EAE Ratlarda Merkez Sinir Sistemi Mononükleer Hücreleri İzolasyon

Merhaba, ben Christine Beaton. California Üniversitesi Irvine'deki Fizyoloji ve Biyofizik Bölümü'nde, George Chen'in laboratuvarında araştırma görevlisiyim. Bugün size sıçanların merkezi sinir sisteminden mononükleer hücrelerin nasıl izole edileceğini göstereceğim.

Bu prosedür, merkezi sinir sisteminde herhangi bir kan kontaminasyonu kalmaması için kardiyak perfüzyon gerçekleştirmek amacıyla sıçanın derin şekilde anesteziye alınmasını içerir. Ardından beyin ve omuriliği çıkaracağız; bir hücre süzgeci kullanarak tek hücre süspansiyonu hazırlayacağız ve ardından çift katmanlı percoll gradyanı kullanarak mononükleer hücreleri izole edeceğiz. Öyleyse başlayalım.

Şimdi kardiyak perfüzyon yapmaya hazırım, bu yüzden bunun için ihtiyacım olan tüm malzemeleri göstereceğim. İlk olarak bir Bell kavanozuna ihtiyacımız var ve altına uçucu anestezikle ıslatılmış kağıt havlular yerleştirdik. Halotan veya izofluran kullanabilirsiniz.

Sırada, sıçanı sabitleyecek bir düzenek ve kanı toplayacak bir kaba ihtiyacımız var. Sıçanlara perfüzyon uygulamak için bu geçici düzeneği hazırladık. 21 gauge bir iğne kullanacağız ve bir IV perfüzyon sistemi aracılığıyla yer çekimi ile beslenen bir salin çözeltisi perfüze edeceğiz.

Bu sistemlerden birine erişiminiz yoksa, birkaç şırıngayı salinle doldurup manuel olarak perfüzyon da yapabilirsiniz. Ancak bu yöntem çok daha kolaydır. Ayrıca, içine Kim wipes yerleştirdiğimiz 10 ml'lik bir şırınga gövdesine de ihtiyacımız var.

Ardından, işlem sırasında sıçanın derin anestezi altında kaldığından emin olmak için burnuna uygulamak üzere bir miktar anestezik ekleyeceğim. Tabii ki, ardından enstrümanlara ihtiyacınız olacak. Bugün hücreleri kültüre almayacağım için steril bir işlem uygulamayacağım.

Kullandığım tüm enstrümanlar steril değildir. Ancak hücrelerinizi kültüre etmek isterseniz, steril enstrümanlar kullanmak isteyebilirsiniz. Bu videonun amaçları doğrultusunda, ölmüş bir sıçan kullanacağım.

Prosedürü size adım adım gösterebilmek için yavaşça uygulayacağım. Elbette, gerçek bir prosedürde sıçanın derin anestezi altında olması ancak ölmemiş olması gerekir. Kalbin hâlâ atıyor olmasını istersiniz.

Öyleyse bu sıçanla başlayalım. Sıçanı sırtı bana bakmayacak şekilde yerleştirdim ve ıslatılmış anestezi mendillerini burnunun üzerine koydum. Ardından yapacağım ilk şey, sıçanın derinlemesine anestezi altında olduğunu kontrol etmek olacak.

Bu nedenle, her bir işlemden önce bunu yapmanız gerekir. Cımbızla sıçanı sıkıştırıyorum ve hiçbir tepki oluşmuyor. Eğer herhangi bir tepki olursa, sıçanın derin anestezide olduğundan emin olmak için onu tekrar belger'e yerleştirmeniz gerekir.

Ardından, sıçanın üst yarısını ıslatmak için %70 etanol kullanacağım. Sonrasında göğüs boşluğunu açacağım. Bu yüzden önce deriyi keseceğim ve yan taraftan açacağım.

Ardından boşluğun kendisini açacağım. Buradaki kütle kalptir. Burada sağ atriumu görebilirsiniz.

Kanın dışarı akmasını sağlamak için burayı keseceğim. Ardından tüm vücuda perfüzyon yapmak için iğnemi sol ventriküle yerleştirmem gerekiyor. Bu yüzden iğnemi tam olarak buraya yerleştireceğim.

İğne yerleştirildikten sonra, salinin akışını sağlamak için IV tüpünü açacağım ve bunu beş ila 10 dakika boyunca bekleteceğim. Eğer perfüzyon iyiyse, kanın sıçan vücudundan ayrıldığını gösteren kırmızı nabzın, kırmızı burnun ve elbette sıçan gözlerinin renginin solduğunu göreceksiniz. Bu da perfüzyonun iyi olması gerektiği anlamına gelir.

Kardiyak perfüzyon sonrası fare buradadır. Gördüğünüz üzere, bu farenin burnu, kulakları ve gözleri artık pembe veya kırmızı değildir. Tamamen beyazdırlar, bu da perfüzyonun başarılı olduğunu göstermektedir.

Kanın tamamı veya çoğu sıçanın vücudundan çıkmıştır. Sıçan kardiyak perfüzyon işleminden geçtiğine göre, şimdi başını kesmem gerekiyor. Sıçanı dekapite etmeliyim.

Bunun için standart laboratuvar ekipmanlarını kullanacağım. Şimdi sıçanın beynini çıkaracağım. Tüylerin her yere dağılmasını önlemek için tüm kürkü %70 ethanol ile ıslatacağım.

Ardından öncelikle deriyi çıkaracağım. Beyni histoloji için kullanmayacağım ve küçük parçalara ayıracağım için, çıkarma işlemini çok temiz bir şekilde yapmaya aşırı özen göstermiyorum. Tek parça halinde, makasımı beynin omuriliğe bağlandığı şu noktada, kafatasının tabanına yerleştireceğim.

Kemikleri her iki taraftan keseceğim ve ardından üst kısmı çıkaracağım. Bunu tekrar tekrar yapacağım. İşte beynin tamamen açığa çıkmış hali.

Gördüğünüz gibi, beyin tamamen berrak olduğu için perfüzyon iyi çalıştı. Perfüzyon yapılmamış bir hayvanda, beynin üst tabakasının tamamen kırmızı kılcal damarlarla, yani kırmızı kan kılcal damarlarıyla kaplı olduğunu görürdünüz; burada bunları hiç görmüyorsunuz, bu da perfüzyonun başarılı olduğu anlamına geliyor. Şimdi, olfaktör bulbu geride bırakmadığımdan emin olarak beyni çıkaracağım ve buzlu PBS içeren bir tüpe yerleştireceğim.

Şimdi, bütünlüğünü korumak için çok fazla dikkat etmeden beyni PBS tüpüne yerleştiriyorum; optik sinirleri keseceğim ve ardından bir spatula kullanarak beyni oldukça kolay bir şekilde çıkaracağım. Şimdi aynı sıcandan omuriliği çıkaracağım. Burada da, omuriliği küçük parçalara ayıracağımız için, tamamını çıkardığım sürece çok temiz bir şekilde çıkarmaya aşırı dikkat etmeyeceğim.

Öncelikle deri boyunca omurga hattı üzerinden kesi yapıyorum ve omurga burada görünür hale geliyor. Ardından, omurganın tamamı açığa çıkana kadar buradaki etleri temizleyeceğim. Ve tam burada omuriliği görebilirsiniz.

Böylece bir farede, her iki ucu kesip şırıngayla PBS püskürtebilirsiniz ve omurilik neredeyse tek parça halinde çıkacaktır. Ancak sıçanlarda bu kadar kolay değildir. Omurilik kanalını kesip açmam ve omuriliği dışarı çıkarmam gerekir.

Şimdi her iki taraftan da kesiyorum ve beyinde yaptığım gibi, omuriliği açığa çıkarmak için kemiği kesip çıkarıyorum. Beyinde olduğu gibi, omuriliğin tamamen beyaz olması kardiyak perfüzyonun başarılı olduğunu göstermektedir. Bu işlemi tüm omurga boyunca gerçekleştireceğim.

Sağ kalça hizasına, yani tam buraya kadar iniyorum. Ardından cımbızları kullanarak, görüntü pek estetik olmayacak ancak spinal kordu çekip çıkaracağım ve beynin bulunduğu tüpe yerleştireceğim. Böylece tüpümde sıçanın hem beyni hem de spinal kordu bulunuyor ve artık tek hücre süspansiyonunu hazırlamaya hazırım.

Şimdi merkezi sinir sistemimden tek hücre süspansiyonu hazırlamaya hazırım. Bunun için ihtiyacım olanlar; içine 70 mikronluk hücre süzgeci yerleştireceğim 10 santimetrelik bir petri kabı, bir mililitrelik şırınga pistonu, cımbız ve makastır.

Numunemi hücre süzgecine yerleştireceğim ve tüpte hiçbir şey kalmadığından emin olacağım. Ardından, hem beyni hem de omuriliği karışık şekilde küçük parçalara ayıracağım. Her şey tamamen kıyıldığında, O'Neill şırıngasının pistonunu kullanarak numuneyi süzgeçten geçireceğim.

Tek tek hücreler geçtikçe, hücre ayıklayıcının dışındaki PBS'nin giderek daha bulanık hale geldiğini göreceksiniz. Hücre süspansiyonumu karıştırmak isteseydim, bunu elbette bir doku kültürü kabininde yapardım ve içine parmaklarımı sokmazdım. PBS bulanıklaştığına göre, onu ilk kez toplayacağım ve 50 ml'lik bir tüpe koyacağım.

Ancak gözlemlemeye devam edeceğim ve hücre süzgecine biraz daha PBS ekleyip üzerinden bastıracağım. MSS çok fazla yağ içerdiğinden, bu tekniği kullanarak hücre süspansiyonu hazırlamanın en zor olduğu organlardan biridir. Bu nedenle tüm MSS dokusunu hücre süzgecinin üzerinden defalarca geçirdim ve tüm tek hücreli süspansiyonu topladım.

Ve işte sağ taraftaki MSS'den hazırladığım tek hücre süspansiyonunu içeren, 50 ml'ye kadar PBS ile doldurduğum tüp. Şimdi, gradyan hazırlığı için bu tüpü santrifüj edeceğim; hücrelerin dönme işlemi tamamlandı. Şu an bir peletimiz var, bu nedenle süpernatantı uzaklaştıracağım ve hücrelerimi PBS içindeki %30'luk Percoll'ün 20 mililitresinde yeniden süspande edeceğim.

Ardından, migrasyonu sağlamak için bunu PBS içindeki %70'lik perkolün 10 ml'si üzerine ekleyeceğim. Bu yüzden süpernatantı atıyorum. Hücrelerin pelet halinde topaklanmadığından ve tek hücre süspansiyonu şeklinde olduğundan emin olmak için peleti parçalıyorum.

Şu anda tek hücre süspansiyonu halindeki MSS hücreleri süspansiyonuna sahibim. Bu hücreleri PBS içinde %30'luk Percoll'ün 20 ml'sine süspanse edeceğim ve bu 20 ml'yi PBS içinde %70'lik Percoll'ün 10 ml'si üzerine ekleyeceğim. Ardından santrifüj edeceğim.

Şimdi, 20 ml'lik CNS süspansiyonunu alacağım ve işlemi kolaylaştırmak için bunu %70 Percoll katmanının üzerine yavaşça ekleyeceğim. Katmanlardan birine fenol kırmızı gibi bir boya da ekleyebilirsiniz, ancak bunun hücreler üzerinde herhangi bir etkisi olup olmadığı konusunda emin değilim. Bu nedenle bundan kaçınmaya çalışıyorum.

İki katmanın birbirine karışmaması için yeterince yavaş ilerlemelisiniz, bu nedenle alt katmanınızda büyük bir türbülans oluşmasını istemezsiniz. Üst katman kalınlaştıkça hızınızı artırabilirsiniz. Böylece hücrelerimi gradyana eklemiş oldum.

Yani buradaki şeffaf katman %70'lik Percoll katmanı, üstteki bulanık katman ise tek hücre süspansiyonumu içeren %30'luk Percoll katmanıdır. Şimdi bu tüpü 20 dakika boyunca santrifüje koyacağım ve eğer işlem başarılı olduysa mononükleer hücre katmanını gözlemleyebileceğim. Böylece gradyan santrifüjleme işlemini tamamlamış olduk.

Bu yüzden her zamanki gibi, gradyanı santrifüj edin; çok hızlı yavaşlayıp gradyanı bozmaması için freni kapatmaya çok dikkat edin. Böylece katmanlarımızı elde etmiş olduk. Gradyanın üzerinde, hücre süspansiyonumu kontamine etmekten kaçınmak için kaldıracağım bir yağ tabakası bulunuyor.

Percoll'ün %30 ve %70'lik iki katmanı arasındaki ara yüzeyde, ara yüzeyin keskin değil, bulanık olduğunu ve hücrelerin burada yer aldığını görebilirsiniz. Hücreleri aldıktan sonra, ara yüzeyin çok daha keskin hale geldiğini göreceksiniz. Bu nedenle, üst katmandaki yağın büyük bir kısmını uzaklaştırıp atık kabına koyacağım.

Tamamını uzaklaştırmama gerek yok, ancak mononükleer hücreleri almak için aşağı indiğimde pipetimi tamamen kaplamayacağı kadarını uzaklaştırmak istiyorum. Şimdi yapacağım şey, başka bir transfer pipeti kullanarak arayüz seviyesine inmek ve hücrelerimi toplamak olacak. Böylece arayüzden birkaç mililitre toplamış oldum.

Böylece muhtemelen elde edebileceğim tüm hücreleri oraya aktarmış oldum. O MSS'deki mononükleer hücre sayısı gerçekten çok azdı. Artık mononükleer hücrelerim tüpte bulunuyor.

Tüpü 50 ml PBS ile dolduracağım ve hücreleri pelletlemek için santrifüj edeceğim; bu işlem perle'yi yıkayıp uzaklaştıracaktır. Tüm perle'den kurtulduğunuzdan emin olmak için hücreleri tam bir tüp PBS ile en az birkaç kez yıkamanızı öneririm. Bundan sonra hücreler, onlarla gerçekleştirmek istediğiniz herhangi bir prosedür için hazır olacaktır.

Bugün size, sıçanların merkezi sinir sisteminden mononükleer hücrelerin nasıl izole edileceğini gösterdim. Elbette, bu mononükleer hücreleri elde ettikten sonra, örneğin popülasyon içerisinden T lenfositlerini izole etmek için onları daha da saflaştırabilirsiniz. Bu hücrelerle yapacağım işlem, beynimdeki hücre popülasyonlarını tespit etmek için akış sitometrisi analizi gerçekleştirmek olacaktır.

Hücre izolasyonunuzda başarılar dileriz.