Konsantrik Jel Sistemi 3D Hücre Göç Matrix mikroçevresinin biyofiziksel Rolü Eğitim için

Bu prosedürün genel amacı, 3D fizyolojik olarak ilgili ortamlarda hücrelerin göç özelliklerini incelemektir. Bu, hücrelerin önce bir iç kollajen jeli içine ekilmesiyle gerçekleştirilir ve daha sonra istenen matris özelliklerine sahip hücresiz bir dış kollajen jeli içine alınır. Daha sonra, hücrelerin dış jeli istila etmesine ve göç etmesine izin verilir, bu sırada izlenebilir ve kantitatif olarak analiz edilebilirler.

Sonuç olarak, bu eşmerkezli jel testi, hücre göçü davranışının hücre dışı matrisin biyofiziksel özelliklerinden nasıl etkilendiğini göstermek için kullanılır. Bu tekniğin transfer tahlili veya çizik tahlili gibi mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, hücrenin göçünün, yapısal ve biyofiziksel özelliklerinin kontrol edilmesi çok kolay olan fizyolojik bir anlaşma ortamında gerçekleşmesidir. Bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi oldukça önemlidir, çünkü konsantre iç yönlendirici jel sisteminin oluşumu oldukça hassastır.

Bazen elde edilmesi biraz zor olabilen bu deneyin başarısı için uygun bir jel arayüzü çok önemlidir. %80 co akıcılığında T 25 şişelerinden hasat edilmeye hazır bir MD MBA 2 31 hücre kültürü ile başlayın. İlk tripsin, şişe başına bir mililitre çözelti kullanan hücrelerdir.

Daha sonra hücreleri dört dakika boyunca 200 Gs kuvvet kullanarak bir pelet olarak toplayın, snat'ı atın ve hücreleri beş mililitre kültürde yeniden süspanse edin. Medya. Şimdi bir hemo sitometre kullanarak hücre yoğunluğunu ölçün ve mililitre başına 100 milyon hücre için gereken hacmi belirleyin. Daha sonra hücreleri dört dakika boyunca 200 G'de döndürün.

Süpernatanı çıkarın ve peleti gerekli hacimde serum içermeyen kültür ortamına iyice yeniden süspanse edin. Bu süspansiyon, son oturma konsantrasyonunun 10 katıdır. Gerekli stok çözeltilerini bir buz kovasında toplamaya başlamak için 10 XPBS milq su ve 0.1 molar sodyum hidroksit içerirler.

Ayrıca, steril tekniği koruyarak, mililitre iç jel çözeltisi başına 50 mikrolitre 2.4 miligram için istenen kollajen miktarını elde edin, birkaç mikro santrifüj tüpünü bir başlık altında soğutun. Daha sonra ölçülen kolajene yavaşça beş mikrolitre 10 XPBS ekleyin. PBS eklenirken tüpü döndürün, ancak kabarcık yapmaktan kaçının.

Ardından, karışımın pH'ını baz çözelti ile 7.4'e ayarlayın. Genellikle beş mikrolitre işi yapar. Metin protokolünde bir sorun giderme kılavuzu sağlanmıştır.

Son olarak, 10 x hücre süspansiyonu için yer bırakarak serum içermeyen kültür ortamı ile hacmi 45 mikrolitreye çıkarın. Başlamak için, kollajen çözeltisine beş mikrolitre 10 x hücre süspansiyonu ekleyin ve hücreleri hava kabarcıkları oluşturmadan çözelti içinde iyice yeniden süspanse edin. Şimdi cam alt plakaya ön ısıtma yapmak için, merkeze 20 mikrolitre süspansiyon ekleyin.

Bir kabarcık oluşursa, kubbe şeklinde bir damlacık oluşturur, hızlı bir şekilde yırtın veya karışıklık yaratmadan emdirin. Jeli doğru şekilde dökmek, özellikle kollajen gibi çok viskoz solüsyonlarda çok zor olabilir. Mümkün olduğunca kabarcık üretmekten kaçınmaya çalışın ve polimerleşmeye hazır olduğunda çözeltiyi döndürmeyin, çünkü şişme yapay elyaf hizalamasına neden olabilir.

Şimdi, inkübasyon sona ermeden 15 dakika önce iç tabakanın polimerize olmasına izin vermek için çanağı 45 dakika inkübatöre geri koyun. Buz üzerinde 200 mikrolitre dış kollajen jel çözeltisi hazırlayın. İlk olarak, gerekli miktarda stok kollajen çıkarın.

İkinci olarak, hafifçe döndürerek 20 mikrolitre 10 XPBS'yi yavaşça ekleyin. Daha sonra pH'ı daha önce olduğu gibi 7.4'e ayarlayın ve çözeltiyi Milli Q su ile 200 mikrolitreye getirin. Şimdi çanağı inkübatörden çıkarın ve iç jel kubbesinin üzerine yavaşça 180 mikrolitre dış jel çözeltisi ekleyin.

Bu, iç çözeltiyi tamamen örtmeli ve kuyuyu doldurmalıdır. Solüsyonu karıştırmayın ve iç jel solüsyonuna dokunmaktan kaçının. Dış çözeltiyi çıkarırken bir kabarcık oluşursa, onu yırtmak veya pipete geri emmek için hızlı olun.

Bir diğer önemli adım, uygun bir jel arayüzünün elde edildiğinden emin olmaktır. Bu adımın anahtarı, dış jel solüsyonunu eklemektir. İç jel henüz onaylanmadığında.

Jelleşme kinetiği polimerizasyon durumuna göre değişebilir ve bu durumu önceden optimize etmek önemlidir: Dış jelin polimerize olmasına izin vermek için çanağı 45 dakika boyunca inkübatöre geri koyun. 45 dakika sonra, jel oldukça katı olmalıdır, ancak yine de yerinden çıkarılabilir, jeli tamamen batırmak için iki mililitre ılık ortam ekleyin. Bu, her iki ila üç günde bir taze ortam sağlanan konsantrik jel kültürünü tamamlar.

Günler içinde, hücreler göçlerini gözlemlemek için dış matrise göç etmeye başlayacak, hücreleri bir floresan izleyici ile boyayacaktır. İki mililitre besiyerini beş mikrolitre boya içeren taze besiyeri ile değiştirin ve inkübasyon süresinden sonra 30 dakika inkübe edin, kültürü yıkama başına iki ila üç dakika boyunca bir mililitre PB S3 kullanarak yıkayın. Yıkamalardan sonra, tabağı normal ortamla doldurun.

Ardından çanağı çevre kontrollü bir mikroskoba yerleştirin. Şimdi jel arayüzünün yanındaki dış jel bölgelerini taramak için bir kullanım hacmi ayarı kullanın. Tipik olarak, ZS yığınında beş mikron aralıklar kullanarak 100 mikron kalınlığındaki 647 mikron kare görünümlerde tarayın.

Ardından ara bölgeleri tarayın ve son olarak jelin dış kısımlarını tarayın. Kenar etkisinden muzdarip olabilecek hücrelerden kaçınmak için alt, üst veya yan yüzeylerin 50 mikronluk bölgelerini hariç tutun. Toplanan verilerden hücrelerin hareketini analiz etmek için öncelikle görüntü dosyalarını imas gibi veri analiz yazılımlarında açın.

Komutu seçerek başlayın surpass ve ardından komut yüzeyi. Bu, yüzeyleri izleme seçeneğini ortaya çıkarır. Zaman içinde, veri kümesi içindeki ilgilenilen bölgeyi, yani Kartezyen koordinatları ve zaman dilimini seçin.

Ardından, ilgilenilen bölgeden arka planı çıkarın. Bir hücreyi arka plan eleme nedeniyle kaybetmemek için, nesneye uyan en büyük küreyi seçin. Şimdi, tohum noktası çapını seçerek bağlı nesneleri bölün ve tüm tohum noktalarını sınıflandırmaya devam edin.

Bir sonraki adım, yüzeyi Şimdi manuel olarak sınıflandırmaktır. Aynı nesneye işaret eden çekirdek noktaları gruplandırın. Bunu, ilgilendiğiniz bölgedeki tüm zaman noktaları arasında yapın.

Son olarak, izleme tamamlandığında nesneleri izleyin, nesne izlerini sınıflandırın ve ardından bir elektronik tablo kullanarak analiz etmek için nicel veri setinin çıktısını alın. Birkaç günlük konsantrik jel kültürlerinden sonra, hücreler iç dış jel arayüzünü kırdı ve dış jeli istila etmeye başladı. Hücre popülasyonu ağırlıklı olarak radyal yönde dışa doğru yayılır.

Çeşitli kollajen yoğunluklarındaki dış jeldeki hücrelerin hareketi karşılaştırıldı. Görüntüleme sekiz saatlik bir süre boyunca gerçekleştirildi ve her örnekten yaklaşık 200 hücre yörüngesi hesaplandı. En ince matristeki hücreler en az mesafeyi hareket ettirdi.

Bu hesaplama, yalnızca radyal olarak dışa doğru göç eden hücreleri değil, tüm hücreleri hesaba kattı. Her durumda, kapsanan toplam mesafe net yer değiştirmeden daha büyüktü. Beklendiği gibi, kalıcılık, yer değiştirme ve mesafe arasındaki oran olarak hesaplandı.

0.4'lük kalıcılık değeri, bu hücrelerin doğası gereği zayıf bir yönlü göçe sahip olduğunu göstermektedir. Ortalama hız hesaplamaları, kollajen yoğunluğunun hücre hızını etkilemediğini gösterdi. Ters orantılı olan matris gözenek boyutu ve kollajen yoğunluğunun, migrasyon hızı üzerinde zıt etkiye sahip olması ve dolayısıyla birbirini dengelemesi mümkündür.

Bu videoyu izledikten sonra, eşmerkezli bir jel sisteminin nasıl kurulacağını ve hücrelerin bu göçünü 3D ortamda nasıl inceleyeceğinizi iyi anlamış olmalısınız. Bu prosedürü takiben, hücre ekstraksiyonu, mikroarray analizi gibi birçok başka şey yapabilirsiniz, burada göçün farklı zaman noktalarında belirli proteinlerin ne kadar ifade edildiği gibi ek soruları yanıtlamaya çalışabilirsiniz.