3D Doku mühendisliği İnsan Özofagus Mukozal Modeli Üretimi, Karakterizasyonu ve Potansiyel Kullanımları

Bu prosedürün genel amacı, deneysel bir platform olarak kullanılmak üzere insan özofagus epitelinin 3D doku mühendisliği modelini üretmektir. Bu, ilk olarak normal insan özofagus fibroblastlarının ve epitel hücrelerinin insan özofagus dokusu örneklerinden izole edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adımda, fibroblastlar de epitelyal bir aselül, gözenek işareti, özofagus iskelesi üzerine ekilir ve yedi gün boyunca kültürlenir.

Daha sonra, iskele ters çevrilir ve izole edilmiş insan özofagus epitel hücreleri dört gün boyunca kültüre eklenir. Son adımda, model, olgun bir tabakalı epitelin gelişmesine izin vererek, beş günlük bir kültür için hava sıvı arayüzüne taşınır. Sonuç olarak, immünohistokimya, model epitel hücreleri tarafından ifade edilen proliferasyon ve farklılaşmanın temel belirteçlerini karakterize etmek için kullanılır.

Bu tekniğin geleneksel 2D hücre kültürüne göre temel avantajları, hücrelerin in vivo olarak sahip olacakları hücre, hücre ve hücre matrisi etkileşimlerine sahip olmalarına izin vermesidir. Ve bu tekniği kullanarak, normal özofagusa benzer olgun tabakalı bir skuamöz epitel üretebiliriz. Genel olarak, bu yönteme yeni olan kişiler üç nedenden dolayı mücadele edeceklerdir.

Birincisi, epitel hücrelerinin çoğunun iskeleye dahil edilmeden önce farklılaşmamasını sağlamak zor olabilir. İkincisi, epitelin olgunlaştığı dönemde doğru hava sıvı arayüzünün sağlandığından emin olmak için özen gösterilmelidir. Ve üçüncüsü, kültür dönemi boyunca çeşitliliği korumak zor olabilir.

İnsan özofagus epitel hücrelerini izole etmek için, hasat edilen özofagus skuamöz mukoza dokusunu steril bir Petri kabına yerleştirin ve dokuyu 0,5 santimetrelik şeritler halinde kesmek için etanol ile sterilize edilmiş bir neşter kullanın. Daha sonra dokuyu 37 santigrat derecede kaplı% 0.1 oranında inkübe edin ve bir saat sonra beş mililitre FCS ile sindirimi durdurun. Daha sonra, şeritleri forseps ile tutarak, epitel hücrelerini çevreleyen ortama çıkarmak için neşter bıçağıyla neşter bıçağıyla şerit başına bir ila iki dakika nazikçe kazıyın, tüm şeritler kazındığında, ayrılmış epitel hücrelerini içeren ortamı 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın.

Hücreleri döndürdükten sonra, sinamekiyi atın ve peleti 12 mililitre epitel ortamında yeniden süspanse edin. Daha sonra ortamı bir fetter hücre kültüründen atın ve insan özofagus fibroblastlarını izole etmek için epitel hücrelerini besleyici hücreler üzerine plakalamak için steril bir pipet kullanın. Kazınmış doku şeritlerini steril bir Petri kabına aktarın ve son olarak dokuyu neşter ile kıyın.

Parçaları, gece boyunca nemlendirilmiş bir atmosfer ile 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksit ile kaplanmış bir çözelti olan 10 mililitre% 0.5 Kollajenaz içinde sindirin. Ertesi gün, sindirimi 50 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın ve hücreleri aşağı doğru döndürün. Damak 10 mililitre fibroblast kültür ortamında askıya alınan Resus.

Bir hücre kültürü inkübatöründe bir T 75 şişesindeki kültür. Hücresizleştirilmiş domuz özofagus iskelelerini hazırlamak için, bir domuz yemek borusunu uzunlamasına kesmek için makas ve bir cımbız kullanarak başlayın. Daha sonra, yemek borusunu 100 mililitre steril PBS içeren 180 mililitrelik steril bir kapta 10 dakika boyunca hafifçe çalkalayarak yıkayın ve doku durulanırken herhangi bir gün kalıntılarını temizleyin.

Mantar yemek borusunda kuruduğunda% 70 etanol içeren bir mantar diseksiyon tahtasını, mukozal tarafı yukarı bakacak şekilde tahtaya püskürtün. Şimdi, yemek borusunun bir ucundaki mukozal yüzeyi kavramak için steril cımbız kullanın ve mukozayı alttaki submukozadan ayırmak için dokuyu tahtadan uzaklaştırın. Daha sonra steril bir neşter bıçağı kullanarak, yemek borusunu lanar propria boyunca uzunlamasına diseksiyon yapın ve diseksiyon ilerledikçe mukozanın kaldırılmasına izin vermek için pimleri çıkarın.

Altta yatan submukozayı atın ve kalan mukozayı beş santimetre karelik parçalar halinde kesmek için bir neşter kullanın. Parçaları, gösterildiği gibi hafif çalkalama ile 150 mililitre steril PBS'de yıkayın. Beş dakika sonra, dokuyu 150 mililitre bir molar sodyum klorür çözeltisi içeren 180 mililitrelik bir tencereye aktarın.

37 derecede antibiyotiklerle desteklenir. 72 saat sonra, dokuyu 150 mililitre steril PBS'ye aktarın, bu noktada epitel alttaki dokudan gözle görülür şekilde ayrılmaya başlayacaktır. Ayrılan epiteli çıkarmak için steril forseps ve bir neşter bıçağı kullanın ve kalan dokuyu 150 mililitre steril PBS'den oluşan taze bir tencereye yerleştirin ve hafif çalkalama ile üç beş dakikalık yıkama yapın, doku şimdi en az dört ay boyunca gliserol içinde saklanmalıdır.

İskeleyi tamamen sterilize etmek için, en az dört ay boyunca gliserol içinde sterilize edilmiş domuz iskelesi parçalarını yeniden sulandırarak özofagus mukoza modelinin hazırlanmasına başlayın. Beş, 10 dakikalık ajitasyonlar için 100 mililitre steril PBS'de. Her yıkama için supinatın taze PBS ile değiştirilmesi.

Beşinci çalkalamadan sonra, iskele sterilitesini 37 santigrat derecede 100 mililitre DMEM'de bir gece inkübasyon ile test edin. Ertesi sabah, iskeleleri altı kuyulu bir plakanın submukozal tarafı yukarı bakacak şekilde ayrı kuyulara aktarın. Ardından, her bir iskelenin ortasına steril bir tıbbi sınıf paslanmaz çelik halka yerleştirin ve doku ile beş kez yeterli bir sızdırmazlık sağlamak için halkalara hafifçe bastırmak için steril forseps kullanın.

Beş insan özofagus fibroblastını 0.2 mililitre fibroblast ortamında her halkanın merkezine ortalayın. Daha sonra, halkanın dışındaki alanı en az iki mililitre daha fibroblast ortamı ile doldurun ve iskeleleri bir hücre kültürü inkübatöründe inkübe edin. 24 saat sonra, halkaları çıkarın ve her bir oyuktaki ortamı en az beş mililitre taze fibroblast ile değiştirin.

Orta, iskelelerin tamamen suya daldırılmasına dikkat edin. Bir hafta sonra, ortamı atın ve iskelenin mukozal yüzeyini yukarı bakacak şekilde ters çevirmek için forseps kullanın. Halkaları iskelelere geri yerleştirin ve ardından altı epitel hücresinin bir kez merkezini, her bir halkanın merkezine bir tane olmak üzere 0.2 mililitre kompozit ortama ekleyin.

Halkanın dışındaki alanı yaklaşık iki mililitre kompozit ortamla tıkayın ve yapıları inkübatöre geri koyun. 24 saat sonra, halkaları çıkarın ve her bir oyuktaki ortamı, biri olmak üzere en az beş mililitre taze kompozit ortamla değiştirin ve iskelelerin tamamen suya daldırıldığından emin olun. 24 saat sonra, ortamı en az beş mililitre kompozit ortamla değiştirin. İki.

Dördüncü günde, steril tıbbi sınıf paslanmaz çelik hasır ızgaraları yeni bir altı Kuyu plakasının kuyularına yerleştirin ve yapıları mukozal tarafı yukarı bakacak şekilde ızgaralara aktarın. Son olarak, yüzeyi havaya maruz bırakırken kompozitin alt tarafına ulaşmak için yeterli miktarda kompozit ortam üç ekleyin ve numunenin bir hava sıvısı arayüzünde tutulmasını sağlayın. Prosedürün en zor kısmı, hava sıvısı arayüzünü kurmaktır.

Izgaranın steril bir boru ucuyla sıvı temas halinde olup olmadığı net değilse, borunun suya batırılıp batırılmadığını görmek daha kolaydır. Alternatif olarak, hareket halindeyken sıvıyı görmek daha kolay olduğu için plakayı hafifçe sallamayı deneyebilir ve ızgarada sıvı olduğunu ve numunenizi örtmediğini kontrol edebilirsiniz. Bu, epitelin mantıksal değerlendirmesi, normal insan yemek borusunda gözlemlenene benzer ancak daha ince, hücrelerin giderek daha düz hale geldiği ve nihayetinde yüzeye doğru göç ettikçe bir nükleer hale geldiği, olgun, çok katmanlı tabakalı bir skuamöz epitel sunar.

Proliferasyon ve farklılaşmanın anahtar belirteçlerinin immünohistokimyasal karakterizasyonu, model epitelin mikroanatomisinin normal insan özofagus epitelininkine benzer olduğunu göstermektedir. Örneğin, hem doğal yemek borusunda hem de model epitelde karşılaştırılabilir sitokeratin 14 ekspresyonu gözlenir ve boyanma bazal tabakadaki hücrelerle sınırlıdır. Bu model, primer epitel hücrelerini karsinom hücreleriyle değiştirerek tümör hücrelerini içerecek şekilde başarılı bir şekilde modifiye edilmiştir ve bu da modelin esnekliğini göstermektedir.

Örneğin, skuamöz karsinom hücreleri, yapı üzerinde epitel içinde büyük yarıklar bulunan tanımlanmış bir sarı bölge olarak görünen bir epitel üretir, bu da muhtemelen model içindeki özofagus adenokarsinom hücreleri de dahil olmak üzere işlevsiz selia moleküllerinin varlığını yansıtır ve bu da iskelenin incelmesi olarak gözle görülebilen büyük miktarda iskele bozulması ile sonuçlanır. Hava sıvı arayüzünde iki haftalık büyümeden sonra ve h ve e analizinde, hücrelerin altındaki bölgedeki iskele kalınlığında belirgin bir azalma olarak doğrulandı Bu prosedürü takiben, aşağıdaki gibi soruları yanıtlamak için aynı dokuya kuzey veya batı blot gibi diğer gen ekspresyonu yöntemleri uygulanabilir: Epitel çevresel streslere nasıl tepki verir? Dolayısıyla bu, geliştirildikten sonra daha derinlemesine daha fazla soruya bakmak için gerçekten değerli bir kaynak sağlar.

Bu teknik, Barrett Metaplazisi ile ilgilenen araştırmacıların, spesifik reflü bileşenlerine maruz kalmanın normal insan özofagusundaki gen ekspresyonu üzerindeki etkisini incelemesinin yolunu açtı.