Kırmızı Kan Hücresi Toplama Dinamik Soruşturma Kontrollü mikroakışkan Çevre
June 4th, 2015
protokol görüntü işleme tekniklerine dayanan, detay kontrollü ve sürekli kayma hızı altında Eritrosit (RBC) agrega ölçmek için deneysel bir prosedür tarif. Bu protokolün amacı, kontrollü bir mikroakışkan bir ortamda gelen kayma oranı RBC agrega boyutları ilişkilendirmek olduğunu.
Bu prosedürün genel amacı, kırmızı kan hücresi agregatlarını mikrosirkülasyonda, kontrollü ve sabit kesme hızları altında dinamik olarak doğrudan ölçmektir. Bu, ilk olarak eğitimde, kırmızı kan hücresi süspansiyonları ve bir fosfat tamponu salin çözeltisi içeren bir çift y mikrokanalı ile gerçekleştirilir ve kan tabakasında sürekli bir tezahürat yaratır. İkinci adım, akışı yüksek hızlı bir kamera ile görselleştirmek ve kaydetmektir.
Ardından, kaydı işlemek için görüntü işleme tekniklerini kullanın ve mikro kanalda ortalama bir toplama boyutu ve toplam boyut dağılımı elde edin. Son adım, mikrokanala enjekte edilen floresan parçacıklarının iki ardışık çerçeve arasında yer değiştirmesini takip ederek kan hızını belirlemektir. Sonuç olarak, mikrokanaldaki kesme hızı, agrega boyutlarını karşılık gelen yerel kesme hızıyla ilişkilendirmek için kan hızına ve kan tabakası kalınlığına dayalı olarak hesaplanır.
Bu tekniğin ışık iletim yöntemi gibi mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, kırmızı kan hücresi agregatlarının diğer tekniklerle istatistiksel olarak değil, mikroskobik pay akışında dinamik olarak analiz edilmesidir. Bu yöntem, kırmızı kan hücresi agregatlarının oluşum koşullarını anlamak ve mikro dolaşımda kan radyolojik davranışını bulmak gibi hemoradyolojik alandaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Standart fotolitografik yöntemlere göre 120 mikron genişliğinde, 60 mikron yüksekliğinde ve yedi milimetre uzunluğunda mikro kanallar üretmeye başlayın.
Daha sonra, sağlıklı gönüllü donörlerden kan hücreleri toplayın ve ekteki metin protokolünde tarif edildiği gibi% beş, 10 ve% 15 hematokrit seviyelerine sahip kırmızı kan hücresi süspansiyonları hazırlayın, her bir kırmızı kan hücresi süspansiyonunun bir mililitresini floresan izleyici parçacıkları içeren% 1'lik bir çözelti ile 60 mikrolitre birleştirin. Çözeltiyi karıştırmak için tüpü hafifçe sallayın. Ayrıca, aynı hacimdeki izleyici parçacıkları, 7.4 pH'ta bir mililitre PBS ile birleştirin.
Kırmızı kan hücreleri içeren izleyici solüsyonu ve 100 mikrolitrelik bir cam şırınga ile 25 mikrolitrelik bir cam şırınga yükleyin. PBS'deki izleyici çözümü ile sistemde kabarcık olmadığından emin olun. Daha sonra mikrokanalı, saniyede 18 kare veya daha fazla kayıt yapabilen yüksek hızlı bir kameraya ve bir mikropartikül görüntü hızı ölçüm sistemine bağlı ters çevrilmiş bir mikroskop aşamasına yerleştirin.
Her bir şırıngayı boru aracılığıyla mikroakışkan kanalın giriş portlarından birine bağlayın ve ardından bunları aynı şırınga pompasının tutucusuna yükleyin. Şırınga pompasını, 25 mikrolitrelik şırıngayı saatte iki mikrolitre hızında dağıtacak şekilde programlayın. Bu aynı zamanda 100 mikrolitrelik şırıngayı, boyut farkından dolayı bu oranın dört katı oranında dağıtacaktır.
Farklı kesme hızlarını test etmek için deneyler arasındaki akış hızını değiştirin. Yüksek hızlı kamerayı kalibre etmek için 20 x lens yerindeyken bir kalibrasyon alay cihazı kullanın. Ardından, iki çözeltiyi mikro kanala dağıtmaya başlamak için pompayı çalıştırın.
En uygun kamera pozlamasını belirleyin. Agregaların net bir şekilde görüntülenmesi için zaman. Herhangi bir ölçüm almadan önce akışın sabit duruma ulaşmasını beklemek önemlidir.
Kararlı durum şimdi üç ila beş dakika içinde ulaşılır. Karışımı eğitmek için şırıngayı yeniden doldurun ve kırmızı kan hücrelerini süspansiyonda tutun. Kararlı durum akışına ulaşıldığında, kırmızı kan hücrelerinin hareketini kaydetmeye başlayın.
Akışı yedi saniye boyunca kaydedin. Görüntü işleme yeteneğine sahip bir program kullanarak, histogram ekolayzır yöntemi kullanılarak çekilen her gri tonlamalı görüntü için kontrastı artırın. Ardından, gri tonlamalı görüntüleri ikili görüntülere dönüştürün.
Birkaç değeri test ederek ve tüm agregaların düzgün bir şekilde algılandığı değeri seçerek eşik değerini dikkatlice ayarlayın. Gerekirse, bir agrega içindeki boşluklara karşılık gelen delikleri doldurun. Ardından, bitişik hücrelerin toplamlar olarak hesaba katılması için ikili görüntüdeki komşu beyaz pikselleri belirleyerek hücreleri algılayın.
Algılanan farklı kırmızı kan hücresi agregalarını etiketleyin ve ardından daha iyi görselleştirme için ikili görüntüyü kırmızı, yeşil mavi bir görüntüye dönüştürün. Son olarak, kırmızı, yeşil mavi görüntüyü orijinal görüntünün üzerine yerleştirin. Görüntü işlemenin verimliliğini doğrulamak için, algılanan piksel sayısına göre çerçevede algılanan her bir agreganın alanını hesaplayın.
Tüm çerçeveleri aynı şekilde işleyin. Ardından, her karede algılanan toplam boyutların ve ardından tüm karelerin sonuçlarının ortalamasını alın. Kırmızı kan hücresi süspansiyon motorlarının her kaydı için ortalama toplam boyutu elde etmek için, alay görüntüsünü kullanarak sonuçları mikrometre kareye dönüştürün.
Ardından bir temsilci belirlemek için bir kırmızı kan hücresinin alanını hesaplayın. Veriler elde edildikten sonra tespit edilen her agrega içindeki tahmini kırmızı kan hücresi sayısı. Yüksek hızlı kamerayı kullanarak, mikropartikül görüntü hızı sistemi için kullanılan çift darbeli kameraya geçin.
Akışın görüntü elde edilmesi ve hız alanı belirleme için görüntü işleme için burada gösterilene benzer bir görüntüleme yazılımı kullanın. Koruyucu gözlük taktığınızdan ve ardından lazer sistemini ve kamerayı açtığınızdan emin olun. Mikroskobun altına bir mikrometre yerleştirin ve elde edilen görüntüyü sistemi kalibre etmek için kullanın.
Ardından sıvı akışını başlatın ve her iki sıvıdaki parçacıkları görselleştirin. Akıştaki en hızlı ve en parlak parçacıklara odaklanarak mikro kanalın orta düzlemini bulun. Ardından, kareler arasındaki zaman aralığını yaklaşık iki milisaniyeye ayarlayın, böylece en hızlı parçacıklar her iki görüntü arasında beş ila 10 piksel hareket eder ve akışı kaydetmeye başlar O. Yazılımı, tüm farklı kırmızı kan hücresi süspansiyonları ve farklı kesme hızları için 100 çift görüntü elde edecek şekilde ayarlayın.
Görüntü ön işlemenin ardından. Korelasyon penceresi boyutunu ve şeklini ve çakışan görüntülerin yüzdesini seçin. Sonuçları, 100 görüntü çiftinden hesaplanan bir ortalama hız alanı ve hızdaki ortalama karekök hatası olarak ifade edin.
Lazer kamerayı ve bilgisayarı kapatın. Tüm ölçümler ve görüntü işleme gerçekleştirildikten sonra, önce yüksek hızlı kamera kaydına dayalı olarak mikro kanaldaki kan kalınlığını tespit edip tahmin ederek saf oranı hesaplayın. Bu amaçla, videonun arka plan görüntüsünü elde etmek için belirli kayıttaki tüm karelerin ortalamasını alın.
Son olarak, tüm karelerin ortalama görüntüsünü görsel olarak inceleyerek kan katmanını delin ve kan katmanının kenarını manuel olarak tespit edin. Daha sonra, çıkarılan hız profilinden manuel olarak karşılık gelen kan tabakası kalınlığı için hız değerini elde edin ve hız değerini kan tabakasına bölerek kesme hızını hesaplayın. Burada gösterilen kalınlık, art arda üç çerçevede tespit edilen dört kırmızı kan hücresi agregatının net hareketleridir.
30'dan fazla hücrenin büyük agregaları kırmızı ile gösterilmiştir. Dokuz ile 30 hücre arasındaki orta agregalar yeşil renkle gösterilir ve dokuzdan az hücreden oluşan küçük agregalar mavi renkle gösterilir. Bir agreganın hızı, gösterilen mikro kanaldaki konumuna göre değişir.
İşte saatte 10 mikrolitre akış hızında %5 hematokrit, %10 hematokrit ve %15 hematokritte asılı kalan kırmızı kan hücrelerinin hız profilleri. Beklendiği gibi her iki kenarda da hızın sıfıra doğru gittiğini görebilirsiniz ve iki akış akışı arasındaki bükülme noktası, genel kesme hızı her hematokrit seviyesi düşüşündeki agregaların boyutunu artırdıkça, hematokrit seviyeleri arasında biraz değişir. Bunun nedeni, mikrokanaldaki saf kuvvetin, kırmızı kan hücrelerinin ayrışmasına neden olan toplama kuvvetini aşmasıdır.
Bu prosedüre katılırken, mikro kanaldaki akışın iyi bir görüntü kalitesini sağlamayı ve akan kırmızı kan hücreleri ile görüntü arka planı arasında bir kontrast sağlamayı unutmamak önemlidir. Bu videoyu izledikten sonra, kontrollü akış koşulları altında kırmızı kan hücresi agregatlarının kalitatif ve kantitatif olarak nasıl analiz edileceğini iyi anlamış olmalısınız.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu protokol, kontrollü kesme oranları altında görüntü işleme teknikleri kullanarak kırmızı kan hücresi (KRH) agregatlarını nicelleme yöntemini belirtir. Çalışmanın amacı, bir mikroakışkan ortamında KRH agregat boyutlarını kesme oranları ile ilişkilendirmektir.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Mikroakıskanlar
- Hematoloji
- Görüntü İşleme
Arka Plan
- Kırmızı kan hücresi agregatları mikrodolaşımda önemli bir rol oynar.
- Kesme oranlarını anlamak, kan akış dinamiğini incelemek için gereklidir.
- Görüntü işleme teknikleri, KRH agregatlarının analizini geliştirebilir.
- Bu çalışma kontrollü deneyler için bir mikrokkanal kurulumunu kullanır.
Çalışmanın Amacı
- Bir mikroakışkan ortamında KRH agregatlarını nicellemek.
- Agregat boyutlarını yerel kesme oranları ile ilişkilendirmek.
- Mikrodolaşimdaki kan akış davranışı hakkındaki anlayışı geliştirmek.
Kullanılan Yöntemler
- Fosfat tamponlu salin çözeltisinde KRH süspansiyonlarının hazırlanması.
- Yüksek hızlı bir kamera kullanarak akışın görselleştirilmesi.
- Ortalama agrega boyutu ve dağılımını belirlemek için görüntü işleme.
- Kan hızı ve katman kalınlığına dayalı olarak kesme oranının hesaplanması.
Ana Sonuçlar
- KRH agrega boyutlarının başarılı bir şekilde nicellenmesi.
- Agregat boyutları ve kesme oranları arasında bir ilişkinin kurulması.
- Görüntü işleme tekniklerinin etkin kullanımının gösterilmesi.
- Mikrodolaşimde KRH davranışının dinamikleri hakkında içgörüler.
Sonuçlar
- Protokol, KRH agregatlarını incelemek için güvenilir bir yöntem sağlar.
- Bulgular, mikroakışkan sistemlerde kan akışını anlamayı geliştirir.
- Gelecekteki uygulamalar, kan bozuklukları ve tedavileri üzerinde yapılacak çalışmaları içerebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Understanding red blood cell aggregation dynamics under controlled shear rates provides critical insights into blood rheology relevant to microcirculation and vascular health. This microfluidic approach enables quantitative assessment of aggregate formation and disaggregation, supporting mechanistic studies in hematology and hemorheology. The method aids in de-risking target validation by linking biophysical parameters to functional outcomes in blood flow behavior.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses related to RBC aggregation pathways and modulators of hemorheological function.
- Operational Value: Supports biological de-risking through direct visualization and quantification of aggregate dynamics under physiologically relevant shear conditions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream screening by establishing reproducible aggregate size metrics under controlled flow.
- Operational Value: Enhances assay standardization and scalability through microfluidic platform reuse and quantitative image-based readouts.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Connects discovery-phase mechanistic insights to preclinical continuity by modeling shear-dependent RBC behavior in microcirculation.
- Operational Value: Informs risk-adjusted advancement decisions by correlating aggregate stability with hemodynamic conditions relevant to vascular function.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery continuum from target validation through lead identification by providing shear-dependent phenotypic readouts that inform mechanistic understanding of blood flow modifiers.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling dynamic observation of aggregate formation and dissociation under controlled shear rates.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized microfluidic environments and quantitative aggregate size distribution outputs.
- Analytics: Provides measurable readouts including average aggregate size, size distribution, and localized shear rate calculations derived from velocity fields and layer thickness.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by modeling RBC behavior in microvascular environments relevant to disease states.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform for evaluating compounds or conditions affecting hemorheological properties across multiple hematocrit levels and shear conditions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in RBC-plasma interactions under flow.
- Operational Value: Ensures reproducibility and standardization through controlled shear rates, calibrated imaging, and automated image processing workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early detection of hemorheological liabilities that could impact drug safety or efficacy.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by identifying compounds that modulate aggregation propensity in a shear-dependent manner.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidic device handling, high-speed imaging, and image processing techniques for binary thresholding and particle labeling.
- Depends on microfluidic fabrication capabilities, high-speed cameras capable of ≥18 fps, and μPIV systems for velocity field determination.
- Necessitates cross-team standardization of hematocrit preparation, tracer particle concentration, and flow rate protocols to ensure comparability across experiments.
- Involves adaptation considerations when extending to diseased RBC samples or varying plasma conditions that may alter aggregation kinetics.
- Includes practical limitations such as the need for bubble-free systems, steady-state flow validation, and manual validation of blood layer thickness for shear rate calculation.
