Periventriküler Yetişkin Rat Bölgesinde ve İnsan Omurilik gelen Nöral Kök / Progenitör Hücreler izolasyonu

Bu prosedürün genel amacı, yetişkin sıçan veya insan omuriliğinin paraventriküler bölgesinden nöral kök hücreleri izole etmektir. Bu işlem, öncelikle laminektomi yoluyla omuriliğin hasat edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adımda, omurilik enine bir santimetrelik segmentlere kesilir ve her bir omurilik segmentinden paraventriküler bölge diseke edilir.

Ardından, kıyılmış doku bir milimetrelik parçalara ayrılır ve ardından enzimatik olarak dissosiye edilir. Son adım, süreksiz bir yoğunluk gradyanı boyunca santrifüjasyon ile sağlam hücrelerin ayrılması ve hücre süspansiyonunun plaklara ekilmesidir. Nihayetinde, nörosfer oluşumu ve nöral kök hücrelerin büyümesi immunofloresan mikroskopi kullanılarak değerlendirilebilir.

Bugün, yetişkin sıçan omuriliğinin paraventriküler bölgesinden nöral kök hücrelerin nasıl izole edileceğini göstereceğim. Bu hücreler daha sonra, hangi eksojen faktörlerin soy kısıtlamasını teşvik ettiği veya bu hücrelerin çeşitli uyarılara veya strese nasıl tepki verdiği gibi nöral kök hücre alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olmak için kullanılabilir. Başlamak için, beraberindeki metin protokolünde açıklandığı şekilde kültür, besiyeri ve diseksiyon tamponlarını hazırlayın.

Ardından, anestezi doz aşımının ardından sıçanın cildini sterilize edin ve vertebral kolonu açığa çıkarmak için dorsal yüzeyi geniş diseksiyon makasıyla kaldırın. Diseksiyon makasını dorsal yüzeye dik ve transvers şekilde tutun. Vertebral kolonu arka ekstremitelerin üzerinden kesin.

Ardından, açık olan caudal uçtan başlayarak spinöz çıkıntıları açığa çıkarmak için vertebral kolonun üzerindeki dorsal kası rostral yönde boylamasına kesmek için daha küçük makaslar kullanın. Spinal kord ile vertebral kolon arasındaki boşlukta, spinal kanalın lateral kısmına ekstraoral olarak küçük, küt uçlu bir kemik kesme aleti yerleştirin. Bıçağı korda paralel ve sığ bir şekilde konumlandırın.

Ardından lamina üzerinde küçük kesikler yapın ve omuriliği açığa çıkarmak için laminayı dikkatlice soyun. Bu açı, alttaki omuriliğin zarar görmesini önler. Laminayı rostral yönde çıkarmaya devam edin.

Küt doku pensleri kullanarak torasik ve servikal omuriliği açığa çıkarmak için, omuriliği omurgadan nazikçe kaldırın ve kökleri mikro makasla kesin. Omuriliği serbest bırakmak için, çıkarılan omuriliği buz gibi soğuk, steril sıçan diseksiyon tamponu içeren bir Petri kabına yerleştirin. Dokuyu buz gibi soğuk diseksiyon tamponu ile durulayın ve omuriliği enine bir santimetrelik segmentler halinde kesmek için makas kullanın. Her bir doku segmenti için, bir elinizle ince pens kullanarak dokuyu tutun ve diğer elinizle mikro makas kullanarak, omuriliğin sadece periventriküler bölgesini bırakacak şekilde beyaz maddeyi ve gri maddenin büyük bir kısmını dikkatlice temizleyin.

Diseke edilmiş periventriküler dokuyu, buz gibi soğuk sıçan diseksiyon tamponu içeren 10 santimetrelik steril bir Petri kabına alın. Sıçan nöral kök hücrelerinin izolasyonuna başlamak için, mikro makas kullanarak diseke edilmiş periventriküler dokuyu bir kübik milimetrelik parçalar halinde kıyın. Ardından, önce bir papain disosiyasyon kitinden alınan bir papain flakonuna beş mililitre Earl dengeli tuz çözeltisi ekleyerek enzimatik disosiyasyon tamponunu hazırlayın.

Papainin tamamen çözünmesi ve solüsyonun berrak görünmesi için flakonu 10 dakika boyunca 37 °C'de bekletin. Ardından, disosiasyon kitinden gelen DNA flakonuna 500 µL Earl dengeli tuz çözeltisi ekleyin. Nazikçe karıştırın, ardından papain içeren flakona 250 µL DNA solüsyonu ekleyin ve nazikçe karıştırın.

Ardından, yaklaşık 0.2 gram kıyılmış dokuyu viyale ekleyin ve viyali 37 °C'de 45 dakika ile bir saat arasında bir sallayıcı platforma yerleştirin. İnkübasyon sonrası, kalan doku parçalarını ayrıştırmak ve bulanık bir hücre süspansiyonu elde etmek için karışımı 10 ml'lik bir pipetle trite edin. Hücre süspansiyonunu steril 15 ml'lik konik bir tüpe aktarın ve 300 G'de beş dakika boyunca santrifüjleyin.

Santrifüj sırasında oda sıcaklığında, 2,7 mililitre Earl dengeli tuz çözeltisini 300 mikrolitre rekonstitüe albümin OVO MOID inhibitör çözeltisi ile karıştırarak OVO moid çözeltisini hazırlayın. 15 mililitrelik konik bir tüpe, daha önce hazırlanmış DNA çözeltisinden 150 mikrolitre oval moid çözeltisine ekleyin ve tüpü ters çevirerek karıştırın, peletlenmiş hücrelerin üzerindeki süpernatantı atın ve hücre peletini hemen seyreltilmiş DNA albümin inhibitör karışımı içinde yeniden süspanse edin. Ardından, 15 mililitrelik bir tüpe beş mililitre albümin inhibitör çözeltisi ekleyerek süreksiz bir yoğunluk gradyanı hazırlayın ve beş mililitrelik bir pipet kullanarak hücre süspansiyonunu albümin inhibitör çözeltisinin üzerine nazikçe ve yavaşça katmanlayın.

Numuneyi oda sıcaklığında altı dakika boyunca 70 ×g'de santrifüjleyin. İşlem tamamlandığında, süpernatanı atın ve hücre peletini, beraberindeki metin protokolünde açıklandığı şekilde hazırlanan bir mililitre ön ısıtmalı sıçan EFH besiyerinde yeniden süspande edin. Canlı hücre yoğunluğunu bir hemositometre ile sayın ve hücreleri, EFH içinde mikrolitre başına 10 hücre yoğunluğunda bir T 25 kültür flaskına ekleyin.

Sferlerin kümelenmesini önlemek için flaskları 37 °C'de, %5 karbondioksit ortamında inkübe edin ve kültürlerin bir hafta boyunca rahatsız edilmeden büyümesine izin verin. Burada, beyaz ve gri cevher sınırlarını göstermek için hematoksilin ve eozinle birlikte luxal fast blue ile boyanmış sıçan spinal kordunun bir enine kesiti gösterilmiştir. Noktalı dış hat, bu protokolde bu bölgeden izole edilen diseke edilmiş kalan periventriküler dokuyu belirtmektedir.

Burada gösterilenlere benzer nörosferler, yüksek büyütmede süspansiyon kültüründe serbest yüzen halde büyüyecektir. Nörosferlerden dışarı doğru uzanan mikro dikenler görülebilir; nörosferlerin disosiye edilip matrigel kaplı kuyucuklara ekildiği durumda, KI 67 pozitif boyama ile gösterildiği üzere nörosferler prolifere olur. Ayrıca, öncelikle nöral öncül hücrelerin bir belirteci olan nestin eksprese edeceklerdir.

Bu prosedürün ardından, farklılaşmayı teşvik etmek için kültüre edilen hücrelere ekzojen faktörler eklenebilir. Erişkin nöral kök hücreler veya onların progenitörleri, rejeneratif onarım yeteneklerini değerlendirmek amacıyla çeşitli hayvan modellerine de nakledilebilir. Bu videoyu faydalı bulmanızı umuyor, deneylerinizde başarılar diliyorum.