Ekstrasellüler Veziküller Yalıtım ve Karakterizasyonu için kağıt tabanlı cihazlar

Bu prosedürün genel amacı, kağıt tabanlı bir platform kullanarak hücre dışı vezikülleri izole etmektir. Bu, ilk olarak dairesel selülozlu iki polistiren tabaka ile laminasyon ile gerçekleştirilir, kağıt kesikleri bir dizi kayıtlı açık delik üzerine hizalanır. İkinci adım, hücre dışı vezikülleri kağıt test bölgesine bağlayacak molekülleri kimyasal olarak eşlenik etmektir.

Daha sonra, biyolojik numune doğrudan kağıt test bölgesine pipetlenebilir ve durulama adımından sonra hücre dışı veziküller izole edilir. Son adım, elektron mikroskobu, Eliza veya transkriptomik analiz kullanarak yakalanan hücre dışı vezikülleri karakterize etmektir. Sonuç olarak, 10 mikrolitre kadar küçük serum örneklerinden elde edilen hücre dışı veziküllerin alt kümeleri saflaştırılabilir ve konsantre edilebilir.

Dolayısıyla, bu tekniğin ultra eğitim gibi mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, çok nazik bir şekilde birleştirilmesi ve gerçekleştirilmesinin basit olmasıdır. Prosedürü gösteren bir yüksek lisans öğrencisi olacak, siz olacaksınız. İki polistiren tabakasından başlayarak, bir dizi dairesel kesik oluşturun.

Her biri, manuel bir delgeç veya cad, otomatik kesici çizici ile beş milimetreden daha küçük bir çap sergiler. Ek olarak, bir dizi beş milimetre çapında kromatografi, bir delik zımbası ile kağıt diskleri kesin. Tezgahın üzerine bir polistiren levha yerleştirin ve karşılık gelen her bir açık deliğin üzerine tek bir kağıt disk yerleştirin.

İkinci polistiren tabakasını kaydederek ve kaplayarak kağıt diskleri sandviçleyin. Sandviçi bir termal laminatöre yapıştırmadan önce genel hizalamayı kontrol edin. Ardından, lamine cihazı bir plazma odasına yerleştirerek kağıt diskler üzerinde kimyasal yüzey modifikasyonlarına başlayın.

Hazne vakumunun serbest bırakılmasının ardından kağıt yüzeyini oksijen plazması ile kısa bir süre etkinleştirin, hemen kağıt cihazını silin çözeltisine aktarın ve 30 dakika inkübe edin. Oda sıcaklığını ayarlayın. Cihazı beş mililitre 200 geçirmez etanol ile durulayarak fazla cy şeritlerini çıkarın.

Daha sonra cihazı A-G-M-B-S bağlayıcı solüsyonu ile 15 dakika inkübe edin. Oda sıcaklığını ayarlayın. Fazla bağlayıcı molekülünü bol miktarda etanol durulama ile çıkarın.

Daha sonra, cihazı dört santigrat derecede bir saat boyunca avadon ile inkübe edin ve bağlanmamış avadonu beş mililitrelik bir PBS yıkama ile çıkarın. Cihaz daha sonra antikor bağlama adımına geçebilir veya gerekirse dört hafta boyunca dört santigrat derecede saklanabilir. Aden ekinden sonra, açıkta kalan kağıt disk bölgelerine 10 mikrolitre blokaj solüsyonu pipetleyin ve kağıdı 10 dakika inkübe edin.

Oda sıcaklığında, 10 mikrolitre bloke edici solüsyon ilavesini ve 10 dakikalık oda sıcaklığında inkübasyonu tekrarlayın. Açıkta kalan kağıt substratın biyo-işlevselleştirmesini tamamlamak için iki kez daha 10 mikrolitre biyotinile yakalama molekülünü disklere pipetleyin ve 10 dakika inkübe edin Hücre dışı veziküller için oda sıcaklığında, tercih edilen yakalama molekülleri ya anti CD 63 antikorları ya da bir xin beş olabilir. 10 mikrolitrelik pipetleme ve 10 dakikalık inkübasyon işlemlerini tekrarlayın.

Yakalandıktan sonra iki kez daha molekül bağlanması. Fazla parçaları pipetleyerek yıkayın. Her bir kağıt diske 10 mikrolitre uygun yıkama tamponu.

Yıkamayı oda sıcaklığında bir dakika inkübe edin ve 10 mikrolitrelik yıkama ve bir dakikalık inkübasyon adımlarını iki kez daha tekrarlayın. Tamamen işlevsel hale getirilmiş kağıt cihaz artık hücre dışı vezikülleri serum veya sulu mizahtan izole etmek için hazırdır Serum işleme için. Bir vakum tüpünde 10 mililitre periferik kan toplayın ve tüpü beş kez hafifçe ters çevirin.

Tüpü dikey konuma getirin ve 30 dakika bekleyin. Oda sıcaklığını ayarlayın, kan örneğini 15 dakika santrifüjleyin. Oda sıcaklığını ayarlayın.

Üst şeffaf serum tabakasını temiz bir plastik tüpe aktarın ve alt yarı katı fazı atın. Serumu 30 dakika boyunca daha yüksek bir santrifüj hızında berraklaştırın. Oda sıcaklığını ayarlayın.

Süpernatanı yeni bir tüpe aktarın ve süpernatanı 0,8 mikrometrelik bir filtreden geçirerek ince partikülleri çıkarın. Elde edilen filtrelenmiş serum hemen kullanılabilir veya eksi 80 santigrat derecede saklanabilir. Hücre dışı veziküller mizahtan çıkarılacaksa, hastalardan doğrudan invaziv prosedürlerle sulu mizah toplayın ve örnekleri eksi 80 santigrat derecede saklayın.

Kullanıma kadar, vitreus mizah örnekleri için herhangi bir filtreleme veya arıtma adımına gerek yoktur. Hücre dışı vezikülleri serum veya sulu mizahtan izole etmek için, biyolojik numunenin beş mikrolitresini her bir biyo-işlevselleştirilmiş kağıt substrat diskine pipetleyin. Lekeyi oda sıcaklığında bir dakika inkübe edin ve beş mikrolitrelik pipetleme ve bir dakikalık inkübasyon işlemlerini tekrarlayın.

İki kez daha Afinite bağlandıktan sonra, önce uygun yıkama tamponundan 10 mikrolitre pipetleyerek bağlanmamış vezikülleri durulayın. Tamponu oda sıcaklığında bir dakika inkübe edin ve 10 mikrolitrelik yıkamayı ve sonraki inkübasyonu tekrarlayın. İki kez daha adım atın.

Yakalanan hücre dışı veziküller artık aşağıdaki aşağı akış tahlilleri için hazırdır: yakalanan vezikülleri işlevselleştirilmiş kağıt destek pipetine sabitlemek için her bir kağıt diske 10 mikrolitre 0.5 x karnofsky fiksatif. Çapraz bağlama reaksiyonunun oda sıcaklığında 10 dakika devam etmesine izin verin ve tüm diskleri bol miktarda PBS ile beş dakika durulayın. Ardından, aşağıdaki yıkamaları sırayla uygulayarak kağıt alt tabakaları kurutun.

Bir adet %35 etanol inkübasyonu, iki adet %50 etanol inkübasyonu, iki adet %70 etanol inkübasyonu, iki adet %95 etanol inkübasyonu ve dört adet %100 etanol inkübasyonu. Her bir yıkama için, etanol çözeltisinin kağıt disklerin üzerinde oda sıcaklığında 10 dakika inkübe etmesine izin verin. Kağıt cihaz kemik kuru olduğunda, numuneleri metal bir püskürtmede 18 nanometrelik bir paladyum altın tabakası ile kaplayın.

Numuneyi bir taramalı elektron mikroskobuna yerleştirin ve immünolojik testler yoluyla yakalanan vezikülleri tespit etmek için biyolojik numunenin aşırı yüklenmesini önlemek için beş kilovoltta mikroskopi gerçekleştirin. Her kağıt diske beş mikrolitre anti CD dokuz birincil antikor ekleyerek başlayın ve oda sıcaklığında bir dakika inkübe edin. Kağıt cihazını mekanik çalkalama yoluyla 30 mililitre oda sıcaklığında PBS ile yıkayarak tüm bağlanmamış antikorları çıkarın.

Daha sonra, her kağıda beş mikrolitre at turpu peroksidaz konjuge ikincil antikor pipetleyin. Disk ve oda sıcaklığında bir dakika inkübe edin. Bağlanmamış ikincil antikorları çıkarmak için cihazı mekanik çalkalama yoluyla 30 mililitre PBS ile yıkayın.

Son olarak, her kağıda beş mikrolitre renk ve metrik alt tabaka karışımı ekleyin. Reaksiyonu oda sıcaklığında 20 ila 30 dakika inkübe edin ve ortaya çıkan spot renk yoğunluğundaki değişikliği bir masaüstü tarayıcı kullanarak tarayın. Başlamak için, makas veya tıraş bıçağı kullanarak fazla polistiren laminat bölgelerini keserek tek tek kağıt diskleri toplu cihazdan izole edin.

Her kağıt diski 1,5 mililitrelik temiz bir mikro santrifüje yerleştirin. İkisi, 265 mikrolitre lizis tamponu ekleyerek yakalanan vezikülleri yayar. Ve her tüpe 35 mikrolitre PVP bazlı polisakkarit uzaklaştırma taşıyıcısı kuvvetli bir şekilde girdap.

Serbest kalan RNA moleküllerinin tam vezikülünü, parçalanmasını ve yerinden çıkmasını sağlamak için, tüpü 10 dakika boyunca buz üzerinde karıştırmak ve inkübe etmek için lizat girdabına 30 mikrolitre homojenat çözeltisi ekleyin. Daha sonra, RNA'nın hem proteinlerden hem de DNA girdabından tüp başına en az 15 saniye boyunca kuvvetli bir şekilde faza özgü ayrılmasını sağlamak için lizata 330 mikrolitre asit fenol kloroform karışımı ekleyin. Tüpü beş dakika boyunca tam hızda santrifüjleyin.

Oda sıcaklığında, üst sulu fazı içeren RNA'yı 1,5 mililitrelik taze bir tüpe aktarın ve alt organik fazı atın. RNA'ya 1.25 sulu hacim değerinde %100 etanol ekleyin ve karıştırmak için kısa bir süre girdaplayın. Daha sonra karışımı ticari bir RNA katı ekstraksiyon kolonuna uygulayın.

Tüpü oda sıcaklığında 15 saniye santrifüjleyin ve akış fraksiyonunu atın. 700 mikrolitre çalışma solüsyonu ekleyerek kolonu yıkayın. Birincisi, tüpü beş ila 10 saniye santrifüjleyin ve akışı atın.

Daha sonra, sütunu 500 mikrolitre çalışma solüsyonu ile yıkayın. İkincisi, tüpü beş ila 10 saniye santrifüjleyin. Akışı atın ve yıkamayı bir kez daha tekrarlayın.

Artık etanolü oda sıcaklığında son bir dakika döndürerek çıkarın ve kurutulmuş ekstraksiyon kolonunu 1.5 mililitrelik yeni bir tüpe aktarın. 100 mikrolitre önceden ısıtılmış R RNA içermeyen su ekleyin. Tüpü beş ila 10 saniye boyunca tam hızda santrifüjleyin ve gerekirse üst ekstraksiyon kolonunu atın.

Floresan etiketli biyotin kullanan ticari bir RNA temizleme kiti kullanarak RNA EIT'yi konsantre edin ve daha da saflaştırın. Yüzey Im seferberliği için bir muhabir olarak. Kağıt işlevselleştirme protokolünün etkinliği ve özgüllüğü, çapraz bağlayıcı modifiye edilmiş yüzeyde meydana gelen yüksek floresansın işlevselleştirilmemiş kağıt yüzeyleri ile karşılaştırılmasıyla görülebilir.

Ayrıca, raportör molekül biyotinile edilmiş bir anti CD 63 antikoru ile değiştirildiğinde, uygun şekilde işlevselleştirilmiş kağıt substrat, negatif bir kontrol kağıdı substratı üzerinde daha yüksek bir hücre dışı vezikül yakalama oranını kolaylaştıracaktır. Farklı yakalama molekülleri kağıt substratlar üzerinde hareketsiz hale getirildiğinde, hücre dışı veziküllerin farklı alt grupları, kağıt cihazı kullanılarak farklı boyut dağılımları sergiliyor gibi görünmektedir. Hem intravezikal RNA içeriği hem de veziküle özgü yüzey proteinlerinin bolluğu için de test edilebilir.

Bu videoyu izledikten sonra, kağıt bazlı bir cihaz kullanarak hücre dışı les'te nasıl izole edileceğini ve yükselmeyi nasıl karşılayacağınızı iyi anlamış olmalısınız.