Fare Glokomda Konfokal Oftalmoskopik Görüntüleme ve Hücre morfometrisi: Nörodejenerasyonda sırasında Retina Mikroglial Aktivasyonu Vivo Dynamics

Aşağıdaki deneyin genel amacı, retinanın in vivo konfokal görüntülemesi yoluyla kronik glokomun bir fare modelindeki mikroglial dinamikleri karakterize etmektir. Bu, retinadaki ve optik sinir başındaki floresan mikrogliaları görüntülemek için invaziv olmayan aylık konfokal oftalmoskopi veya CSLO kullanılarak gerçekleştirilir. Eşik tabanlı hücre SOMA segmentasyonu ve morfo kullanan canlı görüntü analizi, mikroglial hücre sayısı ve aktivasyonundaki değişiklikleri nicelleştirir.

Sonuçlar, canlı farelerde aylık CSLO görüntülemenin, kronik nörodejenerasyonun erken ilerleyişi sırasında mikroglial hücre yoğunluğu dağılımının kinetiğini ve morfolojik aktivasyonunu izlemek için kullanılabileceğini göstermektedir. Bu tekniğin, GFP pozitif mikroglial fare beyninin iki foton konfokal görüntülemesi gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, retinanın CSLO görüntülemesinin, yaşlanmaya bağlı nörodejeneratif bozuklukların ilerleyişi boyunca mikroglial hücrelerin sağlam organizma içerisinde doğrudan gözlemlenmesine ve izlenmesine olanak sağlamasıdır. Bu yönteme dair fikri ilk kez, genç DBA/2J farelerde, saptanabilir nörodejenerasyon öncesindeki yaşlarda mikrogliaların merkezi retinada yoğun aktivasyon ve kümelenme gösterdiğini ex vivo olarak kanıtladıktan sonra geliştirdim.

Saptanabilir glokom öncesinde meydana gelen bu erken doğuştan gelen bağışıklık değişikliklerinin nörodejenerasyona yol açıp açmadığını sorgulamak için, mikroglial değişiklikleri takip edecek bir in vivo yaklaşım oluşturmamız gerekiyordu. Canlı görüntüleme prosedürünü, laboratuvarımın teknisyeni Caesar Romero gösterecek. İşlemlere başlamak için CSLO sistemini başlatın ve oturum bilgilerini girin. Ardından, güvenli bir şekilde görüntüleme için hazırlık yapın.

Temiz bir 55 derece geniş alan objektif lens takın. Anestezi uygulamasından iki dakika sonra bir fareyi görüntüleme platformuna yerleştirin ve miyotik damlalar kullanarak her iki pupillayı da genişletin. Beş dakika sonra farenin anestezi altında olduğunu doğrulayın.

Ardından, minimum basınç uygulayarak her iki gözü kontak lenslerle kapatın. Fareyi, sağ gözü objektif lensle karşı karşıya gelecek ve orbital bölge lensle paralel olacak şekilde konumlandırın. Hayvanın sabitlenmesine gerek yoktur ancak objektif lensten sabit bir mesafede tutulmalıdır.

Göz 10 ila 15 dakika boyunca hizalı tutulduğunda, fare göz hareketleri CSLO canlı görüntüleme sistemi tarafından takip edilirken hareket etmeyecek veya göz kırpmayacaktır. Görüntüleme oturumuna, iç retinanın bir fundus görüntüsünü alarak başlayın. Bunun için.

820 nanometrelik bir uyarım dalga boyuna karşılık gelen kızılötesi modu seçin. Ardından lazer gücünü %100'e, hassasiyeti ise %40 ile %60 arasına ayarlayın. Sonrasında, yüksek hızda çalışarak, oftalmoskopu yönlendirmek için joystick'i kullanarak gözü konumlandırın ve optik disk ile retinal damarlanmanın fundus görüntüsünü toplamaya hazırlanın. Kornea ve lenzi yaralanma veya opasite açısından inceleyin.

Görüntü alımını etkileyebilecek kusurları veya yaralanmaları olan gözleri çalışmanın dışında tutun. Şimdi objektifi göze yaklaştırarak, optik sinir başının veya ONH'nin yüzeyi olan optik disk bölgesini bulun. Ardından görüntüyü ONH üzerine ortalayın.

ONH'nin doğru şekilde konumlandırılması, görüntü boyunca eşit bir odaklama ve emisyon elde etmek için temeldir. Bir sonraki adım, ONH'nin yanı sıra retinanın iç düzlemlerini görselleştirmektir. Referans odak düzlemi için, retinanın vitreöz yüzeyinde bulunan ve 59 ile 60 diyoptreye, hatta ekskavate optik disk alanlarında daha derin olan 55 diyoptreye karşılık gelen ana kan damarlarını kullanın.

Ardından, optik disk etrafındaki fundus alanının çoğunu kapsayan beyaz bir aydınlatma halesi oluşana kadar dokunmatik paneldeki düğmeyi kullanarak görüntü doygunluğunu ayarlayın. Daha sonra, o göz için optimal kontrastı belirten tekdüze bir hale oluşturan daha düşük doygunluk değerini seçin. Karanlık alanlar devam ederse kamerayı yeniden hizalamak gerekebilir.

Şimdi, sinyal-gürültü oranını artırmak için gerçek zamanlı olarak alınan 30 kareyi ortalayarak merkezi retinanın yüksek çözünürlüklü bir fundus görüntüsünü toplayın. Bu işlem saniyede 4,7 kareye tekabül eder; GFP pozitif hücrelerin floresan görüntüsünü toplamaya hazır şekilde, aynı konumda ve hemen normalize edin. Dokunmatik panelden floresan görüntüleme moduna geçin; bu işlem 488 nanometre lazer eksitasyonlu mavi lazeri ve 460 ila 490 nanometrelik bir bariyer filtre setini seçer; ardından kazanımı %100 lazer gücüne ve %100 ila %125 hassasiyete ayarlayın.

Şimdi, 100 x taramanın ortalamasını alarak ONH'nin tek bir XY noktası iki boyutlu floresan görüntüsünü toplayın. Ardından, kontrol panelinden kompozit seçeneğini belirleyerek ONH çevresindeki retinanın çok noktalı bir görüntüsünü yakalayın ve oftalmoskopla nazal temporal eksen boyunca kaydırma yapın. Yazılım, yeni taranan alanların ortalamasını otomatik olarak alır ve bunları gerçek zamanlı olarak birleştirir.

Retina bölgelerinin görüntü kalitesi, ortalama alma işlemine izin vermeyecek kadar yetersizse, taranan bölgeyi belirleyen yeşil daire kırmızıya dönecektir. Ortaya çıkan kompozit görüntü, 1.7 çarpı dört milimetreye kadar olan bir alanı kapsar. Kompozit görüntünün elde edilmesi sırasında dikkatli olunmalıdır.

Tarama ortalaması ve görüntü birleştirme işlemleri tamamlanmadan objektifin çok hızlı hareket ettirilmesi, yüksek çözünürlüklü görüntülerin kaybına neden olabilir. Anestezinin etkisi geçmeye başladığında, fare ağır nefes almaya başladığı ve görüntüleme imkansız hale geldiği için görüntüleme oturumu sonlandırılmalıdır. Damarlar ve optik disk referans noktaları olarak kullanılarak, bir zaman serisi için fundus görüntülerinin ardışık olarak hizalanmasıyla işleme başlayın.

Geleneksel görüntü düzenleme yazılımını kullanarak tüm görüntüleri O hs kısımları üst üste gelene kadar hizalayın. Üstteki görüntü, sürükleme sırasında yarı şeffaf olacaktır. Ardından, dizideki her bir görüntüyü, ana kan damarları bir önceki görüntüdeki damar yapısıyla örtüşene kadar döndürün ve bu düzenlemeyi gelecekte başvurmak üzere kaydedin.

Her görüntü için düzeltilmiş açıyı kaydedin ve bunu ilgili tek XY noktası floresan görüntüsüne uygulayın. Artık, hizalanmış TIFF dosyaları Fluor render programında açılarak merkezi retinada yerleşmiş tekil GFP pozitif mikroglial hücrelerin tanımlanması mümkündür. Tüm hücreleri görselleştirmek için görüntüyü ekrana sığdırın ve render görünümünü "composite orthogonal" ve "interpolated" olarak tanımlayın.

Ardından 0.58 gamma, 255 doygunluk noktası, 255 lüminans, 1.00 gölgeleme değerinde 195 alfa özelliklerini tanımlayın. RG kanallarının her ikisini de görünür seçerek seçimleri tamamlayın. Tekil hücreleri segmente etmek için çalışma alanı çerçevesinde B kanalına çift tıklayarak onu gizleyin.

Yüksek eşiği sabit tutarak, hücrelerin çoğunluğu minimum örtüşme ile maskelenene ve hücre uzantıları hariç tutulana kadar düşük eşiği artırarak kırmızı kanalı seçin ve eşikleme işlemini gerçekleştirin. Son olarak, yakalama komutunu kullanarak maskelenmiş hücrelerin bulunduğu dosyayı kaydedin. Maskelenmiş hücrelerin olduğu görüntüyü oradaki raster grafik düzenleyicide açın.

Doğrudan gözlem için gri tonlamayı ters çevirin ve çözünürlüğü 300 DPI veya üzerine ayarlayın. RGB görüntüsü TIF dosyası olarak kaydedilir. Canlı görüntü analizinin bir sonraki adımı mikroglialardır; bu nedenle, alan miktar belirlemesi için SATA'yı tanımlamak amacıyla segmentasyon ve morfoloji uygulanır.

Eşik değerine dayalı yoğunluk ölçümleri ve nesne sayımı yapabilen bir yazılım kullanın. Segmentlere ayrılmış hücrelerin bulunduğu TIFF dosyasını açın; maksimum çözünürlük için spline yeniden ölçeklendirmeyi (spline rescaling) ve daha iyi görselleştirme için kırmızı kanalı siyah-beyaz olarak seçin. Ardından, bireysel hücreleri segmente etmek için görüntünün yatay çapını yaşa bağlı olarak 1.4 ile 1.7 milimetre arasında tanımlayarak kalibre edin.

Ardından, kırmızı kanal üzerinde yoğunluk eşikleme uygulayın. Nesne sayımı ve hesap güncelleme komutu altındaki eşik yoğunluk fonksiyonunu açın. Bireyi temsil eden ilgi alanının her bir eşiği için iki boyutlu parametreleri takip etmek amacıyla bu fonksiyonu kullanın.

Ardından, yoğunluk histogramındaki yoğunluk eşiğini belirleyin. 255 seviyenin en düşük %50 ila %60'ını seçin ve münferit hücrelerin nihai eşik değerini optimize edin. Binary araç çubuğu kontrollerini veya nesne kataloğunu kullanarak mavi renkteki eşik renk maskesi ile gri renkteki hücre soma çevresi arasındaki örtüşmeyi görsel olarak değerlendirin.

Çoklu hücreler içeren somal ilgi bölgelerini manuel olarak tanımlayın. İlgi bölgelerini ayırarak bu elementleri birbirinden ayırın. Bu işlemi yaparken, alan kısıtlaması kullanarak hücreleri doğrudan görselleştirmek için düğmeyi kullanın.

Soma alanları 50 ila 60 kare mikrondan büyükse, mikroglial hücreleri aktive olmuş olarak sınıflandırın. Daha küçük somalara sahiplerse mikrogliaları deaktive olmuş olarak sınıflandırın.

Son olarak, soma maskesini ve tekil XY nokta görüntüsünü %50 artırılmış kontrastla üst üste getirerek süreci doğrulayın ve her bir aktive olmuş mikroglial hücredeki dallanma karmaşıklığını kontrol edin. Tanımlanan protokol, santral retinanın geniş bir alanındaki mikroglial hücreleri görselleştirmek için kullanılmıştır. CX3CR1 GFP'yi heterozigot olarak eksprese eden genç DBA/2J farelerde, yüksek hücre çözünürlüğünün canlı görüntüleme, eşikleme ve morfometrik analizle birleştirilmesi, tekil GFP pozitif hücrelerin otomatik segmentasyonuna olanak tanımış ve böylece hücreler alanlarına göre ayırt edilmiştir. DBA/2J fareleri kronik glokomu modeller ve her bir gözdeki nörodejenerasyonun değişken ilerleyişiyle uyumlu olarak, saptanabilir nörodejenerasyon öncesindeki yaşlarda lokal mikrogliyozis ve mikroglia aktivasyonunun gelişimini izlemek amacıyla aylık olarak görüntülenmişlerdir. Bu analiz, retinal mikroglia aktivasyonu ve mikrogliyozisteki zamanla meydana gelen değişiklikleri ortaya koymuştur.

Analiz ayrıca, tekil retinalar içindeki toplam ve aktive mikroglia yoğunluğunda dinamik değişiklikler tespit etmiştir. Mikroglia popülasyon yoğunluğu, diğer bulgularla tutarlı olarak, GFP eksprese eden hücre yoğunluğundaki değişikliklerle ilişkili değildi. Bu nedenle, CSLO analizi erken hastalık ilerlemesinin bir göstergesi olarak kullanılabilir.

Bu prosedürü uygularken, iç retinada yerleşmiş olan GFP pozitif mikrogliaların floresan görüntüsündeki doygunluk seviyelerini dikkatle optimize etmek önemlidir; merkezi retinanın CSLO görüntülerinin tekrarlanabilirliği ve merkezi retina boyunca tespit edilen tutarlı hücresel detaylar, geliştirme sonrası kritik olarak bu adıma bağlıdır. Bu canlı görüntüleme protokolü, laboratuvarımızda DBA/2J farelerinde ve diğer kronik retinal dejenerasyon modellerinde, retinal ve optik sinir başı mikroglialarındaki erken değişiklikler ile glokomun daha sonraki ilerlemesi arasındaki potansiyel bağlantıyı incelemek amacıyla uygulanmaktadır. Bu canlı görüntüleme stratejisi ayrıca multipl skleroz, Alzheimer ve Parkinson hastalığı gibi retinayı ve optik siniri dejenerasyon hedefi olarak belirleyen diğer kronik patolojilerin erken teşhisine de olanak sağlayabilir.