Name: Bir Enzimatik Yöntem Kaymaklı Kemik İliği Örneklerinden Mezenkimal Kök Hücreler Kurtarma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 58 s
Description: Öğrenin urokinaz kullanarak pıhtılaşmış kemik iliği örneklerinden mezenkimal kök hücreleri izole etme yöntemini. Bu enzimatik protokol, hücre genişletme için hızlı ve ekonomik bir alternatif sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma İsviçre Ulusal Vakfı Hibe CR3I3_140717/1 ve İsviçre Parapleji Vakfı tarafından desteklenmiştir.

NOT: iliak İnsan kemik iliği aspirasyon Lucerne kantonunda etik kurul onayı ile donör rıza toplanmıştır. Iliak gelen köpek kemik iliği aspiratlan (yakl. 20 mL) ile köpek sahibinin consent.Human ile toplandı ve köpek (yaklaşık. 10 mi), kemik iliği aspiratları, anti-pıhtılaşmış hemen kesilmesinden sonra,% 3.8 sodyum sitrat solüsyonu, 15 ml ilave edilerek ameliyathanede. Numuneler geri aynı gün işleme laboratuar ortamına transfer edilmiştir. Urokinaz 1. Hazırlama (önce 1 st Kullanımı) <ol><li> Üreticinin talimatlarına uygun olarak steril fosfat tamponlu salin (PBS) ile ürokinaz sulandırın: 10 ml&#39;lik bir şırınga kullanılarak, septum-giriş şişeye 10 ml PBS ekleyin. Ml başına 50.000 enjeksiyon üniteleri (U) elde etmek için dönen kuru madde çözülür. </li><li> S içine 500 ul alikotları (25.000 U her) hazırlanmasıterile tüpler. Mağaza alikotları -20 ° C ve en az 6 ay için gerekli olan zaman kullanın. </li></ol> 2. Hazırlama Adımları (Önceki Her Kemik İliği Tedavisi) <ol><li> Ürokinaz bir kısım pıhtılaşmış kemik iliği aspiratı başı (25,000 U), (25 ml aspirasyon hacmi başarıyla 25000 U, tek bir kısım ile tedavi edilmiştir) çözülme. </li><li> 37 ° C su banyosu veya sallayarak inkübatör ısıtın. </li></ol> Pıhtısı 3. Enzimatik Digest <ol><li> Işleme sırasında kemik iliği örneklerinin mikrobiyal kontaminasyonu önlemek için bir laminer akış biyogüvenlik kabininde tüm çalışmaları gerçekleştirin. Potansiyel bulaşıcı insan malzeme ile çalışırken, koruyucu eldiven yanı sıra dikkatli taşıma kullanımı tavsiye edilir. </li><li> Bir steril 50 ml tüp üstünde bir 100 um hücre süzgecinden yerleştirin. Dikkatle süzgeç eğerek veya pıhtı malzemesinin dolaşırım, hücre süzgecinden kemik iliği aspiratını dökün. Için steril bir pipet ucu kullanarakFiltre örgü ile daha iyi akış. NOT: PBS ile pıhtı yıkanmasıyla, örneğin, pıhtı herhangi bir seyreltme kaçının. Urokinaz dolaylı hareket ve serum bileşenlerini (yani., Plazminojen) etkili sindirmek için biyopsi gerektirir. Pıhtı malzeme ile işlem devam ederken, filtre ürünü adım 3.6 de kullanılana kadar oda sıcaklığında muhafaza edilebilir. </li><li> Steril forseps kullanarak boş bir hücre kültürü çanak içine kemik iliği pıhtı malzemeyi aktarın. Yaklaşık 2 ile 3 mm Steril bir bisturi bıçağını kullanarak küçük parçalar halinde çöpleri kesilir. </li><li> Steril pensler kullanılarak 50 ml&#39;lik bir reaksiyon tüpüne pıhtı küçük parçalar aktarın. Kıyılmış pıhtı ıslak görünüme sahiptir emin olun. Kuru görünüyorsa, nemlendirmek için adım 3.1 den bazı süzülen kullanın. </li><li> Yukarı ve aşağı pipetleme 5 ml mikrotitre pipet kullanarak 5 kez ile pıhtı çiğnemek. Örnek ürokinazın 1 kısım ekleyin. 37 ° C&#39;de ya da bir su banyosunda ya da 30 dakika boyunca inkübe edinBir sallayarak (hafifçe) inkübatör. </li><li> Yukarı ve aşağı pipetleme 5 ml pipet kullanarak 5 kez ile triturate. Bir biyogüvenlik kabini bu adımı gerçekleştirin. 37 ° C&#39;de 30 dakika süreyle inkübe edilir. İnkübasyondan sonra, 5 ml&#39;lik bir pipet kullanılarak 5 kez çiğnemek. Adım 3.2 filtrata ile havuz taze 100 mikron hücre süzgeç üzerinden geçmek. </li><li> Santrifüj 500 x g&#39;de 10 dakika süre ile oda sıcaklığında hücre süspansiyonu. Süpernatantı atın. Aşağıda açıklanan veya MSC genişleme kültürü için laboratuvar standart prosedüre göre medya hücre pelet yeniden askıya. </li></ol> Genişleme Hücre Kültürü ve CFU Tabaklar 4. Tohumculuk <ol><li> Alfa-MEM,% 10 fetal sığır serumu (FBS), 100 U / ml penisilin, 100 mg / ml streptomisin ve 2.5 mg / ml amfoterisin B ile desteklenmiş: bazal ortam, 50 ml (eritrositler ve mononükleer hücrelerinden oluşan) hücreler yeniden süspanse . hücreleri bir Neubauer Chambe kullanarak Tripan Mavi çözeltisi içinde seyreltilmiş 01:10 Sayısır. </li><li> 5 x 10 7 hücre / cm2 yoğunluğunda, hücre kültürü şişelerinde, hücreler plaka ve 37 ° C&#39;de nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde inkübe edilir. Varsa, hipoksik (% 5 oksijen) koşulları kullanın. CFU tahlili kontrolü için, 10 cm çapında bir hücre kültürü çanağı içinde 10 9 hücreleri plaka. </li><li> Diğer hücreler, süspansiyon devam ederken, kültür, 3 gün sonra, mezenkimal kök hücreler, hücre kültür kaplarına eklenir. 5 ng / ml temel fibroblast büyüme faktörü (bFGF) ile desteklenmiş bazal ortam maddesi ile ortam kullanın. CFU tahlili kontrolü için, aynı şekilde hücre kültürü çanak davranın. </li><li> Ortam haftada üç kez değiş tokuş, 2 haftada bir toplam hücre kültürü devam edin. Hücreler% 80 confluency aşarsanız, tripsinizasyonla bölünmüş. CFU tahlili kontrolü için, aynı şekilde medya alışverişi, ancak iki hafta kurs için hücreleri bölmek değil. </li></ol> CFU tahlili için 5. Giemsa <ol><li> Tabak başına Giemsa çözeltisi 10 ml hazırlayın: İnceltilmişute stok solüsyonu (gliserol 7.6 g / l Giemsa: metanol) 01:10 steril su (her zaman taze bir çalışma seyreltme hazırlamak). </li><li> Hücre kültürü çanak ortamı çıkarın ve PBS ile hücreleri yıkayın. Petri sıvı uygulanırken çok temkinli olun ve hücreleri yıkama kapalı kaçının. </li><li> Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca saf metanol içinde hücreleri saptamak. Metanol atın. Giemsa çözeltisi ilave edin ve 37 ° C&#39;de, nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde, 60 dakika boyunca inkübe edin. </li><li> PBS ile iki kez yıkanır. Hava bir kağıt havlu üzerine ilk plaka kafasını kurulayın. Elle kolonileri sayın. Bu, en iyi plakanın arkasında bir işaretleyici kalem kullanılarak elde edilmektedir. </li></ol> 6. MSC Farklılaşma <ol><li> Köpek MKH farklılaşma NOT: Köpek MKH dört hafta için uygun medya ile stimülasyonu ile kondrojenik, osteojenik ve adipojenik soy içine ayırt edildi. </li><li> Için Adipogenic farklılaşma, 4 x 10 5 ce de tek tabaka kültür MKHaşağıdaki gibi rf / cm 2, iki farklı kültür koşulları alternatif; <ol><li> DMEM Glutamax,% 3 FBS, 100 ünite / ml penisilin, 100 mg / ml streptomisin, 2.5 ug / ml amfoterisin B ve 170 mM insülin içeren adipogenesis muhafaza ortamında kültürü. </li><li> 3,% FBS,% 5 tavşan serumu, 1 uM deksametazon ile desteklenen koruma aracına sahip adipogenesis indükleyici ortamdan Kültür, 500 uM 3-izobutil-1-metilksantin, 33 uM biyotin, 5 uM roziglitazon ve 16 17 uM pantotenat içerebilir. </li><li> Yağ Kırmızı O ile boyanarak lipid damlacıkları Revel. Kısaca,% 10 formaldehid ile hücrelerin tespit PBS ile yıkayın ve izopropanol içinde% 0.35 yağ-kırmızı O ile boyanır. </li></ol></li><li> 7 x 10 3 hücre / cm2 ve aşağıdaki teşvik de tek tabakalı Osteogenik farklılaşma kültür MSC&#39;ler için: <ol><li> Gelişmiş DMEM (Gibco) + GlutaMAX,% 5 FBS, 100 ünite / ml penisilin, 100 mg / ml streptomisin, 2.5 ug / ml amfoterisin B, 501 M L-askorbik asit 2-fosfat, 10 mM beta-gliserofosfat, 100 nM deksametason. </li><li> Von Kossa leke (% 5 AgNO 3) ile mineralizasyon mevduat belirleyin. Kısaca,% 10 formaldehid ile hücrelerin tespit% 5 damıtılmış su içinde iyodinin 3 ile PBS ve leke ile yıkayın. </li></ol></li><li> Kondrojenik farklılaşma <ol><li> Bir sünger şeklindeki tıbbi cihazdan Kesme küpleri (her iki tarafta da, 3 mm), liofilize kollajen tip I&#39;den oluşturulur ve hücreler 17 desteklemek için iskele malzemesi olarak kullanılır. </li><li> 4 x 10 6 hücre / ml (~ 70,000 hücre / küp) konsantrasyonda küpler üzerine Tohum MSC&#39;ler. </li><li> Ortam eklenmesinden önce, hücreler 30 dakika boyunca küp uymak için izin verir. </li><li> DMEM / F12 + Glutamax,% 2.5 FBS, 100 ünite / ml penisilin, 100 mg / ml streptomisin, 2.5 ug / ml amfoterisin B, 40 ng / ml deksametazon, 50 ug / ml askorbik oluşan kondrojenik ortam MSC-kollajen yapıları korumak asit 2-fosfat,50 ug / ml L-prolin, 1x İnsülin-Transferrin-Selenyum X ve büyüme faktörü-β1 transforme 10 ng / ml olmuştur. </li><li> Yapılar bölümlerde proteoglikanlarla birikimini görselleştirmek için alcian mavi boyama kullanın. Kısaca,% 0.01 H 2SO 4 ve 0.5 M guanidin hidroklorür içinde çözülmüş% 0.4 alcian mavisi ile bölümlere göre O / N leke. Daha sonra, yıkama bölümleri% 40 DMSO ve 0.05 M MgCl2 30 dakika boyunca yıkanmıştır. Hücreler nükleer fast red ile zıt. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Jiang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pluripotency+of+mesenchymal+stem+cells+derived+from+adult+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow.</a> Nature. 418 (6893), 41-49 (2002).</li>
<li>Uccelli, A., Moretta, L., Pistoia, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells in health and disease.</a> Nat Rev Immunol. 8 (9), 726-736 (2008).</li>
<li>Bartholomew, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+suppress+lymphocyte+proliferation+in+vitro+and+prolong+skin+graft+survival+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Hematol%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells suppress lymphocyte proliferation in vitro and prolong skin graft survival in vivo.</a> Exp Hematol. 30 (1), 42-48 (2002).</li>
<li>Wang, S., Qu, X., Zhao, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+applications+of+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hematol+Oncol%22%5BJournal%5D)">Clinical applications of mesenchymal stem cells.</a> J Hematol Oncol. 5, 19(2012).</li>
<li>Baksh, D., Song, L., Tuan, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+mesenchymal+stem+cells%3A+characterization%2C+differentiation%2C+and+application+in+cell+and+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Adult mesenchymal stem cells: characterization, differentiation, and application in cell and gene therapy.</a> J Cell Mol Med. 8 (3), 301-316 (2004).</li>
<li>Malempati, S., Joshi, S., Lai, S., Braner, D. A., Tegtmeyer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Videos+in+clinical+medicine.+Bone+marrow+aspiration+and+biopsy%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Videos in clinical medicine. Bone marrow aspiration and biopsy.</a> N Engl J Med. 361 (15), e28(2009).</li>
<li>Cuthbert, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-platform+quality+control+assay+to+quantify+multipotential+stromal+cells+in+bone+marrow+aspirates+prior+to+bulk+manufacture+or+direct+therapeutic+use%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Single-platform quality control assay to quantify multipotential stromal cells in bone marrow aspirates prior to bulk manufacture or direct therapeutic use.</a> Cytotherapy. 14 (4), 431-440 (2012).</li>
<li>Veyrat-Masson, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+content+of+fresh+bone+marrow%3A+a+proposed+quality+control+method+for+cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Haematol%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal content of fresh bone marrow: a proposed quality control method for cell therapy.</a> Br J Haematol. 139 (2), 312-320 (2007).</li>
<li>Lazarus, H. M., Haynesworth, S. E., Gerson, S. L., Rosenthal, N. S., Caplan, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+expansion+and+subsequent+infusion+of+human+bone+marrow-derived+stromal+progenitor+cells+%28mesenchymal+progenitor+cells%29%3A+implications+for+therapeutic+use%5BTitle%5D)+AND+%22Bone+Marrow+Transplant%22%5BJournal%5D)">Ex vivo expansion and subsequent infusion of human bone marrow-derived stromal progenitor cells (mesenchymal progenitor cells): implications for therapeutic use.</a> Bone Marrow Transplant. 16 (4), 557-564 (1995).</li>
<li>Bertolo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+expansion+score+for+tissue-engineering+applications+with+human+bone+marrow-derived+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Tissue+Eng+Regen+Med%22%5BJournal%5D)">An in vitro expansion score for tissue-engineering applications with human bone marrow-derived mesenchymal stem cells.</a> J Tissue Eng Regen Med. , (2013).</li>
<li>Casiraghi, F., Remuzzi, G., Abbate, M., Perico, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multipotent+mesenchymal+stromal+cell+therapy+and+risk+of+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rev%22%5BJournal%5D)">Multipotent mesenchymal stromal cell therapy and risk of malignancies.</a> Stem Cell Rev. 9 (1), 65-79 (2013).</li>
<li>Bonab, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging+of+mesenchymal+stem+cell+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Aging of mesenchymal stem cell in vitro.</a> BMC Cell Biol. 7, 14(2006).</li>
<li>Niku, S. D., Hoon, D. S., Cochran, A. J., Morton, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+lymphocytes+from+clotted+blood%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Isolation of lymphocytes from clotted blood.</a> J Immunol Methods. 105 (1), 9-14 (1987).</li>
<li>De Vis, J., Renmans, W., Segers, E., Jochmans, K., De Waele, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+immunophenotyping+of+leukemia+cells+in+clotted+blood+and+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric immunophenotyping of leukemia cells in clotted blood and bone marrow.</a> J Immunol Methods. 137 (2), 193-197 (1991).</li>
<li>St Antoine, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+thrombolytic+drugs+on+clotted+blood+and+bone+marrow+specimens+to+generate+usable+cells+for+cytogenetic+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Pathol+Lab+Med%22%5BJournal%5D)">Application of thrombolytic drugs on clotted blood and bone marrow specimens to generate usable cells for cytogenetic analyses.</a> Arch Pathol Lab Med. 135 (7), 915-919 (2011).</li>
<li>Kisiel, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+characterization%2C+and+in+vitro+proliferation+of+canine+mesenchymal+stem+cells+derived+from+bone+marrow%2C+adipose+tissue%2C+muscle%2C+and+periosteum%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Vet+Res%22%5BJournal%5D)">Isolation, characterization, and in vitro proliferation of canine mesenchymal stem cells derived from bone marrow, adipose tissue, muscle, and periosteum.</a> Am J Vet Res. 73 (8), 1305-1317 (2012).</li>
<li>Bertolo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+different+commercial+scaffolds+on+the+in+vitro+differentiation+of+human+mesenchymal+stem+cells+to+nucleus+pulposus-like+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Spine+J%22%5BJournal%5D)">Influence of different commercial scaffolds on the in vitro differentiation of human mesenchymal stem cells to nucleus pulposus-like cells.</a> Eur Spine J. 21, Suppl 6. S826-S838 (2012).</li>
<li>Makridakis, M., Roubelakis, M. G., Vlahou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells%3A+insights+into+the+secretome%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Stem cells: insights into the secretome.</a> Biochim Biophys Acta. 1834 (11), 2380-2384 (2013).</li>
<li>Benvenuti, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rosiglitazone+stimulates+adipogenesis+and+decreases+osteoblastogenesis+in+human+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Endocrinol+Invest%22%5BJournal%5D)">Rosiglitazone stimulates adipogenesis and decreases osteoblastogenesis in human mesenchymal stem cells.</a> J Endocrinol Invest. 30 (9), RC26-RC30 (2007).</li>
<li>Jaiswal, N., Haynesworth, S. E., Caplan, A. I., Bruder, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteogenic+differentiation+of+purified%2C+culture-expanded+human+mesenchymal+stem+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">Osteogenic differentiation of purified, culture-expanded human mesenchymal stem cells in vitro.</a> J Cell Biochem. 64 (2), 295-312 (1997).</li>
<li>Patel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+banking+for+research--bench+to+bedside+and+back--myth%2C+reality+or+fast+fading+reality+at+the+dawn+of+a+personalised+healthcare+era%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Bank%22%5BJournal%5D)">Tissue banking for research--bench to bedside and back--myth, reality or fast fading reality at the dawn of a personalised healthcare era.</a> Cell Tissue Bank. 12 (1), 19-21 (2011).</li>
<li>Smith, H. W., Marshall, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+cell+signalling+by+uPAR%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Regulation of cell signalling by uPAR.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (1), 23-36 (2010).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Hasta sadece küçük bir ek iş ameliyathanede personel tarafından yapılmalıdır avantajı ile, (bizim durumumuzda özellikle omurga cerrahisi olarak) ameliyat geçiren iken rutin kemik iliği örnek. Numuneler hemen çekilmesinden sonra, sodyum sitrat ile karıştırılır olsa onlar işleme laboratuarda geldi, birçok örnekleri kısmen pıhtılaşmış idi. Bu aşamada, pıhtılaşmış numuneler yerine örnekleme ayrı bir ek müdahale yine yerel veya genel anestezi gerektiren 6 olacaktır. Bu katkı, klinik personeli ve donör hem de istek...

Mezenkimal kök hücreler (MKH) rejeneratif tıp ve doku mühendisliğinde önemli bir rol oynamaktadır. Onlara otolog tedaviler 2,3 için ideal bir aday kılan, hangi çeşitli hücre tipleri 1 içine ayırt ve aşılamak, göç edebilir. Son zamanlarda, kemik ve kıkırdak onarımı için MKH&#39;lerin kullanarak klinik çalışmalarda, host hastalığı veya kalp hastalığı greft versus 4 başlatıldı. Bu MSC&#39;ler göbek kordonu ya da yağ dokusu hasat edilir, ancak en fazla umut vaat eden sonuçlar kemik iliğinden elde edilen kök hücreleri 5 elde edilmiştir. iliak kemik iliği önemli miktarda toplamak için izin verir ve bu nedenle aspirasyon 6 ana site olarak hizmet vermektedir. Ancak, aspirat kalitesi çekilen kemik iliği hacmini artması ile azalmaktadır. Kemik iliği aspirasyon ilk 5 ml kaliteli MKH&#39;lerin ihtiva ederken, daha büyük hacimli çekilmesi periferik kan f aspirat seyreltme yol açarçok kanlanan kemik 7 rom. Antikoagülan kullanıldığı sürece Çünkü mevcut megakaryositlerin ve trombosit, kemik iliği aspirasyon, pıhtılaşma yatkındır. Ama bile antikoagülan, pıhtıları oluşabilir. Kemik iliğinde, MKH toplam hücre havuzunun 8 sadece küçük bir kısmını temsil ve birçok doku mühendisliği veya terapötik uygulamalar 4 kültür genişletilmiş gerekir. Böyle bir kültürün kalitesi büyük ölçüde ilk hücre havuzu, yani bağlıdır., çeşitlilik ve yüksek başlangıç ​​numarası 9. Çekme gelen MKH Düşük sayılar kısmen donör değişkenliği ile açıklanabilir. Diğer taraftan, düşük kaliteli örneklerinden MKH hücre istenilen sayıda ulaşmak için kültürde uzun süre ve genişletilmiş Pasajlanması gerektirir. Her iki durumda da, uzun pasajı hücre yaşlanmasının kaynağıdır ve 10, potansiyel farklılaşmanın aşamalı olarak kaybına yol açabilir. Bu nedenle, hücre y maksimize protokolleri optimizeield ve zararlı etkileri 11,12 geliştirilmesi gerekmektedir engellemek. Biz köpek MSC ile çalışmaya başladığında neyse pıhtılaşmış insan örnekleri (on bir) daha az sıklıkta iken, biz, yaklaşık üç dört köpek kemik iliği örnekleri pıhtıları içerdiğini görmek için şaşkın. Öte yandan biz pıhtılaşmış örneklerinden MKH çok daha düşük verim gözlenen, hiçbir sürpriz oldu. Pıhtılaşmış numuneler tekrarlanan sorunu çözmek için, biz yeniden örnekleme yerine trombolitik ilaç urokinez kullanarak protokolü geliştirdi. Trombolitik tedavi, kalp krizi, felç nedeniyle veya istenmeyen pıhtılaşma embolileri neden kan damarlarının tıkanması gibi hayatı tehdit eden durumları ortadan edebilirsiniz. Onlar plazmin ve enzimatik plazminojen aktivatörleri ile fibrin enzimatik bölünme yoluyla pıhtıların bozulması ile çalışır. Hastaların tedavisi için geniş kullanım rağmen, sadece çok az yayın çok kullanılan trombolitik faaliyetler olduğunu varLaboratuvar uygulamaları pıhtılaşmış numuneler kurtarmak için, çoğunlukla lenfositler üzerinde duruluyor. 1987 yılında, Niku ve ark. 13 ve dört yıl sonra fonksiyonel lenfosit sonuçlanan kan pıhtıları eriterek streptokinaz kullanımını tarif De Vis ark. Akış sitometri uygulamaları 14 kan ve kemik iliğinden lösemi hücreleri izole etmek için streptokinaz kullanımı genişletilmiş. Daha yeni bir yayın kanser teşhisinde 15 Alteplaz kullanımını önermektedir. Aynı enzimatik yaklaşımı kullanırken, bizim protokol kök hücre alanındaki araştırmacılar için bir araç sağlamak için multipotent MKH formu kemik iliği izolasyonu üzerinde duruluyor.

<table><tbody><tr><td>Bazal Orta Bileşenler</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PenStrep 100X</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>İnsan FGF-basic</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>MEM Alpha, Nükleositli, stabil Glutamin</td><td>Amimed</td><td>1-23S50-I</td><td></td></tr><tr><td>FBS Isıyla</td><td>Etkisiz Amimed</td><td>2-01F36-I</td><td></td></tr><tr><td>Amfoterisin B</td><td>Aplikesi</td><td>A1907</td><td></td></tr><tr><td>Adipojenik Orta Bileşenler</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM-HAM F12 + GlutaMAX</td><td>Amimed</td><td>1-26F09-I</td><td></td></tr><tr><td>İnsülin&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>I5500</td><td></td></tr><tr><td>Tavşan serumu&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>16120099</td><td></td></tr><tr><td>Deksametazon</td><td>Applichem</td><td>D4902</td><td></td></tr><tr><td>3-İzobutil-1-metilksantin</td><td>Sigma</td><td>I5879</td><td></td></tr><tr><td>Biotin&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>B4639</td><td></td></tr><tr><td>Rosiglitazone&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>R2408</td><td></td></tr><tr><td>Pantotenat&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P5155</td><td></td></tr><tr><td>Yağ Kırmızısı-O&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>O0625</td><td></td></tr><tr><td>Osteojenik Orta Bileşenler</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-askorbik asit 2-fosfat</td><td>Sigma</td><td>A8960</td><td></td></tr><tr><td>&szlig;-gliserofosfat</td><td>Sigma</td><td>G9422</td><td></td></tr><tr><td>Gümüş nitrat (AgNO3)</td><td>Sigma</td><td>S6506</td><td></td></tr><tr><td>Kondrojenik Orta Bileşenler</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biopad - sünger şekilli tıbbi cihaz&nbsp;</td><td>Euroresearch</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-prolin&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P5607</td><td></td></tr><tr><td>İnsülin-Transferrin-Selenyum X</td><td>Gibco</td><td>51500056</td><td></td></tr><tr><td>İnsan dönüştürücü büyüme faktörü-&beta; 1&nbsp;</td><td>Peprotech</td><td>100-21</td><td></td></tr><tr><td>Alcian Blue 8GX</td><td>Sigma</td><td>A3157</td><td></td></tr><tr><td>Nükleer hızlı kırmızı</td><td>Sigma</td><td>N8002</td><td></td></tr><tr><td>Jenerik</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tri-Sodyum sitrat dihidrat</td><td>Uygulaması</td><td>A3901</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Uygulaması</td><td>964.9100</td><td></td></tr><tr><td>Ürokinaz</td><td>Medac</td><td>1976826</td><td></td></tr><tr><td>% 0.5 Tripsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>15400054</td><td></td></tr><tr><td>Giemsa leke</td><td></td><td>Uygulaması A0885</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehit</td><td>Uygulaması</td><td>A0877</td><td></td></tr><tr><td>Sülfürik asit (H2SO4)</td> <td>Uygulama</td><td>A0655</td><td></td></tr><tr><td>Dimetil sülfoksit (DMSO)</td> <td>Uygulama</td><td>A1584</td><td></td></tr><tr><td>Magnezyum klorür (MgCl2)</td> <td>Uygulama</td><td>A3618</td><td></td></tr><tr><td>Guanidin hidroklorür</td><td>Applichem</td><td>A1499</td><td></td></tr><tr><td>Sarf malzemeleri</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 ml reaksiyon tüpü</td><td>Axygen</td><td>SCT-50ML-25-S</td><td></td></tr><tr><td>10 ml şırınga</td><td>Braun</td><td>4606108V</td><td></td></tr><tr><td>Sterican iğnesi (22G)</td><td>Braun</td><td>4657624</td><td></td></tr><tr><td>1.7 ml Mikrotüpler</td><td>Brunschwig</td><td>MCT-175-C</td><td></td></tr><tr><td>100 ve mu; m hücre süzgeci</td><td>Falcon</td><td>6.05935</td><td></td></tr><tr><td>steril forseps</td><td>Bastos Viegas, SA</td><td>489-001</td><td></td></tr><tr><td>steril neşter</td><td>Braun</td><td>5518059</td><td></td></tr><tr><td>Primaria hücre kaplama kabı</td><td>Falcon</td><td>353803</td><td></td></tr><tr><td>C-Chip Neubauer Geliştirilmiş</td><td>Bioswisstech</td><td>505050</td><td></td></tr><tr><td>hücre kültürü şişesi - Şişe T300</td><td>TPP</td><td>90301</td><td></td></tr><tr><td>Ekipman</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikrobiyolojik biyogüvenlik kabini sınıf II</td><td>Skan</td><td>82011500</td><td></td></tr><tr><td>su banyosu</td><td>Memmert</td><td>1305.0377</td><td></td></tr><tr><td>Stripetler Serolojik Pipet 5ml</td><td>Corning</td><td>4487-200ea</td><td></td></tr><tr><td>mikroskop</td><td>Olympus</td><td>CKX41</td><td></td></tr><tr><td>nemlendirilmiş inkübatör Heracells 240</td><td>Thermo bilimsel</td><td>51026331</td><td></td></tr><tr><td>Heraeus Multifuge 1S-R</td><td>Termo bilimsel</td><td>75004331</td><td></td></tr></tbody></table>

bir enzimatik yöntem kaymaklı kemik İliği Örneklerinden mezenkimal kök hücreler kurtarma

An Enzymatic Method to Rescue Mesenchymal Stem Cells from Clotted Bone Marrow Samples

Genellikle kemik iliğinden elde edilen mezenkimal kök hücreler (MSC'ler) genellikle genleşme kültürü gerektirir. Protokolümüz, kemik iliğindeki pıhtıları parçalamak ve daha fazla kullanım için MSC'leri serbest bırakmak için klinik derece ürokinaz kullanır. Bu protokol, kemik iliği yeniden örneklemesine hızlı ve ucuz bir alternatif sunar. Kemik iliği, doku mühendisliği ve otolog kök hücre tedavileri için ilginç olan MSC'lerin önemli bir kaynağıdır. Çekilme üzerine kemik iliği, hematopoetik sistemin tamamını içerdiği için pıhtılaşabilir. Elde edilen pıhtılar, genişleme kültürü veya doğrudan kök hücre tedavisi için kaybedilen MSC'leri de içerir. Köpek kemik iliği örneklerinin %74'ünün pıhtı içerdiğini ve pıhtılaşmamış örneklerden beklenen kök hücre sayısının yarısından daha azını verdiğini deneyimledik. Bu nedenle, emek yoğun ve maliyetli kemik iliği yeniden örneklemesini önlemek için bu pıhtıların enzimatik sindirimi için bir protokol geliştirdik. Klinik olarak onaylanmış ve kolayca bulunabilen trombolitik bir ilaç olan ürokinaz, kemik iliği pıhtılarını neredeyse tamamen temizler. Sonuç olarak, tedavi edilen kemik iliği aspiratları, pıhtılaşmamış örneklerle benzer sayıda MSC verir. Ayrıca, ürokinaz tedavisinden sonra hücreler metabolik aktivitelerini ve kondrojenik, osteojenik ve adipojenik soylara farklılaşma yeteneklerini korudular. Protokolümüz, hücrelerin kalitesini etkilemeden pıhtılaşmış kan ve kemik iliği örneklerini kurtarır. Bu, yeniden örneklemeyi geçersiz kılar, numune alma maliyetlerini önemli ölçüde azaltır ve pıhtılaşmış numunelerin araştırma veya tedavi için kullanılmasını sağlar.

ile birlikte onlar bizim laboratuvar (Şekil 1A) geldi köpek kemik iliği örneklerinin% 74 (n = 54) pıhtıları içerdiği gerçekler bize MKH önemli sayıda pıhtıları içinde tuzağa inanıyorum yaptı, bu örneklerden MSC verimi düşmüştür . Gerçekten de, kesit pıhtı malzemesinin basit bir DAPI leke yüksek yoğunluklu (Şekil 1B) çekirdekli hücrelerin varlığını teyit eder. Bu sonuçta urokinez kullanarak protokolü geliştirmek için bize tetikleyen genişleme kültürü için mevcut MSC düşük sayılar, yol aç...

Mezenkimal kök hücreler genellikle kemik iliğinden elde edilir ve genişletme kültürü gerektirir. Numuneler işlenmeden önce pıhtılaştığında, pıhtıyı parçalamak için (enzimatik) trombolitik ilaç ürokinaz kullanan bir protokol uygulanabilir. Böylece hücreler serbest bırakılır ve genleşme kültürü için kullanılabilir hale gelir. Bu protokol, yeniden örneklemeye hızlı ve ucuz bir alternatif sunar.

Bir Enzimatik Yöntem Kaymaklı Kemik İliği Örneklerinden Mezenkimal Kök Hücreler Kurtarma

Mesenchymal stem cells (MSCs) - usually obtained from bone marrow - often require expansion culture. Our protocol uses clinical grade urokinase to degrade ...

Bu prosedürün genel amacı, pıhtıları urokinase ile sindirerek pıhtılaşmış kemik iliği örneklerinden yararlanmaktır. Bu işlem, öncelikle kemik iliği örneğinin bir hücre süzgecinden filtrelenmesiyle gerçekleştirilir. Ardından, kemik iliği pıhtısı küçük parçalara bölünür.Ardından pıhtı bir Falcon tüpüne aktarılır ve urokinase kullanılarak sindirilir. Son olarak, sindirilmiş pıhtı materyali, mezenkimal kök hücrelerin veya MSC'lerin genişletilmesi için ekim yapılır. Nihayetinde, sindirim işleminin etkinliğini değerlendirmek amacıyla plaklar, em sustain kullanılarak bir kontrol plağı ile karşılaştırılır.Bu tekniğin uygulama alanı, otolog kök hücre tedavisi veya tanısına kadar uzanmaktadır. Çünkü greftleme, çok sayıda kök hücrenin genişletilmesini ve farklılaşmasını gerektirir. DOC'den gelen birçok kemik iliği örneğinin laboratuvarımıza ulaştığında pıhtılaşmış olduğunu fark ettiğimizde bu yöntem için ilk fikri edindik.Bu kadar değerli örnekleri çöpe atmak istemedik. Ürokinazı yeniden çözmek için, septum girişli flaska 10 mL steril PBS enjekte edin ve mililitre başına 50.000 ünite konsantrasyonuna ulaşana kadar vorteksleyerek çözün. Her biri 25.000 ünite içeren 500 µL'lik alikotları steril

an-enzymatic-method-to-rescue-mesenchymal-stem-cells-from-clotted

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Rat MKH, femur ve tibiaları izole edilmiş ve daha sonra manyetik hücre sıralama ile zenginleştirilmiş. Sıralama hücreler flow sitometri ile yüzey belirteçlerinin ifade teyit edildi. Bu hücreler de klonal yoğunluğu tek koloniler oluşturmak için kültüre edildi ve daha sonra bu kolonilerin klonlama silindir ile ayrıldı.

İzolasyon ve Rat Mezenkimal Kök Hücreler zenginleştirilmesi (MKH) ve MKH Türetilmiş Tek koloni Ayırma

Sitometrisi kemik iliği hematopoietik öncü dağıtımı yanı sıra verimli yalıtmak için son derece saf hematopoetik kök hücreleri (HKH'ler) analiz etmek için bir yöntem tarif edilir. İzolasyon ^ işleminde esas olarak hücresel ve moleküler çalışmalar için HKH'ler arındırmak için sıralama c-Kit + hücreleri ve hücre manyetik zenginleştirme dayanmaktadır.

Mürin Hematopoetik Kök Hücreler ve Lineage-kararlı progenitörlerin Fenotipik Analizi ve İzolasyon

Mezenkimal kök hücreler (MSC'ler), çözünür faktörler veya spesifik biyomateryaller ile uyarıldıklarında osteoblastik soya doğru farklılaşma potansiyeline sahiptir. Bu çalışma, sığır kemik matrisi Nukbone'u (NKB) bir iskele olarak kullanan insan amniyotik membranından (-hMSC'ler) MSC'lerin verilmesi için yeni bir seçenek sunmaktadır.

İnsan Mezenkimal Kök Hücre İzolasyonu ve Gözenekli Kemik Matrix kendi Yetiştirme

otolog serum ile insan Mezenkimal Stromal Hücreleri (hMSCs) Kültürleme, ksenojenik malzeme ve diğer olumsuz etkileri ile reddi riskini azaltır. Aynı zamanda, taze hMSCs sağlayabilir mezodermal progenitörlerin bir alt kümesi, bir geri kazanımını sağlar. otolog fibrin pıhtısı içinde hMSCs gömülmesi kolay kullanım ve etkin bir cerrahi implantasyon sağlar.

Mezenkimal Stromal Otolog Koşullarında Hücre Kültürü ve Teslimat: Ortopedik Uygulamalar için Akıllı Yaklaşım

Bu iletişim kuralı CD133 değiştirmek için güvenli ve verimli bir yordam gösterilmektedir+ hematopoietik kök hücre. Sunulan viral sigara, manyetik polyplex dayalı yaklaşım temel terapötik kök hücre etkileri de manyetik rezonans görüntüleme üzerinden yönetilen hücre ürün izleme gelince optimizasyonu için sağlayabilir.

Yetişkin kemik iliği türevi hematopoetik kök hücre mühendislik manyetik hedefleme ile kombine etkinleştirmek için hücre içine mikroRNA Transfer için iletişim kuralı

Bu protokol, ekstrektif bir yöntem kullanılarak abdominoplasti ve lipoaspirate örneklerinden mezenkimal kök hücrelerin izole imal etmek için enzimsiz bir yöntem sağlar. Sert enzimlerin veya santrifüj adımlarının olmaması, in vitro çalışmalarda kullanılabilecek veya kliniğe geri transfer edilebilen klinik olarak ilgili kök hücreleri sağlar.

İnsan Yağtüretilmiş Mezenkimal Kök HücrelerinIn İzolasyon ve Genişlemesi için Enzimsiz Bir Yöntem

Bu protokol, tek hücreli sıralama yöntemi kullanılarak insan mezenkimal kök hücrelerinin floresanla aktive edilen hücre sınıflandırmasının kullanımını açıklar. Spesifik olarak, tek hücreli ayıklamanın kullanımı, multiparametrik akış sitometrisi tabanlı bir yaklaşımla birleştirildiğinde, heterojen bir popülasyondan immünofenotiplenmiş hücrelerin %99 saflığını sağlayabilir.

İnsan Eksfoliye Edilmiş Yaprak Döken Dişlerden İmmünfenotipli Mezenkimal Kök Hücrelerin Tek Hücreli Sınıflandırılması

Burada, tek hücreli multiomik ile uyumlu murin kemiği, kemik iliği, timus ve insan timik dokusundan stromal hücrelerin izolasyonunu sağlayan protokoller sunulmaktadır.

Hematopoetik Organlardan Stromal Hücre İzolasyonu

Mevcut protokol, farelerden yüksek oranda homojen kemik iliği mezenkimal kök hücrelerini (BMSC'ler) saflaştırmak, genişletmek ve karakterize etmek için uygun maliyetli bir yöntemi tanımlamaktadır. Bu yaklaşım, yüksek proliferasyon ve farklılaşma potansiyeline sahip büyük miktarlarda BMSC'lerin elde edilmesini kolaylaştırır, fare modellerini destekler ve klinik öncesi araştırmaları ilerletir.

Fare Kaynaklı Kemik İliği Mezenkimal Kök Hücrelerinin Saflaştırılması, Genişletilmesi ve Akış Sitometrisi Tabanlı Fenotiplendirilmesi

Bu protokol, fikoeritrin (PE) etiketli akış sitometrisi antikorları ve anti-PE mikroboncukları kullanarak yüksek postsort hedef-belirteç pozitifliğine sahip spesifik mezenkimal kök hücre alt popülasyonlarını izole etmek için manyetik boncuk tabanlı bir sıralama yöntemini tanımlar; test edilen koşullarda CCK-8 tabanlı proliferasyon/metabolik aktivite gerektiren bu yöntem pahalı hücre sorgulayıcıları veya hedefe özgü özel boncuklar gerektirmeden izole eder.

Dodoplanin-pozitif mezenkimal kök hücre alt popülasyonlarının dolaylı manyetik boncuk stratejisi kullanılarak izolasyonu ve doğrulanması

Öğrenin urokinaz kullanarak pıhtılaşmış kemik iliği örneklerinden mezenkimal kök hücreleri izole etme yöntemini. Bu enzimatik protokol, hücre genişletme için hızlı ve ekonomik bir alternatif sunar.

Bir Enzimatik Yöntem Kaymaklı Kemik İliği Örneklerinden Mezenkimal Kök Hücreler Kurtarma

Daha fazla video keşfet