İnsan A53T aşırı eksprese eden transjenik farelerin beyninde Geliştirilmiş ELISA ile Hastalık ile ilişkili α-sinüklein tespiti α-sinüklein Mutasyona uğramış

Aşağıdaki deneyin genel amacı, Parkinson hastalığının bir transgenik fare modelinde hastalıkla ilişkili alfa süünelin birikimlerini nicel bir Eliza yaklaşımı kullanarak izlemektir. Bu, önce enjekte edilmemiş farelerin normal yaşlanmasına izin verilerek veya hasta M 83'ten alınan beyin özütü ile farelerin intra serebral olarak enjekte edilmesiyle gerçekleştirilir. Fareler klinik hastalığı geliştirip kurban edildikten sonra, farelerin beyin bölgeler ayrıştırılır.

Daha sonra her beyin bölgesinden homojen örnekler yüksek tuz tamponunda hazırlanır ve homojenler üzerinde Eliza gerçekleştirilerek her beyin bölgesindeki hastalıkla ilişkili alfa-süünelin miktarının belirlenmesi sağlanır. Eliza sonuçları, hastalıkla ilişkili alfa süünelin çoğunlukla kodal beyin bölgelerinde, mezensefala ve beyinsapına ve ayrıca farelerin omuriliğinde biriktiğini gösterir. Bu Eliza tekniğinin, önceki yöntemlere göre, örneğin western blot veya immünohistokimyadan daha hızlı ve güvenilir hastalıkla ilişkili alfa süünelin kantitatif analizini sağlaması avantajını sunar.

Bu deney modelinde, bu yöntem MA üç farelerin merkezi sinir sistemindeki bu proteinin birikim ve yayılmasını izlemeye yardımcı olabilir. Bu, klinik bilim gelişimine kadar beyin benzeri bir mekanizmanın dahil olduğunu düşündürür. Bu yöntemin daha ileri gelişmeleri, gelecekte serebral spinal sıvı veya muhtemelen değiştirilmiş alfa formları içeren kan gibi çeşitli biyolojik numunelerin çalışması için düşünülebilir. Bu prosedürün bir laboratuvar teknisyenimiz tarafından gösterileceğini belirtmek önemlidir.

Hayvanları içeren tüm prosedürler ve protokoller, EC direktifi 86 6 0 9 EEC ile uyumlu olup, Fransız Ulusal Komitesi olan comm ETH tarafından onaylanmıştır. Etik ve Hayvan Deneyleri Komitesi'nin gözönünde bulundurulması için, hayvanlar Leon Young'da uygun deney tesislerinde barındırılmış ve bakılmıştır. Farelerin ötanazi yapılıp beyin ve omurilik alındıktan sonra, metin protokolüne göre buz üzerinde bir tüm beyin bir Petri kabına yerleştirilmiştir.

İki koku ampulünden birini, ampulü hemen arkasından tutan forseps ile ayırarak başlayın. Aşağı doğru hareketle ampullü beyinden çıkarın, ardından ikinci ampulu benzer bir şekilde çıkarın. Şimdi beyni yerine sabit tutan forseps kullanarak, sol ve sağ korteksler arasına ikinci bir forseps takın ve ileriye doğru hareket ettirerek iki yarıyı ayırın.

Şimdi beyni yerleştirilmiş halde tutmaya devam edin. İkinci forsepsin korteksi iki milimetre arkasından yerleştirin ve yukarı doğru baskı uygulayarak korteksin hipokampus üzerinden çıkmasını sağlayın. Ardından hipokampustan başlayarak beynin ön tarafına doğru ilk korteks kısmını soyun.

İkinci yarıda da aynı şekilde işlemi tekrarlayın. Ardından açık forsepsin bir hipokampunun etrafına yerleştirin. Daha sonra forsepsin alt kısmını hafifçe kapatın ve hipokampusu hafifçe çıkarın.

İkinci hipokampusta da aynı şekilde tekrarlayın. Korsepsin bir striatumun arkasına yerleştirin ve beynden hafifçe ayırın. Beyinden kalan korteks kalıntılarını çıkarmak için forseps kullanın ve ardından ikinci satuyu çıkarın. Forsepsle serebellumu geri kalan beyinden ayırın ve serebellumun konturunu hafifçe bastırarak çıkarın.

Daha sonra forsepsin serebellumun arkasına yerleştirin ve forsepsin ön kısmını ileri doğru hareket ettirerek çıkarın. Serebellumun dört yuvarlak yapıdan oluşan ve beyinsapına bağlandığını açıkça görebilmeniz için forsepsin geniş kısmını kaldırarak yükseltin. Ardından bağlantı noktasında dikey bir kesi yapın ve beyinsapını çıkarın. Forsepsin mezensefala arkasından yerleştirin ve yukarı doğru hareket ettirerek kalan beyinden tamamen ayırın. Beyin homojeni hazırlamak için, kesilen beyin bölgelerine yeterli miktarda HS tamponu ekleyerek aşağıdaki tabloda gösterildiği gibi beklenen yüzde homojenizasyonunu elde edin.

Bo silika cam tüp ve tüp havanlarından oluşan bir doku öğütücü kullanarak, ezilmesi gereken bir beyin bölgesini tüpe dökün. Sonra havan A ile dokuyu 10 kez homojenize ederek ayırın. Daha sonra havan B'ye geçin ve dokuyu 20 kez daha homojenize edin.

Transfer pipeti kullanarak homojenizasyonu, 1.5 mililitrelik bir tüpe aktarın ve kalan beyin örnekleri ile homojenizasyonu tekrarlayın. Örnekleri dört derece Celsius'ta beş dakika boyunca 1000 G'de santrifüjleyin ve sonra süpernatantı toplayın ve 200 mikrolitrelik Ali Wattlara bölün. Sonraki Eliza analizi için eksi 80 derece Celsius'ta saklayın. Beyin homojenizasyonunda Eliza gerçekleştirmek için.

50 mikromolar karbonat tamponunu kullanarak, kaplama anti alfa süünelin, tavşan poliklonal veya monoklonal klon 42 antikorunun 0.01 nanogram/mililitre konsantrasyonuna seyreltin. 100 mikrolitre antikor kaplama solüsyonu ile 96 kuyuluk bir mikroplak kuyularını kaplamak ve dört derece Celsius'ta bir gece boyunca inkübe edin. Ertesi gün, kuyulara 300 mikrolitre PBST ekleyin ve plaka yıkayıcıyı kullanarak oda sıcaklığında çalışırken plakaları beş kez yıkayın.

İleriye doğru, her ku