Name: Nikotin Kaynaklı Kalsiyum Sinyali ve ventral Hipokampal Aksonlar boyunca Nörotransmitter Release Canlı Görüntüleme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 19 s
Description: Öğrenin, ventral hipokampal-akumbens devresinde nikotin kaynaklı kalsiyum sinyali ve nörotransmitter salınımını canlı görüntüleme yöntemiyle incelemeyi. Bu teknik, sinaptik plastisite mekanizmalarını anlamak için değerli bilgiler sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Teknik destek için Yehui Qin ve Mallory Myers'a teşekkür ederiz. Ayrıca Dr. Sigismund Huck'a bize anti-α4-ECD antikorunu sağladığı için teşekkür ederiz. Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından L. W. R.'ye NS22061 desteklenmektedir.

Tüm hayvan deneyleri (2012 revize NIH Yayınları No. 80-23) Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanım Sağlık Rehberi National Institutes uyarınca yürütüldü ve çalışmalar Kurumsal Hayvan Bakım tarafından onaylanmış ve Stony Araştırma Komiteleri için kullanın edildi Brook Üniversitesi (# 1618 ve # 1792). 1. vHipp-NACC Sinaptik Co-kültürler <ol><li> Kurban fareleri (doğum sonrası gün 0 - vahşi tip (WT) ya da α7 nAChRs transgenik fare hattı 3) CO2 ile. Her yavru başını kesmek ve post facto genotipleme için 1,5 ml santrifüj tüpüne kuyruk kaydedin. Steril kaputu aşağıdaki adımları uygulayın. </li><li> Tüm beyin ortaya çıkarmak için makas ve forseps ile kafatası üst çıkarın. Birbirini kaudalde serebral korteks bölümü, bir mikroskop altında vHipp 5,21 olmak üzere arka korteks içeren bir koronal bölümü elde noktada başlatılıyor. </li><li> V teşrihGelişmekte olan bir fare beyin atlası 22 (Şekil 1A) göre CA1-subiculum bölgesini dışarı içeren Hipp doku şeritleri. Soğuk kültür ortamı (4 ° C) içeren 35 mm kültür çanak transfer, küçük ince dilim (um 100 civarında × 100 mikron microslices) oyulmuş. </li><li> 37 ° C&#39;de inkübatör içinde en az 30 dakika boyunca kültür ortamı (~ 500 ul) ile 24 oyuklu doku kültürü plakaları içindeki 12 mm poli-D-lisin / laminin ile kaplanmış cam lamelleri önceden inkübe edin. Microslices kaplama önce ortamı çıkarın. </li><li> (Microslices arasında ~ 20 parçalarını içeren ~ 50 ul) ortam az miktarda lamel merkezi bir ateş cilalı Pastör pipeti ile Plaka eksplant bağlanmasını kolaylaştırmak için. Tek bir hayvandan kaynaklanan Plaka vHipp microslices (ya + / + veya - / - transgenik α7 hattının genotip) her lamel. </li><li> Eksplantlar lamel üzerine yerleşmek sonra, yavaşça th ek medya (~ 100 ul) ekleyinE duvar böylece medyanın düzeyi değil, bu lamel merkezinde, tamamen çevre üzerinde eksplantlar karşılamak için yeterince yüksek. </li><li> 37 ° C de bir O / N inkübasyondan sonra,% 5 CO2 kuluçka makinesi, doğum sonrası gün 1 ila farelerde embriyonik gün 18&#39;den NACC nöronlar dağılması ve eksplantlar ekleyin. <ol><li> Gelişmekte olan bir fare beyin atlas 20 (Şekil 1B) göre NACC dokuları dışarı parçalara ayır. </li><li> 15 ml tüp ve transfer (500 500 mikron microslices × um civarında) küçük parçalar halinde kesin. </li><li> 37 ° C&#39;de 15 dakika boyunca% 0.25 tripsin (2 mi) ile tedavi edin. Yıkama doku parçaları soğuk yıkama ortamı ile üç kez (5 mi, 4 ° C) soğuk bir kültür ortamı içinde bir yıkama, ardından (5 mi, 4 ° C). Süspansiyon her yıkama aşamasında 5 dakika dinlenmeye ve sonra dikkatlice süpernatant dökmek için izin verin. </li><li> Hafif ateş cilalı Pastör pipeti ile kültür ortamı 2 ml dikkatlice toz haline getirilerek hücreleri ayırmak. </li><li> Trans5 dakika boyunca 2,000 x rpm&#39;de bir 15 ml tüp ve santrifüj ferin hücre süspansiyonu. Süpernatantı ve 6 yavrular başına 1 ml kültür ortamı hücreleri tekrar süspansiyon. Yumuşak bir ateş cilalı Pastör pipeti ile ortam birkaç kez pipetleme hücreleri dağıtılır. </li><li> VHipp eksplant ile her bir lamel dağılmış NACC hücrelerinin 0.25 ml ilave edilir. </li><li> Nemlendirilmiş bir 37 ° C kültürleri bakımı,% 5 CO2 kuluçka. Mekanik sinaps oluşumunu kolaylaştıran, stabilize ve nemi muhafaza etmek nemlendirilmiş steril gazlı bez üzerine kültür tabak yerleştirin. </li></ol></li></ol> 2. İmmünositokimya <ol><li> Kültürleri saptamak -% 4 paraformaldehid /% 4 sukroz (5 in vitro 7 gün) / PBS (~ lamel 500 ul, 20 dakika, RT). </li><li> % 0.25 Triton X-100 / PBS ile Permeabilize kültürler (~ lamel 500 ul, 5 dakika, RT). </li><li> PBS içinde% 10 normal eşek serumu ile blok kültürleri (~ lamel 500 ul, 30 dakika, RT) Antibod öncesindeY boyama. 4 ° C &#39;de O / N primer antikorlar ile inkübe edin. Anti-veziküler glutamat taşıyıcı 1 (1: 250), anti-GAD65 (1: 100):;: Anti-nAChRs (anti-α 5 alt birimleri, 1 500 500 α 4 -ECD 1:) Aşağıdaki primer antikorlar kullanın. </li><li> (Lamel haftada 3 kez / ~ 500 ul, 5 dakika) PBS ile primer antikor yıkayın ve daha sonra (~ lamel 500 ul, 1: 500), Alexa 488 konjüge edilmiş sekonder antikor kültürleri inkübe ya lamel ortalama Alexa 594 (~ 500 ul , 1: 37 ° C&#39;de 1 saat süre ile 500). </li><li> Önceden etiketlenmesi yüzeyi α7 * nAChR&#39;lerin için tespit için 37 ° C&#39;de 45 dakika boyunca (kültür ortamı 1000 ~ lamel 500 ul, 1) Alexa 594 konjüge αBgTx kültürleri inkübe edin. </li><li> Dağı ve mühür lamelleri. </li><li> Plan-Apochromat hedefleri (0.8 NA veya 1.4 NA ile 63X yağ ile 20X) ile donatılmış bir floresan mikroskop ve CCD kamera ile görüntüleri yakalayın. </li></ol> 3. FM1-43 Tabanlı Veziküler Fusion <ol><li> Bir görüntüleme odasında - (in vitro 7 gün 5) Disk konfokal mikroskop iplik üzerine odasına monte kültürleri korumak. Sürekli oda sıcaklığında HBS kokteyli ile (1 mi / dak) perfüze. </li><li> 90 sn için 56 mM K + ACSF (~ 500 ul) (boyama) içinde 10 uM FM1-43 perfüzyon ve yük kültürleri dur, Ca2 + ADVASEP-7 (0.1 mM) ihtiva eden serbest HBS ile birlikte 15 dakika boyunca uzaklıkta dış boyayı zara bağlı FM1-43 temizlemek için. </li><li> 120 saniye FM1-43 olmadan 56 mM K + ACSF (~ 500 ul) (destaining) ile kültürleri teşvik aynı koşullar kullanılarak FM1-43 ile kültürleri yeniden ve Ca ile tekrar içeren 2+ ücretsiz HBS yıkama ADVASEP-7 için 15 dk. </li><li> CCD kamera ile Plan-Apochromat objektif (1.4 NA ile 60X su, uyarma 488 nm, emisyon 530 nm) ve yakalama görüntüleri ile donatılmış iplik diski konfokal mikroskop ile FM1-43 floresan görüntüler elde. </li><li> 1 dakika boyunca bazal FM1-43 floresan görüntüleri (her 2 sn toplayın) Önceden nikotin kontrol olarak; 1 dakika boyunca hızlı bir perfüzyon (2 ml / dakika) ile nikotin (1 uM) uygulanır, ve daha sonra HBS kokteyli ile nikotin yıkayın. 5 dakika boyunca her 2 saniyede sırasında ve nikotin uygulamadan sonra, daha önce yakalama time-lapse görüntüleri tutun. </li><li> Önce FM1-43 floresan (F boyama) ve sonrası (F destaining) her sinaptik bouton de nikotin uygulamasını ölçmek. </li><li> Öncesi ve nikotin uygulaması (mesafe kadar taşınmış = F boyama -F destaining) sonra FM1-43 floresan yoğunluğu farkını miktarının tarafından vHipp akson boyunca salınabilir FM1-43 floresan toplam miktarını hesaplayın. Aşağıdaki denklemle nikotin sonra floresan yoğunluğu azalma kısmını analiz: F azalma% = mesafe kadar taşınmış / F boyama. </li></ol> 4. Kalsiyum Görüntüleme <ol><li> Daha sonra (5 mcM Fluo-4 Ca 2 + göstergesi ile kültürleri yük normal HBS hızla - (in vitro 7 gün 5) kültürleri durulayınAM ester) ve 37 ° C de 30 dakika karıştırıldı ve% 5 CO2 boyunca HBS&#39;de% 0.02 Pluronic F-127 (2 mi) eklendi. </li><li> (3 kez / 5 dk) HBS ile Flu-4 çözüm yıkayın. (37 ° C /% 5 CO2), en azından 30 dakika boyunca kuluçka kültürler dönün. </li><li> Aynı görüntüleme odası ve FM1-43 göre veziküler füzyon bölümünde tarif edildiği gibi aynı şartlarda kültürleri muhafaza (adım 3.1). </li><li> Bir Plan-Apochromat objektif (1.4 NA ile 60X su, uyarma 488 nm, emisyon 530 nm) ve bir CCD kamera ile vHipp mikro dilim aksonal projeksiyonlar Fluo-4 floresan görüntüleri toplayın. </li><li> 1 dakika boyunca hızlı bir perfüzyon (2 ml / dakika) ile nikotin (1 uM) uygulanır, ön-nikotin kontrol olarak temel Fluo-4 floresans görüntüleri (2 dakika süre ile, her 10 saniye) toplamak, ve daha sonra HBS kokteyli ile nikotin yıkayın. 30 dakika boyunca her 10 saniyede sırasında ve nikotin uygulamadan sonra, daha önce yakalama time-lapse görüntüleri tutun. </li><li> Bir dizi olarak ham fluo-4 floresan görüntüler, ihracat tüm kareleri kaydetDaha fazla analiz için TIFF formatında görüntüler. </li><li> Önce vHipp akson boyunca ve nikotin uygulamadan sonra fluo-4 floresan entegre yoğunluğu toplayın. </li><li> Aşağıdaki denklem ile entegre bir floresan Normalize: kadar taşınmış / F = 0 (FF 0) / F 0 artalan-düzeltilmiş önceden nikotin entegre floresans şiddetidir ve F&#39;den her biri bir zaman noktasında vHipp akson boyunca entegre floresan yoğunluğu F 0, Nikotin uygulaması sonrası. Analiz ve normalize entegre floresan arsa. </li></ol>

<ol><li>Changeux, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+nicotinic+receptors%3A+structure+and+regulation%2C+role+in+learning+and+reinforcement%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Brain+Res+Rev%22%5BJournal%5D)">Brain nicotinic receptors: structure and regulation, role in learning and reinforcement.</a> Brain Res Brain Res Rev. 26 (2-3), 198-216 (1998).</li>
<li>Levin, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nicotinic+receptor+subtypes+and+cognitive+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Nicotinic receptor subtypes and cognitive function.</a> J Neurobiol. 53 (4), 633-640 (2002).</li>
<li>Dani, J. A., Bertrand, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nicotinic+acetylcholine+receptors+and+nicotinic+cholinergic+mechanisms+of+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Pharmacol+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Nicotinic acetylcholine receptors and nicotinic cholinergic mechanisms of the central nervous system.</a> Annu Rev Pharmacol Toxicol. 47, 699-729 (2007).</li>
<li>Mineur, Y. S., Picciotto, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nicotine+receptors+and+depression%3A+revisiting+and+revising+the+cholinergic+hypothesis%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Pharmacol+Sci%22%5BJournal%5D)">Nicotine receptors and depression: revisiting and revising the cholinergic hypothesis.</a> Trends Pharmacol Sci. 31 (12), 580-586 (2010).</li>
<li>Zhong, C., Talmage, D. A., Role, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nicotine+elicits+prolonged+calcium+signaling+along+ventral+hippocampal+axons%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Nicotine elicits prolonged calcium signaling along ventral hippocampal axons.</a> PloS one. 8 (12), e82719(2013).</li>
<li>McGehee, D. S., Heath, M. J., Gelber, S., Devay, P., Role, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nicotine+enhancement+of+fast+excitatory+synaptic+transmission+in+CNS+by+presynaptic+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Nicotine enhancement of fast excitatory synaptic transmission in CNS by presynaptic receptors.</a> Science. 269 (5231), 1692-1696 (1995).</li>
<li>Gray, R., Rajan, A. S., Radcliffe, K. A., Yakehiro, M., Dani, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hippocampal+synaptic+transmission+enhanced+by+low+concentrations+of+nicotine%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Hippocampal synaptic transmission enhanced by low concentrations of nicotine.</a> Nature. 383 (6602), 713-716 (1996).</li>
<li>Dickinson, J. A., Kew, J. N., Wonnacott, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+alpha+7-+and+beta+2-containing+nicotinic+acetylcholine+receptors+modulate+excitatory+amino+acid+release+from+rat+prefrontal+cortex+nerve+terminals+via+distinct+cellular+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Presynaptic alpha 7- and beta 2-containing nicotinic acetylcholine receptors modulate excitatory amino acid release from rat prefrontal cortex nerve terminals via distinct cellular mechanisms.</a> Mol Pharmacol. 74 (2), 348-359 (2008).</li>
<li>Zappettini, S., Grilli, M., Salamone, A., Fedele, E., Marchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-synaptic+nicotinic+receptors+evoke+endogenous+glutamate+and+aspartate+release+from+hippocampal+synaptosomes+by+way+of+distinct+coupling+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Pre-synaptic nicotinic receptors evoke endogenous glutamate and aspartate release from hippocampal synaptosomes by way of distinct coupling mechanisms.</a> Br J Pharmacol. 161 (5), 1161-1171 (2010).</li>
<li>Zappettini, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+nicotinic+alpha7+and+non-alpha7+receptors+stimulate+endogenous+GABA+release+from+rat+hippocampal+synaptosomes+through+two+mechanisms+of+action%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Presynaptic nicotinic alpha7 and non-alpha7 receptors stimulate endogenous GABA release from rat hippocampal synaptosomes through two mechanisms of action.</a> PloS one. 6 (2), e16911(2011).</li>
<li>Fabian-Fine, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructural+distribution+of+the+alpha7+nicotinic+acetylcholine+receptor+subunit+in+rat+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Ultrastructural distribution of the alpha7 nicotinic acetylcholine receptor subunit in rat hippocampus.</a> J Neurosci. 21 (20), 7993-8003 (2001).</li>
<li>Jones, I. W., Barik, J., O'Neill, M. J., Wonnacott, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpha+bungarotoxin-1.4+nm+gold%3A+a+novel+conjugate+for+visualising+the+precise+subcellular+distribution+of+alpha+7%2A+nicotinic+acetylcholine+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Alpha bungarotoxin-1.4 nm gold: a novel conjugate for visualising the precise subcellular distribution of alpha 7* nicotinic acetylcholine receptors.</a> J Neurosci Methods. 134 (1), 65-74 (2004).</li>
<li>Nashmi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+alpha4beta2+nicotinic+acetylcholine+receptors+assessed+with+functional+fluorescently+labeled+subunits%3A+effects+of+localization%2C+trafficking%2C+and+nicotine-induced+upregulation+in+clonal+mammalian+cells+and+in+cultured+midbrain+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Assembly of alpha4beta2 nicotinic acetylcholine receptors assessed with functional fluorescently labeled subunits: effects of localization, trafficking, and nicotine-induced upregulation in clonal mammalian cells and in cultured midbrain neurons.</a> J Neurosci. 23 (37), 11554-11567 (2003).</li>
<li>Drenan, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+trafficking%2C+pentameric+assembly%2C+and+subunit+stoichiometry+of+neuronal+nicotinic+acetylcholine+receptors+containing+fluorescently+labeled+alpha6+and+beta3+subunits%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Subcellular trafficking, pentameric assembly, and subunit stoichiometry of neuronal nicotinic acetylcholine receptors containing fluorescently labeled alpha6 and beta3 subunits.</a> Mol Pharmacol. 73 (1), 27-41 (2008).</li>
<li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological%2C+pharmacological%2C+and+molecular+evidence+for+alpha7-nicotinic+acetylcholine+receptors+in+rat+midbrain+dopamine+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharmacol+Exp+Ther%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological, pharmacological, and molecular evidence for alpha7-nicotinic acetylcholine receptors in rat midbrain dopamine neurons.</a> J Pharmacol Exp Ther. 311 (1), 80-91 (2004).</li>
<li>Parikh, V., Ji, J., Decker, M. W., Sarter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prefrontal+beta2+subunit-containing+and+alpha7+nicotinic+acetylcholine+receptors+differentially+control+glutamatergic+and+cholinergic+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Prefrontal beta2 subunit-containing and alpha7 nicotinic acetylcholine receptors differentially control glutamatergic and cholinergic signaling.</a> J Neurosci. 30 (9), 3518-3530 (2010).</li>
<li>Nayak, S. V., Dougherty, J. J., McIntosh, J. M., Nichols, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca%282%2B%29+changes+induced+by+different+presynaptic+nicotinic+receptors+in+separate+populations+of+individual+striatal+nerve+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Ca(2+) changes induced by different presynaptic nicotinic receptors in separate populations of individual striatal nerve terminals.</a> J Neurochem. 76 (6), 1860-1870 (2001).</li>
<li>Richards, C. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trafficking+of+alpha4%2A+nicotinic+receptors+revealed+by+superecliptic+phluorin%3A+effects+of+a+beta4+amyotrophic+lateral+sclerosis-associated+mutation+and+chronic+exposure+to+nicotine%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Trafficking of alpha4* nicotinic receptors revealed by superecliptic phluorin: effects of a beta4 amyotrophic lateral sclerosis-associated mutation and chronic exposure to nicotine.</a> J Biol Chem. 286 (36), 31241-31249 (2011).</li>
<li>Colombo, S. F., Mazzo, F., Pistillo, F., Gotti, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biogenesis%2C+trafficking+and+up-regulation+of+nicotinic+ACh+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Biogenesis, trafficking and up-regulation of nicotinic ACh receptors.</a> Biochem Pharmacol. 86 (8), 1063-1073 (2013).</li>
<li>St John, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+trafficking+of+nicotinic+acetylcholine+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Pharmacol+Sin%22%5BJournal%5D)">Cellular trafficking of nicotinic acetylcholine receptors.</a> Acta Pharmacol Sin. 30 (6), 656-662 (2009).</li>
<li>Zhong, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+type+III+neuregulin+1+is+required+for+sustained+enhancement+of+hippocampal+transmission+by+nicotine+and+for+axonal+targeting+of+alpha7+nicotinic+acetylcholine+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Presynaptic type III neuregulin 1 is required for sustained enhancement of hippocampal transmission by nicotine and for axonal targeting of alpha7 nicotinic acetylcholine receptors.</a> J Neurosci. 28 (37), 9111-9116 (2008).</li>
<li>Jacobowitz, D. M., Abbott, L. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJacobowitz%2C+DM+%22Chemoarchitectonic+Atlas+of+the+Developing+Mouse+Brain%22">Chemoarchitectonic Atlas of the Developing Mouse Brain</a>. , CRC Press. New York. (1998).</li>
<li>Betz, W. J., Mao, F., Bewick, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-dependent+fluorescent+staining+and+destaining+of+living+vertebrate+motor+nerve+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Activity-dependent fluorescent staining and destaining of living vertebrate motor nerve terminals.</a> J Neurosci. 12 (2), 363-375 (1992).</li>
<li>Amaral, E., Guatimosim, S., Guatimosim, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+the+fluorescent+styryl+dye+FM1-43+to+visualize+synaptic+vesicles+exocytosis+and+endocytosis+in+motor+nerve+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Using the fluorescent styryl dye FM1-43 to visualize synaptic vesicles exocytosis and endocytosis in motor nerve terminals.</a> Methods Mol Biol. 689, 137-148 (2011).</li>
<li>Garduno, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+alpha4beta2+nicotinic+acetylcholine+receptors+increase+glutamate+release+and+serotonin+neuron+excitability+in+the+dorsal+raphe+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Presynaptic alpha4beta2 nicotinic acetylcholine receptors increase glutamate release and serotonin neuron excitability in the dorsal raphe nucleus.</a> J Neurosci. 32 (43), 15148-15157 (2012).</li>
<li>Guo, J. Z., Liu, Y., Sorenson, E. M., Chiappinelli, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptically+released+and+exogenous+ACh+activates+different+nicotinic+receptors+to+enhance+evoked+glutamatergic+transmission+in+the+lateral+geniculate+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Synaptically released and exogenous ACh activates different nicotinic receptors to enhance evoked glutamatergic transmission in the lateral geniculate nucleus.</a> J Neurophysiol. 94 (4), 2549-2560 (2005).</li>
<li>Szabo, S. I., Zelles, T., Vizi, E. S., Lendvai, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+nicotine+on+spiking+activity+and+Ca2%2B+dynamics+of+dendritic+spines+in+rat+CA1+pyramidal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Hippocampus%22%5BJournal%5D)">The effect of nicotine on spiking activity and Ca2+ dynamics of dendritic spines in rat CA1 pyramidal neurons.</a> Hippocampus. 18 (4), 376-385 (2008).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

ko-kültür hazırlanması açıklanan yeniden taahhüt eder in vitro ventral hipokampal-accumbens devreleri. pre-sinaptik nAChR&#39;lerin aktivasyon glutamaterjik iletimi 5, 21 gelişmiş ortaya çıkaran hangi mekansal ve zamansal profillerin Bu preparat izin oldukça basit ve güvenilir bir sınav. Co-kültürlerinde in vivo benzeri işlev göstermek için, in vitro olarak fizyolojik koşulları sağlayan bir çanak içinde farklı spesifik hücre tiplerinin büyümesi ...

Devre uyarılabilirliğinin Kolinerjik modülasyon biliş temel yönlerine katkıda bulunur ve değişmiş kolinerjik modülasyonu Alzheimer hastalığı, Parkinson hastalığı, şizofreni ve bağımlılık 1-4 olmak üzere nörodejeneratif ve nöropsikiyatrik bozuklukların bir özelliğidir. CNS&#39;de sinaptik iletim kolinerjik kolaylaştırılması kurulan bir mekanizma, ön-sinaptik olarak lokalize nAChR&#39;lerin doğrudan aktivasyonu yoluyla olmaktadır. Dolaylı olarak bazı nAChR alt tipleri ve nispeten yüksek kalsiyum iletkenlik hem doğrudan, bağlı ile hücre içi sinyal iletim - bu pre-sinaptik reseptörlerinin aktivasyonu, hücre içi Ca + 2 ([Ca2 +] i) ön-sinaptik terminallerindeki sebep olur 5, bu şekilde nörotransmitter salgılanmasını zenginleştirmek. Aslında, pre-sinaptik nAChR&#39;lerin aktivasyonu da dahil olmak üzere, glutamat nörotransmitterlerin çok çeşitli GABA, ACh, serbest değişikliklerle bağlantılı olan birnd dopamin 6-10. Bu işlem, dolaylı, çeşitli sinapslarda elektrofizyolojik yöntemler kullanılarak incelenmiştir, ancak optik habercilerin [Ca2 +] i ve sinaptik vezikül dönüştürme pre-sinaptik olayların daha doğrudan ve zamansal olarak hassas ölçümü sağlar. NAChR&#39;lerin pre-sinaptik lokalizasyon elektron mikroskobik (EM) düzeyinde 11,12 olarak nAChR&#39;lerin doğrudan bağışıklık altın etiketleme ile ikna edici kanıtlanmıştır. Birkaç diğer teknikler de kültürlü nöronlar 13,14 nAChRs subunit- floresan protein kimeralar yerleri tespit da dahil olmak üzere, dolaylı nAChR yerelleştirme hitap için kullanılır olmuştur, sinaptik terminallerde 15,16 yılında nAChR akımların elektrofizyolojik kayıt, [içinde Ca nikotin kaynaklı değişiklikleri izleme sinaptik terminalinde canlı hücre görüntüleme 17 ve nörotransmitter salınımı dolaylı izlenmesi sinaptik sinir terminallerinde 2 +] istiril amfipatik FM boyalar (FM1-43 ve FM4-64) ve / veya synapto-pHluorin ve bu tür glutamat ACH ve iGluSnFr için CNiFERs gibi özel flüoresan nörotransmiter muhabir, tarafından izlendi sinaptik veziküllerin ekzositozu de dahil olmak üzere, floresan göstergesi olan canlı hücre görüntüleme teknikleri 18-20. Genel olarak, nAChR&#39;lerin pre-sinaptik localisation belirlenmesi için, bu mevcut yaklaşımlar karmaşıktır ve güvenilir bir kimlik ve pre-sinaptik aktivitenin fizyolojik izleme sağlamak için özel bir sistem ve teknikler gerektirir. Belirlemek ve sinaptik iletim öncesi ve post-sinaptik bileşenleri hem de analiz doğrudan erişim sağlayan nükleus akumbens (NACC) devre - Burada bir ventral hipokampal (vHipp) in vitro ko-kültür sistemi protokolleri ve ekipmanlar açıklar. Biz pre-sinaptik nAChR&#39;lerin lokalizasyonu ve Ca 2 + sinyalizasyon ve nörotransmitter bırakma alo aracılı nAChR&#39;nin canlı hücre görüntüleme örneklerini göstermektedirng vHipp aksonlar. Burada sunulan protokol doğal (ve basit) uzantısı farklı genotipleri gelen nöronların oluşan öncesi ve post-sinaptik temasların hazırlanmasıdır. Bu şekilde, modülasyon öncesi ve / veya post-sinaptik mekanizma belirli bir gen ürününün katkı, doğrudan tespit edilebilir.

<table><tbody><tr><td colspan="4">1. Kültür Besiyeri (50 ml)</td></tr><tr><td>Nörobazal&nbsp;</td><td>GIBCO</td><td>10888022</td><td>48 ml</td></tr><tr><td>B-27 Takviyeleri</td><td>GIBCO</td><td>0080085-SA</td><td>1 ml</td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin</td><td>GIBCO</td><td>10908-010</td><td>0.5 ml</td></tr><tr><td>GlutaMAX Takviyesi</td><td>GIBCO</td><td>35050-061</td><td>0.5 ml</td></tr><tr><td>Beyin kaynaklı nörotrofik faktör (BDNF)</td><td>GIBCO</td><td>15140-122</td><td>20 ng/ml</td></tr><tr><td colspan="4">2. yıkama ortamı (HBSS, 100 ml)</td></tr><tr><td>HBSS, kalsiyum yok, magnezyum yok, fenol yok kırmızı&nbsp;</td><td>GIBCO</td><td>14175-095</td><td>99 ml</td></tr><tr><td>HEPES ( 1M)</td><td>GIBCO</td><td>15630-130</td><td>1 ml</td></tr><tr><td colspan="4">3. HEPES tamponlu tuzlu su&nbsp; (HBS)&nbsp; &nbsp; pH=7.3</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9888&nbsp;</td><td>135 milyon</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9333&nbsp;</td><td>5 milyon</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M8266&nbsp;</td><td>1 milyon</td></tr><tr><td>CaCl2,</td> <td>Sigma</td><td>C1016 ve nbsp;</td><td>2 milyon</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375&nbsp;</td><td>10 milyon</td></tr><tr><td>Glukoz</td><td>Sigma</td><td>G0350500&nbsp;</td><td>10 milyon</td></tr><tr><td colspan="4">4. Canlı görüntüleme için HBS Kokteyli pH=7.3</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9888&nbsp;</td><td>135 milyon</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9333&nbsp;</td><td>5 milyon</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M8266&nbsp;</td><td>1 milyon</td></tr><tr><td>CaCl2,</td> <td>Sigma</td><td>C1016 ve nbsp;</td><td>2 milyon</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375&nbsp;</td><td>10 milyon</td></tr><tr><td>Glukoz</td><td>Sigma</td><td>G0350500&nbsp;</td><td>10 milyon</td></tr><tr><td>Tetrodotoksin&nbsp;</td><td>Tocris</td><td>1078</td><td>2 & mikro; M</td></tr><tr><td>bicuculline</td><td>Tocris</td><td>131</td><td>10 & mikro; M</td></tr><tr><td>D-AP-5</td><td>Tocris</td><td>105</td><td>50 & M</td></tr><tr><td>CNQX</td><td>Tocris</td><td>1045</td><td>20 ve mikro; M</td></tr><tr><td></td><td>LY341495 Tocris</td><td>1209</td><td>10 & mikro; M</td></tr><tr><td colspan="4">5. Kalsiyum içermez&nbsp; HBS&nbsp; &nbsp; pH=7.3</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9888&nbsp;</td><td>135 milyon</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9333&nbsp;</td><td>5 milyon</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M8266&nbsp;</td><td>1 milyon</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375&nbsp;</td><td>10 milyon</td></tr><tr><td>Glukoz</td><td>Sigma</td><td>G0350500&nbsp;</td><td>10 milyon</td></tr><tr><td colspan="4">6. 56 mM Potasyum ACSF pH=7.4</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td>119 mM</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9333</td><td>56 mM</td></tr><tr><td>MgSO4.7H</td><td>Sigma</td><td>M1880</td><td>1.3 mM</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C1016</td><td>2.5 mM</td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma</td><td>S8282</td><td>1 mM</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td>26.2 mM</td></tr><tr><td>Glikoz</td><td>Sigma</td><td>G0350500&nbsp;</td><td>10 milyon</td></tr></tbody></table>

nikotin kaynaklı kalsiyum sinyali ve ventral hipokampal aksonlar boyunca nörotransmitter release canlı görüntüleme

Live Imaging of Nicotine Induced Calcium Signaling and Neurotransmitter Release Along Ventral Hippocampal Axons

Pre-sinaptik nikotinik asetilkolin reseptörlerinin (nAChR'ler) aktivasyonu ile aksonal sinyallemenin sürekli artması ve nörotransmitter salınımının artması, asetilkolin (ACh) tarafından nöromodülasyon için önemli bir mekanizmadır. Hem in vitro hem de in vivo olarak sağlam aksonlar ve sinir terminallerindeki sinyal mekanizmalarının araştırılmasına erişimdeki zorluk, sinaptik plastisitenin pre-sinaptik bileşenlerinin çalışmasında sınırlı ilerlemeye sahiptir. Burada, pre- ve post-sinaptik nöronların genetik profilini seçici olarak değiştirirken, iletimin hem pre- hem de post-sinaptik bileşenlerini analiz etmek için doğrudan canlı görüntülemeye izin veren in vitro ventral hipokampal (vHipp)-accumbens (nAcc) devresinin gen-kimerik bir preparatını tanıtıyoruz. Pre-sinaptik aksonal girdi olarak vHipp mikro dilimlerinden gelen projeksiyonların, nAcc'den dağılmış nöronlar olan post-sinaptik hedeflerle çoklu, güvenilir glutamaterjik sinapslar oluşturduğunu gösteriyoruz. nAChR'lerin çeşitli alt tiplerinin pre-sinaptik lokalizasyonu tespit edilir ve pre-sinaptik nikotinik sinyalleme aracılı sinaptik iletim, eşzamanlı elektrofizyolojik kayıt ve canlı hücre görüntüleme ile izlenir. Bu hazırlık aynı zamanda in vitro glutamaterjik sinaptik plastisitenin sinaptik öncesi ve sonrası mekanizmalarını incelemek için bilgilendirici bir yaklaşım sağlar.

kullanılan preparat, in vitro olarak vHipp-NACC devreler gen, kimerik ko-kültürler oluşur. VHipp microslices kaynaklanan Projeksiyonlar, pre-sinaptik akson girdi olarak, post-sinaptik hedefler NACC dağılmış nöronlar ile sinaptik kişileri yapabilirsiniz. VHipp tarafından innerve NACC nöronlardan glutamaterjik iletimin bir sürekli (≥ 30 dk) kolaylaştırma kaynaklı nikotin pre-sinaptik α7 * nAChRs aracılığıyla vHipp aksonlar 5 boyunca sinyal 21 ve uzamış kalsiyum aksonları. <p class="jove_...

Nikotinik asetilkolin reseptörlerinin (nAChR'ler) aracılı sinaptik iletimin presinaptik mekanizmalarını analiz etmek için doğrudan canlı görüntülemeye izin veren in vitro ventral hipokampal - accumbens devresinin gen-kimerik bir preparatını geliştirdik. Bu hazırlık aynı zamanda sinaptik plastisitenin sinaptik öncesi ve sonrası mekanizmalarını incelemek için bilgilendirici bir yaklaşım sağlar.

Nikotin Kaynaklı Kalsiyum Sinyali ve ventral Hipokampal Aksonlar boyunca Nörotransmitter Release Canlı Görüntüleme

Sustained enhancement of axonal signaling and increased neurotransmitter release by the activation of pre-synaptic nicotinic acetylcholine receptors ...

Bu prosedürün genel amacı, sinaptik iletimin hem presinaptik hem de postsinaptik bileşenlerini tanımlamak ve analiz etmek için doğrudan canlı görüntülemeye olanak tanıyan, ventral hipokampal akumbens devresinin in vitro bir gen kimera preparatını oluşturmaktır. Bu işlem, öncelikle CA1 bölgesini içeren ventral hipokampal doku şeritlerinin diseke edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adımda, ventral hipokampal şeritler küçük ince dilimler halinde kesilir ve ardından bu mikro dilimler, 24 kuyucuklu doku kültürü plağı içindeki lamel camın merkezine yerleştirilerek gece boyunca bekletilir.Ardından, nucleus accumbens'i beyin dokularından disseke edin. Son adım, nucleus accumbens şeritlerini tripsin ile tekil nöronlara ayrıştırmak, nucleus accumbens nöronlarını ventral hipokampal implantların ekili olduğu lam üzerine eklemek ve beş ila yedi gün boyunca inkübe etmektir. Nihayetinde, nikotinik asetilkolin reseptörlerinin presinaptik lokalizasyonu ile nikotinik asetilkolin reseptör aracılı kalsiyum sinyalizasyonu ve nörotransmitter salınımı incelenir.Ventral hipokampal aksonlar, dönen disk konfokal canlı hücre görüntüleme ile tanımlanabilir ve izlenebilir. Bu tekniğin temel avantajı, bu mikro dilim disosiye nöron ko-kültür hazırlığının, presinaptik aksonların ve postsinaptik hedeflerin kolayca tanınmasına olanak tanımasıdır. İn vitro ko-kültür hazırlığı, ventral hipokampal devresini in vitro ortamda yeniden oluşturur.Bu, presinaptik ve postsinaptik kompartmanların ya da her ikisinin doğrudan canlı görüntülenmesine olanak tanır. Bu in vitro sinaptik preparasyon, presinaptik reseptörlerin aktivasyonunun glutamaterjik sinaptik iletim üzerindeki mekansal ve zamansal etkilerinin yüksek çözünürlüklü görüntülenmesine imkan verir. Sonuç olarak, doku toplama işleminden önce, glutamaterjik sinaptik plastisiteye katkıda bulunan hem pre hem de postsinaptik mekanizmalar hakkında bilgi edinilebilir.12 mm'lik poli-D-lizini kaplı laminasyonlu cam lamelleri, 24 kuyucuklu doku kültürü plakaları içerisinde 500 µL kültür medyumu ile 37 °C'de en az 30 dakika ön inkübasyona tabi tutun. Ardından, kültür için doku toplamak amacıyla mikro dilimleri ekmeden önce medyumu uzaklaştırın. Her bir sakrifiye edilen yavrunun tüm beynini açığa çıkarmak için diseksiyon mikroskobu altında kafatasının üst kısmını çıkarın.Serebral kortekslerin birbirinden ayrıldığı noktadan başlayarak, ventral hippo.Campi dahil olmak üzere posterior korteksleri içeren bir koronal kesit alın. Ardından, ca one seum bölgelerini içeren ventral hipokampal dokuları diseke ederek çıkarın. Daha sonra, dokuları soğuk kültür medyumu içeren 35 milimetrelik bir kültür kabına aktarın.Ardından dokuları daha küçük ve ince dilimler halinde kesin. Dilimleri, alevle cilalanmış bir pastoral pipet yardımıyla lamelin merkezine yerleştirin. Eksplantların tutunmasını kolaylaştırmak için üzerine 50 µL besiyeri ekleyin.Ardından, ventral hipokampal mikro dilimleri lamelle yerleştirin; X eksplantı lamelle yerleştikten sonra, çevredeki eksplantları tamamen örtecek ancak lamelin merkezindekileri etkilemeyecek kadar yüksek bir medya seviyesi sağlamak için kenardan 100 µL ek medya yavaşça ekleyin. Daha sonra, nukleus akkumbens nöronlarının dağılımı işleminden önce, eksplantları %5 CO2 içeren 37 °C ortamda gece boyunca inkübe edin. Şimdi, embriyonik 18. günden postnatal 1. güne kadar olan yaban tipi farelerden nukleus akkumbens dokularını elde edin, bunları küçük parçalara bölün ve ardından 15 mL'lik bir tüpe aktarın.Dokuları, 37 °C'de 15 dakika boyunca 2 ml %0,25 trypsin ile işleyin. Ardından, dokuları 4 °C'deki yıkama medyusunun 5 ml'si ile üç kez yıkayın ve her yıkama adımında süspansiyonun beş dakika dinlenmesini sağlayın. Daha sonra dokuları, 4 °C'deki kültür medyumunun 5 ml'si ile yıkayın.Ardından, hafifçe ateşle uçları düzeltilmiş bir Pastoral pipet kullanarak, hücreleri iki mililitre kültür ortamı içerisinde nazikçe pipetleme yoluyla ayrıştırın. Sonrasında, hücre süspansiyonunu başka bir 15 mililitrelik tüpe aktarın ve 2000 RPM'de beş dakika boyunca santrifüjleyin. Beş dakika sonra, süpernatantı uzaklaştırın ve hücreleri her altı pup başına bir mililitre olacak şekilde kültür ortamında yeniden süspande edin; ardından kültürü, ateşle uçları düzeltilmiş bir Pastoral pipet ile birkaç kez nazikçe pipetleyerek hücreleri dağıtın.Son olarak, her bir ventral hipokampal eksplantlı lamın üzerine 25 milliliters dağıtılmış nukleus akkumbens hücreleri ekleyin. Sinaps oluşumunu kolaylaştırmak amacıyla, mekanik stabilizasyonu sağlamak ve nemi korumak için kültür plakalarını nemlendirilmiş steril gazlı bez pedler üzerine yerleştirin. Ardından plakaları %5CO2 altında 37 degrees Celsius'de inkübe edin.Bu prosedürde, kültürleri tek tek bir görüntüleme haznesine aktarın. Hazneyi döner disk konfokal mikroskoba yerleştirin. Örneği, oda sıcaklığında dakikada bir mililitre hızla HBS kokteyli ile sürekli perfüze edin.Ardından, profüzyonu durdurun ve kültürü 56 millimolar potasyum A CSF içerisindeki 10 micromolar FM 1 43 ile 90 saniye boyunca boyayın. Daha sonra, dış boyayı 0.1 millimolar A-D-V-A-S-E-P yedi içeren kalsiyumsuz HBS ile 15 dakika boyunca yıkayarak uzaklaştırın. Bundan sonra, kültürü FM 1 43 içermeyen 56 millimolar potasyum A CSF ile 120 saniye boyunca uyaransız hale getirin.Sabitleme için. Kültürü aynı koşullar altında FM 1 43 ile yeniden yükleyin ve A-D-V-A-S-E-P seven içeren kalsiyumsuz HBS ile 15 dakika boyunca tekrar yıkayın. Şimdi, plan apokromatik objektifli bir döner disk konfokal mikroskobu ile FM 1 43 floresan görüntülerini elde edin ve görüntüleri bir CCD kamera ile yakalayın.Nikotin öncesi kontrol olarak, her iki saniyede bir, bir dakika boyunca bazal FM 1 43 floresan görüntülerini toplayın. Ardından, nikotini HBS kokteyli ile yıkayıp uzaklaştırmadan önce, dakikada iki mililitre hızında hızlı perfüzyonla bir mikromolar nikotin uygulamasını bir dakika boyunca gerçekleştirin. Nikotin uygulamasından önce, uygulama sırasında ve sonrasında, beş dakika boyunca her iki saniyede bir zaman ayarlı görüntüleri yakalamaya devam edin.Bu adımda, kültürleri normal HBS ile hızlıca durulayın. Ardından kültürleri, iki mililitre HBS içerisinde beş mikromolar fluo-4 kalsiyum indikatörü ve %0,02 onic F1 27 ile 37 °C ve %5 CO2 koşullarında 30 dakika boyunca yükleyin. Bundan sonra, fluo-4 çözeltisini her biri beş dakika sürecek şekilde 3 kez HBS ile yıkayarak uzaklaştırın.Kültürleri en az 30 dakika boyunca inkübatöre geri yerleştirin. Ardından kültürleri tek tek görüntüleme haznesine aktarın. FM 1 43 tabanlı veziküler füzyon prosedürlerinde açıklanan koşulların aynısı altında uygulayın.Nikotin öncesi kontrol olarak, ventral hipokampal mikro kesitlerdeki aksonal projeksiyonların bazal flu oh dört floresan görüntülerini toplayın. Ardından, dakikada 2 mL hızında hızlı perfüzyonla 1 dakika boyunca 1 µM nikotin uygulayın ve ardından nikotini HBS kokteyli ile yıkayarak uzaklaştırın. Nikotin uygulamasından önce, uygulama sırasında ve sonrasında 30 dakika boyunca her 10 saniyede bir zaman ayarlı (time-lapse) görüntüleri yakalamaya devam edin.Bu şekil, ventral hipokampal mikro dilimlerden gelen projeksiyonların glutamaterjik olduğunu ve temasların dağılmış GABAerjik nucleus accumbens orta dikenli nöronları ile kurulduğunu doğrudan göstermektedir; hem alfa yedi hem de alfa yedi dışı nikotinik asetilkolin reseptörleri ventral hipokampal aksonlar boyunca ve özellikle ventral hipokampal projeksiyonların nucleus accumbens nöronları ile temas ettiği bölgelerde saptanmıştır. Nucleus accumbens'teki dağılmış nöronların alfa yedi nikotinik asetilkolin reseptörlerini eksprese etmediği, bunun da temas noktalarındaki reseptör kümelerinin kesin olarak presinaptik olduğu anlamına geldiği belirtilmelidir.Ventral hipokampal aksonlar boyunca flu oh dört kalsiyum floresansı zaman ayarlı görüntüleri, dönen disk konfokal mikroskop kullanılarak 60 x objektif su lensi ile 30 dakika boyunca her 10 saniyede bir elde edilmiştir. Elde edilen görüntüler yalancı renk ölçeğinde belirtilmiş ve saniyede iki kare hızında video olarak oynatılmıştır. Bu video, canlı vahşi tip ventral hipokampal aksonlar boyunca nikotin uygulamasının tetiklediği sürekli flu oh dört kalsiyum floresans aktivitesini göstermektedir.Bu prosedür uygulanırken, ventral hipokampal mikro-doku parçalarının minimal hacimde besiyeri ile ekilmesi ve kültür plakalarının nemli stereo büyüme platformlarında tutulması gerektiğini hatırlamak önemlidir. Bu adımlar, mikro-dokuların yapışması, projeksiyonların uzaması ve sinapsların oluşumu için kritiktir. Böylece bu ko-kültür sistemi, presinaptik girdilerin genotiplerinin, postsinaptik hedeflerinden bağımsız olarak değiştirilmesine olanak tanır.Ayrıca, eksojen genlerin her iki bölmede bağımsız olarak seçici ekspresyonuna olanak tanır. Bu, sinaptik plastisitenin pre-sinaptik ve post-sinaptik mekanizmalarını incelemek için büyük bir potansiyel sunar. Bu videoyu izledikten sonra, ventral hipokampustan nucleus accumbens'e uzanan devreyi yeniden canlandıran gen kimera sinaptik ko-kültürlerin nasıl oluşturulacağını anlamış olmalısınız.Ardından, hem pre- ve post-sinaptik nöronları analiz etmek için canlı görüntüleme tekniklerini kullanabilmeniz gerekir.

live-imaging-nicotine-induced-calcium-signaling-neurotransmitter

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Biz daha iyi bir yaklaşım knock-in ve spektral kullanarak reseptör floresan protein etiketleme dahil yaklaşımların bir arada kullanılarak nikotin bağımlılığı mekanizmalarını anlamak için MSS nöron spesifik alt tiplerinin Subselüler bölgeler içinde nikotinik asetilkolin reseptör değişiklikleri nicel yeni bir teknik geliştirdik konfokal görüntüleme.

Kronik Nikotin İdaresi fareler Knock-in içinde floresan etiketli Nikotinik Reseptör Spektral Konfokal Görüntüleme

Bu video, fare beyinlerinden alınan ventral hipokampal ve nucleus accumbens dokularının ko-kültür için hazırlanma sürecini göstermektedir. Nöronlar, ventral hipokampal ve nükleus accumbens dokuları arasında sinaptik bağlantılar oluşturmak için çıkıntıları genişletir. Bu yöntem, bu iki beyin bölgesi arasındaki nöronal etkileşimlerin incelenmesine izin vererek biliş, davranış ve nörolojik bozukluklar hakkında içgörüler sunar.

Ventral Hipokampal ve Nucleus Accumbens'in birlikte kültürlenmesi

Bu video, fare ventral hipokampusundaki nikotinik asetilkolin reseptörlerinin nikotin aracılı aktivasyonunun aksonlar boyunca sürekli kalsiyum sinyalizasyonu ile nasıl sonuçlandığını göstermektedir.

Sinaptik Ko-Kültürlerde Ventral Hipokampal Aksonlar Boyunca Nikotin Kaynaklı Kalsiyum Sinyalinin Görüntülenmesi

Kaynak: Bancroft, E. A., {{}} ve diğerleri. Spontan Ca2+{{}} Akıları ve Aşağı Akış Etkilerinin Ölçülmesi. J. Vis. Uzm.  (2020) {{TAG_ 46}}Bu video, fare embriyolarından türetilen ventral orta beyin nöronlarındaki kalsiyum akışının gerçek zamanlı görselleştirmesini göstermektedir. Bir kalsiyum indikatörünü ifade etmek için viral bir vektör kullanılarak, nöronlar, spontan ve nörotransmitter kaynaklı kalsiyum aktivitesi sırasında floresan yoğunluğundaki değişiklikleri izlemek için konfokal bir...

Fare Embriyolarından Türetilen Ventral Orta Beyin Nöronlarında Kalsiyum Akışının Görselleştirilmesi

Kaynak: Lark, A. R., et. al., Biyolüminesan Kalsiyum İndikatörü GFP-aequorin'e Dayalı İn Vivo Fonksiyonel Beyin Görüntüleme Yaklaşımı. J. Vis. Uzm.  (2016)Bu video, Green kullanarak kalsiyum dinamiğinin gerçek zamanlı görüntülemesini göstermektedir. Drosophila'nın derin beyin yapılarında floresan protein-aequorin biyolüminesansı.

Drosophila Beyin Yapılarında Kalsiyum Geçişlerini İncelemek için Biyolüminesans Görüntüleme

Bu makalede nikotin uncaging tarafından fare Beyin dilimleri nikotinik asetilkolin reseptörü (nAChRs) çalışmak için bir yöntem sunar. Eşzamanlı yama kelepçe kayıt ve mikroskobu tarama 2-foton lazer ile birleştiğinde nikotin uncaging nikotinik reseptör işlevi kolinerjik Nörobiyoloji daha derin bir anlayış sağlayan hücresel morfoloji ile bağlanır.

Fare beyin dilim Photoactivatable nikotin lazer Flash Photolysis üzerinden nikotinik asetilkolin reseptör işlevinde sondalama

Bu yöntem, yaşayan farelerin Hippocampus optik erişim sağlayan kronik bir hazırlık açıklar. Bu hazırlık, birkaç hafta boyunca nöronal yapısal plastisite ve aktivite-uyarılmış hücresel plastisite uzunlamasına optik görüntüleme gerçekleştirmek için kullanılabilir.

Canlı fareler içinde dorsal hipokampal CA1 uzunlamasına Iki foton görüntüleme

Burada drosophila öğrenme ve bellek bağlamında pre-ve/ veya postsinaptik kalsiyum görselleştirilebilen bir protokol sayılmaktadır. Sinapti lokalize kalsiyum sensörleri kullanılarak yapılan in vivo kalsiyum görüntüleme, bu tür bir assosiyatif öğrenmenin altında yatan sinaptik plastisitenin belirlenebileceği klasik koku alma koşullandırma paradigması ile birleştirilir.

Drosophila melanogaster Öğrenme Kaynaklı Sinaptik Plastisite Vivo Optik Kalsiyum Görüntüleme

Mevcut protokol, hipokampusa ventral tegmental alan (VTA) glutamat projeksiyonlarının izlenmesi için basit bir yöntem göstermektedir. VTA glutamat nöronlarının fototimülasyonu, VTA glutamat terminallerinin CA1 putatif piramidal ateşleme hızını in vivo olarak nasıl modüle ettiğini göstermek için CA1 kaydı ile birleştirildi.

Hipokampustaki Ventral Tegmental Alan Glutamat Terminallerinin Kombine In Vivo Anatomik ve Fonksiyonel İzlenmesi

Bu makale, infüzyon kanülü ile desteklenmiş özel yapım bir görüntüleme penceresinin hazırlanmasını ve farelerde hipokampüsün CA1 bölgesine implantasyonunu göstermektedir.

Behaving Farelerinin Hipokampusunda Nöronal Aktiviteleri Görselleştirmek için Kraniyotomi Prosedürü

Bu protokol, sağlam trigeminal ganglion (TG) nöronlarının in vivo GCaMP kalsiyum görüntülemesini tanımlar. Bu tanım, TG maruziyet cerrahisini, TG nöronlarının in vivo konfokal mikroskopi görüntülemesini, TG nöronlarının mikroskobik görüntülemesi sırasında somatik uyaranların uygulanmasını ve in vivo GCaMP kalsiyum görüntüleme verilerinin analizini içerir.

In vivo (İn canlı) İntakt Trigeminal Gangliyonlarda Primer Duyusal Nöron Ağlarında Nöronal Toplulukların Kalsiyum Görüntülemesi

Öğrenin, ventral hipokampal-akumbens devresinde nikotin kaynaklı kalsiyum sinyali ve nörotransmitter salınımını canlı görüntüleme yöntemiyle incelemeyi. Bu teknik, sinaptik plastisite mekanizmalarını anlamak için değerli bilgiler sunar.

Nikotin Kaynaklı Kalsiyum Sinyali ve ventral Hipokampal Aksonlar boyunca Nörotransmitter Release Canlı Görüntüleme

Daha fazla video keşfet