Periventriküler Yetişkin Rat Bölgesinde ve İnsan Omurilik gelen Nöral Kök / Progenitör Hücreler izolasyonu

Bu prosedürün genel amacı, nöral kök hücreleri yetişkin sıçanın veya insan omuriliğinin paraventriküler bölgesinden izole etmektir. Bu, önce omuriliğin laminektomi yoluyla toplanmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım, omuriliği enine bir santimetrelik segmentlere kesmek ve paraventriküler bölgeyi omuriliğin her bir segmentinden çıkarmaktır.

Daha sonra, kıyılmış doku bir milimetrelik parçalar halinde kesilir ve daha sonra enzimatik olarak ayrışır. Son adım, bozulmamış hücreleri süreksiz bir yoğunluk gradyanı boyunca santrifüjleme yoluyla ayırmak ve hücre süspansiyonunu plakalamaktır. Sonuç olarak, nöros küre oluşumu ve nöro kök hücrelerin büyümesi immünofloresan mikroskobu kullanılarak değerlendirilebilir.

Bugün, yetişkin sıçan omuriliğinin paraventriküler bölgesinden nöral kök hücrelerin nasıl izole edileceğini göstereceğim. Bu hücreler daha sonra nöral kök hücre alanındaki hangi dışsal faktörlerin soy kısıtlamasını teşvik ettiği veya bu hücrelerin çeşitli uyaranlara veya strese nasıl tepki verdiği gibi temel soruları yanıtlamaya yardımcı olmak için kullanılabilir. Başlamak için, ekteki metin protokolünde açıklandığı gibi kültür, ortam ve diseksiyon tamponlarını hazırlayın.

Daha sonra, aşırı dozda anestezik aldıktan sonra, farenin cildini sterilize edin ve sırt yüzeyini çıkarmak için büyük diseksiyon makası kullanın ve vertebral kolonayı açığa çıkarın. Diseksiyon makasını sırt yüzeyine dik ve enine tutun. Vertebral sütunu arka bacakların üzerinde kesin.

Ardından, açıkta kalan coddle ucundan başlayan dikenli süreçleri ortaya çıkarmak için vertebral kolonun üzerindeki sırt kasını rostral yönde uzunlamasına kesmek için daha küçük bir makas kullanın. Küçük künt kemik kesme aletini, omurilik ile omur sütunu arasındaki boşluğa omurilik kanalının yan yönüne ağız dışı olarak yerleştirin. Bıçağı sığ ve kabloya paralel olarak yerleştirin.

Daha sonra laminaya küçük kesikler atın ve omuriliği ortaya çıkarmak için laminayı dikkatlice soyun. Bu açı, alttaki omuriliğin zarar görmesini önler. Laminayı rostral yönde çıkarmaya devam edin.

Künt doku forsepsleri kullanarak torasik ve servikal omuriliği ortaya çıkarmak için, omuriliği omurilikten nazikçe kaldırın ve kökleri mikro makasla kesin Kordonu serbest bırakmak için, eksize edilen omuriliği buz gibi, steril sıçan diseksiyon tamponu içeren bir Petri kabına yerleştirin. Dokuyu buz gibi soğuk diseksiyon tamponu ile durulayın ve omuriliği enine bir santimetrelik segmentlere kesmek için makas kullanın. Dokunun her bir segmenti için, dokuyu bir elinizle tutmak için ince forseps kullanın ve diğer elinizle beyaz maddeyi gri maddenin çoğuyla birlikte dikkatlice çıkarmak için mikro makas kullanın ve omuriliğin sadece periventriküler bölgesini bırakın.

Diseke edilen periventriküler dokuyu buz gibi soğuk sıçan diseksiyon tamponu içeren 10 santimetrelik steril bir Petri kabına çekin. Sıçan nöral kök hücrelerinin izolasyonuna başlamak için, disseke edilen ventriküler dokuyu bir milimetre küp parçaya ayırmak için mikro makas kullanın. Daha sonra, bir papain ayrışma kitinden bir papain şişesine önce beş mililitre Earl'ün dengeli tuz çözeltisini ekleyerek enzimatik ayrışma tamponunu hazırlayın.

Şişeyi 10 dakika boyunca 37 santigrat dereceye yerleştirin, böylece papain tamamen çözülür ve çözelti berrak görünür. Daha sonra, ayrışma kitinden gelen DNA şişesine 500 mikrolitre Earl'ün dengeli tuz çözeltisini ekleyin. Ve yavaşça karıştırın, papain içeren şişeye 250 mikrolitre DNA çözeltisi ekleyin ve yavaşça karıştırın.

Daha sonra, kıyılmış dokuyu şişeye yaklaşık 0.2 gram ekleyin ve şişeyi 45 dakika ila bir saat boyunca 37 santigrat derecede bir külbütör platformuna yerleştirin. İnkübasyondan sonra, bulanık bir hücre süspansiyonu elde etmek için kalan doku parçalarını ayırmak için karışımı 10 mililitrelik bir pipetle üç kez oranlayın. Hücre süspansiyonunu steril 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın ve beş dakika boyunca 300 Gs'de santrifüjleyin.

Santrifüjleme sırasında oda sıcaklığında, 2.7 mililitre Earl'ün denge tuzu çözeltisini 300 mikrolitre sulandırılmış albümin OVO MOID inhibitör çözeltisi ile karıştırarak OVO moid çözeltisini hazırlayın. 15 mililitrelik konik bir tüpte, daha önce hazırlanmış olan 150 mikrolitre DNA solüsyonunu oval moid solüsyonuna ekleyin ve tüpü ters çevirerek karıştırın, süpernatanı peletlenmiş hücrelerden atın ve seyreltilmiş DNA albümin inhibitörü karışımında hücre peletini hemen tekrar askıya alın. Daha sonra, 15 mililitrelik bir tüpe beş mililitre albümin inhibitör çözeltisi ekleyerek ve beş mililitrelik bir pipet kullanarak hücre süspansiyonunu albümin inhibitörü çözeltisinin üzerine nazikçe ve yavaşça katmanlayarak süreksiz bir yoğunluk gradyanı hazırlayın.

Numuneyi oda sıcaklığında altı dakika boyunca 70 gs'de santrifüjleyin. Bitirdikten sonra, süpernatanı atın ve hücre peletini, ekteki metin protokolünde açıklandığı gibi hazırlanan bir mililitre ön ısıtma sıçan EFH ortamında yeniden süspanse edin. Bir hemo sitometre ile canlı hücre yoğunluğunu sayın ve hücreleri EFH'de mikrolitre başına 10 hücre yoğunluğunda bir T 25 kültür şişesine yerleştirin.

Şişeleri 37 santigrat derecede% 5 karbondioksit içinde inkübe edin ve kürelerin toplanmasını önlemek için kültürlerin bir hafta boyunca rahatsız edilmeden büyümesine izin verin. Burada, beyaz ve gri maddenin sınırlarını göstermek için hematin ve eoinin yanı sıra luxal hızlı mavi ile boyanmış sıçan omuriliğinin enine bir kesiti gösterilmektedir. Noktalı anahat, bu protokolde bu bölgeden izole edilen diseke edilmiş kalan periventriküler dokuyu belirtir.

Burada gösterilenler gibi nörosferler, yüksek büyütmede süspansiyon kültüründe serbest yüzer olarak büyüyecektir. Nörosferlerden çıkıntı yapan mikro sivri uçlar görülebilir, nörosferler, nörosferlerin ayrıştığı ve matrigel kaplı kuyucuklar üzerine kaplandığı KI 67 pozitif boyama ile gösterildiği gibi çoğalır. Ek olarak, öncelikle nöral öncü hücreler için bir belirteç olan yuvayı ifade edeceklerdir.

Bu prosedürü takiben, farklılaşmayı teşvik etmek için kültürlenmiş hücrelere ekzojen faktörler eklenebilir. Yetişkin nöral kök hücreler veya soyları, rejeneratif onarım yeteneklerini değerlendirmek için çeşitli hayvan modellerine de nakledilebilir. Umarım bu videoyu faydalı bulursunuz ve deneylerinizde iyi şanslar.