Name: İnsan A53T aşırı eksprese eden transjenik farelerin beyninde Geliştirilmiş ELISA ile Hastalık ile ilişkili α-sinüklein tespiti α-sinüklein Mutasyona uğramış (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 1 s
Description: Öğrenin, transgenik farelerde geliştirilmiş ELISA ile hastalık ilişkili α-sinüklein birikimini nicel olarak tespit etme yöntemini. Bu teknik, sinükleinopati araştırmalarında hızlı ve güvenilir protein ölçümü sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar aşılar için Damien Gaillard teşekkür ve takibinde hayvan deneyleri istiyoruz. Bu eser Anses (Gıda, Çevre ve İş Sağlığı ve Güvenliği Fransız Ajansı) tarafından ve Vakıf Fransa Parkinson bir hibe ile desteklenmiştir.

Tüm prosedürler ve hayvanları da içeren protokoller EC Direktifi 86/609 / EEC ve Cometh, hayvan deneyleri (protokol 11-0043) etik dikkate Fransız ulusal komitesi tarafından onaylanmış uygun idi. hayvanların barındırıldığı ve Anses en (0801 69387 onay B) Lyon deneysel tesisleri onaylı bakım için. Fareler 1. Hazırlık <ol><li> Sodyum pentobarbital öldürücü dozun intraperitoneal enjeksiyonu ile farelere Euthanize. </li><li> Fare kafatası tüm beyin almak ve ekstraksiyon kadar buz üzerinde 35 mm plastik Petri kabı yerleştirin. </li><li> Servikal spinal kord ayıklayın. NOT: Özü aS ya Tablo 1&#39;de listelenen deneyler sonra kullanılabilir sagital kesit sonra veya disseke fare beyinleri beyin yarım birinden gelen. </li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Experiment </td><td> Fareler Aşı (beyin eşdeğeri) </td><td> Survival dönemi (Dpi) </td><td> Medyan / maksimum sağkalım (Gün eski) </td><td> ELISA ile D algılama aS / WB / İHK </td></tr><tr><td> 1 </td><td> Aşılanmamış fareler </td><td> 441 ± 166 </td><td> 419/736 </td><td> 8/8 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> Aşılanmış fareler (0.2 mg), </td><td> 150 ± 52 </td><td> 140/241 </td><td> 9/9 </td></tr></tbody></table> M83 fareler üzerinde gerçekleştirilen deneylerin Tablo 1. listesi. Aşılama sonrası, (glikoz içinde% 1 ağırlık / hacim,% 5), hasta bir fare beyin homojenatının 20 ul ile striato-kortikal bölgede Deney 2 6 hafta uygulandı % 3 izofluran inhalasyon yoluyla 6 haftalık homozigot M83 farelerin anestezi. dpi: gün inokülasyonu sonrasıtirme. Beyin Yarısı 2. aS Ekstraksiyon <ol><li> Sagittally iki yarısını elde etmek için beyin kesti. Öğütme topları içeren bir ribolysis tüp içinde her yarım tartılır. </li><li> 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 750 mM NaCI, 5 mM EDTA, 1 mM DTT,% 1 fosfataz ve proteaz inhibitörü kokteyli içeren yüksek tuz (HS), tampon hazırlayın. % 20 (ağırlık / hacim) homojenatları elde etmek için, beyin yarısı yüksek tuz tamponu ekleyin. </li><li> 6.0 m mekanik homojenleştirici kullanarak beyin yarıları örnekleri hazırlayın / s 23 sn kez. Ilk 23 saniye homojenize edildikten sonra ikinci bir 23-sek çevriminden önce 2 dakika için buz üzerinde homojenatları içeren tüpleri. </li><li> 5 dk öğütülmemiş beyin parçalarını ortadan kaldırmak için 1000 xg&#39;de örnekleri santrifüj. 200 ul alikotlara bölünür ve daha sonra ELISA analizi için -80 ° C&#39;de saklayın, süpernatantlar kurtarmak. </li></ol> Dissected Beyin Bölgeler 3. aS Ekstraksiyon <ol><li> Teşrih biruçları, hipokampus kesme dışında bir arada tutulur, iki forcipes kullanarak düşük güç büyüteç (8 x büyütme) ile buz üzerinde 35 mm&#39;lik plastik Petri tabağı içine tüm beyin. Beyin bütünlüğünü korumak için 10 dakika aşmayın. Beyin yerleştirin sağ yan ve bu sırayla şu beyin bölgelerinin almak: <ol><li> Sadece ampul arkasına yerleştirilen forseps kullanılarak iki koku ampuller Ayrı biri. Bir aşağı hareket ile beyinden ayırmak. İkinci ampul bu işlemi tekrarlayın. </li><li> Yavaşça iki kortekste arasında forseps kama ve iki korteks ayrılmasını kolaylaştırmak için ileriye doğru hareket ettirin. Bir forseps ile yerine beyin tutulması, hipokampus gelen korteks ayırmak için başka kullanabilirsiniz. </li><li> Forseps korteks altında 2 mm yerleştirin. Hipokampus üst görünür oluncaya kadar forseps üzerinde hafif bir baskı koruyun. Korteksin ilk bölümü soyulabilir ve ikinci bölümü ile tekrarlayın. İki korteks ayırmak için forseps kullanabilirhipokampus başlayan ve beynin ön tarafına doğru hareket. </li><li> Hippocampi biri etrafında açık forseps yerleştirin. Daha sonra yavaşça mümkün olduğu kadar geri kazanılması, çıkarmak hipokamp altındaki forseps kapatın. İkinci hipokampus için prosedürü tekrarlayın. </li><li> Striatasından birinin altındaki açık forseps yerleştirin ve yavaşça beynin ayırın. Striatum kalan korteks kaldırmak için forseps kullanın. İkinci striatum için bu yordamı yineleyin. </li><li> Yavaşça beyin beyincik ayrılmasını kolaylaştırmak için, 2 mm beyincik konturu tarafından bastırmak için forseps kullanın. Sadece beyincik arkasında forseps yerleştirin ve ileri forseps hareket ettirerek çıkarın. </li><li> Beyin sapını birleştiği yerde açıkça görmek için mesencephalon yükseltmek için forseps geniş kısmını kullanın. Kavşakta dikey kesi daha sonra beyin sapı çıkarın olun. </li><li> , Mezensefalona arkasındaki forseps yerleştirin hangi idört yuvarlak yapılardan oluşur s. Mezensefalon tamamen geriye kalan beyin ayrılmış kadar dikey olarak İnsizyon. </li></ol></li><li> Değişken% HS tampon maddesi içinde (ağırlık / hacim), mevcut dokuların miktarına bağlı olarak, örneğin, 10 ve 30 mg arasında bir ağırlık için% 5 homojenat, 30 ve 80 mg arasında bir ağırlık için% 10 ve% 20 arasında homojenatları hazırlanması 80 mg üzerinde bir ağırlık. <ol><li> Homojenat beklenen% elde etmek için parçalandı beyin bölgelerine HS tamponu yeterli hacim. </li><li> Vortex ve dokular tamamen HS tamponu dalmış olup olmadığını kontrol edin. </li><li> Borosilikat cam tüp ve iki havan tokmaklarının, A ve B oluşan bir doku öğütücüsüyle kesilerek beyin bölgelerinde veya servikal spinal kord hazırlanabilir örnekleri homojenize </li><li> Tüp içine doğrudan ezilmiş olan her beyin bölgesini dökün. Tüpe havaneli A yerleştirin ve geri çekin. Doku ayırmak Bu hareketi yaklaşık on kez tekrarlayın. Ardından c havaneli B kullanınBir başka 20 hareketleri ile doku taşlama ontinue. 1 ml transfer pipet ile 1.5 ml tüp içine homojenatları aktarın. </li></ol></li><li> Herhangi bir öğütülmemiş beyin parçaları ortadan kaldırmak için 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 1000 x g&#39;de örnekleri santrifüjleyin. Süpernatanlar Al 200 ul alikotları bunları ayırmak ve daha sonra ELISA analizi için -80 ° C &#39;de muhafaza edin. </li></ol> ELISA ile aS 4. Algılama <ol><li> 0.01 ng / ml kaplama antikorları sulandırmak. 50 mM Na-2 CO 3 / NaHCO 3 tamponu (pH 9.6), anti-aS tavşan poliklonal ya da monoklonal antikor klon 42 kullanın. </li><li> Ceket 96 oyuklu mikro-plakalar bu kaplama çözeltisi, oyuk başına 100 ul ve 4 ° CO / N bırakın. Saptama antikorları syn514 kullanılarak ELISA kaplama çözeltisi içinde, anti-aS tavşan poliklonal antikoru kullanarak 42, LB509, AS11, 4D6 ve 8A5 klonu. Bir kaplama solüsyonu gibi anti-aS monoklonal antikor klon 42 kullanınAnti-pSer129 aS algılama antikoru ile kombinasyon halinde. Not: plakalar ELISA önce bir hafta boyunca 4 ° C&#39;de muhafaza edilebilir, gerekli ise gerçekleştirilir. </li><li> Oyuk başına% 0.05 Tween 20 (PBST) ile fosfat tamponlu tuz çözeltisi, 300 | il ile beş kez yıkamak için bir levha yıkayıcı kullanın. Başlar ve bu adımdan, inkübasyon, oda sıcaklığında yer almaktadır. </li><li> T20 PBS kuyu başına tampon engelleme 200 ul ekleyin. 150 rpm&#39;de 1 saat boyunca çalkalanır. PBST ile plakalar beş kez yıkayın. </li><li> (% 20 homojenatlarının 100,% 10 homojenatlarının 1:50 ve PBST BSA% 1% 5 homojenatlarının 1:25 seyreltme 1) ve her bir kuyucuğa 100 ul Beyin homojen seyreltilir. 150 rpm&#39;de çalkalanarak daha sonra 2 saat süreyle inkübe edin. PBST ile plakalar beş kez yıkayın. </li><li> Malzeme Listesi&#39;nde belirtilen sulandırmalarda BSA ile PBST% 1 farklı aS algılama antikorları ekleyin. 150 rpm&#39;de 1 saat süreyle inkübe edin. PBST ile plakalar beş kez yıkayın. </li><li> Anti-ya Ekle150 rpm&#39;de çalkalanarak 1 saat boyunca% 1 BSA ile desteklenmiş PBST içinde 8000: -fare ya da anti-tavşan IgG HRP konjügatları 1 seyreltilmiştir. PBST ile plakalar beş kez yıkayın. </li><li> Her oyuğa, 5,5&#39;-tetrametilbenzidin (TMB) çözeltisine 3,3 &#39;100 ul ilave edin ve 150 rpm&#39;de çalkalanarak karanlıkta 15 dakika boyunca inkübe edin. </li><li> De o zaman mikro levha okuyucusu ile 450 nm&#39;de absorbans ölçümü için 1 N HCI, 100 ul ilave ederek reaksiyonu durdurun. </li><li> Veri analizi için, analiz edilen örneklerin her biri için, ölçülen OD değerleri herhangi bir fare beyin örneklerindeki (boş oyuk) dışındaki tüm reaktifleri ile iyi olarak elde edilen OD değerini çıkarın. </li></ol> 5. Epitop Haritalama <ol><li> Osman 16 tarafından tarif edilen metoda göre, epitop eşleme gerçekleştirin. Kısaca, 10 üst üste binen amino asitlerin nitroselüloz üzerinde 12 amino asidini ihtiva eden insan α-sinüklein dizisinin Noktası peptidler. </li><li> 50 mM Tris / 150 mM NaCl tamponu, pH 1 ile bloke0% 0.05 Tween 20 ve% 5 süt tozu ihtiva etmektedir. 2-10 ° CO / H de ml başına 2 ug antikorun bir konsantrasyonda çözelti engelleme antikor inkübe edin. </li><li> Membranı 50 mM Tris / 150 keçi anti-fare IgG HRP konjügatı ile% 0.05 Tween 20 ihtiva eden inkübe mM NaCI tampon pH 10 ile üç kez yıkayın. Daha sonra aynı tampon kullanarak başka beş kez bir Western Blot TMB boyama kiti kullanılarak leke membran yıkayın. </li></ol> 6. İstatistiksel Analiz <ol><li> OD model karışık etkiler regresyon gerçekleştirmek için R yazılım ve nlme paketi kullanın. Her bir karşılaştırma için, karışık bir etkisi regresyon modeli yerine getirir. Asemptomatik gruplardan semptomatik ayırt etmek için bir sabit efektini kullanın. </li><li> Belirli bir fare tekrarlar değişkenliği yansıtacak şekilde rastgele efektini kullanın. Artıklar inceleyerek homoscedasticity edin ve gerekirse Pinheiro ve Bates 1 doğrultusunda grup içi hataların varyans yapısını modellemek için varyans işlevlerini kullanın7. P. önemi eşiği olarak 0.05 ayarla </li></ol>

<ol><li>Goedert, M., Spillantini, M. G., Del Tredici, K., Braak, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((100+years+of+Lewy+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurol%22%5BJournal%5D)">100 years of Lewy pathology.</a> Nat Rev Neurol. 9, 13-24 (2013).</li>
<li>Waxman, E. A., Giasson, B. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specificity+and+regulation+of+casein+kinase-mediated+phosphorylation+of+alpha-synuclein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuropathol+Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Specificity and regulation of casein kinase-mediated phosphorylation of alpha-synuclein.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 67, 402-416 (2008).</li>
<li>Anderson, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation+of+Ser-129+is+the+dominant+pathological+modification+of+alpha-synuclein+in+familial+and+sporadic+Lewy+body+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation of Ser-129 is the dominant pathological modification of alpha-synuclein in familial and sporadic Lewy body disease.</a> J Biol Chem. 281, 29739-29752 (2006).</li>
<li>Mougenot, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prion-like+acceleration+of+a+synucleinopathy+in+a+transgenic+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Aging%22%5BJournal%5D)">Prion-like acceleration of a synucleinopathy in a transgenic mouse model.</a> Neurobiol Aging. 33, 2225-2228 (2012).</li>
<li>Luk, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracerebral+inoculation+of+pathological+alpha-synuclein+initiates+a+rapidly+progressive+neurodegenerative+alpha-synucleinopathy+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Intracerebral inoculation of pathological alpha-synuclein initiates a rapidly progressive neurodegenerative alpha-synucleinopathy in mice.</a> J Exp Med. 209, 975-986 (2012).</li>
<li>Giasson, B. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+alpha-synucleinopathy+with+severe+movement+disorder+in+mice+expressing+A53T+human+alpha-synuclein%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Neuronal alpha-synucleinopathy with severe movement disorder in mice expressing A53T human alpha-synuclein.</a> Neuron. 34, 521-533 (2002).</li>
<li>Luk, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathological+alpha-synuclein+transmission+initiates+Parkinson-like+neurodegeneration+in+nontransgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Pathological alpha-synuclein transmission initiates Parkinson-like neurodegeneration in nontransgenic mice.</a> Science. 338, 949-953 (2012).</li>
<li>Masuda-Suzukake, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prion-like+spreading+of+pathological+alpha-synuclein+in+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+%3A+a+journal+of+neurology%22%5BJournal%5D)">Prion-like spreading of pathological alpha-synuclein in brain.</a> Brain : a journal of neurology. 136, 1128-1138 (2013).</li>
<li>Sacino, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloidogenic+alpha-synuclein+seeds+do+not+invariably+induce+rapid%2C+widespread+pathology+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+neuropathologica%22%5BJournal%5D)">Amyloidogenic alpha-synuclein seeds do not invariably induce rapid, widespread pathology in mice.</a> Acta neuropathologica. 127, 645-665 (2014).</li>
<li>Recasens, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lewy+body+extracts+from+parkinson%27s+disease+brains+trigger+alpha-synuclein+pathology+and+neurodegeneration+in+mice+and+monkeys%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Neurol%22%5BJournal%5D)">Lewy body extracts from parkinson's disease brains trigger alpha-synuclein pathology and neurodegeneration in mice and monkeys.</a> Ann Neurol. , (2013).</li>
<li>Foulds, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylated+alpha-synuclein+can+be+detected+in+blood+plasma+and+is+potentially+a+useful+biomarker+for+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Phosphorylated alpha-synuclein can be detected in blood plasma and is potentially a useful biomarker for Parkinson's disease.</a> FASEB J. 25, 4127-4137 (2011).</li>
<li>El-Agnaf, O. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+oligomeric+forms+of+alpha-synuclein+protein+in+human+plasma+as+a+potential+biomarker+for+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Faseb+J%22%5BJournal%5D)">Detection of oligomeric forms of alpha-synuclein protein in human plasma as a potential biomarker for Parkinson's disease.</a> Faseb J. 20, 419-425 (2006).</li>
<li>Lee, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzyme-linked+immunosorbent+assays+for+alpha-synuclein+with+species+and+multimeric+state+specificities%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neruosci+Meth%22%5BJournal%5D)">Enzyme-linked immunosorbent assays for alpha-synuclein with species and multimeric state specificities.</a> J Neruosci Meth. 199, 249-257 (2011).</li>
<li>Unterberger, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+disease-associated+alpha-synuclein+in+the+cerebrospinal+fluid%3A+a+feasibility+study%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">Detection of disease-associated alpha-synuclein in the cerebrospinal fluid: a feasibility study.</a> Clin Neuropathol. 33, 329-334 (2014).</li>
<li>Betemps, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpha-synuclein+spreading+in+M83+mice+brain+revealed+by+detection+of+pathological+alpha-synuclein+by+enhanced+ELISA%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol.+%28Berl%29%22%5BJournal%5D)">Alpha-synuclein spreading in M83 mice brain revealed by detection of pathological alpha-synuclein by enhanced ELISA.</a> Acta Neuropathol. (Berl). 2, 29(2014).</li>
<li>Osman, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+monoclonal+antibody+that+recognizes+a+potential+coeliac-toxic+repetitive+pentapeptide+epitope+in+gliadins%29%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Gastroenterol+Hepatol%22%5BJournal%5D)">A monoclonal antibody that recognizes a potential coeliac-toxic repetitive pentapeptide epitope in gliadins).</a> Eur J Gastroenterol Hepatol. 13, 1189-1193 (2001).</li>
<li>Pinheiro, J. C., Bates, D. M. Ch. 5. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPinheiro%2C+JC+%22Mixed-Effects+Models+in+S+and+S-PLUS%22">Mixed-Effects Models in S and S-PLUS</a>. Chambers, J. 5, Springer. 206-225 (2000).</li>
<li>Mougenot, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+a+monoclonal+antibody%2C+against+human+alpha-synuclein%2C+in+a+subpopulation+of+C57BL%2F6J+mice%2C+presenting+a+deletion+of+the+alpha-synuclein+locus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neruosci+Meth%22%5BJournal%5D)">Production of a monoclonal antibody, against human alpha-synuclein, in a subpopulation of C57BL/6J mice, presenting a deletion of the alpha-synuclein locus.</a> J Neruosci Meth. 192, 268-276 (2010).</li>
<li>Specht, C. G., Schoepfer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deletion+of+the+alpha-synuclein+locus+in+a+subpopulation+of+C57BL%2F6J+inbred+mice%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Deletion of the alpha-synuclein locus in a subpopulation of C57BL/6J inbred mice.</a> BMC Neurosci. 2, 11(2001).</li>
<li>Lee, B. R., Matsuo, Y., Cashikar, A. G., Kamitani, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Ser129+phosphorylation+of+alpha-synuclein+in+melanoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Role of Ser129 phosphorylation of alpha-synuclein in melanoma cells.</a> J Cell Sci. 126, 696-704 (2013).</li>
<li>Perrin, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epitope+mapping+and+specificity+of+the+anti-alpha-synuclein+monoclonal+antibody+Syn-1+in+mouse+brain+and+cultured+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">Epitope mapping and specificity of the anti-alpha-synuclein monoclonal antibody Syn-1 in mouse brain and cultured cell lines.</a> Neurosci Lett. 349, 133-135 (2003).</li>
<li>Emmanouilidou, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+alpha-synuclein+secretion+in+mouse+and+human+brain+parenchyma%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Assessment of alpha-synuclein secretion in mouse and human brain parenchyma.</a> PLoS One. 6, e22225(2011).</li>
<li>Mougenot, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmission+of+prion+strains+in+a+transgenic+mouse+models+overexpressing+human+A53T+mutated+alpha-synuclein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuropathol+Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Transmission of prion strains in a transgenic mouse models overexpressing human A53T mutated alpha-synuclein.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 70, 377-385 (2011).</li>
<li>Foulds, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+longitudinal+study+on+alpha-synuclein+in+blood+plasma+as+a+biomarker+for+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">A longitudinal study on alpha-synuclein in blood plasma as a biomarker for Parkinson's disease.</a> Sci Rep. 3, 2540(2013).</li>
</ol>

Yazarların açığa çıkarılacak hiçbir çelişkili çıkarı yoktur.

bir ELISA kullanımı özellikle M83 transjenik fare modelinde hastalıktan sırasında fare beyni homojenatlarında şirketinden aS D tespit etmek için ortaya konmuştur. Nitekim, bu ELISA kolayca Yüksek Tuz tamponunda sadece tüm beyin homojenatları kullanarak sağlıklı M83 farelerden elde edilen hasta M83 fareler ayırt olabilir. Bu ELISA kullanılarak başarılı sonuçlar için en kritik adımlar şunlardır: doğru diseksiyon sırasında zarar görmesini önlemek için gerekli el becerisi geliştirerek...

Parkinson hastalığı (PD) ile ilişkili α-sinükleinin (αSD) tespiti için mevcut yöntemlerin çoğu, immünohistokimya veya Western blot gibi, deneysel modellerde zaman alıcıdır ve nicel değildir. Bu nörodejeneratif hastalık, normalde çözünür presinaptik protein olan αS1,2 (Lewy cisimcikleri ve Lewy nöritleri) olan agrega formlarını içeren inklüzyonlar şeklinde alfa-sinüklein agregasyonu ile karakterizedir. Normalde sadece marjinal olarak fosforile edilen αS, bu inklüzyonlarda3 serin 129 residösünde hiperfosforile edilir ve Ser129 fosforile edilmiş αS'ye özgü antikorlarla izlenebilir, böylece patolojinin güvenilir bir belirtecini sağlar.
Son araştırmalar, etkilenen bir hastanın sinir sistemi içinde αS agregasyonunun yayılmasında bir "prion benzeri" mekanizmanın rol oynayabileceğini öne sürmektedir4,5. Bu çalışmalar, A53T mutasyonlu bir insan αS proteini ile ilişkili ciddi bir motor bozukluğu olan (M83) transgenik bir fare modeline (M83) αSD içeren beyin ekstreleri enjekte ederek bir sinükleinopatinin hızlandığını bildirmiştir6. Aynı şekilde, aynı M83 fare modeline agregalı rekombinant αS'nin intraserebral enjeksiyonu agregasyonun hızlandığını doğrulamıştır5. Fosforile αS tortularının indüksiyonu, C57Bl/6 vahşi tip farelere fibriller rekombinant αS veya insan DLB hastalarından elde edilen beyin ekstreleri enjekte edildikten sonra da rapor edilmiştir7,8. Sacino et al.9 son zamanlarda, fibriller insan αS'nin enjeksiyonu sonrasında M83 farelerinde yaygın ve ilerleyici bir serebral αS inklüzyon oluşumunun indüklenebileceğini, ancak E46K transgenik farelerinde veya indüklenen αS inklüzyonlarının geçici ve çoğunlukla enjeksiyon bölgesine kısıtlı olduğu non-transgenik farelerde bu oluşumun indüklenemeyeceğini belirttiler. Son zamanlardaki maymunlar üzerinde yapılan çalışmalar, PD türevli ekstrelerin insanlara daha yakın türlere enjeksiyonu sonrasında αS agregalarının yayıldığını doğrulamıştır10.
αS değişiklikleri ve Parkinson hastalığı arasındaki bağlantı, αSD'nin Parkinson hastalığı için potansiyel bir biyobelirteç olduğunu öne sürmektedir11. Son zamanlarda yapılan bir çalışma, oligomerik çözünür α-sinüklein agregalarının insan serebrospinal sıvısı (CSF) ve plazmasında, konvansiyonel bir sandviç sistemi ELISA kullanarak αS'yi yakalamak ve tespit etmek için aynı antikoru kullanarak Parkinson hastalığı için potansiyel bir biyobelirteç olarak tespit edildiğini göstermiştir12. Aynı yönteme dayanarak, biyolojik numunelerde, dahil olmak üzere beyin, birleştirilmiş formlarda mevcut olan çoklu epitop kopyaları olduğu için multimerik proteinler tanınmıştır13. Çok yakın zamanda, Lewy cisimciği patolojisi kanıtlanmış hastaların CSF'sinde patolojik αS, hem αSD (5G4)’ye karşı oldukça spesifik bir antikoru içeren bir ELISA kiti ile hem de bir immünopresipitasyon analizi kullanılarak tespit edilmiştir14. Bu yöntemler, PD/DLB olan hastaları diğer demans tiplerinden ayırt edebilir.
αS agregasyonunun "prion benzeri" yayılması, M83 transgenik fare modelinde, özellikle αSD'yi tanımlamak için tasarlanmış bir ELISA yaklaşımı kullanarak daha da çalışılmıştır15. Bu çalışmada, hasta M83 farelerinden αSD ile aşılanmış olsun ya da olmasın, özellikle bu M83 transgenik fare modelinde patolojik sürece özgü olarak hedef alan beyin bölgelerine göre αSD'yi kantitatif olarak tespit etmek için kullanılan detaylı ELISA protokolünü rapor etmekteyiz4.

<table><tbody><tr><td>LB509</td><td>Abcam</td><td>ab27766</td><td>Tespit antikoru 1/2.000</td></tr><tr><td>AS11</td><td>Produced at Anses</td><td></td><td>Tespit antikoru 1/1.000</td></tr><tr><td>4D6</td><td>Abcam</td><td>ab1903</td><td>Tespit antikoru 1/2.000</td></tr><tr><td>PSer129</td><td>Abcam</td><td>ab59264</td><td>Tespit antikoru 1/3.000</td></tr><tr><td>PSer129&nbsp;EP1536Y</td><td>Abcam</td><td>ab51253</td><td>Tespit antikoru 1/1.000</td></tr><tr><td>syn514</td><td>Abcam</td><td>ab24717</td><td>Tespit antikoru 1/500</td></tr><tr><td>clone 42</td><td>BD Biosciences</td><td>610787</td><td>Kaplama ve tespit antikoru (1/2.000)</td></tr><tr><td>8A5</td><td>Provided by Dr. Anderson</td><td></td><td>Tespit antikoru 1/2.000</td></tr><tr><td>polyclonal anti-&alpha;syn antikoru</td><td>Millipore</td><td>AB5038P</td><td>Kaplama antikoru</td></tr><tr><td>Anti-mouse IgG HRP konjugesi</td><td>Southern Biotech</td><td>1010-05</td><td></td></tr><tr><td>Anti-rabbit IgG HRP konjugesi</td><td>Southern Biotech</td><td>4010-05</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-mouse IgG HRP konjugesi</td><td>Dianova</td><td>115-035-164</td><td></td></tr><tr><td>HS tamponu</td><td></td><td></td><td>pH 7,5'te ayarlanmış, 4 &#176;C'de muhafaza</td></tr><tr><td><ul>
<li>Tris-HCl 50&nbsp;mM </li>
</ul></td><td>Euromedex</td><td>26-128-3094-B</td><td></td></tr><tr><td><ul>
<li>NaCl 750 mM </li>
</ul></td><td>Euromedex</td><td>1112-A</td><td></td></tr><tr><td><ul>
<li>EDTA 5 mM </li>
</ul></td><td>Euromedex</td><td>EU0007-B</td><td></td></tr><tr><td><ul>
<li>DTT 1 mM </li>
</ul></td><td>Sigma</td><td>43815</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td></td><td></td><td>pH 7,5'te ayarlanmış</td></tr><tr><td><ul>
<li>Na2HPO4 1&nbsp;mM </li>
</ul></td><td>Euromedex</td><td>1309</td><td></td></tr><tr><td><ul>
<li>KH2PO4 1.5&nbsp;mM </li>
</ul></td><td>Euromedex</td><td>2018</td><td></td></tr><tr><td><ul>
<li>NaCl&nbsp; 137 mM </li>
</ul></td><td>Euromedex</td><td>1112-A</td><td></td></tr><tr><td><ul>
<li>KCl 2.7 mM </li>
</ul></td><td>Euromedex</td><td>P017</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Euromedex</td><td>2001-C</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>DTT 1 mM</td><td>Sigma</td><td>43815</td><td>Stoka 100 mM, toksik</td></tr><tr><td>1% fosfataz kokteyli</td><td>Pierce</td><td>78428</td><td></td></tr><tr><td>1% proteaz inhibitör kokteyli</td><td>Roche</td><td>04&nbsp;693&nbsp;132&nbsp;001</td><td>50x konsantre</td></tr><tr><td>Microplate MaxiSorpTM</td><td>Thermo Scientific</td><td>442404</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Karbonat tamponu 50 mM pH 9,6</td></tr><tr><td><ul>
<li>Na2CO3, 10H2O </li>
</ul></td><td>Sigma</td><td>71360</td><td>2,86 g/L</td></tr><tr><td><ul>
<li>NaHCO3 </li>
</ul></td><td>Merk</td><td>6329</td><td>3,36 g/L, pH&nbsp;9,6</td></tr><tr><td>Superblock T20 PBS blokaj tamponu</td><td>Pierce</td><td>E6423H</td><td>10x konsantre</td></tr><tr><td>TMB</td><td>Sigma</td><td>T0440</td><td>ELISA için kullanılır</td></tr><tr><td>TMB</td><td>Analytik Jena AG</td><td>847-0104200302</td><td>Epitop haritalaması için kullanılır</td></tr><tr><td>HCl 1&nbsp;N</td><td>Chimie plus</td><td>40030</td><td></td></tr><tr><td>Ribolyser</td><td>Thermo</td><td>Fast prep FP120</td><td>bu adımda buz üzerinde muhafaza</td></tr><tr><td>Ezme tüpleri</td><td>Biorad</td><td>355-1197</td><td></td></tr><tr><td>Plaka yıkayıcı</td><td>Tecan</td><td>Columbus Pro</td><td></td></tr><tr><td>Plaka okuyucu</td><td>Biorad</td><td>Model 680</td><td></td></tr><tr><td>Düşük güçlü büyüteç&nbsp;</td><td>VWR</td><td>630-1062</td><td>8X büyütme</td></tr><tr><td>Dumont#7 forseps</td><td>WPI</td><td>14097</td><td>Diseksiyon adımları için</td></tr><tr><td>Transfer pipeti 1ml Samso</td><td>Samso</td><td>043231</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml tüpler</td><td>Dutscher</td><td>033290</td><td></td></tr></tbody></table>

İnsan a53t aşırı eksprese eden transjenik farelerin beyninde geliştirilmiş elisa ile hastalık ile ilişkili α-sinüklein tespiti α-sinüklein mutasyona uğramış

Detection of Disease-associated &#945;-synuclein by Enhanced ELISA in the Brain of Transgenic Mice Overexpressing Human A53T Mutated &#945;-synuclein

Western blot gibi bilinen metotlara ek olarak, yeni yöntemler hızlı ve kolay bir sinükleopatiler deneysel modellerinde hastalıkla ilişkili α-sinüklein (aS D) ölçmek için ihtiyaç vardır. Aşırı ifade eden insan A53T aS ve kendiliğinden kilo kaybı, bitkinlik, ve ağır motor bozukluğu dahil olmak üzere semptomlarla karakterize Sekiz ve 22 ay arasında bir dramatik klinik fenotip üreten bir transjenik fare soyu (M83), bu çalışmada kullanılmıştır. Bu farelerde aS D (hastalıkla ilişkili aS) moleküler analiz için, bir ELISA, özellikle hasta farelerde aS D ölçmek için tasarlanmıştır. Bu fare modeli, merkezi sinir sistemi analizi esas kaudal beyin bölgelerinde ve omurilikteki aS D varlığını göstermiştir. Yani klinik hastalığa yol açan farklı deneysel koşullar arasında aS D dağılımında farklılıklar uninocul de vardıated ve normal transgenik fareler yaşlanma ve hastalık farelerden alınan beyin özleri ile aşılanmış farelerde. Ser129 karşı bir antikor kullanılarak aS D imünoreaktivite spesifik tespiti esas olarak Western Blot ve immünohistokimya ile elde edilen korelasyon ELISA ile aS fosforile. Beklenmedik bir şekilde, benzer bir sonuç aS C-terminal kısmına karşı birkaç diğer antikorlar ile gözlendi. Bir &quot;prion gibi&quot; mekanizmasının rolünü düşündürmüştür aS D yayılması, böylece kolayca izlenebilir ve bir ELISA yaklaşımı kullanarak bu fare modelinde belirlenebilir.

Bu çalışmada kullanılan ELISA özel hasta M83 farelerden yüksek tuz tamponu içinde hazırlanan beyni homojenatlarında hastalıkla ilişkili aS (aS D) tanımlanmıştır. Özellikle pSer129 aS (p = 0,0074) tanıyan bir antikor kullanarak, ELISA kolaylıkla genç (eski 2-5 ay), sağlıklı M83 farelerde (Şekil 1) eski, hasta farelerin (&gt; 8 aylık) ayırır. Birkaç diğer antikorlar benzer şekilde yüksek sinyaller sadece hasta farelerin beyin homojenatlanndaki (&gt; 0.6 OD) gösterdi. Bu 4D6 durum (p = 0.01) pro...

Yeni bir kantitatif yaklaşım sunan bir ELISA açıklanmaktadır. Spesifik olarak, bir transgenik fare modeli (M83) içindeki (M83) sinoleinopatide, Ser129 fosforile αS formu veya proteinin C-terminal kısmına karşı çeşitli antikorlar kullanarak hastalıkla ilişkili α-sineulini (αSD) tespit etmektedir.

İnsan A53T aşırı eksprese eden transjenik farelerin beyninde Geliştirilmiş ELISA ile Hastalık ile ilişkili α-sinüklein tespiti α-sinüklein Mutasyona uğramış

In addition to established methods like Western blot, new methods are needed to quickly and easily quantify disease-associated &#945;-synuclein (&#945;SD) ...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, Parkinson hastalığının bir transgenik fare modelinde hastalıkla ilişkili alfa süünelin birikimlerini nicel bir Eliza yaklaşımı kullanarak izlemektir. Bu, önce enjekte edilmemiş farelerin normal yaşlanmasına izin verilerek veya hasta M 83'ten alınan beyin özütü ile farelerin intra serebral olarak enjekte edilmesiyle gerçekleştirilir. Fareler klinik hastalığı geliştirip kurban edildikten sonra, farelerin beyin bölgeler ayrıştırılır.Daha sonra her beyin bölgesinden homojen örnekler yüksek tuz tamponunda hazırlanır ve homojenler üzerinde Eliza gerçekleştirilerek her beyin bölgesindeki hastalıkla ilişkili alfa-süünelin miktarının belirlenmesi sağlanır. Eliza sonuçları, hastalıkla ilişkili alfa süünelin çoğunlukla kodal beyin bölgelerinde, mezensefala ve beyinsapına ve ayrıca farelerin omuriliğinde biriktiğini gösterir. Bu Eliza tekniğinin, önceki yöntemlere göre, örneğin western blot veya immünohistokimyadan daha hızlı ve güvenilir hastalıkla ilişkili alfa süünelin kantitatif analizini sağlaması avantajını sunar.Bu deney modelinde, bu yöntem MA üç farelerin merkezi sinir sistemindeki bu proteinin birikim ve yayılmasını izlemeye yardımcı olabilir. Bu, klinik bilim gelişimine kadar beyin benzeri bir mekanizmanın dahil olduğunu düşündürür. Bu yöntemin daha ileri gelişmeleri, gelecekte serebral spinal sıvı veya muhtemelen değiştirilmiş alfa formları içeren kan gibi çeşitli biyolojik numunelerin çalışması için düşünülebilir. Bu prosedürün bir laboratuvar teknisyenimiz tarafından gösterileceğini belirtmek önemlidir.Hayvanları içeren tüm prosedürler ve protokoller, EC direktifi 86 6 0 9 EEC ile uyumlu olup, Fransız Ulusal Komitesi olan comm ETH tarafından onaylanmıştır. Etik ve Hayvan Deneyleri Komitesi'nin gözönünde bulundurulması için, hayvanlar Leon Young'da uygun deney tesislerinde barındırılmış ve bakılmıştır. Farelerin ötanazi yapılıp beyin ve omurilik alındıktan sonra, metin protokolüne göre buz üzerinde bir tüm beyin bir Petri kabına yerleştirilmiştir.İki koku ampulünden birini, ampulü hemen arkasından tutan forseps ile ayırarak başlayın. Aşağı doğru hareketle ampullü beyinden çıkarın, ardından ikinci ampulu benzer bir şekilde çıkarın. Şimdi beyni yerine sabit tutan forseps kullanarak, sol ve sağ korteksler arasına ikinci bir forseps takın ve ileriye doğru hareket ettirerek iki yarıyı ayırın.Şimdi beyni yerleştirilmiş halde tutmaya devam edin. İkinci forsepsin korteksi iki milimetre arkasından yerleştirin ve yukarı doğru baskı uygulayarak korteksin hipokampus üzerinden çıkmasını sağlayın. Ardından hipokampustan başlayarak beynin ön tarafına doğru ilk korteks kısmını soyun.İkinci yarıda da aynı şekilde işlemi tekrarlayın. Ardından açık forsepsin bir hipokampunun etrafına yerleştirin. Daha sonra forsepsin alt kısmını hafifçe kapatın ve hipokampusu hafifçe çıkarın.İkinci hipokampusta da aynı şekilde tekrarlayın. Korsepsin bir striatumun arkasına yerleştirin ve beynden hafifçe ayırın. Beyinden kalan korteks kalıntılarını çıkarmak için forseps kullanın ve ardından ikinci satuyu çıkarın. Forsepsle serebellumu geri kalan beyinden ayırın ve serebellumun konturunu hafifçe bastırarak çıkarın.Daha sonra forsepsin serebellumun arkasına yerleştirin ve forsepsin ön kısmını ileri doğru hareket ettirerek çıkarın. Serebellumun dört yuvarlak yapıdan oluşan ve beyinsapına bağlandığını açıkça görebilmeniz için forsepsin geniş kısmını kaldırarak yükseltin. Ardından bağlantı noktasında dikey bir kesi yapın ve beyinsapını çıkarın. Forsepsin mezensefala arkasından yerleştirin ve yukarı doğru hareket ettirerek kalan beyinden tamamen ayırın. Beyin homojeni hazırlamak için, kesilen beyin bölgelerine yeterli miktarda HS tamponu ekleyerek aşağıdaki tabloda gösterildiği gibi beklenen yüzde homojenizasyonunu elde edin.Bo silika cam tüp ve tüp havanlarından oluşan bir doku öğütücü kullanarak, ezilmesi gereken bir beyin bölgesini tüpe dökün. Sonra havan A ile dokuyu 10 kez homojenize ederek ayırın. Daha sonra havan B'ye geçin ve dokuyu 20 kez daha homojenize edin.Transfer pipeti kullanarak homojenizasyonu, 1.5 mililitrelik bir tüpe aktarın ve kalan beyin örnekleri ile homojenizasyonu tekrarlayın. Örnekleri dört derece Celsius'ta beş dakika boyunca 1000 G'de santrifüjleyin ve sonra süpernatantı toplayın ve 200 mikrolitrelik Ali Wattlara bölün. Sonraki Eliza analizi için eksi 80 derece Celsius'ta saklayın. Beyin homojenizasyonunda Eliza gerçekleştirmek için.50 mikromolar karbonat tamponunu kullanarak, kaplama anti alfa süünelin, tavşan poliklonal veya monoklonal klon 42 antikorunun 0.01 nanogram/mililitre konsantrasyonuna seyreltin. 100 mikrolitre antikor kaplama solüsyonu ile 96 kuyuluk bir mikroplak kuyularını kaplamak ve dört derece Celsius'ta bir gece boyunca inkübe edin. Ertesi gün, kuyulara 300 mikrolitre PBST ekleyin ve plaka yıkayıcıyı kullanarak oda sıcaklığında çalışırken plakaları beş kez yıkayın.İleriye doğru, her ku

detection-disease-associated-synuclein-enhanced-elisa-brain

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Normal prionları sindirmek için proteolitik bir enzim ile inkübe edin ve dirençli agregaları sağlam bırakın.

Fare Beyin Dokusunda Yanlış Katlanmış Prion Protein Agregatlarının Western Blotting Kullanılarak Saptanması

Kaynak: Bétemps, D.,  et al.,  İnsan A53T Mutasyona Uğramış α-sinükleini Aşırı İfade Eden Transgenik Farelerin Beyninde Gelişmiş ELISA ile Hastalıkla İlişkili α-sinükleinin Tespiti. J. Vis. Uzm. (2015). Bu video, ELISA kullanılarak transgenik farelerden alınan beyin dokusunda nörodejeneratif hastalıkla ilişkili protein α-sinükleini tespit etme prosedürünü göstermektedir. Adımlar, hastalıkla ilişkili formlarını ölçmek için doku homojenizasyonu, santrifüjleme ve α-sinüklein proteininin ELISA...

ELISA Kullanarak Nörodejeneratif Hastalıkla İlişkili Protein α-Sinükleinin Saptanması

Bu yüksek verimli robot transfections ve bir ev yapımı çift ışıma lusiferaz deneyi kullanılarak transkripsiyon düzenleyiciler belirlenmesi için hızlı ve ucuz bir tarama yöntemi sunulmaktadır. Bu protokol, hızlı bir şekilde binlerce gen için doğrudan yan yana fonksiyonel veriler üreten ve ilgi duyulan herhangi bir geni hedef kolayca değiştirilebilir olduğunu.

Bir ev yapımı Çift kızdırma Lusıferaz Testi kullanarak yüksek verim Fonksiyonel Taraması

Burada, ölüm sonrası insan beyin dokusundan giderek çözünmeyen/kümelenmiş alfa-sinükleinin (α-syn) izolasyonu için bir protokol sunuyoruz. Deterjan mukavemeti arttırılmış tamponların ve yüksek hızlı ultrasantrifüj tekniklerinin kullanılmasıyla, hastalıklı ve hastalıksız dokularda α-syn agregasyonunun değişken özellikleri incelenebilir.

Parkinson Brains gelen Çözünür ve çözünmez alfa-sinüklein Sıralı Ekstraksiyon

Bu el yazması, viral vektör aracılı yerel gen iletiminin, merkezi sinir sistemindeki transgenleri ifade etmek için nasıl çekici bir yol sağladığını açıklamaktadır.  Protokol, Parkinson hastalığı için viral vektör tabanlı bir hayvan modeli geliştirmek için sıçanın substantia nigra'sında bir viral vektör enjeksiyonu gerçekleştirmek için tüm önemli adımları özetlemektedir.

Bir rekombinant adeno-ilişkili viral vektörün stereotaktik enjeksiyon yoluyla Parkinson Hastalığı için bir alfa-sinüklein Bazlı Fare Modeli Geliştirme

(+/- M83: GFAP -Luc +/-) Tg periton ya da dil içine alfa-sinüklein fibrillerinin Çevresel enjeksiyon ailesel A53T mutasyon ve ateş böceği lusiferaz ile insan alfa-sinükleinin eksprese eden farelerden, nöro de dahil olmak üzere, nevropatlojinin uyarabilir bunların merkezi sinir sistemindeki.

Alfa-sinüklein fibrillerinin Çevresel Aşılama sonrası Tranjenik Farelerde Nöroinflamasyondan Biyoparlaklık Görüntüleme

Bu iletişim kuralı, Alfa-synuclein oluşumu çoğaltır hücre tabanlı bir sistem içinde vivoagrega sağlamak için hedeftir. Hücre içi Alfa-synuclein kapanımlar birincil nöronlarda tarafından içselleştirilmesi numaralı seribaşı ve eksojen yayılması hastalıklı Alfa-synuclein transgenik fareler izole yerli microsomes ilişkili Alfa-synuclein toplamları yönetilen.

Microsomes ilişkili Alpha-synuclein toplamları için birincil nöronlar eksojen yönetim olarak güçlü hücre modeli liflerinde oluşumu

Burada, birincil fare dopamin nöronlarında nöronal α-sinüklein birikimini incelemek için ayrıntılı bir protokol sıyoruz. Nöronlarda fosforial α-sinüklein agregaları önceden oluşan α-sinüklein fibrilleri ile indüklenir. İmmünfloresan etiketli hücrelerin otomatik görüntülemesi ve tarafsız görüntü analizi, bu sağlam protokolü α-sinüklein birikimini engelleyen ilaçların orta-yüksek iş akışı taraması için uygun hale getirilmiştir.

Primer Embriyonik Fare Orta Beyin Dopamin Nöronlarında Pre-formed Fibril Indüklenen α-Sinüklein Birikiminin İncelendirilmesi

Bu çalışma, Parkinson hastalığının bu klinik öncesi modelinde nöroinflamasyonu, nörodejenerasyonu ve motor bozukluğu indüklemek için gereken vektör dozunu ve maruz kalma süresini analiz etmektedir. İnsan α-sinükleini kodlayan bu vektörler, Parkinson hastalığı ile ilişkili sinüklein patolojisini özetlemek için substantia nigra'ya verilir.

İnsan α-Sinükleini Kodlayan Adeno İlişkili Viral Vektörler Tarafından İndüklenen Parkinson Hastalığı Fare Modelinin Analizi

Fare merkezi sinir sisteminin histolojik analizi için uygun bir yerçekimi beslemeli perfüzyon yöntemi sunulmaktadır. Fosforile α-sinükleinin immünofloresan tespiti, Parkinson hastalığının bir fare modelinde gösterilmiştir. Bu çalışma aynı zamanda transkardiyal perfüzyon, diseksiyon, doku dondurma/gömme ve dondurulmuş kesit adımlarını kapsamlı bir şekilde tanımlamaktadır.

Fare Merkezi Sinir Sisteminin Histolojik Analizi için Yerçekimi Beslemeli Transkardiyal Perfüzyon Yöntemi

Parkinson hastalığının patogenezini incelemek ve anlamak için α-sinükleinin in vivo fizyolojik modeli gereklidir. İnsanlaştırılmış bir maya modeli kullanarak α-sinükleinin sitotoksisitesini ve agrega oluşumunu izlemek için bir yöntem tanımladık.

İnsanlaştırılmış Bir Maya Modeli Kullanarak α-Sinüklein Toksisitesini ve Agregasyonunu İncelemek İçin Bir Yöntem

Öğrenin, transgenik farelerde geliştirilmiş ELISA ile hastalık ilişkili α-sinüklein birikimini nicel olarak tespit etme yöntemini. Bu teknik, sinükleinopati araştırmalarında hızlı ve güvenilir protein ölçümü sağlar.

İnsan A53T aşırı eksprese eden transjenik farelerin beyninde Geliştirilmiş ELISA ile Hastalık ile ilişkili α-sinüklein tespiti α-sinüklein Mutasyona uğramış (Video) | JoVE Journal

İnsan A53T aşırı eksprese eden transjenik farelerin beyninde Geliştirilmiş ELISA ile Hastalık ile ilişkili α-sinüklein tespiti α-sinüklein Mutasyona uğramış

Daha fazla video keşfet