Name: Bir oksijen-Glukoz Yoksunluk ve reoksijenizasyonun In Vitro İskemi-Reperfüzyon Modeli incelenmesi Kan-Beyin Bariyeri Disfonksiyon için (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: Öğrenin, kan-beyin bariyeri disfonksiyonunu incelemek için oksijen-glukoz yoksunluk ve reoksijenizasyon modelini kullanarak in vitro iskemi-reperfüzyon hasarını nasıl simüle edeceğinizi.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz mali destek için Scott Beyaz Hastanesi Araştırma Hibeler Programı kabul ve Texas A &amp; konfokal lazer mikroskobu kullanımı için Tıp Entegre Görüntüleme Laboratuvarı M Sağlık Bilim Merkezi Koleji. Biz el yazması düzenleme ile yardım için Sayın Glen Cryer kabul etmiş sayılırsınız.

Endotel Hücreleri 1. Tohum <ol><li> Yetişkin Sprague Dawley sıçanların RBMEC en birincil kültürleri elde etmek (ya da ticari bunları elde). </li><li> 100 cm-fibronektin (50 ug / ml), sıçan beyin endotelyal hücre büyüme ortamı kullanılarak kaplanmış petri kaplarına RBMECs geliştirin. Birleşme sağlandığı ulaşılana kadar her iki günde bir ortam değiştirme. </li><li> % 80-90 konfluense ulaştıktan sonra, hafifçe döndürülerek, 5 ml fosfat tamponlu salin (PBS) hücreleri yıkamak. Hücreler daha sonra 37 ° C&#39;ye dengelenmiş sıcak% 0.25 tripsin etilendiamintetraasetik asit (EDTA) çözeltisi, 1 ml, maruz bırakılmasıyla ayrılır. </li><li> Hücreler ayrılmış ve dağılana kadar 2-5 dakika süreyle 37 ° C&#39;de inkübe hücreleri. NOT: hücreleri ayırmak için kültür çanak dokunun. Mikroskop altında görüntüle hücreleri tabak yüzeyinden hücrelerin tamamen ayrılmasını teyit etmek için. </li><li> Tripsin etkisiz hale getirmek için bir petri 5 ml komple ortam ekleyin.Müstakil hücreleri ihtiva eden ortam üzerinden pipet ve bir 15 ml&#39;lik santrifüj tüpüne toplayın. . </li><li> 5 dakika boyunca 220 xg&#39;de endotel hücreleri ihtiva eden ortam santrifüjleyin. </li><li> Süpernatantı aspire ve sonra otomatik hücre sayacı veya hemasitometre kullanarak sayılır edilecek pipet Hücreleri yavaşça yukarı karıştırılarak ve aşağı 3-5 ml taze sıçan beyin endotel hücre büyüme ortamına cells.Suspend pelet içeren pelet korumak. </li><li> Oyuk başına 10,000-15,000 hücreler arasında değişen bir çekirdek yoğunluğuna sahip / oyuk, 8 iyi steril oda slayt sistemi önceden kaplanmış fibronektin (50 ug / mi) içine 0.7 cm 2 hücre süspansiyonu aktarın. Kaynaşma elde edilene kadar 37 ° C&#39;de hücreler büyümek Not: Deney için gerekli olan western blot veya başka deneyler için hücreler 10 cm hücre kültür tabaklarında veya özel yemekler yetiştirilebilir. </li></ol> 2. Oksijen ve In Vitro Glukoz Yoksunluk-reoksijenizasyonModel Not: Aşağıdaki protokol Zulueta ve ark adapte edilmiştir. 1997; Zhu, H ve ark., 2012 8,9. <ol><li> Içinde RBMECs üzerinde OGD-R etkilerini (Şekil 1) incelemek için hipoksi hücre kültür sistemi kullanın. Kurulum ve üreticinin talimatlarına göre, deney başlamadan önce hipoksi hücre kültür sistemi kalibre. </li><li> 37 ° C inkübatör konfluent odası slaytlar (adım 1.8) sökün. Deoksijene ile oda slayt tam orta yerine, glükoz, Dulbecco Modifiye Eagle Ortamı (DMEM), 37 ° C &#39;de 2 saat süre ile% 95, N2 ve% 5 CO2 ile hipoksi odasına yerleştirilir, OGD durumu temsil ettiği. </li><li> 37 ° C&#39;de% 95 O2,% 5 CO2 ile tekrar inkübatör hücreleri taşı ve taze sıçan beyin endotel hücre komple ortam ile sağlanır ve 37 ° C de bir 1 saat boyunca inkübe edilir. NOT: Bu adım, bir reoksijenizasyon durumu temsil eder. </li><li> Immunofloresan lokalizasyonu ve rodamin Phalloidin etiketleme odası slaytlar kullanın (Bölüm 3). </li></ol> Rodamin phalloidin kullanma ZO-1 ve f-aktin Etiketleme 3. İmmünofloresan Yerelleştirme <ol><li> Iyi 1 saat opti-MEM / azaltılmış serum medya / 100 ul RBMEC mono tabakaları içeren odası slaytlar Açığa. Fosfat tamponlu tuzlu su (PBS, pH 7.0-7.2), 100 ul oda slaytlar 3 kez yıkayın. </li><li> (PH 7.0-7.2), 15 dakika boyunca PBS (pH 7.0-7.2)% 4 paraformaldehit 100 ul kullanarak hücreleri saptamak ve PBS içinde 3 kez daha özel oda slaytlar yıkayın. </li><li> Başka bir 15 dakika boyunca PBS içinde% 0.5 Triton X-100, 100 ul, (pH 7.0-7.2) kullanılarak hücrelerin geçirgenliği. Bir saat süreyle PBS içinde% 2 sığır serum albümini (BSA) 100 ul ile bloke edin. ZO-1 ya da f-aktin için bu adımda ya da leke / etiket hücrelerden sonra. <ol><li> Immunofloresan sta için150, 4 ° C &#39;de N / O% 2 BSA-PBS içinde hazırlandı: ining 1 ZO-1&#39;e karşı anti-tavşan primer antikor ile hücrelerin inkübe edin. PBS&#39;de hücreleri (pH 7.0-7.2) 3 kez yıkayın. Flüoresein izotiyosiyanatla (FITC), 100 ul ile inkübe oda sıcaklığında 1 saat için bir anti-tavşan ikincil antikoru etiketli. </li><li> Rodamin Phalloidin etiketleme için, bloke sonra, 20 dakika boyunca,% 2 BSA-PBS içinde hazırlanan, 1:50 dilüsyonda rodamin Phalloidin 100 ul hücreleri maruz kalmaktadır. </li><li> Immunofloresan boyama ve PBS rhodamine Phalloidin etiketleme, (pH 7.0-7.2) hücreleri yıkayın. DAPI anti-solmaya reaktif içeren montaj medyayı kullanarak odaları monte edin. </li></ol></li><li> 60 X suya daldırma lens kullanarak hücrelerin görselleştirmek ve hücreler konfokal mikroskop altında tek bir optik düzlemde taranır. </li></ol>

<ol><li>Eltzschig, H. K., Eckle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ischemia+and+reperfusion--from+mechanism+to+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Ischemia and reperfusion--from mechanism to translation.</a> Nat Med. 17 (11), 1391-1401 (2011).</li>
<li>Kalogeris, T., Baines, C. P., Krenz, M., Korthuis, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+biology+of+ischemia%2Freperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Rev+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell biology of ischemia/reperfusion injury.</a> Int Rev Cell Mol Biol. 298, 229-317 (2012).</li>
<li>Yang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lycium+barbarum+polysaccharides+reduce+intestinal+ischemia%2Freperfusion+injuries+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Biol+Interact%22%5BJournal%5D)">Lycium barbarum polysaccharides reduce intestinal ischemia/reperfusion injuries in rats.</a> Chem Biol Interact. 204 (3), 166-172 (2013).</li>
<li>Kaur, C., Ling, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+brain+barrier+in+hypoxic-ischemic+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Neurovasc+Res%22%5BJournal%5D)">Blood brain barrier in hypoxic-ischemic conditions.</a> Curr Neurovasc Res. 5 (1), 71-81 (2008).</li>
<li>Khatri, R., McKinney, A. M., Swenson, B., Janardhan, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-brain+barrier%2C+reperfusion+injury%2C+and+hemorrhagic+transformation+in+acute+ischemic+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Blood-brain barrier, reperfusion injury, and hemorrhagic transformation in acute ischemic stroke.</a> Neurology. 79 Suppl 1. (13), S52-S57 (2012).</li>
<li>Hossmann, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+models+for+the+investigation+of+brain+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">Experimental models for the investigation of brain ischemia.</a> Cardiovasc Res. 39, 106-120 (1998).</li>
<li>Ogawa, S., Gerlach, H., Esposito, C., Pasagian-Macaulay, A., Brett, J., Stern, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+modulates+the+barrier+and+coagulant+function+of+cultured+bovineendothelium.+Increased+monolayer+permeability+and+induction+of+procoagulant+properties%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Hypoxia modulates the barrier and coagulant function of cultured bovineendothelium. Increased monolayer permeability and induction of procoagulant properties.</a> J Clin Invest. 85 (4), 1090-108 (1990).</li>
<li>Zulueta, J. J., Sawhney, R., Yu, F. S., Cote, C. C., Hassoun, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+generation+of+reactive+oxygen+species+in+endothelial+cellsexposed+to+anoxia-reoxygenation%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Intracellular generation of reactive oxygen species in endothelial cellsexposed to anoxia-reoxygenation.</a> Am J Physiol. 272 (5 Pt 1), L897-L902 (1997).</li>
<li>Zhu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Baicalin+reduces+the+permeability+of+the+blood-brain+barrier+during+hypoxia+in+vitro+by+increasing+the+expression+of+tight+junction+proteins+in+brain+microvascular+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Ethnopharmacol%22%5BJournal%5D)">Baicalin reduces the permeability of the blood-brain barrier during hypoxia in vitro by increasing the expression of tight junction proteins in brain microvascular endothelial cells.</a> J Ethnopharmacol. 141 (2), 714-720 (2012).</li>
<li>Abramov, A. Y., Scorziello, A., Duchen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+distinct+mechanisms+generate+oxygen+free+radicals+in+neurons+and+contribute+to+cell+death+during+anoxia+and+reoxygenation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Three distinct mechanisms generate oxygen free radicals in neurons and contribute to cell death during anoxia and reoxygenation.</a> J Neurosci. 27 (5), 1129-1138 (2007).</li>
<li>Gundimeda, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Green+tea+polyphenols+precondition+against+cell+death+induced+by+oxygen-glucose+deprivation+via+stimulation+of+laminin+receptor%2C+generation+of+reactive+oxygen+species%2C+and+activation+of+protein+kinase+Cepsilon%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Green tea polyphenols precondition against cell death induced by oxygen-glucose deprivation via stimulation of laminin receptor, generation of reactive oxygen species, and activation of protein kinase Cepsilon.</a> J Biol Chem. 287 (41), 34694-34708 (2012).</li>
<li>Mehta, S. L., Manhas, N., Raghubir, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+targets+in+cerebral+ischemia+for+developing+novel+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Rev%22%5BJournal%5D)">Molecular targets in cerebral ischemia for developing novel therapeutics.</a> Brain Res Rev. 54 (1), 34-66 (2007).</li>
<li>Alluri, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+Oxygen+Species-Caspase-3+Relationship+in+Mediating+Blood-Brain+Barrier+Endothelial+Cell+Hyperpermeability+Following+Oxygen-Glucose+Deprivation+and+Reoxygenation%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Reactive Oxygen Species-Caspase-3 Relationship in Mediating Blood-Brain Barrier Endothelial Cell Hyperpermeability Following Oxygen-Glucose Deprivation and Reoxygenation.</a> Microcirculation. 21 (2), 187-195 (1111).</li>
<li>Sun, H., Breslin, J. W., Zhu, J., Yuan, S. Y., Wu, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rho+and+ROCK+signaling+in+VEGF-induced+microvascular+endothelial+hyperpermeability%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Rho and ROCK signaling in VEGF-induced microvascular endothelial hyperpermeability.</a> Microcirculation. 13 (3), 237-247 (2006).</li>
<li>Doggett, T. M., Breslin, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Study+of+the+actin+cytoskeleton+in+live+endothelial+cells+expressing+GFP+actin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Study of the actin cytoskeleton in live endothelial cells expressing GFP actin.</a> J Vis Exp. (57), (2011).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Işemi-reperfüzyon yaralanması için bir in vitro model olarak OGD-R de nöronlar 10,11 çalışmak için kurulmuştur. Geçirgenlik ve TJ bütünlük 9 beyin endotel hücreleri ve değişiklikler üzerinde OGD&#39;ye etkisini gösteren çalışmalar da vardır. Ancak, bizim çalışmamız aşağıdaki iskemik inme meydana in vivo koşullarda iskemik reperfüzyon hasarı daha yakından temsilidir OGD&#39;ye etkisi yanı sıra yeniden oksijenasyonunu gösterir. Hipoksik iskemik durumlar ...

İskemi-Reperfüzyon (IR) hasarı, inme, miyokard enfarktüsü, travma, periferik damar hastalığı ve travmatik beyin hasarı 1,2 ile ilişkili çeşitli zayıflatıcı komplikasyon ve ölüm sık nedeni olarak bulunmuştur. Serebral damarlarda IR yaralanma inflamasyon ve ödem 3 giden bir erken ikincil yaralanma. Oksidatif ve enflamasyon, aşağıdaki metabolik stres sonucu ortaya çıkan ciddi komplikasyonların bir homeostatik serbest radikal oluşumuna yol açan bir denge, kan-beyin bariyerinin değişiklikler (BBB) ​​sıkı bağlantıları (TJs) ve mikrovasküler geçirgenliğin 4,5 kaybıdır. Şu anda, BBB üzerindeki IR yaralanma etkilerini incelemek için kullanılan in vivo modellerde orta serebral arter tıkanıklığı (MCAO), mikroembolizm ve transgenik veya nakavt hayvanları kapsar. Hossmann 6 tartıştığı Ancak, her biri kendi dezavantajları ve sınırlamaları vardır. MCAO modeli effec incelemek için kullanılırRedoks stres ts, BBB kavşak iletişimde değişiklikler ve beyin ve bağışıklık hücreleri arasındaki etkileşimler. Ancak, bu tür içinde hassas mikrocerrahi prosedürleri ve zorluklar için ihtiyaç olarak çeşitli teknik sorunlar mevcut. Serebral iskemi incelemek için transgenik ya da nakavt hayvanların kullanımı enfarktüs oluşumu gen bağımlı moleküler etkileri, vasküler anatomi değişiklikler ve değişen vücut ağırlıkları 6 gibi zorlukları olabilir iken mikroembolisinden anında BBB yıkar. Bu nedenle, iskemi in vitro modeller ilaçlar için mekanistik çalışmalar yapmak nedeniyle uygulanabilirlikleri esas olarak son zamanlarda ilgi artmaktadır bulduk. Ancak, in vitro çalışmaların sonuçları tam bir in vivo çalışma temsil etmeyebilir ve dikkatli 6 yorumlanması gerekir. Endotelyal hücre tek tabakalarında ve mikrovasküler geçirgenliğin düşük oksijen konsantrasyonları gibi karşı etkisi olmuşturOgawa 7 tarafından incelenmiştir. Fare beyni mikrovasküler endotelyal hücreleri (RBMECs), in vitro BBB geliştirmek için kullanılmıştır. Bu protokol sunulan oksijen glikoz mahrumiyet ve reoksijenizasyonun (OGD-R) tekniği Zulueta ark ve Zhu ve ark 8,9 ile çalışmalarda adapte edilmiştir. Biz% 0 O 2,% 5 CO2 ve% 95 N 2 içeren bir hipoksi / anoksi odasına yerleştirerek OGD-R beyin endotel hücrelerini gözler önüne serdi. Hücreler daha sonra sırasıyla immunofloresan lokalizasyonu ve rodamin Phalloidin etiketleme kullanarak TJ bütünlüğü ve stres lif oluşumu değişiklikler açısından değerlendirildi. Zonula okludinler-1 (ZO-1) için immünofloresan boyama ZO-1 gibi, TJ bütünlüğünü saptamak için gerçekleştirilir TJ proteine ​​bağlı önemli bir iskele membrandır. Rodamin Phalloidin etiketleme hücre iskeletinin içinde ipliksi aktin (f-aktin) belirler ve endotel hücreleri aktin stres lif oluşumu açık bir göstergesidir. &lt;p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Bu yöntemin amacı, BBB endotel hücre TJ bütünlüğü ve F-aktin stres lif oluşumu çalışmak için in vitro bir model olarak İR OGD-R geliştirilmesi hakkında fikir temin edilmesidir. Sonuçlar TJ protein kaderi hakkında bilgi vermek, ZO-1 ve OGD-R aşağıdaki stres lif oluşumu olacaktır. Bu ilişkileri anlamak OGD-R aşağıdaki tetiklemeli olan altta yatan moleküler mekanizmaları belirlemek ve OGD-R tedavisi sonrasında BBB kesintileri artırmak için potansiyel terapötik stratejiler geliştirmek için bir fırsat sağlayacaktır.

<table><tbody><tr><td>Proox model 110</td><td>Biospherix</td><td>Model 110</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, glikoz yok</td><td>Gibco, Yaşam teknolojileri</td><td>11966-025</td><td></td></tr><tr><td>Rhodamine Phalloidin</td><td>Yaşam teknolojileri</td><td>R415</td><td></td></tr><tr><td>ZO-1 Tavşan Poliklonal Antikor</td><td>Yaşam teknolojileri</td><td>617300</td><td></td></tr><tr><td>Nunc Lab Tek II-CC 8&nbsp; iyi steril, cam ve nbsp; slaytlar&nbsp;</td><td>Termo bilimsel</td><td>177402</td><td></td></tr><tr><td>FITC etiketli anti-tavşan ikincil antikoru&nbsp;</td><td>Santa cruz</td><td>sc-2090</td><td></td></tr><tr><td>DPBS 1X</td><td>Thermo scientific</td><td>SH 30028.03</td><td>Mevcut başka herhangi bir PBS kullanılabilir</td></tr></tbody></table>

bir oksijen-glukoz yoksunluk ve reoksijenizasyonun<em&gt; in vitro</em&gt; İskemi-reperfüzyon modeli incelenmesi kan-beyin bariyeri disfonksiyon için

Oxygen-Glucose Deprivation and Reoxygenation as an In Vitro Ischemia-Reperfusion Injury Model for Studying Blood-Brain Barrier Dysfunction

İskemi-Reperfüzyon (IR) hasarı, iskemik inmelerin ile ilişkili morbidite ve mortalite önemli ölçüde katkıda bilinmektedir. İskemik serebrovasküler kazalar tüm inmelerin% 80&#39;ini oluşturmaktadır. IR yaralanma yaygın bir nedeni serbest radikallerin oluşumunu tetikleyen dokuya kan, besin, oksijen akut / kronik tıkanıklığı sonrası sıvıların hızlı girişi olduğunu. İskemik inme, kan-beyin bariyerinin (KBB) disfonksiyonu ve vazojenik beyin ödemi takip eder. Yapısal olarak, endotel hücreleri arasında sıkı bağlantıları (TJs), kan-beyin bariyeri (BBB) ​​bütünlüğünü muhafaza edilmesinde önemli bir rol oynamaktadır. IR hasarı spesifik olmayan, inflamatuar yanıt giden bir erken ikincil yaralanma. Inflamasyon aşağıdaki Oksidatif ve metabolik stres BBB geçirgenliği ve sıkı kavşak (TJ) bütünlüğünün bozulması da dahil olmak üzere ikincil beyin hasarı tetikler. Bizim protokol bir in vitro sunar &lt;/ Em&gt; sıçan beyin endotel hücre TJ bütünlüğü ve stres lif oluşumu üzerine oksijen glikoz mahrumiyet ve reoksijenizasyonun (OGD-R) örneği. Şu anda, in vivo modellerde çeşitli deneysel IR yaralanma etkilerini incelemek için kullanılır; ancak onlar böyle mekanik ilişkileri okuyan ameliyatlar, gen bağımlı moleküler etkileri ve zorluk performans teknik zorluklar gibi çeşitli sınırlamalar var. Bununla birlikte, in vitro modeller bu sınırlamaları birçok üstesinden yardımcı olabilir. sunulan protokol potansiyel terapötik stratejiler sağlamak için çeşitli moleküler mekanizmaları ve mekanik ilişkileri incelemek için kullanılabilir. Ancak, in vitro çalışmaların sonuçları in vivo çalışmalar, standart farklı olabilir ve dikkatle yorumlanmalıdır.

Fibronektin önceden kaplanmış Nunc II haznesi slaytlar üzerinde kültürlenmiş hücreler, bir Biospherix ProOx modeli 110 odası içinde yerleştirilmesi ile OGD-R tabi tutuldu. Rodamin falloidin leke etiketi kullanılarak F-aktin stres lif oluşumu gösteren, Şekil 2 ve sitoskeletal montaj gösterildiği gibi, Şekil 3 &#39;de gösterildiği gibi OGD-R hücreleri tabi tutulduktan sonra, bunlar immünofloresan tekniği kullanılarak ZO-1 kavşak boyama için işlemden geçirilirler. Kontrol hücreleri OGD-R t...

İskemi-Reperfüzyon (İR) yaralanması yüksek oranda morbidite ve mortalite ile ilişkilidir. Burada tarif edilen oksijen-glukoz yoksunluğu ve reoksijenasyonunun (OGD-R) in vitro modelinin amacı, iskemi reperfüzyon hasarının, özellikle kan-beyin bariyeri (BBB) endotel hücrelerinde olmak üzere çeşitli hücreler üzerindeki etkilerini değerlendirmektir.

Bir oksijen-Glukoz Yoksunluk ve reoksijenizasyonun<em&gt; In Vitro</em&gt; İskemi-Reperfüzyon Modeli incelenmesi Kan-Beyin Bariyeri Disfonksiyon için

Ischemia-Reperfusion (IR) injury is known to contribute significantly to the morbidity and mortality associated with ischemic strokes. Ischemic ...

Bu prosedürün genel amacı, kan-beyin bariyeri disfonksiyonunu incelemek için in vitro bir iskemi reperfüzyon hasarı modeli olarak oksijen glukoz yoksunluğunun rolünü göstermektir. Bu, chamber slide'larda büyütülen beyin endotel hücrelerinin, medyumun oksijensiz ve glukozsuz medyum ile değiştirilmesiyle oksijen glukoz yoksunluğuna maruz bırakılması ve iki saat boyunca bir hipoksi odası ortamında tutulmasıyla gerçekleştirilir; ardından hücreler, reoksijenasyonun sağlanması için bir saat boyunca normal koşullara geri döndürülür. Hücrelerin işlenmesinin ardından, Zola Occludin one için immunofloresan boyama ve filamentöz aktin için Rod Domine Phin markalaması yapılır.Ardından, analiz için tekil optik kesitler elde etmek amacıyla konfokal mikroskopta 60 x su daldırma objektifi kullanılarak hücrelerin görüntülemesi yapılır; prosedür laboratuvarımdaki lisansüstü öğrencisi hem nega tarafından gösterilecektir. İşleme başlamak için, yetişkin spra dolly sıçanlardan hazırlanan primer kültür RBM eecs örneklerini hazır bulundurun. Ticari olarak temin edilebilen hatlar da kabul edilebilir.R BM EECS'leri, fibronektin ile kaplanmış 100 santimetrelik kaplarda, sıçan beyin endotel hücresi büyüme ortamında kültüre edin ve ortamı gün aşırı değiştirin. Hücreleri %80 ila %90 konfluens düzeyine ulaşana kadar büyütün. Ardından, hücreleri beş mililitre PBS ile nazikçe yıkayın.Ardından, önce bir mililitre sıcak 0.25% tripsin EDTA çözeltisi ekleyip plağı dairesel hareketlerle sallayarak hücreleri plakadan ayırın. Daha sonra hücreleri iki ila beş dakika inkübe edin. Hücrelerin ayrılmasını artırmak için kabın kenarına hafifçe vurun ve ayrılmalarını onaylamak için hücreleri mikroskop altında inceleyin.Tripsinleştirmeyi sonlandırmak için beş mililitre komple besiyeri ekleyin, ardından ayrılmış hücreleri içeren besiyerini pipetle çekerek 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne toplayın. Hücrelerin bulunduğu besiyerini 220 G'de beş dakika boyunca santrifüjleyin, süpernatantı aspire ederek atın. Daha sonra, hücreleri beş mililitrelik bir pipet aracılığıyla nazikçe akıtarak hücre peletini üç ila beş mililitre taze besiyerinde yeniden süspande edin.Şimdi hücreleri sayın ve fibrin ve aktin kaplı sekiz kuyucuklu bir chamber slide'ın her bir kuyucuğuna 20 ila 30,000 hücre aktarın. Tabii ki, diğer uygulamalar için farklı şekillerde de büyütülebilirler. Ardından, hazırlık aşamasında hücreler konfluen olana kadar chamber slide'ı inkübe edin.Hipoksi hücre kültürü sistemini kurun ve kalibre edin. Üretici talimatlarına göre, hazne ortamı %95 azot, %5 karbondioksit ve 37 °C olmalıdır. Şimdi, glukozsuz DMEM'i dört ila altı saat boyunca hipoksi haznesinde bekleterek deoksijenize edin.Hücrelerin ortamını oksijensiz glikozsuz DMEM ile değiştirerek ve ardından hücreleri iki saat boyunca hipoksi kamerasına yerleştirerek hücreleri strese sokmaya başlayın. İki saat sonra hücreleri tekrar sıçan beyin endotel hücresi komple ortamına koyun. Daha sonra hücreleri bir saat boyunca normal koşullara döndürerek yeniden oksijenlendirin.R-B-M-E-C monokatmanlarının her bir kuyucuğunu 100 ila 200 µL optimum azaltılmış serumlu medyuma maruz bırakarak başlayın ve inkübasyonlarını bir saat boyunca sürdürün. Ardından, yıkama başına kuyucuk başına 100 ila 200 µL PBS kullanarak oda slaytlarını üç kez yıkayın. Hücreleri PBS içindeki %4 paraldehit ile sabitleyin, slaytları oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin ve hücreleri daha önce olduğu gibi PBS ile üç kez yıkayın.Şimdi, her kuyucuğa PBS içerisinde %0,5 Triton X 100'den 100 ila 200 µL uygulayarak hücreleri permeabilize edin ve plakayı oda sıcaklığında 15 dakika daha inkübe edin. Hücreler permeabilize olduktan sonra, bloklama çözeltisini uygulayın ve bunun oda sıcaklığında bir saat boyunca hücreler üzerinde etki etmesini sağlayın. Ardından, ya ZO-1 proteini için immünofloresan uygulama yapın ya da F-aktini etiketleyin.Hücrelerin ZO-1 için immünofloresan boyamasını gerçekleştirmek üzere, hücreleri birincil antikor ile 4 °C'de gece boyunca inkübe edin. Ertesi gün, hücreleri tıpkı fiksatörü uzaklaştırırken olduğu gibi PBS ile üç kez yıkayın. Ardından, hücreleri rhodamine-phalloidin ile işaretlemek için 100 ila 200 µL FITC etiketli anti-tavşan ikincil antikor içerisinde oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edin.Bloklama çözeltisi bir saat boyunca uygulandıktan sonra, hücreleri 2% B-S-A-P-B-S ile 1:50 oranında seyreltilmiş 100 ila 200 µL R domine Phin'e 20 dakika boyunca maruz bırakın. Sekonder antikor veya R domine Phin inkübasyonundan sonra, hücreleri daha önce olduğu gibi tekrar 3 kez PBS ile yıkayın. Ardından, elastikleri soyarak odacıkları çıkarın.Anti-fade içeren montaj ortamı kullanarak lamların montajını gerçekleştirin ve DPI görüntüsü alın. Hücreleri, 60 x objektif ile tek bir düzlemde konfokal mikroskopi ile inceleyin. Hücreler fibronectin kaplı chamber üzerinde kültüre edilmiştir.Slaytlar, bir hipoksi kamarasına yerleştirilerek OGDR işlemine tabi tutulmuştur. Açıklandığı üzere, hücreler daha sonra ZO-1 junctional analizi için işlenmiştir.Boyama kontrol hücreleri sürekli bir birleşim bütünlüğü gösterirken, oksijen ve glikozdan yoksun bırakılan hücrelerde kesintili birleşimler görülmüştür. Ayrıca, F aktini göstermek için kullanılan phalloidin ilele cytoskeletal değişiklikler gözlemlenmiştir. Stres lifi oluşumu kontrol hücreleri, stres lifi oluşumunda hiç veya minimum F ACT gösterirken, OGDR'ye maruz kalan hücrelerde artmış stres lifi oluşumu saptanmıştır.Bu videoyu izledikten sonra, oksijen ve glukoz yoksunluğu ile reoksijenasyonun nasıl gerçekleştirileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Bu yöntem; kan-beyin bariyeri, sıkı bağlantı bütünlüğü ve stres kaynaklı fiber oluşumunu incelemek için bir iskemi reperfüzyon hasarı modeli olarak kullanılabilir.

oxygen-glucose-deprivation-reoxygenation-as-an-vitro-ischemia

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Kaynak: Alluri, H., et.al. Kan-beyin bariyeri disfonksiyonunu incelemek için  in vitro  iskemi-reperfüzyon hasarı modeli olarak oksijen-glikoz yoksunluğu ve reoksijenasyon. J. Vis. Uzm.  (2015). Video, hipoksik ve besin yoksunluğundan yoksun koşulları simüle ederek oksijen-glikoz yoksunluğunun ve ardından yeniden oksijenasyonun sıçan beyni mikrovasküler endotel hücreleri (RBMEC'ler) üzerindeki etkisini göstermektedir. Bu koşullar, ATP'nin tükenmesine, hücre içi kalsiyumun artmasına ve hücre...

Oksijen-Glukoz Yoksunluğu ve Reoksijenasyonun Hücre-Hücre Etkileşimleri Üzerine Etkisi

Sistemik hipotansiyon ile birlikte iki taraflı karotis tıkanıklığı tekrarlanabilir şiddeti ile hipokampus hasar görebilir, sıçan küresel beyin iskemi üretir. Hayvanlar üzerinde beyin hasarı tahmin modelleri ile engelli, onlar expediently kurtarmak ve ölüm oranları nispeten düşüktür.

2-Gemi Tıkanıklığı / Hipotansiyon: Küresel Beyin İskemi Rat Modeli

In vitro travmatik beyin hasarı modelleri in vivo beyin deformasyon yeniden geliştirilmektedir. Streç-kaynaklı yaralanma astrositleri, nöronlar, glial hücreler, aort ve beyin endotelyal hücreler için kullanılmıştır. Ancak sistemimiz in vitro TBI modelinde kurmak için BBB meşru bir modeli oluşturan özelliklere sahip bir kan beyin bariyeri (KBB) modeli kullanır.

Bir olarak beyin mikrovasküler endotel hücreleri (cend) olarak gerin<em&gt; In Vitro</emKan Beyin Bariyer&gt; Travmatik Beyin Hasarı Modeli

Iskemik beyin hasarı birçok açıdan üreyen veriyor entorhino-hipokampal organotipik dilim kültürleri için bir protokol, sunulmuştur. Nöronlarda değişikliklere ek olarak neurovasculature değişiklikleri inceleyerek, bu protokol yaralanma sonrası nöral dokuda plastik değişiklikleri incelemek için çok yönlü bir araçtır.

Içinde Neurovascular Yaptırma Analizi Entorhino-hipokampal Organotipik Dilim Kültürler

Bu protokol, farelerde geçici orta serebral arter tıkanıklığını takiben enfarktüs hacimlerini ve kan-beyin bariyeri bozulmasını azaltan tekrarlayan hipoksik ön koşullandırmayı veya sistemik hipoksiye kısa süreli maruziyetleri tanımlar. Ayrıca, nörovasküler korumanın etkinliğini değerlendirmek için inme sonrası enfarktüs hacminin ve kan-beyin bariyeri bozulmasının ikili miktar tayinini detaylandırır.

Farelerde Tekrarlanan Hipoksik Önkoşullanma ve Geçici Orta Serebral Arter Tıkanıklığı ardından Nörovasküler Koruma Kantitasyonu

İskemik inme astrocytes etkilenen beyin bölgesi için belirli katkısını oksijen glikoz yetmezliği (OGD) maruz bir karmaşık olay çalışmaya zor olduğu. Bu makalede izole astrocytes elde etmek ve onların reaktivite ve nükleer silahların yayılmasına karşı OGD koşullar altında çalışma için bir metodoloji tanıtılmaktadır.

Astrocyte reaktivite ve nükleer silahların yayılmasına karşı Vitro iskemik benzeri koşullar altında izleme

Protokol amacı birincil domuz beyin endotel hücreleri (pBECs) temel alan bir vitro kan - beyin bariyerini (BBB) modeli kurulması için en iyi duruma getirilmiş bir yordam sunmaktır. Modeli gösterir yüksek tekrarlanabilirlik, yüksek gerginlik ve taşıma ve hücre içi ilaç bulma gelen kaçakçılığı için uygundur.

Yöntem bir Vitro kan - beyin bariyerini modeli domuz beyin endotel hücreleri temel alan kurulması için geliştirilmiş

Bu yordamı genel amacı fare modelleri iskemik inme kan - beyin bariyerini bozulma vivo içinde değerlendirmesi için son derece tekrarlanabilir bir teknik sağlamaktır.

Kan - beyin bariyerini bozulma iskemik inme, bir fare modeli Vivo içinde değerlendirilmesi

Burada, nöron ve astrositle zenginleştirilmiş kültürlerin veya embriyonik korteksten nöron-glia kültürlerin kurulmasını sağlayan, yüksek verim ve tekrarlanabilirlik ile özel kültür ortamı nı kullanarak basit bir yaklaşım salıyoruz.

İskemide Nöron-Glia Etkileşimlerinin Rolünü Nörade İncelemek İçin Hücre Kültürü Modeli

Burada, birincil insan beyni mikrovasküler endotel hücrelerine, astrositlere ve perisitlere dayanan kan-beyin bariyerinin üçlü hücre kültürü modelini oluşturma yöntemini açıklıyoruz. Bu çok hücreli model, in vitro iskemik inme sırasında nörovasküler birim disfonksiyonunun incelenmesi veya ilaç adaylarının taranması için uygundur.

İskemik İnme In Vitro Çalışması için İnsan Kan-Beyin Bariyerinin Üçlü Birincil Hücre Kültürü Modeli

Kan-beyin bariyeri (BBB), istikrarlı ve sağlıklı bir beyin ortamının sürdürülmesinde çok önemli bir role sahiptir. BBB disfonksiyonu birçok nörolojik hastalıkla ilişkilidir. Serebrovasküler patolojiyi, BBB bütünlüğünü ve BBB'nin genetik ve hastalık tarafından nasıl değiştirildiğini araştırmak için BBB'nin 3 boyutlu, kök hücre türevli bir modelini geliştirdik.

Nörolojik Hastalığı Modellemek ve Terapötik Olarak Hedeflemek için İn Vitro Kan-Beyin Bariyerinin Yeniden Yapılandırılması

Öğrenin, kan-beyin bariyeri disfonksiyonunu incelemek için oksijen-glukoz yoksunluk ve reoksijenizasyon modelini kullanarak in vitro iskemi-reperfüzyon hasarını nasıl simüle edeceğinizi.

Bir oksijen-Glukoz Yoksunluk ve reoksijenizasyonun In Vitro İskemi-Reperfüzyon Modeli incelenmesi Kan-Beyin Bariyeri Disfonksiyon için (Video) | JoVE Journal

Bir oksijen-Glukoz Yoksunluk ve reoksijenizasyonun

Daha fazla video keşfet