Basitleştirilmiş İnsan Nötrofil Ekstrasellüler Tuzaklar (NET) İzolasyon ve Taşıma

Aşağıdaki deneyin genel amacı, hazır reaktifler kullanarak insan tam kanından nötrofil, hücre dışı tuzaklar veya ağları izole etmek için basit bir protokol göstermektir. Bu, ilk olarak nötrofillerin insan tam kanından izole edilmesiyle, ikinci adım olarak diferansiyel bir santrifüjleme tekniği kullanılarak elde edilir. İzole nötrofiller, NETosis olarak da adlandırılan net oluşumu indüklemek için PMA ile uyarılır.

Daha sonra, hücresiz bir ağ izolatı ile bir plaka hazırlanır ve ağların hücrelerin yapışmasını nasıl etkilediğini göstermek için kanser hücreleri eklenir. Sonuçlar, bir ağ tek tabakasının eklenmesinin 5 49 kanser hücresinin yapışmasını iyileştirdiğini ve ağlar bozulduğunda bu yapışmanın azaldığını göstermektedir. DNAS'ın kullanılması Bu yöntemin görsel gösterimi kritiktir.

Bu tekniğin yeniliği göz önüne alındığında, nötrofil xor hücresel tuzakların kullanımı, bu yapıların ne kadar kırılgan olması nedeniyle son derece zordur. Başlamak için, metin protokolünde açıklandığı gibi 14 heparinize yeşil üst tüpte 80 mililitre taze insan tam kanı elde edin. Her tüpü açın ve her tüpe kalsiyum ve magnezyum içermeyen beş mililitre PBS ekleyin.

Daha sonra, oda sıcaklığında dört adet 50 mililitrelik konik tüpün her birine 15 mililitre lenfosit ayırma ortamı veya LSM ekleyin. Daha sonra, seyreltilmiş kanı LSM üzerine dikkatlice katmanlamak için 60 mililitrelik bir şırınga üzerine monte edilmiş 18 gauge bir iğne kullanın, keskin bir LSM kan arayüzü oluşturun, tüpleri 800 kez G'de 30 dakika boyunca 21 santigrat derecede kırılmadan santrifüjleyin, santrifüjü durdurmak için üstteki iki sıvı katmanı ve aralarındaki arayüzü dikkatlice aspire edin ve atın, sadece alttaki kırmızı katmanı bırakın. Bu pelet eritrositler ve nötrofiller içerir.

Her tüpe 20 mililitre PBS ve 20 mililitre% 6 dekstran çözeltisi ekleyin. Her tüpü nazikçe ters çevirin ve 30 dakika oda sıcaklığında bekletin. Kırmızı kan hücreleri tüpün dibine çökelecektir.

Ardından, süpernatanları yeni tüplere aktarın ve paletleri atın. Süpernatanları beş dakika boyunca dört santigrat derecede 450 kez G'de santrifüjleyin ve ardından süpernatanı atın ve nötrofil açısından zengin peleti bırakın. 4,5 mililitre steril suda 0,5 mililitre lizis tamponu içeren bir lizasyon çözeltisi hazırlayın.

Her tüpe toplam beş mililitre lizleme çözeltisi ekleyin ve tüm peletleri tek bir şişede toplayın. Kalan kırmızı kan hücrelerini bitlemek için şişeyi oda sıcaklığında 10 dakika karanlıkta bırakın. Nötrofilleri beş dakika boyunca dört santigrat derecede 450 kez G'de santrifüjleyin.

Süpernatanı atın ve peleti kalsiyum ve magnezyum içermeyen beş mililitre PBS ile yıkayın. Daha sonra numuneyi dört santigrat derecede 450 kez G'de tekrar santrifüjleyin ve kalan lizis çözeltisini içeren süpernatanı çıkarın. Nötrofil peletini% 3 fetal sığır serumu ile desteklenmiş 30 mililitre soğuk RPMI ortamında yeniden süspanse edin ve nötrofil hücre dışı tuzakların veya ağların oluşumunu uyarmak için tüpü buzun üzerine koyun.

150 milimetreye 25 milimetrelik bir düz doku kültürü kabında 30 litre nötrofil süspansiyonuna 500 nano molar PMA ekleyin. 20 milimetrelik bir ızgara ile, hücreleri %5 karbondioksit altında 37 santigrat derecede dört saat inkübe edin. İnkübasyondan sonra, ortamı nazikçe aspire edin ve atın, ağ tabakasını bozmamaya dikkat edin ve nötrofiller tabağın dibine yapışır.

Daha sonra, her bir tabağın altını kalsiyum ve magnezyum içermeyen 15 mililitre soğuk PBS ile yıkamak için bir pipet kullanın, tüm yapışkan malzemeler alttan çıkarılmalıdır. Yıkama süspansiyonunu 15 mililitrelik konik bir tüpte toplayın ve ardından 10 dakika boyunca 450 kez G'de santrifüjleyin. Dört santigrat derecede, nötrofiller ve kalan hücreler altta topaklanacaktır.

Hücresiz net zengin bir süpernatant bırakarak, süpernatanı birden fazla 1.5 mililitrelik tüplere boşaltın ve dört santigrat derecede 10 dakika boyunca sekiz 18.000 kez G'de santrifüjleyin. DNA'yı peletlemek için, süpernatanı atın ve peleti, konsantrasyon 100 mikrolitre PBS başına iki kez 10 ila yedinci nötrofillere karşılık gelecek şekilde PBS'de yeniden süspanse getirin. Bu hücresiz ağ stoğu, sonraki deneyler için kullanılabilir.

Spektro fotometri kullanarak numunenin DNA konsantrasyonunu ölçün. Yeterli bir konsantrasyon, 96 kuyulu düz tabanlı bir plakanın her bir oyuğuna 100 mikrolitre net stokta mikrolitre başına 140 ila 180 nanogram arasında değişmeli ve 12 ila 20 saat sonra kuyuları kaplamak için plakayı karanlıkta dört santigrat derecede gece boyunca inkübe etmelidir, kuyuların dibinde tek tip bir hücresiz ağ tabakasının oluşumunu doğrulamak için bir mikroskop kullanın. Tek tabaka doğrulandıktan sonra, yapışmayan tüm malzemeleri kuyucuklardan nazikçe aspire edin.

Alttaki tek tabakayı bozmamaya dikkat edin. Bu, bu prosedürün en zorlu yönüdür. Yeterli bir ağ tek tabakasını korumak için, plakayı çok dikkatli bir şekilde kullanmanız gerekir.

Tüm reaktifleri ve hücreleri kuyucukların yan tarafına yavaşça ekleyin, çok nazikçe aspire edin ve kuyu dibine bir emme ucu ile dokunmaktan kaçının. Yapışmayan materyal çıkarıldıktan sonra, nazikçe her bir oyuğa 100 mikrolitre% 1 sığır serum albümin bloke edici solüsyon ekleyin ve oda sıcaklığında bir saat bekletin. Net mono tabakayı bozabileceğinden plakayı çalkalamayın veya sallamayın.

Daha sonra, %70 ila 80 birleştiğinde hasat ederek 5 49 kanser hücresi hazırlayın. Standart teknikler kullanarak, hücreleri 100 mikrolitre başına iki kez 10 ila dördüncü hücre konsantrasyonunda ortamda yeniden askıya alın. Mililitre ortama bir mikrolitre CFS e ekleyerek hücreleri boyayın ve 10 dakika oda sıcaklığında bırakın.

Daha sonra, hücreleri beş dakika boyunca dört santigrat derecede 450 kez G'de santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve 100 mikrolitre ortam başına iki kez 10 ila dördüncü kanser hücresi konsantrasyonunu korumak için hücreleri ilk ortam hacminde yeniden süspanse edin. Ağ kaplı plakayı alın ve blokaj solüsyonunu nazikçe aspire edin.

Daha sonra her bir oyuğa 100 mikrolitre kanser hücresi süspansiyonu ekleyin ve hücrelerin 37 santigrat derecede 90 dakika boyunca plakaya yapışmasına izin verin ve% 5 karbondioksit sıvıyı tamamen aspire edin ve 1000 birim DNA ekleyin, diğer kuyucuklardaki ağları bozmak için 10 dakika boyunca bazı kuyucuklara bir. Araç kontrolü olarak 10 dakika boyunca kuyu başına 100 mikrolitre steril su ekleyin. Daha sonra, sıvıyı her bir oyuktan nazikçe aspire edin ve yapışmayanları çıkarmak için 100 mikrolitre PBS ile yıkayın.

A 5 49 hücre, kuyucuklardaki tüm çözeltiyi aspire eder ve atar, altta sadece ağları ve yapışık kanser hücrelerini bırakır. Daha sonra, hücreleri sabitlemek için oyuk başına 100 mikrolitre% 4'lük bir formaldehit çözeltisi ekleyin, hemen testi okumak için plakayı bir floresan mikroskobuna aktarın ve ardından sonuçları çizin ve analiz edin. Veri analizi yazılımını kullanma.

Hücresiz ağlar, 5 49 kanser hücresi ile statik adezyon testlerinde kullanıldı. Işık mikroskobu, kanser hücrelerinin net tek tabakaya güçlü bir şekilde yapıştığını gösterdi. Laboratuvar ortamında.

Bu yapışma, net tek tabakanın DNA ile parçalanmasından sonra azaldı, etiketli bir 5 49 kanser hücresinin bir floresan mikroskobu bu sonuçları doğruladı. 5 49 hücrenin net mono katmana bağlanması, yüksek güç alanı başına hücre sayısı sayılarak ölçüldü. Burada gösterildiği gibi, araç kontrolünde kanser hücresinin ağlara yapışmasında herhangi bir değişiklik olmamıştır.

Bununla birlikte, DNA bir varlığında kanser hücresinin ağlara yapışmasında önemli bir azalma oldu. Bu videoyu izledikten sonra, ağları tam insan kanından nasıl izole edeceğiniz ve kullanacağınız konusunda iyi bir fikre sahip olmalısınız. Bu hücresiz net izolatlar daha sonra immünofloresan, konfokal mikroskopi, elektron mikroskobu ve western blotlama dahil olmak üzere çeşitli tekniklerde kullanılabilir.