Fare Naif CD4 ⁺ T Hücre İzolasyonu ve In vitro T hücre alt içine Farklılaşma

Aşağıdaki prosedürün genel amacı, fare lenf düğümlerinden izole edilen naif CD dört pozitif T hücresini ve dalakları farklı T yardımcı alt kümelerine polarize etmektir. İn vitro olarak, bu, ilk olarak yetişkin yabani tip farelerden toplanan dalakların ve lenf düğümlerinin işlenmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adımda, CD dört pozitif hücre popülasyonu, manyetik boncuk ayırma ile zenginleştirilir ve daha sonra saf T hücresi işaretleyici ekspresyonu ile daha da sıralanır.

Son adımda, hücreler, çeşitli T yardımcı soylarına farklılaşmalarını indüklemek için T hücresi reseptörü aktive edici faktörler ve polarize edici sitokinler ile muamele edilir. Sonuçta akış sitometrisi. Elis A ve gerçek zamanlı PCR, T yardımcı hücre farklılaşmasının etkinliğini değerlendirmek için kullanılır.

Bu yöntem, spesifik moleküllerin ekspresyonu veya spesifik ilaçlarla tedavinin bir T hücresi yanıtının doğasını nasıl etkilediği gibi T yardımcı hücre alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Beş ila 10 haftalık bir C 57 siyah altı farenin uzuvlarını diseksiyon tahtasına sabitleyerek başlayın ve ardından alttaki periton dokusunu delmemeye dikkat ederek cildi anüsten çeneye kadar uzunlamasına kesin. Ardından, cildi açın ve lenf düğümünü tutmak için bir çift forseps kullanın ve dokuyu görüntüde belirtilen konumların her birinden ayırmak için başka bir forseps kullanın.

Her lenf nodu hasat edilirken,% 1 FBS veya PBS plus ile takviye edilmiş PBS içeren bir toplama kabına yerleştirin ve ardından peritonu dikkatlice açın ve dalağı çıkarın. Dalağı da toplama kabına yerleştirin ve CD için dört pozitif hücreyi zenginleştirmek için kabı bir buz kovasına aktarın. Dalaklardaki lenf düğümlerini, her biri steril forseps kullanarak üç mililitre PBS içeren iki ayrı 60 milimetrelik tabağa bölün.

Daha sonra, dalakların üzerine bir kare steril naylon ağ yerleştirin ve bir şırınga pistonunun başparmak tarafını kullanarak, dokunun neredeyse tamamı süspansiyona girene kadar bunları ağa hafifçe çarpın. Kalan çözünür kümeleri parçalamak için süspansiyonu birkaç kez yukarı ve aşağı sıkın ve ardından 15 mililitrelik konik bir tüpün açıklığının üzerine yeni bir naylon ağ parçası yerleştirin. Kalan kalıntıları temizlemek için süspansiyonu tüpe süzün.

Şimdi lenf düğümleri için mekanik ayrışmayı tekrarlayın ve filtrelenmiş hücrelerin her iki tüpünü de PBS plus ile doldurun. Daha sonra tüpleri birkaç kez ters çevirin ve hücreleri aşağı doğru döndürün. Lenf nodu peletini iki mililitre PBS'de yeniden askıya alın.

Dalak hücresi peletine fare başına bir CK çözeltisi olan bir mililitre buz gibi soğuk ekleyin. Bir dakika sonra, 10 mililitre PBS plus ile kırmızı kan hücresi lizizini durdurun. Tüpü ters çevirin ve hücreleri tekrar aşağı doğru döndürün.

Daha sonra dalak peletini 10 mililitre PBS plus içinde yeniden süspanse edin, lenf nodu hücrelerini ekleyin ve havuzlanmış hücre süspansiyonunu aşağı doğru döndürün. Bu süre, peleti 15 mikrolitre CD'de, 85 mikrolitre PBS artı fare başına seyreltilmiş dört manyetik boncukta dört santigrat derecede 15 ila 30 dakika boyunca yeniden süspanse edin. Daha sonra hücreleri 10 mililitre PBS plus ile seyreltin.

Süspansiyonu naylon bir süzgeçten geçirerek 15 mililitrelik yeni bir tüpe süzün ve hücreleri aşağı doğru döndürün. Yine, peleti fare başına 100 mikrolitre PBS plus'ta yeniden döndürün ve üreticinin talimatlarına göre manyetik boncuk seçimi ile CD için dört pozitif hücreyi pozitif olarak seçin. CD dört pozitif, pozitif hücre fraksiyonunu elde ettikten sonra, CD dört pozitif T hücresi fraksiyonunu ayırmak için hücreleri 10 mililitre PBS plus'ta yıkayın.

Daha sonra, hücreleri yıkadıktan sonra karanlıkta dört santigrat derecede 15 ila 30 dakika boyunca uygun floresan antikorlarla etiketleyin. Herhangi bir kalıntıyı temizlemek için etiketli hücreleri filtreleyin ve bunları buz üzerindeki bir faks tüpüne aktarın ve ışıktan koruyun, CD dört pozitif, CD 25 negatif CD 62 L, pozitif CD 44 negatif popülasyonunu tam RPMI ortamına ayırın. Tüm hücreler toplandığında.

Saf T hücrelerini taze, tam ortamda yıkayın. Daha sonra peleti yeniden süspanse edin ve tam RPMI, saf T hücrelerini sayın ve in vitro T yardımcı alt küme farklılaşmasını indüklemek için konsantrasyonu mililitrede 10 ila altı hücreye bir kez ayarlayın. Daha sonra, daha önce anti CD üç ve anti CD 28 ile kaplanmış hücre kültürü plakalarının her bir kuyusunu bir mililitre steril FBS içermeyen PBS ve plaka içinde yıkayın.

Hücreler son olarak kültür ortamını tabloda belirtildiği gibi uygun sitokinler ve bloke edici antikorlarla takviye eder ve hücreleri, kültürde dört ila beş gün sonra dört ila beş gün boyunca% 5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede inkübe eder. İn vitro diferansiye TH bir, TH iki indüklenebilir treg ve TH 17 kültürlerinden dört pozitif T hücresinin hücre içi sitokin boyaması yapılabilir. Her bir T hücresi alt kümesinin beklenen sitokin profilini sergilediğini doğrulamak için.

Gerçekten de, anti CD üç EIS ile 24 saatlik yeniden uyarımdan sonra, A, alt kümelerin hücre içi olarak eksprese edilen sitokin proteinlerinin karşılık gelen hücre dışı üretimini de sergilediğini gösterir. Soy spesifik transkripsiyon faktörleri için gerçek zamanlı PCR, in vitro farklılaşmış CD dört pozitif T hücresi alt kümesinin uygun transkripsiyon faktörü profillerini daha da doğrular. Bu videoyu izledikten sonra, saf CD dört pozitif T yardımcı hücresi elde etmek için aynalama lenf nodu ve dalak hücrelerinin nasıl izole edileceğini ve işleneceğini iyi anlamış olmalısınız.

Ayrıca, bu T hücrelerini TH bir, TH iki TH 17 veya ireg hücrelerine ayırabileceksiniz.