Fare Glokomda Konfokal Oftalmoskopik Görüntüleme ve Hücre morfometrisi: Nörodejenerasyonda sırasında Retina Mikroglial Aktivasyonu Vivo Dynamics

Aşağıdaki deneyin genel amacı, retinanın in vivo konfokal görüntülemesi ile kronik glokomun bir fare modelinde mikroglial dinamikleri karakterize etmektir. Bu, retina ve optik sinir başındaki floresan mikrogliayı görüntülemek için non-invaziv aylık konfokal oftalmoskopi veya CSLO ile elde edilir. Eşik tabanlı hücre SOMA segmentasyonu ve morfo kullanan canlı görüntü analizi, mikroglial hücre sayısı ve aktivasyonundaki değişiklikleri ölçer.

Sonuçlar, canlı farelerde aylık CSLO görüntülemenin, kronik nörodejenerasyonun erken ilerlemesi sırasında mikroglial hücre yoğunluğu dağılımının ve morfolojik aktivasyonun kinetiğini izlemek için kullanılabileceğini göstermektedir. Bu tekniğin, GFP pozitif mikroglia fare beyninin iki foton konfokal görüntülemesi gibi mevcut yöntemlere göre ana avantajı, retinanın CSLO görüntülemesinin, sağlam organizmada yaşlanmanın nörodejeneratif bozukluklarının ilerlemesi boyunca mikroglial hücrelerin doğrudan gözlemlenmesine ve izlenmesine izin vermesidir. Bu yöntem için ilk olarak, exvivo'yu gösterdikten sonra, mikroglia'nın, saptanabilir nörodejenerasyondan önceki yaşlarda J fareleri aracılığıyla genç DBA'nın merkezi hazırlığında yoğun aktivasyon ve kümelenme gösterdiğini düşündüm.

Saptanabilir glokomdan önce gelen bu erken doğuştan gelen bağışıklık değişikliklerinin nörodejenerasyonunu yapıp yapmadığını sormak için, mikroglial değişiklikleri izlemek için in vivo bir yaklaşım oluşturmamız gerekiyordu. Canlı görüntü elde etme prosedürünü gösteren, laboratuvarımda bir teknisyen olan Caesar Romero olacak İşlemlere başlamak için CSLO sistemini başlatın ve oturum bilgilerini girin. Ardından, güvenli bir şekilde görüntülemeye hazırlanın.

Temiz, 55 derece geniş alan objektif lensi takın. Anesteziyi uyguladıktan iki dakika sonra fareyi görüntüleme platformunun üzerine yerleştirin ve tatic damlalarımı kullanarak her iki öğrenciyi de genişletin. Beş dakika sonra, farenin uyuşturulduğunu onaylayın.

Ardından, minimum basınç kullanarak her bir gözü kontakt lenslerle kapatın. Fareyi, sağ göz objektif mercekle buluşacak ve yörünge merceğe paralel olacak şekilde yönlendirin. Hayvanın kısıtlanmasına gerek yoktur, ancak objektif mercekten sabit bir mesafede tutulmasına gerek yoktur.

Önümüzdeki 10 ila 15 dakika boyunca göz onunla hizalandığında, göz hareketleri CSLO canlı görüntüleme sistemi tarafından izlenirken fare hareket etmeyecek veya göz kırpmayacaktır. İç retinanın fundus görüntüsünü toplayarak görüntüleme seansına başlayın. Bunu yapmak için.

820 nanometrelik bir uyarma dalga boyuna karşılık gelen kızılötesi modunu seçin. Ardından lazer gücünü %100'e ve hassasiyeti %40 ile %60 arasında ayarlayınArdından, yüksek hızda çalışarak, oftalmoskopu yönlendirmek için joystick'i kullanarak gözü bulun ve optik diskin ve retina damar sisteminin fundus görünümünü toplamaya hazırlanın. Kornea ve lensi yaralanma veya opaklık açısından inceleyin.

Görüntü elde etmeyi etkileyebilecek kusurları veya yaralanmaları olan gözleri çalışmadan çıkarın. Şimdi objektifi göze yaklaştırarak, optik sinir başının veya ONH'nin yüzeyi olan optik disk alanını bulun. Ardından görüntüyü ONH üzerinde ortalayın.

ONH'yi doğru şekilde konumlandırmak, görüntü boyunca eşit bir odak ve misyon elde etmenin anahtarıdır. Bir sonraki adım, retinanın iç düzlemlerini ve ONH'yi görselleştirmektir. Referans odak düzlemi için, retinanın vitreal yüzeyinde bulunan ve 59 ve 60 diyoptriye karşılık gelen veya kazılan optik disk alanlarında 55 diyoptride daha derin olan ana kan damarlarını kullanın.

Ardından, optik diskin etrafındaki fundusun çoğunu beyaz bir aydınlatma halesi kaplayana kadar dokunmatik paneldeki düğmeyi kullanarak görüntü doygunluğunu ayarlayın. Ardından, o göz için en uygun kontrastın göstergesi olan tek tip bir hale oluşturan daha düşük doygunluğu seçin. Karanlık alanlar devam ederse kamerayı yeniden hizalamak gerekebilir.

Şimdi, sinyal-gürültü oranını iyileştirmek için gerçek zamanlı olarak alınan ortalama 30 kareyi inceleyerek merkezi retinanın yüksek çözünürlüklü bir fundus görüntüsünü toplayın. Bu, saniyede 4.7 kareye karşılık gelir, hemen normalize edilir ve aynı konumda GFP pozitif hücrelerin bir floresan görüntüsünü toplamak için hazırlanır. 488 nanometre lazer uyarımı ve 460 ila 490 nanometre bariyer filtre seti ile mavi lazeri seçen dokunmatik ekran panelinde floresan görüntüleme moduna geçin ve alımı %100 lazer gücüne ve %100 ila 125 hassasiyete ayarlayın.

Şimdi, ortalama 100 x tarama yapan ONH'nin tek bir XY noktası iki boyutlu floresan görüntüsünü toplayın. Ardından, kontrol panelindeki ONH select kompozitinin etrafındaki retinanın çok noktalı bir görüntüsünü yakalayın ve ardından oftalmoskopla nazal temporal eksen boyunca kaydırın. Yazılım, yeni taranan alanların ortalamasını otomatik olarak alır ve bunları gerçek zamanlı olarak birleştirir.

Retina alanlarının görüntü kalitesi ortalamanın alınmasına izin vermek için yetersizse, taranan alanı tanımlayan yeşil daire kırmızıya döner. Elde edilen bileşik görüntü, 1,7 x dört milimetreye kadar bir alanı kaplar. Kompozit görüntünün elde edilmesi sırasında dikkatli olunmalıdır.

Yüksek çözünürlüklü görüntüler, tarama ortalaması ve görüntü birleştirme tamamlanmadan önce objektifin çok hızlı hareket ettirilmesi nedeniyle kaybolabilir. Anestezinin etkisi geçmeye başladığında, görüntüleme seansı sona ermelidir çünkü fare ağır nefes almaya başlar ve görüntüleme pratik olmaz hale gelir. Damar sistemini ve optik diski yer işaretleri olarak kullanarak bir zaman serisi için fundus görüntülerini sırayla hizalayarak başlayın.

Geleneksel görüntü düzenleme yazılımını kullanarak, tüm görüntüleri O h'leri üst üste gelene kadar hizalayın. Üstteki görüntü sürüklenirken yarı saydam olacaktır. Ardından, ana kan damarları önceki görüntüdeki damar sistemi ile örtüşene kadar dizideki her görüntüyü döndürün ve düzenlemeyi ileride başvurmak üzere kaydedin.

Her görüntü için düzeltilmiş açıyı kaydedin ve karşılık gelen tek XY noktalı floresan görüntüye uygulayın. Artık, hizalanmış TIFF dosyalarını Fluor render'da açarak merkezi retinaya lokalize edilmiş bireysel GFP pozitif mikroglial hücreleri tanımlamak mümkündür. Tüm hücreleri görselleştirmek için ekranı görüntüyle doldurun ve oluşturma görünümünü kompozit, ortogonal ve enterpolasyonlu olarak tanımlayın.

Ardından 1,00 gölgelemede 0,58 gama 255 doygunluk noktası 255 parlaklık 195 alfa özelliklerini tanımlayın. Her iki RG kanalını da görünür olarak seçerek seçimleri tamamlayın. Tek tek hücreleri segmentlere ayırmak için çalışma alanı çerçevesinde çift tıklayarak B kanalını gizleyin.

Hücrelerin çoğunluğu minimum örtüşme ile maskelenene kadar düşük eşiği artırarak ve yüksek eşiği sabit tutarken hücre işlemlerini hariç tutarak kırmızı kanalı seçin ve eşikleyin. Son olarak, capture komutunu kullanarak dosyayı maskelenmiş hücrelerle kaydedin. Maskelenmiş hücrelerin bulunduğu görüntüyü oradaki raster grafik düzenleyicide açın.

Doğrudan gözlem için gri ölçeği ters çevirin ve çözünürlüğü 300 DPI veya daha fazlasına ayarlayın. RGB görüntüsü bir TIF dosyası olarak kaydedilir. Canlı görüntü analizinin bir sonraki adımı, alan ölçümü için SATA'yı tanımlamak için mikroglial, yani segmentasyon ve morfodur.

Eşiğe dayalı yoğunluk ölçümleri ve nesne sayma yeteneğine sahip yazılım kullanın. Segmentli hücrelere sahip TIFF dosyasını açın ve maksimum çözünürlük için eğri yeniden ölçeklendirmeyi ve daha iyi görselleştirme için kırmızı kanalı siyah beyaz olarak seçin. Ardından, tek tek hücreleri segmentlere ayırmak için yaşa bağlı olarak yatay çapını 1,4 ila 1,7 milimetre olarak tanımlayarak görüntüyü kalibre edin.

Bu yüzden MA, kırmızı kanalda yoğunluk eşiği uygulayın. Nesne sayısı ve hesap güncelleme komutu altında eşik yoğunluğu işlevini açın. Bireyi temsil eden ilgilenilen bölgenin her bir eşiği için iki boyutlu parametreleri izlemek için bu işlevi kullanın.

Ardından, yoğunluk histogramında yoğunluk eşiğini tanımlayın. 255 seviyenin en düşük %50 ila %60'ını seçin ve tek tek hücrelerin son eşik değerini iyileştirin. İkili araç çubuğu denetimlerini veya nesne kataloğunu kullanarak mavi renkteki eşik renk maskesi ile gri renkli hücre soma çevresi arasındaki çakışmayı görsel olarak değerlendirin.

Birden fazla hücre ile ilgilenilen somal bölgeleri manuel olarak tanımlayın. İlgilenilen bölgeleri ayırarak bu öğeleri ayırın. Bunu yaparken, alan kısıtlamasını kullanarak hücreleri şimdi doğrudan görselleştirmek için geçişi kullanın.

Mikroglial hücreleri aktive edilmiş olarak sınıflandırın. Somata alanları 50 ila 60 mikron kareden büyükse. Daha küçük somataları varsa mikrogliaları devre dışı bırakılmış olarak sınıflandırın.

Son olarak, işlemi doğrulayın ve somal maskeyi ve kontrastı %50 artırılmış tek XY noktası görüntüsünü kaplayarak aktive edilmiş her bir mikroglial hücredeki dallanma karmaşıklığını kontrol edin. Açıklanan protokol, merkezi retinanın geniş bir alanı boyunca mikroglial hücreleri görselleştirmek için kullanıldı. CX üç C bir GFP eksprese eden genç DBA iki J faresinde heterozigot, canlı görüntü, eşikleme ve morfometrik analiz ile birleştirilen yüksek hücre çözünürlüğü, bireysel GFP pozitif hücrelerin otomatik segmentasyonuna izin verdi ve böylece hücreler, DBA iki J faresi modeli kronik glokom alanına göre ayırt edildi ve değişkenle tutarlı olarak saptanabilir nörodejenerasyonu ilerleten yaşlarda lokal mikro gliozis ve mikroglia aktivasyonunun gelişimini izlemek için aylık olarak görüntülendi bireysel gözlerde nörodejenerasyonun ilerlemesi. Bu analiz, zamanla retinal mikroglia aktivasyonunda ve mikro glioziste değişiklikler olduğunu ortaya çıkardı.

Analiz ayrıca, bireysel retinalardaki toplam ve aktive edilmiş mikroglia yoğunluğundaki dinamik değişiklikleri de tespit etti. Mikroglia popülasyon yoğunluğu, diğer bulgularla tutarlı olarak hücre yoğunluğunu ifade eden GFP'deki değişikliklere bağlı değildi. Bu nedenle, CSLO analizi erken hastalık ilerlemesinin bir göstergesi olarak kullanılabilir.

Bu prosedürü denerken, GFP artı mikroglia'nın floresan görüntüsünün doygunluk seviyelerini dikkatli bir şekilde optimize etmeyi, iç retinayı lokalize etmeyi, merkezi retinanın CSLO görüntülerinin tekrarlanabilirliğini ve merkezi retina boyunca tespit edilen tutarlı hücresel detayı dikkatli bir şekilde optimize etmeyi hatırlamak önemlidir. Laboratuvarımızda uygulanmakta olan bu canlı görüntüleme protokolü, retina ve optik nörder başı mikrogliasındaki erken değişiklikler ile glokomun daha sonra DBA'dan JM'ye ve diğer kronik retina dejenerasyonu modellerine ilerlemesi arasındaki potansiyel bağlantıyı gerçekten yatıştırmaktadır. Bu canlı görüntüleme stratejisi, multipl skleroz, Alzheimer ve Parkinson hastalığı gibi dejenerasyon için retina ve optik siniri de hedef alan diğer kronik patolojilerin erken tespitine de izin verebilir.