bir araya getirir. Literatürde önerildiği gibi, venöz kan EDTA tüplerde toplandı ve nötrofil aktivasyonunu 14 önlemek için 10 dakika içinde kullanılır. Bu heparinize tam kan, ilk boyum ve ark 15 ile tarif Ficoll yoğunluk santrifüj tekniği adapte edilmiş bir metot ile ilgili granülositleri ve kırmızı kan hücreleri izole etmek için, Limfosit Ayırma Ortamı (LSM), yoğunluk gradyanlı santrifüj kullanır. LSM sodyum metrizoat sodyum Diatrizoate yerine ve nötrofillerin 16-18 izole etmek birçok çalışmada başarıyla kullanılmaktadır Boyum formülasyonun bir değişiklik. Farklı yoğunluklu santrifüjleme, monositler ve lenfositler atılır tarafta; kırmızı kan hücreleri daha sonra çöktürülür% 6 Dekstran çözeltisi 14 kullanılarak ve kalan kırmızı kan Tripan mavisi ve metilen mavisi boyaması ile kontrol edilir saf nötrofil, bir popülasyon elde etmek için eritilir. Çok sayıda maddeler lipopolisakarit (LPS) ve forbol miristat asetat (PMA) ve interlökinler (IL-8), 3,5,6 de dahil olmak üzere, in vitro ve in vivo olarak NETosis uyarılması için kullanılmıştır. Aşağıdaki protokol, izole edilmiş nötrofiller apoptozu 19,20 teşvik etmeden, tutarlı ve güvenilir bir .NET oluşumuna imkan vermek üzere yeterli bir konsantrasyonu gösterilmiştir 4 saat için 500 nM PMA ile uyarılır. Izole edildikten sonra, bu protokolden elde edilen hücre içermeyen NET&#39;ler bir yapışma deneyinde kullanılabilir gösterilmektedir. DNAse1 sindirilmesi ve daha önce tarif edildiği gibi ağları ile indirgeme için kullanılır ve bu nedenle, bir kontrol 2,3,11 olarak hizmet eder. Diğer seçenekler NET Formatı inhibe etmek için Nötrofil elastaz inhibitörü (NEi) kullanımını içeriramaç NET oluşumunu inhibe ziyade bozulmasını 11 gerçekleştirmek için kabul edilebilir bir alternatif olan, üzerinde. NEi çeşitli fonksiyonları bir dizi olmasına rağmen, daha önce NET yerleştirme kromatin yoğunlaşması, nükleer degranülasyonunu ve nötrofıl ölüm 12 blokajı yoluyla NEi ile inhibe edilebilir olduğu gösterilmiştir

<table><tbody><tr><td>Dulbecco' s Fosfat Tamponlu Tuzlu Su (PBS), Modifiye, kalsiyum klorür ve magnezyum klorür olmadan</td><td>Wisent</td><td>311-425-CL</td><td></td></tr><tr><td>Lenfosit Ayırma Ortamı (LSM)</td><td>Wisent</td><td>305-010-CL</td><td></td></tr><tr><td>Dekstran hidroklorür (toz)</td><td>Spektrum</td><td>DE130</td><td>%6 Dekstran çözeltisi, PBS'nin Ca ve Mg ile %6 Dekstran tozu ile takviye</td></tr> edilmesiyle yapılır <tr><td>RPMI-1640 Orta L-glutamin</td><td>Wisent</td> <td>ile350-000-CL</td><td>%3 RPMI çözeltisi, RPMI'nin %3 Fetal Sığır serumu</td></tr><tr><td>BD Pharm Lyse Lysing tamponu</td><td>BD Biosciences</td><td>555899</td><td></td></tr><tr><td>Phorbol 12-miristat 13-asetat (PMA)</td> <td>Sigma-Alrdrich</td><td>P8139</td><td></td></tr><tr><td>DNAse1</td><td>Roche</td><td>11284932001</td><td></td></tr><tr><td>F12 DMEM</td><td>Wisent</td><td>319-075-CL</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu (FBS)</td> <td>ile takviye edilmesiyle yapılırWisent</td><td>080-150</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin / Streptomisin</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>CFSE</td><td>Invitrogen</td><td>C1157</td><td></td></tr>% <tr><td>0.25 Tripsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>20 mm ızgaralı (150 x 25 mm) İntegrit doku kültürü kabı</td> <td>Falcon</td><td>353025</td><td></td></tr></tbody></table>

basitleştirilmiş İnsan nötrofil ekstrasellüler tuzaklar (net) İzolasyon ve taşıma

Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps (NETs) Isolation and Handling

Nötrofil Ekstrasellüler Tuzaklar (NET) son zamanlarda nötrofil en antimikrobiyal araçlara parçası olarak tespit edilmiştir. Apart enfeksiyonları mücadele onların rolü, son araştırmalar da kanser ilerlemesi de dahil olmak üzere diğer birçok hastalık süreçlerinde, yer olabileceğini göstermiştir. Arıtılmış Nets Yalıtımlı bu fonksiyonların çalışma izin çok önemli bir unsurdur. Bu video, piyasada kolayca bulunabilen ayıraçları kullanarak, insan tüm kanından hücresiz .NET izolasyon basit bir yöntem ortaya koymaktadır. İzole NET&#39;ler sonra immünofloresan boyama, kurutma veya çeşitli fonksiyonel deneyleri için de kullanılabilir. Bu nötrofillerin kendileri potansiyel karıştırıcı etkileri yokluğunda onların biyolojik özelliklerinin değerlendirilmesini sağlar. Bir yoğunluk gradyan ayırma tekniği sağlıklı donor bütün kandan nötrofilleri izole etmek için kullanılır. İzole edilmiş nötrofiller sonra forbol 12-myr tarafından uyarılıriState 13-asetat (PMA) NETosis tetiklemek için karıştırılabilir. Aktive edilen nötrofiller, daha sonra atılır ve hücre içermeyen bir .NET hazır elde edilir. Daha sonra A549 insan akciğer kanser hücreleri ile bir yapışma deneyinde kullanılabilir nasıl izole NET&#39;ler göstermektedir. NET hazır kat ilave edilir, 96 gözlü bir hücre kültürü plakası O / N, ve çukurlara altındaki uygun bir .NET tek tabaka oluşumuna katkıda sonra CFSE etiketli A549 hücrelerinin kuyu kullanılır. Yapışık hücreler Nikon TE300 floresan mikroskop kullanılarak değerlendirilmiştir edilir. Bazı kuyularda, 1000U DNAse1 Nets aşağılamak için saymadan önce 10 dakika ilave edilir

NET&#39;ler ile statik yapışma deneyi başarılı olması kanser hücrelerinin ilave edilmesinden önce NET&#39;ler bir tek tabaka (Şekil 1) ile birlikte kuyu yeterli bir kaplama gerektirir. Tüm sonraki basamaklar bu katmanı bozmaya değil dikkatle yapılmalıdır. NET&#39;ler yeterli bir tabaka oluşturulur, bu Şekil 2A ve 2C&#39;de görüldüğü gibi NET&#39;ler önemli kanser hücrelerinin yapışmasını etmesi beklenmektedir. Bu etki Şekil 2B ve 2D gör...

Aşağıdaki protokol, piyasada kolayca bulunabilen ayıraçları kullanarak, insan tüm kanından Nötrofil Ekstrasellüler tuzakları (NET) izole etmek için çok basit bir şekilde tarif eder. Daha sonra izole edilmiş NET&#39;ler kanser hücreleri bir in vitro yapışma deneyinde kullanılabilir gösterilmektedir.

Basitleştirilmiş İnsan Nötrofil Ekstrasellüler Tuzaklar (NET) İzolasyon ve Taşıma

Neutrophil Extracellular Traps (NETs) have been recently identified as part of the neutrophil&#8217;s antimicrobial armamentarium. Apart from their role ...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, kolayca temin edilebilen reaktifler kullanarak insan tam kanından nötrofil hücre dışı tuzaklarının (NETs) izole edilmesi için basit bir protokol göstermektir. Bu işlem, ilk olarak diferansiyel santrifüj tekniği kullanılarak insan tam kanından nötrofillerin izole edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adımda, izole edilen nötrofiller, NETosis olarak da adlandırılan net oluşumunu tetiklemek için PMA ile stimüle edilir.Ardından, hücre içermeyen bir NET izolatı ile bir plaka hazırlanır ve NET'lerin hücre yapışmasını nasıl etkilediğini göstermek için kanser hücreleri eklenir. Sonuçlar, bir NET tek tabakası eklenmesinin 5 49 kanser hücrelerinin yapışmasını iyileştirdiğini ve NET'ler degrade edildiğinde bu yapışmanın azaldığını göstermektedir. DNase I kullanarak bu yöntemin görsel bir gösterimi kritik öneme sahiptir.Bu tekniğin yeniliği göz önüne alındığında, hücresel tuzakların (neutrophil extracellular traps) yönetimi, bu yapıların aşırı kırılgan olması nedeniyle oldukça zordur. Başlamak için, metin protokolünde açıklandığı şekilde, 14 adet heparinli yeşil kapaklı tüp içerisinde 80 mililitre taze insan tam kanı temin edin. Her bir tüpü açın ve her tüpe kalsi

simplified-human-neutrophil-extracellular-traps-nets-isolation

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Nötrofil Ekstrasellüler Tuzaklar (NET), patojen bakteriler, mantarlar ve parazitler mücadele için önemli bir doğuştan gelen bağışıklık mekanizması. Burada insan kan nötrofil granülositler izole etmek ve NET'ler oluşturmak için bunları etkinleştirmek yöntemleri açıklanmaktadır. Biz ışık ve elektron mikroskobu NET'ler görselleştirmek için hazırlama teknikleri mevcut.

Nötrofil Ekstrasellüler Tuzaklar: Onları nasıl oluşturun ve görselleştirin için

Bu videoda, nötrofil hücre dışı tuzakları (NET'ler) oluşturmak ve izole etmek için kullanılan bir in vitro teknik gösterilmektedir. Nötrofiller periferik kandan izole edilir ve NET üretmek için forbol miristat asetat (PMA) ile uyarılır. İnkübasyon sırasında, nötrofiller, granüler sitoplazmik proteinlerle karıştırılmış yoğunlaştırılmış kromatin içeren NET'leri serbest bırakmak için bir hücre ölümü (NETosis) sürecinden geçer.

İnsan Nötrofil Hücre Dışı Tuzakları Oluşturmak için İn Vitro Teknik

Bu video, anti-nötrofil sitoplazmik antikorlar içeren hasta serumu kullanılarak önceden etiketlenmiş nötrofillerde nötrofil hücre dışı tuzakların veya NET'lerin indüksiyonunu ve görselleştirilmesini göstermektedir. Ayrıca, geçirimsiz bir DNA boyası ve floresan mikroskobu kullanmak, NET'lerin görüntülenmesini sağlar.

Önceden Etiketlenmiş Nötrofillerde Nötrofil Hücre Dışı Tuzakların İndüksiyonu ve Görselleştirilmesi

Burada, postoperatif peritoneal lavaj sıvı, kurtarılan insan düşük yoğunluklu nötrofil (LDN), büyük nötrofil hücre dışı tuzakları (ağlar) üretmek ve verimli bir şekilde daha sonra grow ücretsiz tümör hücreleri tuzak bir yöntem mevcut.

Düşük yoğunluklu nötrofil tarafından oluşturulan nötrofil hücre dışı tuzakları Peritoneal lavaj sıvı aracılık tümör hücre büyümesini ve eki elde

Burada, nötrofil ekstrasellüler tuzakları (NETTs) ve işletim NETQUANT, immünororesans görüntüleri NTs quantification için tam otomatik bir yazılım seçeneği oluşturmak için bir protokol salıyoruz.

NETQUANT Kullanarak Nötrofil Ekstrasellüler Tuzakların Otomatik Görüntü Tabanlı Niceliği

Bu iletişim kuralı bir son derece hassas ve yüksek üretilen iş nötrofil hücre dışı tuzak (NET) tahlil için ex vivo NET oluşumu miktar yarı otomatik ayirt üç boyutlu confocal mikroskobu tarafından açıklanır. Bu iletişim kuralı NET oluşumu ve bozulma farklı uyaranlara sonra değerlendirmek için kullanılan ve potansiyel NET hedefli tedaviler çalışma için kullanılabilir.

Nötrofil hücre dışı tuzak oluşumu ölçmek ve değerlendirmek için bir yüksek-den geçerek tahlil

Nötrofil ekstrasellüler tuzakları (NETs) uyarılmış nötrofil granülositler tarafından oluşturulan üç boyutlu yapılardır. Son yıllarda NET'lerin çok çeşitli hastalıklara karıştıkları ortaya çıkmıştır. Dokudaki NET'lerin saptanması tanısal bir önemi olabilir, bu nedenle NET bileşenlerinin etiketlenmesi için standart protokoller gereklidir.

Parafin-Gömülü Dokuda İnsan ve Mürin Nötrofil Ekstrasellüler Tuzaklarının İmmünofloresan Etiketlemesi

Burada in vitro nötrofil hücre dışı tuzakların (NET'ler) indüksiyonu ve analizi için bir protokol sunulmaktadır. DNA, katelisidin (LL37) ve enzim aktivitesinin nicelleştirilmesi, benzer kontrollü koşullar altında mikrobiyal ve kimyasal uyaranlar tarafından indüklenen NET'lerin bileşimindeki ve morfolojisindeki değişkenliği gösteren veriler vermiştir.

Mikrobiyal ve Kimyasal Uyaranlar Tarafından İndüklenen Nötrofil Hücre Dışı Tuzakların Morfolojik ve Bileşimsel Analizi

Bu araştırma, sıçan kemik iliğinden bol miktarda nötrofil hücre dışı tuzakları (NET'ler) izole etmek için iki tekniği özetlemektedir. Bir yöntem, ticari bir nötrofil izolasyon kitini yoğunluk gradyanlı santrifüjleme ile birleştirirken, diğeri yalnızca yoğunluk gradyanlı santrifüjlemeyi kullanır. Her iki yaklaşım da periferik kan nötrofillerinden daha iyi fonksiyonel NET'ler verir.

Karşılaştırılabilir Kapasiteye Sahip Sıçan Kemik İliği Nötrofillerini İzole Etmek için Benzersiz Yaklaşım

Canlı hücre analiz sistemini kullanarak nötrofil hücre dışı tuzaklarını (NET'ler) ölçmek için membran geçirgenliğine bağlı çift boya yaklaşımıyla birleştirilmiş otomatik bir yüksek verimli yöntem sunuyoruz.

İnsan Nötrofillerinde Nötrofil Hücre Dışı Tuzakların Oluşumunu Ölçmek için Gerçek Zamanlı Yüksek Verim Tekniği

Bu tanımlanmış protokol, insan nötrofil hücre dışı tuzak (NET) salınımını in vitro olarak görselleştirmek ve ölçmek için gerçek zamanlı, yüksek verimli bir mikroskopi yaklaşımını tanımlar. Tekrarlanabilir yöntem, farklı NETosis indükleyicileri ile stimülasyon üzerine NET salınımının özelliklerinin ve kinetiğinin araştırılmasına olanak tanır ve NETosis antagonistlerinin farmakolojisinin değerlendirilmesini sağlar.

İnsan Nötrofil Hücre Dışı Tuzak Salınımının Gerçek Zamanlı, Yüksek Verimli Mikroskobik Miktar Tayini ve Antagonistlerin Farmakolojisinin Değerlendirilmesi

Öğrenin, insan tam kanından nötrofil ekstraselüler tuzakların (NET) basit izolasyon yöntemini. Bu protokol, kanser hücrelerinin yapışmasını değerlendirmek için kullanılan hücre içermeyen NET izolatının hazırlanmasını gösterir.

Basitleştirilmiş İnsan Nötrofil Ekstrasellüler Tuzaklar (NET) İzolasyon ve Taşıma

Daha fazla video keşfet