Name: Fare Glokomda Konfokal Oftalmoskopik Görüntüleme ve Hücre morfometrisi: Nörodejenerasyonda sırasında Retina Mikroglial Aktivasyonu Vivo Dynamics (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 48 s
Description: Keşfedin fare glokom modelinde konfokal oftalmoloskopi ile mikroglial hücre dinamiklerinin canlı görüntülenmesini. Bu yöntem nörodejenerasyon sırasında retinal mikroglial aktivasyonu izlemek için güçlü bir araçtır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Utah Üniversitesi Bilimsel Hesaplama ve Görüntüleme Enstitüsü'ne FluoRender yazılımının (R01GM09815) kullanımı için teşekkür ederiz. Bu çalışma, Glokom Araştırma Vakfı, Melsa M. ve Frank Theodore Barr Vakfı ve ABD Ulusal Sağlık Enstitüsü'nden (R01EY020878 ve R01EY023621) MLV'ye ve (R01EY017182 ve R01EY017950) B.K.A.'ya verilen hibelerle desteklenmiştir.

İn vivo görüntüleme Utah Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanmış protokoller kullanılarak patojensiz tesislerinde yapılır. NOT: Bu görüntüleme protokolü retina mikroglia ve infiltre monositler / makrofajlar fractalkine reseptör lokus (CX3CR1) kontrolü altında, yeşil fluoresan protein (GFP) ifade eden raportör fareler için kullanılır. Konfokal Tarayıcı Lazer Oftalmoskopide tarafından Retina GFP + mikroglia Vivo Görüntüleme 1. (cSLO) <ol><li> İşlem sırasında 35-37 ºC arasında fare sıcaklığını dengelemek için ayarlanmış su kontrollü ısıtma sistemi, açın ve iki ısıtma pedleri bağlayın. <ol><li> Konfokal tarayıcı laser oftalmoskop (cSLO) sistemi (Şekil 2A) başlatın. Bireysel fare tanımlamak ve 2 mm (Hasta Veri menüsü) bir kornea eğriliğini koyacaktır bilgileri girin, cSLO programını açın. </li></ol></li><li> Ima hazırlanınging. Güvenli yuvasından temiz bir 55º geniş alan objektif lens takınız. Temiz kağıdı ile kaplı bir ısıtma yastığı güvence altına alarak oftalmoskop görüntüleme platformu hazırlayın. Ped ve kağıdı düzleştirmek ve objektif lens hareketini engelleme onları tutmak için klipler kullanın. </li><li> % 1.3 2,2,2-tribromoetanol ve% 0.8 tert-amil alkol intraperitoneal enjeksiyonu ile fare anestezisi (250 mg / kg vücut ağırlığı; 0.5 ml / 25 g vücut ağırlığı), bir 1 ml tek kullanımlık takılan bir 30½ G iğne kullanılarak Şırınga. Kendi kafesine fare dönün, bir ısıtma yastığı üzerinde tuttu. NOT: Teneffüs karşı enjeksiyon yoluyla anestezi teslim burun koni ve boru ücretsiz görüntüleme ve gözlere engelsiz erişim için fare, daha kolay konumlandırma izin verir. </li><li> Hayvan hareket durur ve kuyruk tutam tepkisiz sonra, eğilimli hayvan konumlandırılması ve 7 dakika boyunca damla her iki gözlerini kapatarak, tropikamid ve fenilefrin (% 0.5 her biri) ile öğrenci dilatasyon neden olur. </li><li> 5 dk, p sonraMinimal basınç uygulayarak, her iki gözlerinin üzerinde oftalmoskop platformun ortasına eğilimli fare ve fit kontakt lensler dantel. NOT: forseps yerine 40 kullanılabilmesine rağmen Kontakt lensler, küçük ve kırılgan ama dikkatle parmaklarınızla ele alınabilir. o göz kuruluğu en aza indirir ve görüntüleme sırasında kornea saydamlığını koruyan olarak kontakt lens kullanımı isteğe ama tavsiye edilir. </li><li> 7 dakika sonra, platformun (Şekil 2B) kenarına yakın sınırlanmadığı hayvan tutarak, objektif lens ve objektif lens yörünge paralel bakan sağ gözü ile fare yönlendirmek. Karşılaştırılabilir doygunluğu ve yönlendirme görüntüleri toplamak için sürekli objektif lens gözün mesafe yanı sıra görüntüleme oturumları boyunca ışık yolu göze hizasını korumak. Gözün gözlem müdahale uzun bıyıkları Clip. NOT: Bir sonraki 8-10 dakika için, fare taşımak veya yanıp ve nazik hareket ile olacak nefes olmazyüksek kontrastlı fundus yerlerinden dayalı tarama kafası konumunu ayarlar cSLO Göz İzleme ART (otomatik gerçek zamanlı) modu ile izlenir likte. O zaman geçmiş, fareler görüntüleme pratik yapma, nefes nefese ve yanıp sönen başlar. </li><li> Görüntüleme kontakt lens kullanmadan gerçekleştirilirse, PBS her iki göze kurumasını önlemek için her 2-3 dakikada damla uygulayın. </li><li> Retina damar sistemi ve optik diskin fundus görüntüsünü toplayın, iç retina üzerinde duruldu. <ol><li> Kızılötesi modu (IR) seçin ve 820 nm uyarma,% 100 lazer gücü,% 40-60 duyarlılık (Şekil 2C) ayarları yapın. </li><li> Yüksek hız modunda (12,6 kare / sn) Çalışma, oftalmoskopu sürmek için joystick&#39;i kullanarak göz bulun. Düşük büyütmede, yaralanma veya opaklık için kornea ve lensi incelemek ve retina (Şekil 3A) görüntüleme etkileyecek kusurları ya da yaralanma ile çalışma gözlerinden dahil değildir. </li><li> Optik disk alanını (yüzeyini bulunyakın göz hedefi getirerek optik sinir başı, OSB), sonra bunun görüntüsünü ortalamak ve joystick vidalanarak bu pozisyonu kilitleyin. Oftalmoskop Gözün bu hizalama bile elde resmin üzerinde odaklanmak ve emisyon anahtarıdır. </li><li> Kazılan optik gösteren gözünde bir referans odak düzlemi (59 ve 60 D), ya da daha derin (55 D) olarak retina vitreus yüzeyinde bulunan büyük kan damarlarını kullanarak, OSB yanı sıra, retinanın iç uçakları görselleştirmek diskler. Optimal odak açıkça belirgin onların lümeni ve duvarlar ile büyük kan damarları içinde kan hücreleri dolaşan çözmelidir. </li><li> Üniforma aydınlatma beyaz halo (hafif aşırı pozlamayı kullanarak) optik disk etrafında 55º fundus alanında çoğunda yayılan kadar dokunmatik kontrol paneli üzerindeki düğmeyi ayarlayarak görüntü doygunluğu optimize edin. Sonra, büyük damarlar boyunca hareket kan hücreleri açıkça çözülebilir kadar kontrast optimize etmek için doygunluğu düşük. Fokal karanlık Eğeralanlar değil nedeniyle retina hasarı, bir homojen parlak bir görüntü elde edilinceye kadar kameraya göz realign, devam etmektedir. Bu ayar konumuna ve kalite görüntülerin tekrarlanabilir setleri yakalamak için esastır. </li><li> Gerçek zamanlı olarak 30 kare (4.7 kare / sn; normalize) ortalama (yaşa bağlı olarak, çapı 1,4-1,7 mm), merkezi retina yüksek çözünürlüklü IR görüntüsü toplamak sinyal-gürültü oranını geliştirmek için, (Şekil 2D ). </li></ol></li><li> Hemen, GFP + mikrogliya ve / veya retina ve OSB iç uçakları lokalize sızan monositler bir floresan görüntü kazanır. Not: retina İR fundus görüntüsünün Optimizasyonu GFP + hücrelerinin floresan görüntü çözünürlüğünü, hem de yayılmış iç retina belirlemektedir. Damarsal kötü kararı ile tespit edilebilir retinanın, iç uçakları odaklanmak için başarısızlık, soluk GFP + hücre görünümleri (Şekil 3B) neden olur. IR Satu ayarlamak için başarısızlıkoranı düzgün ve eşit olarak GFP + hücre yoğunluğu ve boyutu (Şekil 3C) artefakt varyasyonları sokulması, floresan görüntü (FA) etkilemektedir. <ol><li> Korunur mavi, 488 nm lazer uyarma (460-490 nm bariyer filtre seti) ve satın alma ayarlarını (% 100 lazer gücü ve 100-125% duyarlılık) kullanarak, dokunmatik ekran panelinde görüntüleme modu (FA) floresan Swich Tüm fareler (Şekil 2E) için sabittir. </li><li> Tek bir xy noktası, retinanın iki boyutlu floresan görüntü toplayın ve hemen özdeş pozisyonda bir fundus görüntü yakalamak (100x tarama ortalama, her iki görüntüler için 55º tarama açısı; Şekil 2F). </li><li> Burun-zamansal ekseni (Şekil 2H) karşısında retina kaydırma, kontrol paneli (Şekil 2G) &#39;de &quot;kompozit&quot; seçme ve oftalmoskop sağa hareket ve sol tarafından bir çoklu görüntü yakalamak. NOT: Tek bir xy noktası görüntü taradıktan sonra (100x sgerçek zamanlı yazılım otomatik olarak optimum tarama veya tarama olanaksız olduğunda kırmızı sırasında ortalamalar yeşil bir daire ile sınırlı aynı ve yeni alanlara (yeni taramalar), ve dikişleri tüm xy-pozisyonları,) ortalamasını yapabilirsiniz. Elde edilen kompozit görüntü dikey eksende (55º x 120-124º tarama açı) yatay eksen x 3-4 mm üzerinde 1.5-1.7 mm açıklıklı. </li></ol></li><li> Yanıp sönen ve hareket yeniden başlatıldığında daha önce, anestezi uyaran sonra 15 dakika içinde her farenin Komple görüntüleme. </li><li> PBS ile kontakt lensler, hidrat gözleri çıkarın ve motilite tam iyileşme kadar davranışını kontrol etmek, onun ısındı kafesine hayvan dönün. </li><li> Aynı bireysel fare aralıklı cSLO görüntüleme oturumları kullanarak uzunlamasına çalışmalar için, anestezi kümülatif toksisite yanı sıra korneal tahrişi önlemek için en az 3 gün arayla görüntüleme tekrarlayın. </li></ol> 2. Canlı Görüntü İşleme ve Analizi <ol><li> Sıralı görüntü hizalama: <ol><li> Hizalamanirengi noktaları gibi damarsal ve optik disk kullanarak aynı gözün bir zaman serisi için fundus görüntüleri. Ticari bir slayt gösterisi sunumu programında, kendi optik diskler karboksi- uçağa hizaya gelene kadar bir önceki (üst resim sürüklenen olurken yarı saydam görünür), o zamana kadar üst görüntüyü döndürmek üzerinde her görüntüyü sürükleyerek tüm görüntüleri açın onun büyük kan damarları (uzak optik diskten gemiler odaklanan) aşağıdaki resimde damarsal örtüşüyor. Her resim için döndürme açısını kaydetme ve fare ve göz kimliğinin takip, ileride başvurmak üzere bu zaman serisi kaydedin. </li><li> Her zaman noktasında xy dönüşünü düzeltmek için kaydedilen açı uygulamanın bir raster grafik editörü programını kullanarak tek xy noktası floresan görüntülerin gelen dizi aynı hizaya getirin. Ayrıca, 300 (yeniden ölçekleme olmadan) dpi ve arka plan çözünürlüğü ayarlamak (RGB modunda seçin Düzeyleri ve siyah bir kan damarının lümeni örnek). Bu görüntüleri kaydetmeTIF dosyalarını olarak, kendi adlarına &quot;hizalanmış&quot; eklenerek. </li></ol></li><li> Mikrogliyal hücre segmentasyon: <ol><li> FluoRender açık, merkezi retinada en erken zaman noktası / yaşa tekabül &quot;hizaya&quot; TIF dosyası GFP + hücreleri tespit etmek. Ekrana sığacak şekilde görüntüyü yakınlaştırma, daha sonra (sakla görünür olarak RG kanalları hem seçerek, Render görünümü (kompozit, dik, değerli) ve özelliklerini (0.58 gama, 255 doyma noktası, 255 parlaklık, 195 alfa ve 1.00 gölgeleme) tanımlamak çift ​​tıklayarak Çalışma Alanı çerçeve içinde tarafından B kanalı; Şekil 4A). </li><li> Sürekli yüksek eşiği tutarken hücrelerin çoğunluğu asgari örtüşme ve hücre süreçlerinin (mavi) ile (beyaz) maskeli kadar düşük eşiği artırarak, (Workspace çerçeve üzerinde vurgulanmış olmalıdır) tek tek hücrelerin, eşik kırmızı kanalı seçmek için (255). Düşük eşik değeri floresan yoğunluğu (Şekil 4B &lt;bağlı 100 ve 170 arasında değişmektedir/ Strong&gt;). </li><li> Özgün adı (Şekil 4C) için &quot;cellsegm&quot; ekleyerek, yeni bir TIF dosya olarak görünür kırmızı kanalda sadece (Yakalama komutu) ile bu görünümü kaydedin. Genel raster grafik editörü yazılımı kullanarak, onun gri tonlama ters ve yukarıdaki gibi 300 dpi çözünürlüğü ayarlamak, ve RGB (Şekil 4D) olarak yeniden kaydedin. NOT: Otomatik FluoRender tarafından oluşturulan klasörler (proje) silin ve ileride başvurmak için uygulanan eşiği kaydedin. </li></ol></li><li> Mikrogliyal soma segmentasyonu ve morfometri: <ol><li> Alan ölçümü için GFP + hücre somata belirlemek için, otomatik yoğunluk ölçümleri ve eşik yetenekleri yanı sıra, eşik-tabanlı nesne sayma ve ölçümü ile görüntü analiz yazılımı kullanın. &quot;Cellsegm&quot; TIF dosyasını açın ve rescaling yöntemi (spline) ve kırmızı kanalı seçin (RGB kırmızı sekmesini tıklatın). &quot;Renkli görünüm kanalı&quot; seçimi kaldırarak görselleştirme geliştirin (kırmızı RG sağ tıklayınB sekmesi) ve &quot;renkleri tamamlayacak&quot; seçerek (Resim / gri tonlama ters ve beyaz arka plan (Şekil 4E) üzerinde siyah / gri hücreleri görmek için) Resmi ayarlayın. </li><li> Tüm görüntü (Kalibrasyon, Hızlı Kalibrasyon) boyunca yatay bir çizgi çizerek, yaşa bağlı olarak 1,4-1,7 mm görüntüyü ayarlayın. </li><li> Yoğunluk eşikleme (Şekil 4B) uygulayarak Segment bireysel hücre somata. Bunun için, kırmızı RGB kanalında iş ve Eşik Yoğunluk fonksiyonu açın (Object sayın; &quot;sayım update&quot; komutunu seçerek) ayrı somata temsil faiz (ROI) her eşiklenir bölge için iki boyutlu parametreleri izlemek için. </li><li> 255 seviyeleri düşük% 50-60 seçme ve görsel eşik renk maskesi (mavi) ve hücre soma çevre (gri) içinde arasındaki örtüşme değerlendirerek nihai eşik değeri detaylandırarak, yoğunluk histogram yoğunluk eşiği tanımlayın tek tek hücreler (FŞEKIL 4E). </li><li> Ölçümler% 10&#39;dan daha az (İkili Araç Çubuğu ve Açıklamalı Ölçüleri kullanın) farklı ise 10 hücrelerinde segmentasyon önce bölgeyi ölçerek ve daha sonra lizozomal boyutlarını temsil ve seçilen eşik aralığı kabul hücre soma maskeleri doğruluğunu tahmin edin. </li><li> Manuel birden çok hücre bulunur ve doğrudan hücreler (Şekil 4F) görselleştirmek için ikili açma / kapama geçiş yaparken, bu elementler (İkili Araç Çubuğu denetimleri veya Nesne Kataloğu kullanarak ortadan kaldırmak veya ayrı ROI) ayırmak lizozomal ROI&#39;ları belirlemek. </li><li> Lizozomal alanları büyük ve daha küçük 50-60 mikron 2 aktif mikroglia karşılık gelen hücre somata ayrımcılık ve Alan Kısıtlama kullanarak, sırasıyla mikroglia devre dışı etmek ile ROI olarak mikrogliyal hücreleri sınıflandırır. NOT: Her bir hücre lizozomal alt küme farklı yalancı bir ikili tabaka ile tespit edilir, ve daha sonra diğer morfolojik parametrelerin karakterize edilebilir (perimeter, dairesellik, vb) yanı sıra ayrık retinal sektörlerde (Şekil 4G) içinde sayısal olarak. Bir ND2 dosyası olarak analiz görüntüyü kaydedin. </li><li> Lizozomal maske ve tek xy -point görüntü yazdırarak, bireysel aktive mikroglial hücrelerinde süreci ve dallanma karmaşıklığı doğrulayın (Şekil 4H kontrast% 50 arttı). El ile doğrudan hücre soma uzanan süreçleri saymak ya da çardak (İkili Araç Çubuğu ve Açıklamalı Ölçüleri kullanın) kapsayan poligonun çapını ölçün. Not: Aktif hücre süreçleri eksikliği ya da birkaç ayı (&lt;4) ve kısa (&lt;2x lizozomal çap) olanları, bir dallanmış ve detaylı mili ihtiva aktif olmayan hücre süreçlerinin aksine, (&gt; 3-10x lizozomal çap) göreceli olarak çevrelerinde küçük soma. </li><li> El ile, bu nedenle de tarafından tespit edilmemiş olan algılanma limitinin altındadır; somata daha küçük &lt;20 um 2 ve / veya GFP ekspresyonu ile hücreleri tanımlamakyoğunluklu bir eşikleme. Elle tespit elemanları saymak için Detaylandırmalar içinde Taksonomi komutunu kullanın. </li></ol></li></ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Nörodejeneratif bir hastalık sırasında mikrogliyal hücre sayısı ve morfolojik aktivasyon canlı izleme hücre özelliklerinin ayrıntılı görselleştirme izin non-invaziv görüntüleme yöntemlerinin kullanılmasını gerektirir. Görüntüleme sonra, mikroglial hücreler Mikroglia aktivitesi için çıktılan olarak lizozomal boyutu ve / veya işlem karmaşıklığını değerlendirmek için çok sayıda eşik adımlarının kullanımı ile morfometrik analiz için (bölünmüş) izole edilmelidir. Bu protokol, biz cSLO kullanılarak canlı görüntü elde etme ve ...

Mikroglia sadece erken embriyonik gelişim beri ve yetişkinlik boyunca merkezi sinir sistemi (MSS) ikamet nöroimmün hücrelerdir. Reseptörlerinin karmaşık bir repertuar ile donatılmış, mikrogliyal aktivite ve bölgesel heterojenlik komşu nöronlar, glia, kan-beyin bariyeri ve nöroenflamatuar hücreleri 1,2 infiltre ile çift yönlü etkileşimi tarafından düzenlenir. Onlar homeostazisi 3,4 olarak tedirginlikler için kendi topraklarını örnek olarak bazal mikrogliyal fonksiyonlar, fizyolojik bakım ve onarım katkıda bulunmaktadır. CNS yaralanma ya da hastalık sırasında, mikroglia sonra reaktif fenotip onların geçişi tetikler nöronal sinyalleri ilk müdahale var, &quot;mikroglia 2,5-7 aktif olarak adlandırılan. Mikroglia aktivasyonu, hücre soma ve süreç yeniden boyutlandırma ve 6-9 biçimlenme kuple edilir geni ve protein ifadesi, karmaşık bir döngüsünü içerir. Mikroglia aktivasyonu, aynı zamanda, hücre yeniden dağıtım vekümeleme, hücre sayısının (adlandırılır mikroglioz) yerel genel bir artış eşlik edebilir. Bu ya da kan-kaynaklı monosit 3,4,7,10-14 işe olmayan hücre proliferasyonu ve kendini yenileme, kaynaklanabilir. Yaşa bağlı kronik CNS hastalıkları geniş bir yelpazede, mikroglioz ve mikrogliya aktivasyon paralel hastalığın ilerlemesini 15-19 sürdürmüştür. Nasıl Mikroglia darbe nörodejenerasyon onlar hastalığın başlangıcı ve ilerlemesine farklı katkıları olabilir hem nöroprotektif ve zararlı roller oynamaya başlıca nedeni, belirsizliğini koruyor. Kronik CNS hastalığı anlamaya yönelik canlı görüntüleme çalışmaları hayvan modellerinde ve insan merkezi sinir sistemi hasar görmüş mikrogliyal davranışı gözlenir ve mikroglial değişiklikler hastalığın erken aşamalarında 15-17,19,20 saptanabilen bir başlangıç ​​olduğunu göstermiştir. Bu nedenle, tespit etmek ve in vivo olarak mikroglial aktivasyon izlemek için yaklaşımlar geliştirilmesi kritik öneme sahiptir. Non-invaziv deteBeyin mikroglia aktivasyonu bölgesel değişikliklerin ction moleküler görüntüleme veya biyolüminesans ve pozitron emisyon tomografisi veya manyetik rezonans görüntüleme 18,21,22 kullanarak, nörodejeneratif hastalığın ilerlemesi in vivo göstergesi önemli bir olarak kurulmuştur. Bu son derece nicel ve non-invaziv moleküler ve nükleer tıp görüntüleme yöntemleri bölgesel çözünürlükte gliozis algılar. Alternatif olarak, CX3CR1 GFP / + farelerde iki foton konfokal görüntüleme hücresel çözünürlükte 3,4,9,20,23-28 beyin mikroglia gözlenmesi izin verdi. Ancak, bu yaklaşım bile minimal invaziv beyin görüntüleme prosedürleri 29 kendi davranışlarını rahatsız potansiyel risk göz önüne alındığında, uzun vadeli ve kronik mikrogliyal değişiklikler tekrarlanan gözlem sınırlar. Alternatif olarak, retina, akut yaralanma sonrası in vivo görselleştirme doğrudan için en uygun koşulları ve yaşlanma boyunca bozulmadan MSS niş içinde mikrogliya tekrarlanan izleme sunar vePotansiyel kronik nörodejeneratif hastalıklar sırasında. Böylece, son çalışmalar görüntüye konfokal tarayıcı laser oftalmoskopi (cSLO) canlı CX3CR1 GFP / + fareler uyarlayarak GFP ifade retina mikroglia yüksek çözünürlüklü görüntüleme fizibilite kanıtlamıştır. Bu akut kaynaklı yaralanma ya da oküler hipertansiyon 30-36 Aşağıdaki kadar 10 hafta için tek tek farelerde GFP + hücre sayıları haftalık değişimleri izlemek için kullanılmıştır. Biz birkaç ay içinde uzun vadeli görüntüleme gerçekleştirmek ve kantitatif morfometrik analizi kullanılarak soma boyutuna göre mikroglia aktivasyonu değişiklikleri izlemek için bu yaklaşımı artırdık. Somal boyutu CX3CR1-GFP + mikroglia 9 in vivo görüntüleme gerçekleştirmek için kortikal dilim iki foton konfokal mikroskopi kullanılarak canlı görüntüleme çalışmalarında Mikroglia aktivitesi için faydalı bir ölçüt olarak tanımlandı. Bunlar ve diğer çalışmalarda da, WH lizozomal büyüklüğü ve Iba1 protein ekspresyonu düzeyleri arasında korelasyon gösterdiIch, aktivasyon 9,37 ile artar. Bu nedenle, aktif mikroglia canlı farelerde tespit edilebilir, ve bunların sayısı ve dağılımı MSS sağlık ve hastalık sırasında zaman içinde izlenebilir. Bu protokol cSLO canlı görüntü toplama ve analiz yöntemleri mikrogliyal hücre sayıları, retina ganglion hücre (RGH) dejenerasyonu (Şekil 1) sırasında dağılımı ve morfolojik aktivasyon izlemek için açıklanır. Böylece, bu çalışma kullanır: 1) yaşa bağlı optik sinir ve retina ve nörodejenerasyonunun uğrar miras glokom (DBA / 2J) bir fare modeli yaş 38,39 5 ile 10 ay arasında hastalığın ilerlemesinde kayda değer değişkenlik gösterir, 2) aylık Uzun vadeli retinada GFP + hücrelerin görselleştirme ve 3-5 ay, hücre somata ve ölçü izole etmek segmentasyon ve eşikleme 3) canlı görüntüleme analizi yaşlı heterozigot Cx3cr1 GFP / + DBA / 2J farelerin miyelinsiz optik sinirin için cSLO in vivo görüntülemeIR alanı. Bu stratejiler, kronik glokom erken evrelerinde retina mikrogliyal aktivasyonun durumlarının kinetiğini değerlendirmek için uygulanır.

<table><tbody><tr><td>DBA/2J ve CX3CR1-GFP/+ fareler</td><td>Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME</td><td>000671 ve 00582</td><td>Fareler evde yetiştirilir ve genetik sürüklenmeyi önlemek için her 3-4 nesilde bir yeni yetiştiriciler tanıtılır.</td></tr><tr><td>30&frac12; G iğnesi ve 1 ml tüberkülin kayar uçlu şırınga</td><td>BD, East Rutherford, NJ</td><td>305106 ve 309659</td><td></td></tr><tr><td>2,2,2-tribromoetanol, tert-Amil alkol% 99 ve fosfat tampon salin tabletleri</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>T48402, 152463 ve P4417</td><td>Avertin çözeltisi (pH 7.3, steril filtreli) taze yapılmış çözelti olmalı veya 4 ° C'de saklanmalıdır; 1 haftaya kadar C.</td></tr><tr><td>Isı tedavisi T / Pompa</td><td>Gaymar Industries, Orchard Park, NY</td><td>TP-650</td><td></td></tr><tr><td>Pamuk uçlu aplikatörler</td><td>Fisher Scientific, Pittsburgh, PA</td><td>23-400-100</td><td></td></tr><tr><td>Tropicamide %1</td> <td>Bausch & Lomb, Rochester, NY</td><td>NDC 24208-585-64</td><td></td></tr><tr><td>PMMA kontakt lensler, 1.70 taban eğrisi, 3.2 mm toplam çap, 0.40 mm kalınlığında merkez</td><td>Cantor & Nissel Ltd., Northamptonshire, Birleşik Krallık</td><td>G003709</td><td>Lensler steril PBS ile durulanır ve polipropilen kutularda saklanır.</td></tr><tr><td>HRA/Spectralis konfokal taramalı lazer oftalmoskop ve Göz Gezgini yazılımı</td><td>Heidelberg Engineering GmbH, Carlsbad, CA</td><td>Sürüm 1.7.1.0</td><td></td></tr><tr><td>PowerPoint</td><td>Microsoft, Redmond, WA</td><td>Sürüm 14.4.3</td><td></td></tr><tr><td>Adobe Photoshop</td><td>Adobe, San Jose, CA</td><td>Sürüm CS3</td><td></td></tr><tr><td>FluoRender</td><td>Bilimsel Hesaplama ve Görüntüleme Enstitüsü, Utah Üniversitesi</td><td>Sürüm 2.13</td><td>Ücretsiz yazılım. <a href="http://www.sci.utah.edu/software/13-software/127-fluorender.html" target="_blank">http://www.sci.utah.edu/software/13-software/127-fluorender.html</a</td></tr><tr><td>>NIS-Elements C</td><td>Nikon, Melville, NY</td><td>Sürüm 4.30.01</td><td></td></tr></tbody></table>

fare glokomda konfokal oftalmoskopik görüntüleme ve hücre morfometrisi: nörodejenerasyonda sırasında retina mikroglial aktivasyonu vivo dynamics

In Vivo Dynamics of Retinal Microglial Activation During Neurodegeneration: Confocal Ophthalmoscopic Imaging and Cell Morphometry in Mouse Glaucoma

CNS-resident nöroimmün hücreleri mikroglia, farklı fonksiyonları ve gen ekspresyon profilleri ile aktive durumuna geçiş, MSS hasarı yanıt olarak kendi morfolojisi ve boyutunu dönüşümü. Sağlık, yaralanma ve hastalık mikrogliyal aktivasyon rolleri tam olarak nedeniyle mikroçevresinin değişikliklere tepki olarak dinamik ve karmaşık düzenlemeye anlaşılamamıştır. Bu nedenle, non-invaziv monitör için çok önemlidir ve bozulmamış organizmada zamanla mikrogliyal aktivasyon değişiklikleri analiz eder. In vivo mikrogliyal aktivasyon çalışmaları CNS ortamı değiştirmeden izleme mikrogliyal davranış teknik sınırlamalar gecikmelidir edilmiştir. Bu uzun vadeli değişiklikler izlenir gereken kronik nörodejenerasyon sırasında özellikle zor olmuştur. Retina, non-invaziv canlı görüntüleme için uygun bir CNS organ görselleştirmek ve kronik hastalık sırasında mikroglia aktivasyonu dinamiklerini karakterize için güçlü bir sistem sunmaktadır. in vivo görüntüleme, hücresel çözünürlük ile mikroglia görselleştirmek için, konfokal oftalmoskopi (cSLO) ve CX3CR1 GFP / + raportör fareler kullanmak için yöntemler açıklar. Ayrıca, biz büyük hücre alt hücre aktivasyonu ve yoğunluğu aylık değişimleri (retinanın başına 200-300 hücre) ölçmek için yöntemler açıklanmaktadır. Biz in vivo görüntülerin otomatik eşik tabanlı morfometrik analizi uygulayarak retinada mikrogliyal aktivasyon canlı izleme için yararlı bir metrik olarak lizozomal alanının kullanımını doğrulamaktadır. Biz bu canlı görüntü alımı kullanmak ve kronik glokom bir fare modelinde retina nörodejenerasyon erken aşamalarında mikrogliyal aktivasyon ve mikrogliyozu dinamik değişiklikleri izlemek için stratejiler analiz eder. Bu yaklaşım retina ve optik sinir etkileyen kronik CNS rahatsızlıkları nöronal ve aksonal düşüş mikroglia katkılarını araştırmak için yararlı olacaktır.

Bizim son in vivo çalışmalar görselleştirmek ve geç nörodejenerasyona 59 kronik glokom ve ilişkilerinin erken aşamalarında kinetik ve OSB ve retinal mikrogliyal değişiklikler kalıplarını izlemek için bu canlı görüntü toplama ve analiz yöntemleri kullanılır. Burada bireysel genç heterozigot Cx3CR1-GFP DBA / 2J retina merkezi retina (Şekil 5) geniş bir alan boyunca mikrogliyal hücreleri görselleştirmek için bir cSLO görüntü elde etme protokolünü gösterir. Yüksek hücre karara istinaden,...

Mikroglia aktivasyonu ve mikroglioz kronik nörodejenerasyona önemli tepkilerdir. Burada, in vivo, konfokal oftalmoskopi retinal CX3CR1-GFP + mikroglial hücreleri uzun süreli görselleştirme için yöntemler sunmak ve eşik ve morfometrik için belirlemek ve aktivasyonunu ölçmek için analiz eder. Biz yaşa bağlı glokomun erken evrelerinde mikrogliyal değişiklikleri takip.

Fare Glokomda Konfokal Oftalmoskopik Görüntüleme ve Hücre morfometrisi: Nörodejenerasyonda sırasında Retina Mikroglial Aktivasyonu Vivo Dynamics

Microglia, which are CNS-resident neuroimmune cells, transform their morphology and size in response to CNS damage, switching to an activated state with ...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, retinanın in vivo konfokal görüntülemesi yoluyla kronik glokomun bir fare modelindeki mikroglial dinamikleri karakterize etmektir. Bu, retinadaki ve optik sinir başındaki floresan mikrogliaları görüntülemek için invaziv olmayan aylık konfokal oftalmoskopi veya CSLO kullanılarak gerçekleştirilir. Eşik tabanlı hücre SOMA segmentasyonu ve morfo kullanan canlı görüntü analizi, mikroglial hücre sayısı ve aktivasyonundaki değişiklikleri nicelleştirir.Sonuçlar, canlı farelerde aylık CSLO görüntülemenin, kronik nörodejenerasyonun erken ilerleyişi sırasında mikroglial hücre yoğunluğu dağılımının kinetiğini ve morfolojik aktivasyonunu izlemek için kullanılabileceğini göstermektedir. Bu tekniğin, GFP pozitif mikroglial fare beyninin iki foton konfokal görüntülemesi gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, retinanın CSLO görüntülemesinin, yaşlanmaya bağlı nörodejeneratif bozuklukların ilerleyişi boyunca mikroglial hücrelerin sağlam organizma içerisinde doğrudan gözlemlenmesine ve izlenmesine olanak sağlamasıdır. Bu yönteme dair fikri ilk kez, genç DBA/2J farelerde, saptanabilir nörodejenerasyon öncesindeki yaşlarda mikrogliaların merkezi retinada yoğun aktivasyon ve kümelenme gösterdiğini ex vivo olarak kanıtladıktan sonra geliştirdim.Saptanabilir glokom öncesinde meydana gelen bu erken doğuştan gelen bağışıklık değişikliklerinin nörodejenerasyona yol açıp açmadığını sorgulamak için, mikroglial değişiklikleri takip edecek bir in vivo yaklaşım oluşturmamız gerekiyordu. Canlı görüntüleme prosedürünü, laboratuvarımın teknisyeni Caesar Romero gösterecek. İşlemlere başlamak için CSLO sistemini başlatın ve oturum bilgilerini girin. Ardından, güvenli bir şekilde görüntüleme için hazırlık yapın.Temiz bir 55 derece geniş alan objektif lens takın. Anestezi uygulamasından iki dakika sonra bir fareyi görüntüleme platformuna yerleştirin ve miyotik damlalar kullanarak her iki pupillayı da genişletin. Beş dakika sonra farenin anestezi altında olduğunu doğrulayın.Ardından, minimum basınç uygulayarak her iki gözü kontak lenslerle kapatın. Fareyi, sağ gözü objektif lensle karşı karşıya gelecek ve orbital bölge lensle paralel olacak şekilde konumlandırın. Hayvanın sabitlenmesine gerek yoktur ancak objektif lensten sabit bir mesafede tutulmalıdır.Göz 10 ila 15 dakika boyunca hizalı tutulduğunda, fare göz hareketleri CSLO canlı görüntüleme sistemi tarafından takip edilirken hareket etmeyecek veya göz kırpmayacaktır. Görüntüleme oturumuna, iç retinanın bir fundus görüntüsünü alarak başlayın. Bunun için.820 nanometrelik bir uyarım dalga boyuna karşılık gelen kızılötesi modu seçin. Ardından lazer gücünü %100'e, hassasiyeti ise %40 ile %60 arasına ayarlayın. Sonrasında, yüksek hızda çalışarak, oftalmoskopu yönlendirmek için joystick'i kullanarak gözü konumlandırın ve optik disk ile retinal damarlanmanın fundus görüntüsünü toplamaya hazırlanın. Kornea ve lenzi yaralanma veya opasite açısından inceleyin.Görüntü alımını etkileyebilecek kusurları veya yaralanmaları olan gözleri çalışmanın dışında tutun. Şimdi objektifi göze yaklaştırarak, optik sinir başının veya ONH'nin yüzeyi olan optik disk bölgesini bulun. Ardından görüntüyü ONH üzerine ortalayın.ONH'nin doğru şekilde konumlandırılması, görüntü boyunca eşit bir odaklama ve emisyon elde etmek için temeldir. Bir sonraki adım, ONH'nin yanı sıra retinanın iç düzlemlerini görselleştirmektir. Referans odak düzlemi için, retinanın vitreöz yüzeyinde bulunan ve 59 ile 60 diyoptreye, hatta ekskavate optik disk alanlarında daha derin olan 55 diyoptreye karşılık gelen ana kan damarlarını kullanın.Ardından, optik disk etrafındaki fundus alanının çoğunu kapsayan beyaz bir aydınlatma halesi oluşana kadar dokunmatik paneldeki düğmeyi kullanarak görüntü doygunluğunu ayarlayın. Daha sonra, o göz için optimal kontrastı belirten tekdüze bir hale oluşturan daha düşük doygunluk değerini seçin. Karanlık alanlar devam ederse kamerayı yeniden hizalamak gerekebilir.Şimdi, sinyal-gürültü oranını artırmak için gerçek zamanlı olarak alınan 30 kareyi ortalayarak merkezi retinanın yüksek çözünürlüklü bir fundus görüntüsünü toplayın. Bu işlem saniyede 4,7 kareye tekabül eder; GFP pozitif hücrelerin floresan görüntüsünü toplamaya hazır şekilde, aynı konumda ve hemen normalize edin. Dokunmatik panelden floresan görüntüleme moduna geçin; bu işlem 488 nanometre lazer eksitasyonlu mavi lazeri ve 460 ila 490 nanometrelik bir bariyer filtre setini seçer; ardından kazanımı %100 lazer gücüne ve %100 ila %125 hassasiyete ayarlayın.Şimdi, 100 x taramanın ortalamasını alarak ONH'nin tek bir XY noktası iki boyutlu floresan görüntüsünü toplayın. Ardından, kontrol panelinden kompozit seçeneğini belirleyerek ONH çevresindeki retinanın çok noktalı bir görüntüsünü yakalayın ve oftalmoskopla nazal temporal eksen boyunca kaydırma yapın. Yazılım, yeni taranan alanların ortalamasını otomatik olarak alır ve bunları gerçek zamanlı olarak birleştirir.Retina bölgelerinin görüntü kalitesi, ortalama alma işlemine izin vermeyecek kadar yetersizse, taranan bölgeyi belirleyen yeşil daire kırmızıya dönecektir. Ortaya çıkan kompozit görüntü, 1.7 çarpı dört milimetreye kadar olan bir alanı kapsar. Kompozit görüntünün elde edilmesi sırasında dikkatli olunmalıdır.Tarama ortalaması ve görüntü birleştirme işlemleri tamamlanmadan objektifin çok hızlı hareket ettirilmesi, yüksek çözünürlüklü görüntülerin kaybına neden olabilir. Anestezinin etkisi geçmeye başladığında, fare ağır nefes almaya başladığı ve görüntüleme imkansız hale geldiği için görüntüleme oturumu sonlandırılmalıdır. Damarlar ve optik disk referans noktaları olarak kullanılarak, bir zaman serisi için fundus görüntülerinin ardışık olarak hizalanmasıyla işleme başlayın.Geleneksel görüntü düzenleme yazılımını kullanarak tüm görüntüleri O hs kısımları üst üste gelene kadar hizalayın. Üstteki görüntü, sürükleme sırasında yarı şeffaf olacaktır. Ardından, dizideki her bir görüntüyü, ana kan damarları bir önceki görüntüdeki damar yapısıyla örtüşene kadar döndürün ve bu düzenlemeyi gelecekte başvurmak üzere kaydedin.Her görüntü için düzeltilmiş açıyı kaydedin ve bunu ilgili tek XY noktası floresan görüntüsüne uygulayın. Artık, hizalanmış TIFF dosyaları Fluor render programında açılarak merkezi retinada yerleşmiş tekil GFP pozitif mikroglial hücrelerin tanımlanması mümkündür. Tüm hücreleri görselleştirmek için görüntüyü ekrana sığdırın ve render görünümünü "composite orthogonal" ve "interpolated" olarak tanımlayın.Ardından 0.58 gamma, 255 doygunluk noktası, 255 lüminans, 1.00 gölgeleme değerinde 195 alfa özelliklerini tanımlayın. RG kanallarının her ikisini de görünür seçerek seçimleri tamamlayın. Tekil hücreleri segmente etmek için çalışma alanı çerçevesinde B kanalına çift tıklayarak onu gizleyin.Yüksek eşiği sabit tutarak, hücrelerin çoğunluğu minimum örtüşme ile maskelenene ve hücre uzantıları hariç tutulana kadar düşük eşiği artırarak kırmızı kanalı seçin ve eşikleme işlemini gerçekleştirin. Son olarak, yakalama komutunu kullanarak maskelenmiş hücrelerin bulunduğu dosyayı kaydedin. Maskelenmiş hücrelerin olduğu görüntüyü oradaki raster grafik düzenleyicide açın.Doğrudan gözlem için gri tonlamayı ters çevirin ve çözünürlüğü 300 DPI veya üzerine ayarlayın. RGB görüntüsü TIF dosyası olarak kaydedilir. Canlı görüntü analizinin bir sonraki adımı mikroglialardır; bu nedenle, alan miktar belirlemesi için SATA'yı tanımlamak amacıyla segmentasyon ve morfoloji uygulanır.Eşik değerine dayalı yoğunluk ölçümleri ve nesne sayımı yapabilen bir yazılım kullanın. Segmentlere ayrılmış hücrelerin bulunduğu TIFF dosyasını açın; maksimum çözünürlük için spline yeniden ölçeklendirmeyi (spline rescaling) ve daha iyi görselleştirme için kırmızı kanalı siyah-beyaz olarak seçin. Ardından, bireysel hücreleri segmente etmek için görüntünün yatay çapını yaşa bağlı olarak 1.4 ile 1.7 milimetre arasında tanımlayarak kalibre edin.Ardından, kırmızı kanal üzerinde yoğunluk eşikleme uygulayın. Nesne sayımı ve hesap güncelleme komutu altındaki eşik yoğunluk fonksiyonunu açın. Bireyi temsil eden ilgi alanının her bir eşiği için iki boyutlu parametreleri takip etmek amacıyla bu fonksiyonu kullanın.Ardından, yoğunluk histogramındaki yoğunluk eşiğini belirleyin. 255 seviyenin en düşük %50 ila %60'ını seçin ve münferit hücrelerin nihai eşik değerini optimize edin. Binary araç çubuğu kontrollerini veya nesne kataloğunu kullanarak mavi renkteki eşik renk maskesi ile gri renkteki hücre soma çevresi arasındaki örtüşmeyi görsel olarak değerlendirin.Çoklu hücreler içeren somal ilgi bölgelerini manuel olarak tanımlayın. İlgi bölgelerini ayırarak bu elementleri birbirinden ayırın. Bu işlemi yaparken, alan kısıtlaması kullanarak hücreleri doğrudan görselleştirmek için düğmeyi kullanın.Soma alanları 50 ila 60 kare mikrondan büyükse, mikroglial hücreleri aktive olmuş olarak sınıflandırın. Daha küçük somalara sahiplerse mikrogliaları deaktive olmuş olarak sınıflandırın.Son olarak, soma maskesini ve tekil XY nokta görüntüsünü %50 artırılmış kontrastla üst üste getirerek süreci doğrulayın ve her bir aktive olmuş mikroglial hücredeki dallanma karmaşıklığını kontrol edin. Tanımlanan protokol, santral retinanın geniş bir alanındaki mikroglial hücreleri görselleştirmek için kullanılmıştır. CX3CR1 GFP'yi heterozigot olarak eksprese eden genç DBA/2J farelerde, yüksek hücre çözünürlüğünün canlı görüntüleme, eşikleme ve morfometrik analizle birleştirilmesi, tekil GFP pozitif hücrelerin otomatik segmentasyonuna olanak tanımış ve böylece hücreler alanlarına göre ayırt edilmiştir. DBA/2J fareleri kronik glokomu modeller ve her bir gözdeki nörodejenerasyonun değişken ilerleyişiyle uyumlu olarak, saptanabilir nörodejenerasyon öncesindeki yaşlarda lokal mikrogliyozis ve mikroglia aktivasyonunun gelişimini izlemek amacıyla aylık olarak görüntülenmişlerdir. Bu analiz, retinal mikroglia aktivasyonu ve mikrogliyozisteki zamanla meydana gelen değişiklikleri ortaya koymuştur.Analiz ayrıca, tekil retinalar içindeki toplam ve aktive mikroglia yoğunluğunda dinamik değişiklikler tespit etmiştir. Mikroglia popülasyon yoğunluğu, diğer bulgularla tutarlı olarak, GFP eksprese eden hücre yoğunluğundaki değişikliklerle ilişkili değildi. Bu nedenle, CSLO analizi erken hastalık ilerlemesinin bir göstergesi olarak kullanılabilir.Bu prosedürü uygularken, iç retinada yerleşmiş olan GFP pozitif mikrogliaların floresan görüntüsündeki doygunluk seviyelerini dikkatle optimize etmek önemlidir; merkezi retinanın CSLO görüntülerinin tekrarlanabilirliği ve merkezi retina boyunca tespit edilen tutarlı hücresel detaylar, geliştirme sonrası kritik olarak bu adıma bağlıdır. Bu canlı görüntüleme protokolü, laboratuvarımızda DBA/2J farelerinde ve diğer kronik retinal dejenerasyon modellerinde, retinal ve optik sinir başı mikroglialarındaki erken değişiklikler ile glokomun daha sonraki ilerlemesi arasındaki potansiyel bağlantıyı incelemek amacıyla uygulanmaktadır. Bu canlı görüntüleme stratejisi ayrıca multipl skleroz, Alzheimer ve Parkinson hastalığı gibi retinayı ve optik siniri dejenerasyon hedefi olarak belirleyen diğer kronik patolojilerin erken teşhisine de olanak sağlayabilir.

in-vivo-dynamics-retinal-microglial-activation-during

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Kaynak: Bosco, A.,  et al.  Nörodejenerasyon Sırasında Retinal Mikroglial Aktivasyonun İn Vivo Dinamiği: Fare Glokomunda Konfokal Oftalmoskopik Görüntüleme ve Hücre Morfometrisi. J. Vis. Uzm. (2015) Bu video, bir fare glokom modelinde retinal mikroglianın in vivo görüntülemesini göstermektedir. Floresan protein eksprese eden retinal mikrogliaya sahip transgenik bir fare, bir oftalmoskop altına yerleştirilir. Kızılötesi aydınlatma, optik sinir başını (ONH) bulmak için kullanılır ve odak düzlemi,...

Glokomun Fare Modelinde Retinal Mikroglia'nın İn vivo Görüntülenmesi

Kronik oküler hipertansiyon fare gözünde Trabeküler ağın laser kullanılarak meydana gelir. Göz içi basıncı (GİB) lazer tedavi sonrası birkaç ay boyunca yükselir. Görme keskinliği ve Deney hayvanlarının kontrast duyarlılık azalması optomotor testi kullanılarak izlenir.

Görme Kusurları karakterize Kronik Oküler Hipertansiyon bir Lazer-kaynaklı Fare Modeli

Bu video naif fare görsel projeksiyon kontrastlı MR görüntüleme ve akut optik sinir ezilme yaralanma ve kronik optik sinir dejenerasyonu ile ilişkili optik sinir dejenerasyonu tekrarlayan ve uzunlamasına in vivo çalışmalar için, bir klinik 3 T tarayıcı kullanarak, bir yöntemi göstermektedir knock-out fareler (p50 KO).

Farelerde kontrastlı MR ile optik sinir lifi Dürüstlük İn vivo

Burada, glokom görüldüğü gibi, retinal ganglion hücre kaybına neden murin göz oküler hipertansiyon uyarılması için bir protokol mevcut. Manyetik mikroboncuklarının ön kamaraya enjekte ve sulu mizah çıkışı engellemek için bir mıknatıs kullanarak iridokorneal açı çekti.

Bir Manyetik microbead Oklüzyon Modeli Farelerde Glokom Oküler Hipertansiyon Bağımlı tetikleyebilecek

Bu protokolü nasıl yüksek çözünürlüklü spektral etki alanı optik Koherens tomografi gibi görüntüleme teknikleri açıklar ve lazer ophthalmoscopy tarama bir oftalmik görüntüleme platformu üzerinde bilgi edinme sistemiyle küçük Rodents yararlı olabilir dağıtım, hücre sırasıyla retina kalınlığı ve mikroglial.

Vivo Tayf alanlı optik Koherens tomografi ve lazer Ophthalmoscopy tarama Cx3cr1gfp/gfp muhabir farelerin görüntüleme

İn vivo görüntüleme, sağlık ve hastalıkta biyoloji çalışmaları için güçlü bir araçtır. Bu protokol, standart iki foton mikroskobu ile fare retinasının transpupiller görüntülemesini tanımlar. Ayrıca, retinanın birden fazla hücresel kohortunu floresan olarak etiketlemek için farklı in vivoimaging yöntemleri göstermektedir.

Transpupiller İki Foton Fare Retinasının In vivo Görüntülenmesi

Burada, uyanık farelerde mikroglial dinamiklerin ve nöronal aktivitenin eşzamanlı görüntülenmesi için adeno ilişkili virüs enjeksiyonunu kraniyal pencere implantasyonu ile birleştiren bir protokolü tanımladık.

Uyanık Farelerde Mikroglial Dinamiğin ve Nöronal Aktivitenin Eşzamanlı Görüntülenmesi

Mevcut protokol, in vivo görüntülerde gözlenen retinal ganglion hücre akson demeti morfolojisini doğrulamak amacıyla in vivo görünür ışık optik koherens tomografi fibergrafi (vis-OCTF) görüntülerini aynı fare retinasının ex vivo konfokal görüntüleriyle hizalama adımlarını özetlemektedir.

Görünür Işık Optik Koherens Tomografi Fibergramlarının Aynı Fare Retinasının Konfokal Görüntüleri ile Hizalanması

Bu makale, retinadaki postsinaptik nokta ve mikroglia hareketliliğini görselleştirme ve nicelleştirme yöntemini spinning disk konfokal mikroskopisi kullanarak göstermektedir.

Hasta Sare Retinasında Mikroglia Dinamikleri ve Sinapslarla Etkileşimlerin Canlı Görüntülemesi ve Karakterizasyonu

Burada, genişletilmiş ex vivo deneyler için retinayı fare gözünden izole etmek için ayrıntılı bir metodoloji sunuyoruz. Bu protokol, retinal glia'yı canlı dokuda yerinde tutmanın sağladığı araştırma yollarından yararlanmak isteyen araştırmacılar için bu teknik olarak zorlu yaklaşımı erişilebilir kılmayı vurgulamaktadır.

Fare retinasındaki glial etkileşimleri incelemek için bir ex vivo eksplant modeli

Keşfedin fare glokom modelinde konfokal oftalmoloskopi ile mikroglial hücre dinamiklerinin canlı görüntülenmesini. Bu yöntem nörodejenerasyon sırasında retinal mikroglial aktivasyonu izlemek için güçlü bir araçtır.

Fare Glokomda Konfokal Oftalmoskopik Görüntüleme ve Hücre morfometrisi: Nörodejenerasyonda sırasında Retina Mikroglial Aktivasyonu Vivo Dynamics (Video) | JoVE Journal

Fare Glokomda Konfokal Oftalmoskopik Görüntüleme ve Hücre morfometrisi: Nörodejenerasyonda sırasında Retina Mikroglial Aktivasyonu Vivo Dynamics

Daha fazla video keşfet