Name: Ksenopus Translation Düşüklüğü Belirlemek için Bir Model Olarak laevis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: Öğrenin translasyon başlatma faktörü mutasyonlarının etkilerini Xenopus laevis oositleri kullanarak değerlendirme yöntemini. Bu protokol protein sentezi bozukluklarının moleküler mekanizmalarını anlamak için güçlü bir model sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu araştırma, INSERM, Lille Üniversitesi 1, Lille Üniversitesi, Lille 2 Üniversitesi, Lille Bölge Hastanesi Merkezi (CHR de Lille) tarafından desteklenmiştir. MCCH, Fondation de France'ın desteğini kabul eder ve IRCL'ye, V5-plazmitlerin hediyesi için Pr. Sonenberg'e, anti-GFP antikorlarının hediyesi için Dr. Dissous'a (Pasteur Enstitüsü, Lille), Xenopus oositlerinin satın alındığı UMS 3387'ye (Rennes Üniversitesi) ve el yazması metnin eleştirel okuması için Dr Taymans'a (JPArc, Lille) teşekkür eder.

Tüm Xenopus deneyleri laboratuvar hayvanları deney için Avrupa Topluluğu Konseyi yönergelerine (86/609 / EEC) kurallarına göre Lille 1 Üniversitesi&#39;nin hayvan tesisinde gerçekleştirildi. Hayvan protokolü (Comité d&#39;Ethique en Deneme Animale Nord-Pas-de-Calais CEEA 07/2010) yerel kurumsal inceleme kurulu tarafından onaylanmıştır. 1. Oosit İşleme <ol><li> Anestezik hazırlayın: steril su, bir 1 L tricaine metan sülfonat tozu 1 g çözülür. </li><li> Kadın Xenopus bu çözüm içine laevis Dalma, kaçış önlemek ve hayvan tamamen (bir bacak tutam herhangi bir tepki olmadan) sedasyon olmak için yaklaşık 45 dakika beklemek zorunda beher kapsamaktadır. </li><li> Daha sonra temiz bir alüminyum folyo üzerine sırtında hayvan koyun sabunla yıkayın kurbağayı ve musluk suyu ile durulayın. </li><li> Karın yan kısmında ve forseps ile yumurtalıklar düzeyinde cildi Kelepçe.Etanol% 70 ile kullanılmadan önce temizlenmelidir makasla yaklaşık 1 cm&#39;lik bir kesi olun. Bölüm yeterince derin olduğundan emin olun ve çeşitli gelişim aşamalarında çeşitli oosit bulundu edildiği yumurtalık dokusunun çıkarılmasını sağlamak için altta yatan karın duvarı ulaşmak için. </li><li> ND96 ortamı (96 mM NaCI, 2 mM KCI ile bir Petri kabı (50 mm) olanağına 4 kez yıkayın, yumurtalık loblar teşrih, 1 mM MgCl2, 1,8 mM CaCl2, 5 mM HEPES, NaOH ile pH 7.4&#39;e ayarlanmış takviye 50 ug / ml streptomisin / penisilin, 225 ug / ml sodyum piruvat, / ml soya fasulyesi tripsin inhibitörü, 30 ug, 1 ul / ml tetrasiklin) kan ve döküntü tüm izlerini silmek için. Not: Tetrasiklin optimal koruma ve mikroenjeksiyon tedavisi sonrası iyi bir iyileşme sağlar. </li><li> Bir hafta boyunca kendi koruma sağlayan, 14 ° C &#39;de ortam içine kapalı bir Petri tabağına saklayın. </li><li> Karın duvarı ve veteriner emilebilir t ile cildi Dikişhread ve dikiş iğnesi (3 ya da 4 dikiş gerekli olacaktır). </li><li> Su olmadan beher hayvan koyun ve kurbağa tekrar hareket kadar musluk suyu ile cildi nemli. Kaçmasını önlemek için beher örtün. </li><li> 10-kat büyütmeli bir stereomikroskop altında forseps 2 çiftleri kullanılarak dikkatli bir şekilde 5 ila 10 oosit gruplarda orta yumurtalık loblar ayırın. Sahne VI Seçin oositler. Bu, kahverengi bir pigmentli hayvan kutup çapında 10 1.2 mm ii) boyutları her türlü açık bir kayış ile ayrılan sarı bir bitki kutuplu i) kendi şekil ve renk tanınabilir. </li><li> (Kolajenaz oosit / folikül hücresi bağlantısına digests) oosit defolliculation kolaylaştırmak için 45 dakika boyunca hafif hafif çalkalamak suretiyle bir Petri kabındaki (tetrasiklin olmayan ND96 içinde çözülmüş Clostridium histolyticum&#39;dan, 1 mg / ml kollajenaz A) kolajenaz çözeltisi seçilen oositlerin inkübe edin. ND96 ortam ile 3 ya da 4 kez 14 tutulan oosit durulayın° C. Not: oosit az ya da oosit yüzey proteinleri tahrip ve yoksul canlılığı neden riski nedeniyle fazla 45 dakika inkübe etmeyin. Kollajenaz tedavisi kendiliğinden GVBD indükleyebilir. </li><li> 3-4 saat boyunca ortam içinde oosit inkübe edin. Binoküler büyüteç altında ince cımbız ile foliküler hücreleri çıkarın ve ND96 ortamında 19 ° C&#39;de saklayın. </li></ol> MRNA Synthesis 2. Hazırlık <ol><li> I enzim PME ile enzimatik sindirme ile aşağıdaki plazmidlerle 5 ug Linearize. NOT: pcDNA6.2 / a 1599 amino asitler eIF4G1 cDNA vahşi tip (eIF4G1-WT; NM_198241) içeren V5-DEST mutasyonları c.2105T ile, bir eIF4G1 dominant negatif cDNA (eIF4G1-DN) içeren pcDNA6.2 / V5-DEST &gt; G c.2106A&gt; C, c.2120-&gt; G, c.2122T&gt; A, 2125T&gt; - ve c.2126T&gt; G karşılık gelen protein içindeki 618 pozisyonuna 612 eIF4G1 ve eIF4E arasındaki etkileşim bölgesinde rahatsız etkileşim between eIF4G1 ve eIF4E 8 chloramphenicol acetyl transferase ihtiva eden pcDNA6.2 / C-EmGFP (GFP). 3 plazmidlerin her biri için 2 karışımları hazırlayın: I enzim de dahil olmak üzere, ilk ve ikinci PME kontrol olarak enzimsiz. </li><li> Klasik bir etanol prosedürü kullanılarak plazmid DNA çökelti ve nukleazsız H2O 20 ul içinde tekrar süspansiyon haline getirin </li><li> Bir spektrofotometre kullanılarak konsantrasyonunu belirleyin. Konsantrasyon cRNA yazıya ul 150 ng / üstün olmalıdır. </li><li> Plazmid doğrusallaştırma doğrulamak için 1 ul numune ve% 0.8 agaroz jeli üzerinde yükleme tamponu, 5 ul ile kontrol çalıştırın. </li><li> In vitro transkripsiyonu, üreticinin talimatlarına göre cRNA saflaştırılması için bir kit kullanın. Transkribe cRNA, nukleazsız H2O 20 ul içinde tekrar süspanse edilir Gerekirse Numuneler -80 ° C&#39;de saklanabilir. </li><li> 0.2 M MOPS (pH 7.0), 20 m ihtiva MOPS 10X geçiş tamponu hazırlayınM sodyum asetat ve 10 mM EDTA (pH 8.0). 0.45 um filtre ile çözelti sterilize edin. Çözelti oksidasyonu önlemek için oda sıcaklığında ışıktan korunur çözelti stok. </li><li> NaOH, HCl ile art arda elektroforez tankı temizleyin ve iyice bir O çift-filtrelenmiş su ile durulanır / N RNAaz ari önlemek ve RNA bozulmasını önlemek için. </li><li> MOPS ve formaldehit içeren% 1.5 agaroz jel Cast. Tam agaroz çözülünceye kadar sıcak ve 55 ° C&#39;ye kadar soğumasını bekleyin. Davlumbaz altında, MOPS 10X 0.1 hacim, formaldehit% 6.6 ve etidyum 4 mikrogram (10 mg / ml) ekleyin. Davlumbaz altında jel dökün ve jel sertleşmesine yaklaşık 1 saat bekleyin. Not: Formaldehit ve etidyum bromür toksiktir. </li><li> CRNA 1 ul, formaldehit% 8.8, formamit 60 ve% MOPS 10X 0,1 hacmi ile 0.2 ml tüp içinde göç örnekleri hazırlayın. 70 ° C &#39;de 3 dakika süre ile inkübe edilir ve 10 dakika süreyle buz üzerinde tüpler koydu. Santrifüj örnekleri Birkaç saniye at5000 x g. , Jel yükleme tampon maddesi, 2 ul ekle. Not: Formamid toksiktir. </li><li> 90V, 20 dakika boyunca numune çalıştırın. CRNA kalitesini kontrol etmek için analiz etmeden önce jel destain için nukleazsız H 2 OO / N jel bekletin. </li><li> Bir spektrofotometre kullanılarak cRNA konsantrasyonunu belirleyin ve -80 ° C&#39;de saklayın. </li></ol> Sentezlenen RNA ve Oosit Olgunlaşma Uyarım 3. Mikroenjeksiyon <ol><li> Oosit mikroenjeksiyon için gerekli ekipman hazırlayın. Küçük cam kapiller çekmek için bir mikropipet çektirmesi kullanın. Stereomicroscope altında, kör bir uç oluşturmak için cımbız ile kılcal ekstremite kesiyorum. Karşı ucunda, bir Millipore 0,45 mikron filtre ile 1 ml şırınga kullanarak, mineral yağ ile kılcal mikropipet doldurun. Mikroenjeksiyon pipet üzerine mikropipet monte edin. Uygun cam kapiller ile kullanıldığında iyi doğruluk vermek için üretici tarafından kalibre doğru mikropipet seçin. </li><li> Mikroenjeksiyon defolliculation sonra 1-2 saat gerçekleştirin, oosit üzerinde oosit kurtarma için gerekli gecikme 14 ° C&#39;de muhafaza. Alt Kullan Petri kapları oositler için bir yapıştırıcı yüzey oluşturmak ve ND96 ortamı onları doldurmak için forseps ile kazınır. </li><li> 45 ° C &#39;lik bir açıda kılcal mikropipet ile oosit ardışık enjekte etmeyi sağlamak bir Petri kabındaki kazınmış şerit boyunca oosit düzenlemek. </li><li> Sitoplazmada örneklerin optimal difüzyonu için pigmentli, hayvan alanının altında, oosit ekvatoryal mıntıkasında enjekte edilir. Derinliği yaklaşık 150-200 mikron üzerinde kılcal ucu sadece ince bir kısmını yerleştirin. </li><li> Bir birinci oosit içinde 60 nl bir hacimde farklı plazmid sırasıyla elde edilen cRNA 30 ng enjekte edilir. Enjeksiyon sonrası, numune kaçış (Şekil 2A) önlemek için kılcal ucu çıkarmadan önce 5-10 saniye bekleyin. Not: 120 nl aşmayın. Yavaş olabildiğince enjekte edilir. Damıtılmış su olan bir kontrol yapılması tavsiye edilir. </li><li> Bir sonraki oositi enjekte elle Petri kabı taşıyın. Not: İpucu 2 ila 3 microinjections sonra banyo solüsyonu dışarı küçük bir darbe oluşturarak tıkanmış olmadığından emin olun. </li><li> 24 kuyu kültür plakaları içinde Aktarım enjekte edilmiş oositler (10 oosit / oyuk), taze ND96 ortamının 3 ml ile doldurulur ve 19 ° C&#39;de bırakın. </li><li> , 19 ° C de mayoz olgunlaşmasını (GVBD) tetiklemek için progesteron (PG) (2 ug / ml) ile ND96 içinde oosit inkübe 15 saat veya pcDNA6.2 / V5-DESTeIF4G1 ve pcDNA6 sırasıyla elde edilen poliadenile edilmiş cRNAs mikroenjeksiyon 4 saat sonra 0,2 / C-EmGFP bir kontrol (Şekil 2A) olarak kullanılır. Not: cRNA ile floresan markör ortak enjeksiyonu cRNA enjekte edilmiş ve oosit kalmıştır sağlamak için iyi bir araçtır. GFP etiketi ile ilgi bir cRNA kullanarak bu tür ön deneyler yapın. </li><li> Microinject olarak içerisinde 3,5 farklı oranları (1: 3; 2: 2: 3: 1) te üzere eIF4G1-WT ve eIF4G1-DN cRNAs poliadenile arasındast mutant fenotipinin (Şekil 2B) üzerindeki eIF4G1-WT cRNAs translasyon etkisi. </li></ol> 4. Germinal Vesikül Arıza Tespiti <ol><li> Bir stereomikroskopta siyah hayvan kutup beyaz bir nokta varlığını gözlemleyerek PG uyarıldıktan sonra olgun oosit sayısını. 20-4 saat (Şekil 2B, 2C) kadar saymaya her saat tekrarlayın. </li></ol> 5. Western Blot (WB) analizi <ol><li> 50 mM Hepes, pH 7.4, 500 mM NaCl,% 0.05 SDS, 5 mM MgCI2, 1 mg aşağıdaki tampon maddesi içinde 200 ul 4 ° C &#39;de, 10 arka oositler ve bir mikro pipet ile ortaya hareketlerin grubu homojenize / ml büyükbaş hayvan serum albümini, 10 mg / ml löpeptin, 10 mg / ml aprotinin, 10 mg / ml soya fasulyesi tripsin inhibitörü, 10 mg / ml benzamidin, 1 mM PMSF, 1 mM sodyum vanadat. </li><li> 10,000 x g&#39;de 15 dakika boyunca santrifüj örnekleri lipid (üst faz) ve zar (alt faz) f çıkarmak içinkasılma konsantrasyona. Protein konsantrasyonu belirlemek ve Laemmli veya Bis-Tris numune tamponu ile geri kalan tamamlamak için bir alikot depolamak, sitoplazmik bölümünü kazan (1: 1). Not: Bis-Tris jelleri ve yükleme tamponu hidrolizinden proteinleri koruyan daha nötr pH değerine sahip </li><li> 10 dakika boyunca 95 ° C&#39;de örneğin 20 ug ısıtın. Akrilamid jel kuyu içine her bir örnek yükleyin. Uygun tampon maddesi ile bir tankta jel yerleştirin. </li><li> 200 V&#39;de 1 saat boyunca bir elektroforez gerçekleştirme </li><li> TBS pH bir WB 8,0 Gerçekleştirmek (Tris-HCl 15 mM, NaCl 150 mM Tween% 0.1;% 10 bovin serum albümini), bir keçi anti-Aurora A / eg2 (1: 3000, 2 saat) ile birlikte ya da bir tavşan anti-ile -Aurora A / eg2-P (1: 4 ° C &#39;de 1000, O / N), fare anti-ERK2 (1: 3000, 2 saat), keçi anti-ERK2-P (Tyr204) (1: 3000, 2 saat 10.000, 2 saat) ve tavşan anti-Rsk (1:), tavşan anti-ay (1: 5000, 4 saat), tavşan anti-GFP (1: 3000, 2 saat) antibodies.Use fare anti-V5 antikorları (1 : yükleme kontrolleri gibi 1000, 2 saat) (). </li><li> YıkamaMembran 3 kez 10 dakika için TBS-Tween ile 1 saat inkübe edilir, 1 seyreltilerde bir anti-fare ya da anti-tavşan veya anti-keçi (IgM) bayır turpu peroksidazı etiketli ikincil antikor ya: 5000, 1: 7500 ve 1 : sırasıyla 5.000. </li><li> TBS-Tween 10 dakika süren 3 yıkama yapın ve Advanced ECL Detection sistemi ile antijen antikorlarının kompleksleri tespit. </li></ol> 6. Poliadenilasyon Deneyi <ol><li> Örnek 1.5 ml koşulu başına 5 oosit. Nukleazsız PBS 1X (pH 7.4), 1 ml ile yıkanır. Aşağıdaki adımlar davlumbaz altında yapılacaktır. </li><li> (Üretici talimatlarına bakın) klasik organik prosedür kullanılarak RNA ayıklayın. </li><li> 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca santrifüje (10000 x g) RNA kurtarmak. 10 dakika boyunca supernatant ve hava kuru RNA çıkarın. </li><li> Nukleazsız H2O 30 ul içinde süspanse RNA topağı </li><li> Yeni bir tüp içinde numunelerin 15 ul alın ve nukleazsız H 2 O 85 ul ekleyin Temizlemekse örnekleri, üreticinin talimatlarına uygun olarak silisyum dioksidin kolonu üzerinde kalitesini artırmak için. Nukleazsız H2O 30 ul kullanarak, RNA yı Zehir </li><li> RNA bütünlüğü kontrol etmek için bir% 0.8 agaroz jeli üzerinde yükleme tamponu 5 ul numune 1 ul çalıştırın. </li><li> Bir spektrofotometre kullanılarak RNA konsantrasyonu belirleyin. </li><li> Koşul başına 2 ligasyon karışımları hazırlanması (örneğin, eIF4G1-WT, eIF4G1-DN ve H2O kontrol), aşağıdaki reaktifleri ile: RNA ligaz 10 U, 10X tampon maddesi 0.1 hacim, 1 mM ATP, 50 PEG8000,%% 10 , primer P1 (5&#39;-P-GGTCACCTTGATCTGAAGC-NH2-3 &#39;) 11 ve nukleazsız H2O ile 10 ul son hacim getirmek 0.1 ug PG uyarılma olmaksızın oosit elde edilen ilk karışım RNA ekleyin ve PG elde edilen ikinci karışım RNA oosit uyarılmış. </li><li> Enzimler inaktive edildi, 65 ° C de 20 dakika ve sonra 37 ° C&#39;de 1 saat süreyle inkübe edin. </li><li> Bizeea cDNA Ters Transkripsiyon (RT) kiti. Tüp başına, RT karışım hazırlayın: 10X RT tamponu 0,1 hacim nukleazsız H primer P2 (5&#39;-GCTTCAGATCAAGGTGACCTTTTT) 10, 4 mM dNTP karışımı, ters transkriptazın 50 U ve 0.1 ug tam bir nihai hacme 2 O 10 ul. Yukarıda elde edilen ligasyon reaksiyonunun 10 ul ekle. Üretici tarafından tarif edilen koşullar altında RT gerçekleştirin. </li><li> (PCR) karışımı, tüp başına Polimeraz Zincir Reaksiyonu hazırlayın: tampon 10X 0.1 hacim, 1.5 mM MgCI2, 133 uM dNTP karışımı, 0.2 uM spesifik primer, 0.2 uM primer P2, 0.025 U Taq polimerazı, cDNA 1 ul ile komple nukleazsız 50 ul nihai hacme kadar H2O. Aşağıdaki koşullar altında PCR yapın: 50 ° C, 2 dakika, 10 dakika boyunca 95 ° C, [30 saniye için 1 dk için 95 ° C, 56 ° C, 30 sn için 72 ° C] için 40 döngü, 72 ° C 10 dakika 9. Şöyle spesifik primerler şunlardır: mos GTTGCATTGCTGTTTAAGTGGTAA Histon benzeri B4 AGTGACAAACTAGGCTGATATACT; Siklin A1, CATTGAACTGCTTCATTTTCCCAG; Siklin B1: GTGGCATTCCAATTGTGTATTGTT 9. </li><li> % 3 agaroz jel hazırlayın. Her bir PCR ürünlerinin yükleme tamponu 10 ul ekle. Optimal göç 110 V numunelerin 10 ul jel çalıştırın. Tercümelerine için bir ön koşuldur kuyruk poli (A) ve böylece RNA olgunlaşma süresini yansıtan boyutta bir değişikliği gözlemek için 10 ve 20 dakika sonra jel analiz eder. </li></ol>

<ol><li>Jackson, R. J., Hellen, C. U., Pestova, T. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+of+eukaryotic+translation+initiation+and+principles+of+its+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The mechanism of eukaryotic translation initiation and principles of its regulation.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (2), 113-127 (2010).</li>
<li>Holcik, M., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+control+in+stress+and+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Bio%22%5BJournal%5D)">Translational control in stress and apoptosis.</a> Nat Rev Mol Cell Bio. 6 (4), 318-327 (2005).</li>
<li>Lopez-Lastra, M., Rivas, A., Barria, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+synthesis+in+eukaryotes%3A+the+growing+biological+relevance+of+cap-independent+translation+initiation%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Res%22%5BJournal%5D)">Protein synthesis in eukaryotes: the growing biological relevance of cap-independent translation initiation.</a> Biol Res. 38 (2-3), 121-146 (2005).</li>
<li>Terenin, I. M., Andreev, D. E., Dmitriev, S. E., Shatsky, I. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+mechanism+of+eukaryotic+translation+initiation+that+is+neither+m7G-cap-%2C+nor+IRES-dependent%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A novel mechanism of eukaryotic translation initiation that is neither m7G-cap-, nor IRES-dependent.</a> Nucleic Acids Res. 41 (3), 1807-1816 (2013).</li>
<li>Sonenberg, N., Hinnebusch, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+translation+initiation+in+eukaryotes%3A+mechanisms+and+biological+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Regulation of translation initiation in eukaryotes: mechanisms and biological targets.</a> Cell. 136 (4), 731-745 (2009).</li>
<li>Van der Knaap, M. S., Leegwater, P. A., Könst, A. A., Visser, A., Naidu, S., Oudejans, C. B., Schutgens, R. B., Pronk, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+each+of+the+five+subunits+of+translation+initiation+factor+eIF2B+can+cause+leukoencephalopathy+with+vanishing+white+matter%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Neurol%22%5BJournal%5D)">Mutations in each of the five subunits of translation initiation factor eIF2B can cause leukoencephalopathy with vanishing white matter.</a> Ann Neurol. 51 (2), 264-270 (2002).</li>
<li>Senée, V., Vattem, K. M., Delépine, M., Rainbow, L. A., Haton, C., Lecoq, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wolcott-Rallison+Syndrome%3A+clinical%2C+genetic%2C+and+functional+study+of+EIF2AK3+mutations+and+suggestion+of+genetic+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Wolcott-Rallison Syndrome: clinical, genetic, and functional study of EIF2AK3 mutations and suggestion of genetic heterogeneity.</a> Diabetes. 53 (7), 1876-1883 (2004).</li>
<li>Chartier-Harlin, M. C., Dachsel, J. C., Vilariño-Güell, C., Lincoln, S. J., Leprêtre, F., Hulihan, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translation+initiator+EIF4G1+mutations+in+familial+Parkinson+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Translation initiator EIF4G1 mutations in familial Parkinson disease.</a> Am J Hum Genet. 89 (3), 398-406 (2011).</li>
<li>Charlesworth, A., Cox, L. L., MacNicol, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoplasmic+polyadenylation+Element+%28CPE%29-+and+CPE-binding+Protein+%28CPEB%29-independent+mechanisms+regulate+early+class+maternal+mRNA+translational+activation+in+Xenopus+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Cytoplasmic polyadenylation Element (CPE)- and CPE-binding Protein (CPEB)-independent mechanisms regulate early class maternal mRNA translational activation in Xenopus oocytes.</a> J Biol Chem. 279 (17), 17650-17659 (2004).</li>
<li>Dumont, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oogenesis+in+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Morphol%22%5BJournal%5D)">Oogenesis in Xenopus laevis.</a> J Morphol. 136, 153-180 (1972).</li>
<li>Rassa, J. C., Wilson, G. M., Brewer, G. A., Parks, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spacing+constraints+on+reinitiation+of+paramyxovirus+transcription%3A+the+gene+end+U+tract+acts+as+a+spacer+to+separate+gene+end+from+gene+start+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Spacing constraints on reinitiation of paramyxovirus transcription: the gene end U tract acts as a spacer to separate gene end from gene start sites.</a> Virology. 274, 438-449 (2000).</li>
<li>Lin, W., Wadlington, N. L., Chen, L., Zhuang, X., Brorson, J. R., Kang, U. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+PINK1+attenuates+HIF-1%CE%B1+induction+by+preventing+4E-BP1-dependent+switch+in+protein+translation+under+hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Loss of PINK1 attenuates HIF-1α induction by preventing 4E-BP1-dependent switch in protein translation under hypoxia.</a> J Neurosci. 34 (8), 3079-3089 (2014).</li>
<li>Martin, I., Kim, J. W., Lee, B. D., Kang, H. C., Xu, J. C., Jia, H. 2, Stankowski, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosomal+protein+s15+phosphorylation+mediates+LRRK2+neurodegeneration+in+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Ribosomal protein s15 phosphorylation mediates LRRK2 neurodegeneration in Parkinson's disease.</a> Cell. 57 (2), 472-485 (2014).</li>
<li>Cohen, S., Au, S., Panté, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+Xenopus+laevis+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Microinjection of Xenopus laevis oocytes.</a> J Vis Exp. (24), (2009).</li>
<li>Willis, J., DeStephanis, D., Patel, Y., Gowda, V., Yan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Study+of+the+DNA+damage+checkpoint+using+Xenopus+egg+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Study of the DNA damage checkpoint using Xenopus egg extracts.</a> J Vis Exp. (69), e4449(2012).</li>
<li>Keiper, B. D., Rhoads, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+recruitment+of+Xenopus+maternal+mRNAs+in+response+to+poly%28A%29+elongation+requires+initiation+factor+eIF4G-1%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Translational recruitment of Xenopus maternal mRNAs in response to poly(A) elongation requires initiation factor eIF4G-1.</a> Dev Biol. 206 (1), 1-14 (1999).</li>
<li>Wakiyama, M., Imataka, H., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+eIF4G+with+poly%28A%29-binding+protein+stimulates+translation+and+is+critical+for+Xenopus.oocyte+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Interaction of eIF4G with poly(A)-binding protein stimulates translation and is critical for Xenopus.oocyte maturation.</a> Curr Biol. 10 (18), 1147-1150 (2000).</li>
<li>Sheets, M. D., Wu, M., Wickens, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyadenylation+of+c-mos+mRNA+as+a+control+point+in+Xenopus+meiotic+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Polyadenylation of c-mos mRNA as a control point in Xenopus meiotic maturation.</a> Nature. 374 (6522), 511-516 (1995).</li>
<li>Gebauer, F., Richter, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+function+of+Mos%3A+the+control+switch+of+vertebrate+oocyte+meiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Synthesis and function of Mos: the control switch of vertebrate oocyte meiosis.</a> Bioessays. 19 (1), 23-28 (1997).</li>
<li>Le Sommer, C., Lerivray, H., Lesimple, M., Hardy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenopus+as+a+model+to+study+alternative+splicing+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Xenopus as a model to study alternative splicing in vivo.</a> Biol Cell. 99 (1), 55-65 (2007).</li>
<li>Au, S., Cohen, S., Panté, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+Xenopus+laevis.oocytes+as+a+system+for+studying+nuclear+transport+of+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Microinjection of Xenopus laevis.oocytes as a system for studying nuclear transport of viruses.</a> Methods. 51 (1), 114-120 (2010).</li>
<li>Gotoh, T., Villa, L. M., Capelluto, D. G., Finkielstein, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+pathways+coordinating+cell+cycle+progression+in+early+Xenopus+development%5BTitle%5D)+AND+%22Results+Probl+Cell+Differ%22%5BJournal%5D)">Regulatory pathways coordinating cell cycle progression in early Xenopus development.</a> Results Probl Cell Differ. 53, 171-199 (2011).</li>
<li>Schmidt, E. K., Clavarino, G., Ceppi, M., Pierre, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SUnSET%2C+a+nonradioactive+method+to+monitor+protein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">SUnSET, a nonradioactive method to monitor protein synthesis.</a> Nat Methods. 6 (4), 275-277 (2009).</li>
<li>Moreno, J. A., Halliday, M., Molloy, C., Radford, H., Verity, N., Axten, J. M., et al. Oral treatment targeting the unfolded protein response prevents neurodegeneration and clinical disease in prion-infected mice. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMoreno%2C+JA+%22Sci+Transl+Med%22">Sci Transl Med</a>. 5 (206), 206ra138(2013).</li>
<li>Doyle, K. M., Kennedy, D., Gorman, A. M., Gupta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unfolded+proteins+and+endoplasmic+reticulum+stress+in+neurodegenerative+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Unfolded proteins and endoplasmic reticulum stress in neurodegenerative disorders.</a> J Cell Mol Med. 15 (10), 2025-2039 (2011).</li>
<li>Gandin, V., Sikström, K., Alain, T., Morita, M., McLaughlan, S., Larsson, O., Topisirovic, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polysome+fractionation+and+analysis+of+mammalian+translatomes+on+a+genome-wide+scale%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale.</a> J Vis Exp. (87), e51455(2014).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Tercüme birkaç nörodejeneratif hastalıklar dahil olmak üzere sayısız insan bozukluklarının patofizyolojisinde rol bir mekanizmadır. Parkinson hastalığında Örneğin çeşitli raporlar kalıtsal mutasyonlara 8,12,13 ile bağlantılı tercüme edilen değer göstermiştir. Çeşitli hücresel modeller çeviri incelemek için kullanılabilir. Burada, eIF4G1 ve eIF4E mümkün 8 arasındaki etkileşimi azaltmak gibi baskın negatif mutasyonu hareket eIF4G1 bir mutasyon translasyonel sonuçlarını in...

Proteinler organizmanın daha büyük ölçekte temel hücresel yaşam elemanları ve bu nedenle bulunmaktadır. Onlar yapısı, ulaşım, reaksiyon kataliz, yönetmelik, gen ifadesi vb Onların ifade protein içine bir mRNA&#39;nın dönüşümünü sağlayan çeviri karmaşık bir mekanizmanın sonucudur içeren hücresel fonksiyonlarının çoğunu sağlamaktadır. Için uyarlamak ve gelişme ve farklılaşma, yaşlanma, fizyolojik baskılara ya da patolojik seyri sırasında, hücre ihtiyaçlarına göre gen ifadesini düzenlemek için çeşitli kontroller tabi tutulur. Kap-bağımlı, kap-bağımsız İç Ribozom Giriş Segment (IRES) yapıları ve kap-Bağımsız Çeviri arttırıcılar (via: Çeviri 3 başlatma çeviri sistemleri bu ihtiyaçlara cevap vermek amacıyla, 3 aşamadan (başlatma, uzama ve sonlandırma) ve hediyeler ayrılmıştır ) CITE. Çoğu eukaryotik mRNA bir kap-Depe çevrilirProtein sentezi sırasında bir tanıma özelliği olarak hizmet vermektedir 7-methylguanosine 5&#39;-trifosfat kapağı aracılığıyla ndent şekilde. Bu kapak eIF4E, eIF4G1 ve eIF4A ile eIF4F kompleksi bileşenine bağlanır. Poli (A) bağlayıcı protein (PABP) gibi diğer ortaklarla ilişkili elF2-GTP-Met-tRNA Met, bu çeviri başlatma faktörleri mRNA sirküler ve tanınması 1 kodon Ağustos başlatılması kadar formlara 43S kompleksi olan erişilebilirliği iyileştirmek için izin verir. Bu olay, translasyon başlatma yani, çeviri birinci etabının sonuna karşılık gelmektedir. Cap bağımsız için, örneğin hücre çoğalmasının ve apoptozun için neden stresli koşullar altında esas proteinler için kodlayan mRNA tarafından kullanılır. Bu mekanizma, mRNA ikincil yapısını içerir 5&#39;-çevrilmemiş bölümü (UTR) IRES adlandırılan eIF4A ve 43S kompleksi ile ilişkili eIF4G1 karboksi-terminal ucu. Bu 43S, ön başlatma c bağlanmasınınIRES için omplex eIF4E faktörü 2,3 gerek kalmadan kapak bağımsız çeviri başlatır. MRNA UTR 4 içinde yer alan yapıların CITE aracılığıyla Nihayet, yine iyi anlaşılmış değildir başka bir çeviri mekanizması vurguladı şartlar altında bu kap-bağımsız çeviri etkinliğini destekler. Kendi başlatma aşamalarının göre farklı tercüme bu çeşitli modları ile, çeviri, hücresel homeostazında kritik bir rol ve böylece büyük ölçekli etkileri küçük organizmaya etkisi olur, bu işlemlerin biri herhangi bir değişiklik oynar. Nitekim, başlatma proteinlere mRNA doğru çeviri süreçlerini yöneten bir oran sınırlayıcı bir adımdır ve bu nedenle çok sayıda kontrol ve düzenleme noktalarının 5 hedefidir. Ikincisi için ya da bu işlemlerin bileşenleri için olsun biri arızalı olduğu ortaya çıkarsa, bu hücrede kurulan dengeyi bozacak ve böylece patolojik Condi yol açabilirleri. Bu bağlamda, çeviri faktörlerinin mutasyonlar, potansiyel olarak, beyaz matter&#39; (eIF2B1-5 alt-birimi) 6, Walcott-Rallison sendromunda (Perk için EIF2AK3 kodlayan gen) 7, ufuk ile lökoensefalopati `gibi nörodejeneratif bozukluklar dahil olmak üzere çeşitli hastalıklarda yer almışlardır Parkinson hastalığı (eIF4G1 p.R1205H) 8. Bu hastalık gelişimi üzerine ve çeviri inisiyasyon genel sürecine bilgimizi artırmak için bu mutant proteinlerin hücresel ve moleküler çalışmalar yapmak için bu nedenle önemlidir. Bu çalışmaları yürütmek için, bu mutasyonların sonuçlarını gözlemlemek için en uygun modelleri seçmek için esastır Xenopus oositler, özellikle de onların fizyolojik ve biyokimyasal özellikleri nedeniyle uyarlanmış laevis. Fizyolojik eşzamanlılık (hücre döngüsünün faz G2 bloke) , protein sentezinin yüksek kapasiteli (200-400 ng / gün / oosit), ekstre solüsyonu ° yüksek sayıdaaynı hayvandan ytes (800-1.000 oosit / kadın) ve manipülasyonunu daha da kolaylaştırır hücre boyutu (çapı 1.2-1.4 mm). Sentezlenen mRNA ile Xenopus oosit Mikroenjeksiyon kolayca tercüme adımları incelemek için yapılabilir. Bu görüşe göre, diğer avantajlar sağlar. Mayoz ilerleme hızı ve çevirinin mRNA mikroenjeksiyon (~ 24 saat) sonra göz önüne alındığında, Xenopus oosit yeniden hücresel (E.coli çıkarılan, buğday mikroplar veya tavşan retikülosit ...) sistemleri bir mRNA olduğu karşılaştırıldığında hızlı bir sistemi temsil azaltılmış tercüme oranıyla ve düşük bir hızda çevrilmiştir. Yani, bir mRNA tanıtılan bir mutasyonun etkisi hızla gözlemlenebilir ve kolayca birkaç oositlerinde okudu olacaktır. Xenopus oositleri diğer bir avantajı, maternal mRNA&#39;lar latent ve protein için projesteron uyarması önce engellenmiş olmasıdır. Progesteron eklenmesi dolayısıyla çeviri indüksiyon kontrol için iyi bir araçtır. Sitoplazmik polyadenylation oogenez sırasında meydana gelmez. Bu zamansal sırayla progesteron uyarılmış oosit oosit olgunlaşması sırasında başlar ve erken gelişme boyunca devam eder ve çevirinin farklı adımları incelemek için kullanılabilir. Mos mRNA poliadenilasyon meydana ilk arasındadır ve Charlesworth ark tanımlanan &quot;erken olgunlaşma&quot; genlerin sınıfına Aurora A / EG2, Histone Benzeri B4 mRNA ile aittir. (2004) 9. Böyle Cyclin A1 ve B1 Siklin olarak &quot;geç&quot; mRNA öteleme indüksiyon germinal vezikül arıza (GVBD) zamanında etrafında oluşur. Mos mRNA, bir serin / treonin protein kinazın-kodlar. Dolaylı oosit olgunlaşmasını aktive MAP kinaz kaskad indükler beri çeviri önemlidir. Gerçekten de, progesteron tepki olarak, mos mRNA poliadenilasyon eg2 düzenleyici proteinleri ve inci başka RNA bağlanma proteinleri Aurora A / kapsayan bir işlem ile arttırılırmos mRNA&#39;nın e 3&#39;UTR içerir. Mos mRNA bu artan poliadenilasyon da MEK1 aktive mos proteini seviyesinin bir artışa yol açar. Bu işlem, hücre dışı bir sinyal ayarlı kinaz 2-(ERK2) (Şekil 1) ait aktivasyon aracılık eder. Bu sinyal yolunun daha sonra faktör teşvik olgunlaşma M-fazı, Siklin B, Cdc2 kinaz tarafından oluşturulan bir kompleks tetikler ve sonunda öz değişmesine ait yeniden başlamasını sonuçlanır olabilir. Xenopus oosit laevis nedenle, bu tür mos gibi anne mRNA çalışma kolayca birkaç mos, bileşenler sinyal de GVBD oranının belirlenmesi de dahil olmak üzere çeviri onların verimli poliadenilasyonu birkaç uç noktaları ile çevirilebilirlik test etmek için kullanılabilir. Bu sistem, yeni transkripsiyonu mRNA veya transfeksiyon verimlilik müdahalesi olmadan çeviri başlatma faktörleri mutasyonların ilk sonuçlarını değerlendirmek, bu nedenle ilginç sorunlar sıklıkla eukary ile meydana gelenotik hücre çalışmaları. Burada, bir protokol Xenopus oosit laevis ve anne mRNA çeviri test edilir mutant eIF4G1 mRNAlar microinjected nerede kurulmuştur. Oosit mayoz hücre döngüsü boyunca ve erken ve geç sınıf mRNA&#39;larının sonraki çeviri için ilerlemesi için gerekli olan bir GVBD ilerlemesinde defekt, mos mRNA polidenilasyondan huzurunda tespit edilmiştir. Fosforilasyonu Aurora A / EG2 ve ERK de mos deregulation.Thus sonucunu doğrulamak için çalışılmıştır, Xenopus oositler mRNA çeviri farklı adımlar analiz için basit bir yol gösterir.

<table><tbody><tr><td>Trikain metan sülfonat</td><td>Sandoz</td><td>MS-222</td><td>oosit taşıma</td></tr><tr><td>Forseps</td><td>Moria</td><td>Dumont MC40</td><td></td></tr><tr><td>Streptomisin / penisilin</td><td>Sigma</td><td>781</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum piruvat</td><td>Sigma</td><td>P2256</td><td></td></tr><tr><td>Soya fasulyesi tripsin inhibitörü</td><td>Sigma</td><td>T9128</td><td></td></tr><tr><td>Tetrasiklin</td><td>Sigma</td><td>T7660</td><td></td></tr><tr><td>Veteriner emilebilir Vicryl ipliği</td><td>Johnson & Johson Intl</td><td>JV1205</td><td></td></tr><tr><td>Kollajenaz A</td><td>Roche teşhisi</td><td>10103586001</td><td></td></tr><tr><td>PmeI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0560S</td><td>Sentetik mRNA</td></tr><tr><td>DNAse/RNAse içermeyen H2O</td><td>Life Technologies'in</td> hazırlanması <td>10977</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Asetat</td><td>Merck</td><td>6268</td><td></td></tr><tr><td>Mutlak etanol</td><td>Sigma</td><td>02854</td><td></td></tr><tr><td>Nano Damla</td><td>Termo Bilimsel</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TBE 10X</td><td>Eppendorf</td><td>0032006.507</td><td></td></tr><tr><td>Etidyum bromür 10 mg / ml</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>15585-011</td><td></td></tr><tr><td>mMESSAGE mMACHINE Kiti</td><td>Ambion by Life Technologies</td><td>AM1344</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Sigma</td><td>M1254</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fluka</td><td>03609</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Life Technologies</td><td>16500-500</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehit %37</td> <td>Merck</td><td>1.04003.1000</td><td></td></tr><tr><td>Formamid</td><td>Fluka</td><td>47671</td><td></td></tr><tr><td>Jel Doc Görüntüleyici</td><td>Biorad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oosit Pipeti, 100 8" Cam Kılcal Damarlı</td><td>Drummond Scientific Company</td><td>3-000-510-X</td><td>mikroenjeksiyon</td></tr><tr><td>Yedek Cam 8 "</td><td>Drummond Scientific Company</td><td>3-000-210-G8</td><td></td></tr><tr><td>0.45 & m filtre</td><td>Millipore</td><td>SLHA025NB</td><td></td></tr><tr><td>Progesteron</td><td>Sigma</td><td>P0130</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td>Batı Lekesi</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Biorad</td><td>161-0301</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>A3294</td><td></td></tr><tr><td>Sığır serum albümini</td><td>Sigma</td><td>A4612</td><td></td></tr><tr><td>leupeptin</td><td>Sigma</td><td>L8511</td><td></td></tr><tr><td>aprotinin</td><td>Sigma</td><td>A1153</td><td></td></tr><tr><td>benzamidin</td><td>Sigma</td><td>B6506</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma</td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td>sodyum vanadat</td><td>Sigma</td><td>S6508</td><td></td></tr><tr><td>Laemmli tamponu</td><td>Biorad</td><td>161-0737</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE Novex %4-12 Bis-Tris Protein Jelleri, 1.0 mm, 15 kuyulu</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>NP0323BOX</td><td></td></tr><tr><td>SDS-PAGE elektroforezi, mini-Protean TGX</td><td>Biorad</td><td>456-1036 ve -1096</td><td></td></tr><tr><td>yatay yarı kuru lekeleme sistemi</td><td>W.E.P. Compagny</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Biorad</td><td>161-0718</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Biorad</td><td>161-0719</td><td></td></tr><tr><td>Hybond ECL Membran</td><td>Amersham Yaşam Bilimleri</td><td>10401180</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>VWR</td><td>20846-292</td><td></td></tr><tr><td>Ponceau Kırmızı (%0,5)</td><td>Sigma</td><td>P3504</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P2287</td><td></td></tr><tr><td>anti-GFP</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>A11122</td><td></td></tr><tr><td>anti-V5</td><td>Santa Cruz Biyoteknoloji</td><td>sc-58052</td><td></td></tr><tr><td>anti-Eg2</td><td>Noel Baba Cruz Biyoteknoloji</td><td>sc-27884</td><td></td></tr><tr><td>anti-Eg2-P</td><td>Hücre Sinyalizasyonu</td><td>C39D8</td><td></td></tr><tr><td>anti-ERK2</td><td>Santa Cruz Biyoteknoloji</td><td>sc-1647</td><td></td></tr><tr><td>anti-ERK2-P (Tyr204)</td><td>Santa Cruz Biyoteknoloji</td><td>sc-7976</td><td></td></tr><tr><td>anti-RSK</td><td>Santa Cruz Biyoteknoloji</td><td>sc-231</td><td></td></tr><tr><td>anti-mos</td><td>Santa Cruz Biyoteknoloji</td><td>sc-86</td><td></td></tr><tr><td>anti-fare yaban turpu peroksidaz etiketli ikincil antikor</td><td>Santa Cruz Biyoteknoloji</td><td>SC-2005</td><td></td></tr><tr><td>anti-tavşan yaban turpu peroksidaz etiketli ikincil antikor</td><td>Santa Cruz Biyoteknoloji</td><td>sc-2812</td><td></td></tr><tr><td>anti-keçi yaban turpu peroksidaz etiketli ikincil antikor</td><td>Santa Cruz Biyoteknoloji</td><td>sc-2378</td><td></td></tr><tr><td>Gelişmiş ECL Tespit Sistemi</td><td>Amershan Yaşam Bilimleri</td><td>RPN2135</td><td></td></tr><tr><td>PBS 1x</td><td>Sigma</td><td>P4417</td><td>poliadenilasyon deneyi</td></tr><tr><td>TRIZOL (Qiazol Lizis Reaktifi)</td> <td>Qiagen</td><td>79306</td><td></td></tr><tr><td>Kloroform</td><td>Sigma</td><td>31998-8</td><td></td></tr><tr><td>İzopropanol</td><td>Sigma</td><td>278475-1L</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy mini kit</td><td>Qiagen</td><td>74106</td><td></td></tr><tr><td>RTL tamponu&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>79216</td><td></td></tr><tr><td>RNAse serbest DNAse seti</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>Primerler</td><td>Eurogentec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>T4 RNA ligaz 1&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>M0204S</td><td></td></tr><tr><td>Yüksek kapasiteli c-DNA Ters Transkripsiyon kiti</td><td>Uygulamalı Biyosistemler, Yaşam Teknolojileri</td><td>4368813</td><td></td></tr><tr><td>Taq polimeraz</td><td>Yaşam</td><td>Teknolojileri 10342020</td><td></td></tr></tbody></table>

ksenopus translation düşüklüğü belirlemek için bir model olarak laevis

Xenopus laevis as a Model to Identify Translation Impairment

Protein sentezi, çeşitli biyolojik süreçleri çevresel koşullara özellikle adaptasyon etkileyen gen ifadesi temel bir süreçtir. MRNA başlangıç ​​kodonu da dahil olmak üzere ilgili eIF4G1 başlatma faktörü ribozomal alt birimlerinin düzenlenmesine içeren başlangıç ​​aşaması. Çevirinin bu oran sınırlayıcı bir aşama kusurlar, çeşitli bozuklukları ile bağlantılıdır. Bu tür özerkleştirmeler olası sonuçlarını incelemek için, Xenopus oositler insanla temel hücresel ve moleküler mekanizmaları korunması yüksek derecede çekici bir model teşkil laevis. Buna ek olarak, mayoz olgunlaşma sırasında, oosit transkripsiyonel bastırılmış ve gerekli tüm proteinleri önceden var, maternal mRNA&#39;lardan çevrilir. Bu ucuz modeli etkin bir çeviri ile mükemmel entegre olmak için eksojen mRNA sağlar. Burada (eIF4G1 here) ilgi konusu bir faktör ile çeviri değerlendirmek stor kullanmak için bir protokol açıklananİlk olduklarını anne mRNA ed poliadenile ve fizyolojik okuma olarak oosit olgunlaşması sırasında tercüme edilecek. İlk başta, mRNA ilgi plazmidler (buradan eIF4G1) in vitro transkripsiyonu ile sentezlenmiş oluşum safhası torbacığı yarılmasının tespiti ile oosit ve oosit olgunlaşma kinetiği enjekte edilir belirlenir. Çalışılan anne mRNA hedef, serin / treonin protein kinaz mos olup. Bu poliadenilasyon ve daha sonraki için oosit olgunlaşmasında yer alan sinyalleme kaskadında mos proteinlerinin ekspresyonu ve fosforilasyon ile birlikte incelenmiştir. Geçerli protokol Varyasyonları ortaya koymak için öteleme kusurları da genel uygulanabilirliğini vurgulamak için önerilmiştir. Anormal protein sentezinin nörolojik bozuklukların patogenezinde olabilir dair kanıtlar ortaya ışığında, böyle bir model kolayca bu bozukluğunu değerlendirmek ve yeni hedefler belirlemek için bir fırsat sunuyor.

PG stimülasyon 24 saat (Şekil 2B, 2C) sonra, Xenopus oositlerde ve yüzde oosit GVBD belirlenmesi kinetik olgunlaşma EIF4G1-DN mutasyon translasyon sonuçlarını incelemek için, Xenopus PG&#39;ye yanıtı (2 H, O, GFP) eIF4G1-WT ve diğer kontrol koşulları mukayese edilir cRNA eIF4G1-DN microinjected oosit laevis. Kontroller bakılmaksızın enjekte cRNA veya eIF4G1 aşın doğanın oosit mikroenjeksiyon insidansını değerlendirmek için etkinleştirin....

Protein sentezi kontrolü esas olarak translasyon başlatma adımında gerçekleşir, eksiklikler çeşitli bozukluklarla bağlantılıdır. Etiyolojilerini daha iyi anlamak için, burada translasyon başlatma faktörü eIF4G1'in bir mutantının varlığında mos transkriptinin translasyonunu değerlendiren Xenopus laevis oositlerini kullanan bir protokol tanımladık.

Ksenopus Translation Düşüklüğü Belirlemek için Bir Model Olarak laevis

Protein synthesis is a fundamental process to gene expression impacting diverse biological processes notably adaptation to environmental conditions. The ...

Bu prosedürün genel amacı, yeni transkribe edilmiş mRNA'nın etkileşimi veya ökaryotik hücre çalışmalarında sıkça karşılaşılan transfeksiyon verimliliği sorunları olmaksızın, translasyon başlatma faktörlerindeki mutasyonların ilk sonuçlarını değerlendirmektir. Bu işlem, öncelikle ilgili plazmidlerden mutant vahşi tip ve kontrol veya GFP mRNA'larının sentezlenmesiyle gerçekleştirilir. Ardından, sentezlenen RNA, altıncı evredeki XUS Lavis sitlerine mikroenjeksiyonla aktarılır ve olgunlaşmaları progesteron ile stimüle edilir.Ardından, germinal vezikül yıkımının görselleştirilmesi ile sit olgunlaşması değerlendirilir ve aktivasyonu moss proteini ekspresyonuna bağlı olan MA kinaz kaskadının bazı bileşenleri western blot ile analiz edilir. Son olarak, moss ve XPO sitlerinin mayoz geri kazanımı için gerekli olan diğer mRNA'ların mRNA Poliadenilasyonu incelenir. Nihayetinde kinetik sit olgunlaşması belirlenir.Bir translasyon başlangıç faktörü mutasyona uğradığında, protein ekspresyonu üzerindeki potansiyel etkiyi göstermek için Western blot ve poliadenilasyon analizleri kullanılır. Bu tekniğin, mevcut yöntemlerimize veya germ hücrelerinden ya da tavşan retikülositlerinden elde edilen yeniden oluşturulmuş hücresel sistemlere göre temel avantajı, bir mRNA'ya yerleştirilen mutasyonun etkilerinin hızla gözlemlenebilmesi ve genel olarak çeşitli hücre tiplerinde kolayca çalışılabilmesidir.Bu modelin, tek dev hücreleri sayesinde basitlik avantajı vardır ve kullanımı, biyokimyasal deneyler için önemli miktarda materyal sağlar. Bu işlem, stabil hücre hattı oluşturmaya kıyasla zaman açısından da verimlidir. Bu yöntem, translasyon çalışmalarındaki temel soruların yanıtlanmasına, örneğin translasyon faktörlerinin belirli domainlerinin rolünün daha iyi anlaşılmasına veya bu faktörlerin eklenmesine (splicing) dair çalışmalar yapılmasına yardımcı olabilir.Bu yönteme dair fikri ilk olarak, transkripsiyonun müdahalesi olmadan, mutasyona uğramış bir translasyon başlama faktörünün protein sentezi üzerindeki etkisini incelemek istediğimizde geliştirdik. Bu sayede, bu iki omik mekanizma arasındaki potansiyel geri besleme döngülerinden kaçınmış oluyoruz. Nitekim, materyal transkriptler depolanır ve yerleştirilir.Transkripsiyon progesteron ile tetiklenebilir. Defekasyon sonrası, hücreleri yıkayıp metin protokolüne uygun olarak cRNA hazırlayın, 1,5% AROS jeli oluşturmak için 10 x mops ve %6,6 formaldehit kullanın. Örnekleri 0,2 ml'lik tüplerde %8,8 formaldehit, AMIDE için %60, 0,1 hacim 10 x mops ve bir mikrolitre cRNA ile hazırlayın; 70 °C'de üç dakika inkübe edin ve tüpleri 10 dakika boyunca buz üzerinde bekletin. İki mikrolitre jel yükleme tamponu eklemeden önce örnekleri 5.000 ×g'de birkaç saniye santrifüjleyin.Jeli boyamak için örnekleri 90 voltta 20 dakika boyunca çalıştırın. Jeli gece boyunca nükleaz içermeyen suda bekletin. Ardından CNA kalitesini kontrol etmek için analiz edin.CNA konsantrasyonunu belirlemek için bir spektrofotometre kullanın ve RNA mikroenjeksiyonunu gerçekleştirmek üzere örnekleri -80 °C'de saklayın. Defoliasyondan bir ila iki saat sonra, kazınmış bir Petri kabını doldurmak için ND 96 besiyeri kullanın. Sitleri kap içindeki kazınmış bir şerit boyunca düzenleyin.Ardından, ucu kırılmış ve 45 derecelik bir açıyla yerleştirilmiş bir kapiler mikropipet kullanın. Kapiler ucu, pigmentli hayvan bölgesinin altındaki ekvatoryal bölgeye yaklaşık 150 ila 200 mikron derinliğinde yerleştirin. İlk oositin içine 60 nanolitrede 30 nanogram CRNA enjekte edin.Numunenin dışarı sızmasını önlemek için kapiler ucu çıkarmadan önce beş ila 10 saniye bekleyin. Bir sonraki cyte'i enjekte etmek için kabı manuel olarak hareket ettirin. Enjekte edilen cyte'leri, üç mililitre ND 96 besiyeri ile doldurulmuş 24 kuyucuklu kültür plaklarına aktarın ve mitotik olgunlaşmayı tetiklemek için 19 °C'de bekletin.Oositleri, mililitrede iki mikrogram progesteron veya PG içeren ND 96 içerisinde 19 °C'de 15 saat boyunca inkübe edin. Yaban tip EIF 4G one CRNAs'ların mutant fenotip üzerindeki translasyon etkisini metin protokolüne göre test edin. Germinal vezikül yıkımının boyutunu bir stereo mikroskop altında belirleyin.Siyah hayvan kutbunda beyaz bir leke varlığına bakarak, PG stimülasyonu sonrası olgun sitlerin sayısını belirleyin. Western kan analizi yapmak için sayımı 24. saate kadar her saat başı tekrarlayın. Burada gösterilen tamponun 200 microliters içeriğindeki 10 siti homojenize etmek için dört degrees Celsius'ta bir mikro pipet ucunun ileri geri hareketlerini kullanın.Sitozomal fraksiyonu ortada toplamak için örnekleri 10,000 ×g'de 15 dakika boyunca santrifüjleyin. Üst fraksiyonu lipidler, alt fraksiyonu ise hücresel debris olarak tanımlayın. Sitozomal fraksiyonu toplayın ve protein konsantrasyonunu belirlemek için bir alikot saklayın.SDS page ve western blotting işlemlerinden önce, kalanları lamely veya Biss örnek tamponu ile bire bir oranda birleştirin. Metin protokolüne uygun olarak, bir poly ventilation analizi gerçekleştirmek için her koşul başına beş sitosite 1 ml nükleaz içermeyen 1X PBS ile 1,5 ml'lik mikrosantrifüj tüplerini yerleştirerek sitositleri yıkayın.Ardından, çeker ocak altında, RNA'yı izole etmek için üretici talimatlarına uygun bir RNA ekstraksiyon kiti kullanın. RNA bütünlüğünü kontrol edip konsantrasyonunu belirledikten sonra, her bir CRNA durumu için aşağıdaki reaktifleri kullanarak iki ligasyon karışımı hazırlayın; ilk karışıma pg ile stimüle edilmemiş sitlerden elde edilen RNA'yı, ikinci karışıma ise ilgili RNA'yı ekleyin.PG ile stimüle edilmiş oositlerden elde edilen RNA'yı ekleyin. Bir saat boyunca 37 °C'de, ardından 20 dakika boyunca 65 °C'de inkübe edin. Bir CD NA ters transkripsiyon kiti kullanarak enzimi inaktive edin.Her bir örnek için burada listelenen RT karışımını hazırlayın. Önceden hazırlanmış ligasyon reaksiyonundan 10 µL ekleyin ve üretici talimatlarına göre RT işlemini gerçekleştirin; PCR işlemini yaptıktan sonra, her bir reaksiyona dört µL yükleme tamponu kullanarak aşağıdaki reaksiyon karışımı ve koşullarını uygulayın ve her bir örneğin 10 µL'sini %3'lük agaroz jelde 110 V'da yürütün. Son olarak, polyA kuyruğunun uzunluğunu ve dolayısıyla translasyonları için ön koşul olan RNA olgunlaşmasını yansıtan boyut değişikliğini gözlemlemek için jeli 10 ve 20 dakika sonra analiz edin.Burada gösterildiği üzere, kontrol koşulları altında mikroenjeksiyon yapılan oositlerin kinetik olgunlaşması, PG stimülasyonundan sonraki 12. ve 24. saatlerde GVBD geçiren benzer sayılarla vahşi tipe benzerlik göstermektedir. Olgunluğa ulaşan oositlerin yüzdesi, vahşi tipin yanı sıra su ve GFP enjekte edilen kontroller için de benzerdir; bu durum, su veya kontrol veya EIF 4G one CRNA'larının mikroenjeksiyonunun oosit mayozuna çok az etkide bulunduğunu göstermektedir. Ancak, dominant negatif EIF 4G one ile yapılan mikroenjeksiyon, PG stimülasyonundan sonra bile GVBD'de dramatik bir azalmaya yol açmıştır. Bu şekil, vahşi tip ile dominant negatif EIF 4G one CRNA oranı arttıkça, olgunlaşma kusurunun vahşi tip CRNA ile geri döndürülebileceğini göstermektedir.Beklendiği gibi, matürasyona uğrayan sitlerin yüzdesi de öyle gerçekleşir. PG stimülasyonu yokluğunda endojen moss ekspresyonu tespit edilmemiştir ve EIF 4G bir dominant negatifin aşırı ekspresyonunun endojen moss üzerinde, önceki sonuçlarla uyumlu olarak, çok az etkisi vardır. Ayrıca, moss indüksiyonunun yukarısında yer alan Aurora AEEG iki'de, protein deregülasyonuna veya PG stimülasyonu sonrası indüklenen fosforile formuna dair herhangi bir kanıt görülmemektedir.Aksine, moss tarafından indüklenen irk two fosforilasyonu, dominant negatif EIF 4G one varlığında inhibe edilir. Uzmanlaşıldığında, bu teknik uygun şekilde uygulandığında beş günde tamamlanabilir. Bu prosedür uygulanırken, CNA miktarının 120 nanolitreyi geçmemesi ve konsantrasyonun belirli nanogramların altında tutulması gerektiği unutulmamalıdır.Hangi RNA'ların düşük veya yüksek düzeyde transle edildiğini belirlemek gibi ek soruları yanıtlamak amacıyla polizom profilleme analizi gibi yöntemler uygulanabilir.

xenopus-laevis-as-a-model-to-identify-translation-impairment

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Xenopus embriyonik epitel, epitel morfolojilerinden sırasında kutup geliştirme ve şekil değişikliği gibi hücre davranışlarını incelemek için ideal bir model sistem . Geleneksel sabit örnekleri histoloji giderek canlı hücre konfokal görüntüleme tarafından tamamlanmaktadır. Burada, kurbağa dokularda izole ve canlı hücre konfokal mikroskopi kullanılarak canlı epitel hücreleri ve hücre iskeletinin görselleştirmek için yöntemler göstermektedir.

Canlı hücre Görüntüleme ve Kantitatif Analiz Embriyonik Epitel Hücreleri Xenopus laevis</em

Burada, geliştirmek için sistematik bir yaklaşım sunmak fizyolojik, ilgili duyarlı ve...

Br.rerio kullanarak Morbid İnsan Genomu İn Vivo Modelleme

Üretimi<em&gt; Xenopus tropicalis</em&gt; Yumurta Mikrotubul ilişkili RNA&#39;lar tanımak ayıklar

Bu makalede, kesitleri üzerinde imüno-floresansı ile Xenopus embriyo, merkezi sinir sisteminde, farklı nöronal hücre popülasyonları görselleştirmek için uygun ve hızlı bir yöntem sunulur.

İlköğretim nöron değerlendirilmesi<em&gt; Xenopus</em&gt; Embriyolar kullanarak immün

Bu el yazması görselleştirmek ve hücre altı bölmeleri olaylarda yerelleştirilmiş çeviri ölçmek için bir yöntem açıklanır. Bu el yazması önerilen yaklaşım temel confocal görüntüleme sistemi ve Kimyasalları gerektirir ve hızlı ve düşük maliyetlidir.

Nicel ayirt ölçmek küresel çeviri lokalize

Xenopus kurbağa yavrularını içinde vivo sinir sisteminin işlevi araştırmak için benzersiz bir platform sunuyoruz. Biz metodolojileri yaşayan koku bilgi işleme değerlendirmek için tarif Xenopus larva normal yetiştirme koşullarında veya yaralanma sonra.

Fonksiyonel yaşam Xenopus kurbağa yavrularını koku yollar değerlendirilmesi

Bu yazıda, metod Mycobacterium, Mycobacterium smegmatis, kazanç-of-Function Reporter sistemleri kullanarak translasyonel hata ve güvenme belirli oranlarını ölçmek için iki tamamlayıcı yöntemler sunuyoruz. Daha yüksek verimlilik ayarında düşük verim veya göreli hata oranlarında doğru hata oranlarını ölçmek için yöntemler kullanılabilir.

Fonksiyon kazancı Reporter sistemleri ile spesifik Mikobakteriyel güvenirlik oranlarının ölçülmesi

Bu protokol, bir günlük Xenopus laevis embriyolarının göz tomurcuklarına bir DNA/DOTAP karışımının nasıl mikroenjekte edilebildiğini ve tek tek yeşil floresan proteinin (GFP) tek tek görüntülenme ve yeniden nasıl yeniden yapılandırılabildiğini göstermeyi amaçlamaktadır. bozulmamış, yaşayan Xenopus kurbağa yavruları.

Xenopus laevis Embriyolarında Göz tomurcuklarına DNA'nın mikroenjeksiyonu ve GFP'nin Sağlam Optik Aksonal Arbors'u İfade Etme Görüntülemesi, Yaşayan Xenopus Kurbağaları

Bu protokol, in vitro olgunlaşma sırasında tek oositlerde mRNA çevirisinin düzenlenmesini incelemek için bir muhabir testini açıklar.

Tek Bir Oocyte Reporter Tahlil Kullanarak In vitro Olgunlaşma Sırasında Maternal mRNA Çeviri Programını Tanımlama

Memeli beyninin gelişimi, gen ekspresyonunun çeviri düzeyinde uygun şekilde kontrolini gerektirir. Burada, gelişmekte olan beyindeki mRNA'ların çevirisel durumunu değerlendirmek için montajı kolay bir sakkaroz gradyan ve fraksiyonasyon platformuna sahip bir polisome profilleme sistemini tarif ediyoruz.

Polisome Profilleme Kullanarak Gelişen Fare Beyninde Çeviri Analizi

Burada, transkriptomik ve proteomik çalışmalar için Afrika pençeli kurbağalarından doku örnekleri hazırlamak için etkili bir hızlı kan perfüzyon protokolü sunulmaktadır.

Ksenopusta etkili hızlı kan perfüzyonu

Öğrenin translasyon başlatma faktörü mutasyonlarının etkilerini Xenopus laevis oositleri kullanarak değerlendirme yöntemini. Bu protokol protein sentezi bozukluklarının moleküler mekanizmalarını anlamak için güçlü bir model sunar.

Ksenopus Translation Düşüklüğü Belirlemek için Bir Model Olarak laevis

Daha fazla video keşfet