Name: İlaç test için bir sulu iki-fazlı bir sistem ile Cancer Celi sferoitlerin Robotik üretimi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: Keşfedin kanser hücre sferoitlerinin robotik üretimini, sulu iki-fazlı sistem kullanarak yüksek verimli ilaç testi için. Bu yöntem, anti-kanser ilaç etkinliğini standart 96-kuyucuk plakalarda değerlendirir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar, Ulusal Sağlık Enstitüleri R21CA182333'ndan fon aldığını kabul ediyor.

Polimer sulu iki fazlı bir sistem 1. Hazırlama (ATPS) <ol><li> Polietilen glikol (PEG) (MW 35,000) ve 0.5 g tartılır ve sulu faz, PEG (w / v)% 5, 10 ml hazırlamak için, steril bir 15 ml konik tam büyüme ortamı 9,5 ml ekleyin. Not: İlk polimer ekleyerek ve ardından konik orta yarısını eklenmesi sonra orta kalan miktarı konik duvarlara polimerin yapışmasını en aza indirir ve polimer daha hızlı çözülür yardımcı olur. </li><li> Dekstran (Dex) ve 0.128 g (MW 500,000) tartılır ve% 12.8 (w / v) sulu bir DEX faz 1 ml hazırlamak için, steril bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içinde tam büyüme ortamı 0.872 ml ekleyin. </li><li> Yaklaşık 1 dakika vorteksleyin, her iki çözelti ortam içinde polimerlerin çözünmesi için. </li><li> Bir çözünme ve karışımın homojen bir karışım sağlamak için 1 saat boyunca 37 ° C&#39;de bir su banyosu içinde, her iki çözüm tutun. Banyosundan çözümler bulaşma olasılığını önlemek için su seviyesinin üzerinde kapaklarını tutmaksu. </li><li> Steril, plastik şırıngaya PEG fazlı bir çözelti yükleyin ve yabancı maddelerin çıkarılması için 0.2 mikron gözenek boyutunda bir şırınga filtresinden geçirilir. Yavaş yavaş filtre ile çözüm itmek, PEG çözeltisi ile şırınga doldurun bir konik tüpün üst ve kuvvet kullanarak filtre ekleme yerleştirin: Not. Bu enjektör pistonunun hareketine karşı direnç olması normaldir. Çözeltisinin bir kısmının filtre kalır, ancak polimer konsantrasyonu değişmez olarak polimer çözeltisinin küçük kaybı oluşur. </li><li> Pipet 10 DEX faz çözeltisi ul ve ayrı bir tüp içinde ortamdan 10 ul seyreltilmesi% 6.4 (ağırlık / hacim) deksmedetomidin fazlı bir çözelti ile sonuçlandırılabilir. Aspire 100, PEG faz çözeltisi ul bir Petri çanağı içine dağıtın. <ol><li> PEG faz çözeltisi içine deksmedetomidin faz çözeltisi (ağırlık / hacim)% 6.4, 0.5 ul koyun. Görme mikroskop altında DEX damla gözlemleyerek başarılı ATPS oluşumunu onaylayın. damla sınıriki sabit, ayrı sulu fazın varlığına işaret eden görülebilir kalmalıdır. </li></ol></li><li> Kullanana kadar 4 ° C stok sulu PEG ve DEX faz çözümleri saklayın. Not: Polimer solüsyonları, önceki her bir deney için taze olarak hazırlanmıştır ve depolama, 24 saat içinde kullanılması önerilmektedir. </li></ol> Baskı Kanseri Hücre küremsilerin 2. Hazırlık <ol><li> % 90 -100% konfluent tek tabaka için de (örneğin, MDA-MB-157 göğüs kanseri hücre) kanser hücrelerinin büyütün. MDA-MB-157 hücreleri için, DMEM,% 10 FBS,% 1 glutamin ve% 1 antibiyotik içeren oluşan bir ortamı kullanmaktadır. <ol><li> (Üreticinin protokolüne göre) ve 15 ml konik bir süspansiyon yük hücre ayırma tamponu kullanılarak hasat hücreleri. , 173.3 x g&#39;de 5 dakika için santrifüj süpernatant kaldırmak ve tekrar süspansiyon hücreleri tam büyüme ortamı, 1 ml. </li></ol></li><li> Yük hücreleri bir hemositometrede üzerine ve onları saymak gerekli sayısını hesaplamak içinistenen bir küremsi hücre yoğunluğu için hücre. T75 şişesi içinde yetiştirilen, MDA-MB-157 hücrelerinin konfluent tek tabaka genellikle ~ 7 x 10 6 hücre sağlar. Not:. 1.5 x 10 4 veya MDA-MB-157 hücreleri için daha büyük bir damla hacmi için gerekli hücre yoğunluğu, bir tek küremsi hücre tipine bağlı olacaktır oluşturmak için örneğin 22, bir yoğunluk için 0.3 ul deksmedetomidin faz damla başına önerilir Tek bir sfero oluşumunu sağlamak. </li><li> 173.3 x g&#39;de 5 dakika boyunca ikinci bir kez santrifüj hücreleri ve arzu edilen bir hücre yoğunluğuna kadar süspansiyon konsantre büyüme ortamı, uygun hacimde bunları yeniden süspanse edin. Not: 7 x 10 6 kanser hücreleri hasat edilmiştir, örneğin, bir 0.3 ul deksmedetomidin faz damla 1.5 x 10 4 hücre yoğunluğunun bir küremsi oluşturulması için gerekli olan hücre süspansiyonu, toplam hacmi 140 | il olacaktır. Bununla birlikte bağlı bir sonraki aşamada deksmedetomidin faz çözeltisi ile seyreltme ile, sadece hücreler tekrar süspansiyon hücre kültür ortamı, 70 ul kullanın. </li><li&gt;% 12.8 eşit bir miktarda (w / v) sulu bir DEX fazlı çözelti 1.2 hazırlanan elde edilen hücre süspansiyonu ekleyin. 1.5 x 10 4 hücre yoğunluğu sfero Örneğin, deksmedetomidin fazlı bir çözelti, 70 ul hücre süspansiyonu, 70 ul ilave edilir. </li><li> İyice hücreleri ve deksmedetomidin çözeltisi karıştırma homojen dağılımını sağlamak için bir hücre süspansiyonu karıştırılır. Pipetleme yukarı ve aşağı kabarcık oluşmasmı önlemek üzere yavaşça yapılması gerekmektedir. </li></ol> Eş-kültür küremsi Baskı için 3. Hazırlık <ol><li> Büyüme kanser hücreleri (örneğin, MDA-MB-157 insan meme kanseri hücreleri) ve 90% -100% konfluent tek tabaka destek hücreler (örneğin, insan fibroblastları). (Üreticinin protokolüne göre) bir hücre ayırma tamponu kullanılarak, her hücre türü hasat edilir. <ol><li> Her konik 5 173.3 xg&#39;de dakika ve aspire süpernatant onları santrifüj, 15 ml konik içine her süspansiyon yükleyin. Tam g, 1 ml her bir konik hücreleri tekrarrowth ortamı. Not: Calcein AM (canlı hücre lekesiz) ve nükleer boya (Hoechst) gibi floresan boyalar iki hücre tipleri ayırt etmek için kullanılabilir. </li></ol></li><li> Bir hemasitometre üzerinde ayrı ayrı hücre tipi yükleyin ve ko-kültür sferoitler hücreleri desteklemek için kanser hücrelerinin arzu edilen bir oran için, her hücre türü için gerekli sayısını hesaplamak için say. T75 şişeleri içinde yetiştirilen Konfluent, MDA-MB-157 hücrelerinin tek tabakaları ve fibroblast genellikle, sırası ile, yaklaşık 7 x 10 6 ve ~ 6 x 10 6 hücreleri vermek. </li><li> Iki hücre türünün sayısının istenilen oranı verecek şekilde kanser hücreleri süspansiyonuna hücrelerdeki durdurulması- doğru hacim. Örneğin, 1 fibroblast hücre 50 kanser hücreleri oranı kullanılır. </li><li> Santrifüj, uygun bir hacim içinde 173.3 xg ve tekrar süspansiyon hücreleri, 5 dakika boyunca karıştırılmış bir hücre süspansiyonu ihtiva eden konik sulu deksmedetomidin (w / v) eşit bir büyüme ortamı hacmi ve% 12.8 içeren son yoğunluğuna sonuçlandığı(1.2 hazırlandı) fazlı çözelti. </li><li> Yavaşça süspansiyon homojenliği sağlamak için yukarı ve aşağı ortaya çıkan hücre süspansiyonu pipetle. </li></ol> 96 oyuklu bir plaka içerisine Tümör sferoitlerin 4. Baskı <ol><li> Bir gün önce deneyler için,% 1 kat muamele edilmemiş, yuvarlak dipli 96 oyuklu plakalar, 24 saat boyunca 37 ° C &#39;de (w / v) Pluronik. Bu kaplama, kültür süresi boyunca, hücre yapışmasını önler. </li><li> Süzüldü% 5, 50 ul koyun 96 oyuklu bir plaka (hedef plaka) her bir oyuğuna, sulu PEG faz (a / h). </li><li> Bir pipet kullanarak, hücre süspansiyonu karışımı (aşama 2 veya sırasıyla mono ve ko-kültür, Aşama 3&#39;te hazırlanan) ve 384 oyuklu plakanın bir kolonu (kaynak plaka) ile ilgili de her süspansiyonun 20 ul . </li><li> Sıvı işleyici ve &quot;ev&quot; koordinatlarını kaydetmek için pipet kafa açın. Ardından laboratuar aletlerinin sağlamak için (4.6 aşağıda) önceden tanımlanmış protokol derlemek ve parametreleri doğru tanımlanırly. Bu &quot;güdümlü&quot; bir adım, farklı sıvı işleyicileri için farklı olabilir. Not: protokol akışı, adım-adım aşağıda 4.6 olarak, ne olursa olsun kullanılan robotik sıvı işleyici benzer olacaktır gösterilmiştir; Ancak, programlama arayüzü sayesinde farklı yazılım kullanımı farklı görünebilir. </li><li> Şekil 1&#39;de gösterildiği gibi sıvı işleyici iş istasyonunda belirlenen pozisyonlarda kaynak plaka, plaka hedef ve pipet ucu kutuları yerleştirin. </li><li> Aşağıdaki adımları içeren protokolü yürütün: <ol><li> Yük istasyonunda (Şekil 1) den pipet uçları (8 ipuçları) karıştırma sıvı işleyici pipet kafasından varil bir sütun. </li><li> Kaynak plaka (Şekil 1), oyuklarında hücre süspansiyonu karıştırılır. Kabarcık oluşumunu önlemek için kuyular hücre süspansiyonu hacmi daha küçük bir karıştırma birimi seçin. </li><li> Boş bir atık ipuçları kutusu (Şekil 1) içine ipuçlarını çıkarın. </li&gt; <li> Yük 10 ul dağıtım pipet uçları ile pipet kafasından varil bir sütun (Şekil 1). </li><li> Her bir kaynağı havalandır pipet içine kaynak plaka hücre süspansiyonunun 0.3 ul (Şekil 1). </li><li> Hedef plakanın bir kolonu (şekil 1) ve kuyu içine bir hücre süspansiyonu koyun. 0.5 mm&#39;lik bir dağıtıcı yüksekliği ve 1&#39;den küçük ul / sn bir dağıtıcı akış hızı kullanın. </li><li> Tüm hedef plakasına kolon-by-kolonu baskı tamamlanana kadar tekrarlayın 4.6.6 ile 4.6.1 adımları. </li></ol></li><li> Dikkatle iş istasyonu yüzeyinden hedef plaka kaldırmak ve CO 2 37 ° C&#39;de nemli inkübatör yerleştirin ve% 5. Hücreleri içeren DEX faz damlalarının bozmamak için kuvöz içine taşırken plaka yatay koruyun. </li><li> Deksmedetomidin faz damla içinde bir küremsi, hücrelerin toplanmasını sağlamak için 24 saat boyunca plaka inkübe edin. </li></ol> &lt;p class = &quot;jove_title&quot;&gt; 5. Cancer Celi sferoitlerin İlaç Tedavisi Aşağıdaki protokol 4 gün ilaç tedavisi ve diğer tedavi dönemleri için modifiye edilebilir günden sonra 2. taze ilaç ile bir yenileme içerdiğini unutmayın. <ol><li> Görsel olarak, 24 saat sonra, 96 gözlü plakalar içinde küremsi oluşumu teyit edilmiştir. Her sfero küçük ve en büyük çap ortalamasını alarak küremsilerin boyutunun ölçülmesi için görüntü kuyu Gerekirse. </li><li> Önceden tespit edilmiş bir çözünürlük konsantrasyonda üretici tarafından tavsiye edilen bir solvent içinde eritilmesi ile arzu edilen bir ilacın stok çözelti hazırlayın. Örneğin, mi, 2 mg / su içinde sisplatin çözülür. Not: İlaç ışığa duyarlı ise ışıktan ilacın stok solüsyonu koruyun. </li><li> Seri seyreltme tekniği kullanarak, önceki aşamada hazırlanmış olan stok çözeltisinden hücre kültür ortamı ile sulandırılmış ilaç konsantrasyonları hazırlamak. Her bir seyreltme iki kez, istenen konsantrasyon yapılmalıdır. DilKatkı oranları başlangıç ​​stok konsantrasyonuna bağlı olarak değişir ve çalışma konsantrasyonlarını arzu edecektir. </li><li> Her bir oyuğa, önceki aşamada hazırlanan ilaç solüsyonu 50 ul ekle. Bu robot veya manuel pipetleme yapılabilir. Not: her bir ilaç konsantrasyonu, her yuva içinde daha önce 50 ul sulu bir PEG faz ile istenen konsantrasyona devre seyreltilir. <ol><li> Her bir konsantrasyon için, 96-çukurlu bir tablaya (n = 16) iki adet sütun sferoidler kullanın. </li><li> Kontrol kuyuları olarak, sulu bir PEG fazın mevcut 50 ul taze kültür ortamı 50 ul ekle. </li></ol></li><li> Işıksız bir ortamda 37 ° C&#39;de 48 saat% 5 CO2 için ilaç ile sferoidler inkübe edin. </li><li> Inkübasyondan 48 saat sonra, arzu edilen konsantrasyonlarda ilacın taze dilüsyonları hazırlanması ve her bir oyuğa taze ilaç çözeltisinin 50 ul ekleyerek ilaç yeniler. Not: kuyular zaten ilk ilaç t istenen ilaç konsantrasyonu içerirreatment. Seyreltme ortaya çıkar çünkü Bu nedenle, bu yenileme evresinde, her bir konsantrasyonu, arzu edilen bir konsantrasyonda hazırlanır. </li><li> Işıksız bir ortamda 37 ° C&#39;de başka bir 48 saat süre ile ilaç ve% 5 CO2 ile sferoidler inkübe edin. </li></ol> 6. küresellerde hücresel viabileteyi analizi <ol><li> Yenilenen ilaç (örneğin, bir ilaç ile küremsilerin toplam tedavi süresi 4 gün) ile inkübasyondan ve 48 saat sonra iyi kılavuzlarını pipetleme ile bir ortamın toplam hacmini ölçün. Not: Bir kuyuda tipik hacmi 140 ul (küçük bir düşüş buharlaşma nedeniyle oluşur) ~ olduğunu. </li><li> Toplam oyuk hacmi içinde% 10 konsantrasyonda hücre canlılığı reaktifi (örneğin, PrestoBlue) hacminin hesaplayın. Her bir oyuğa Hücre canlılığı reaktifi bu hacim. Not: iyi olarak 140 ul olan bir ortam hacmi ile, 15.6 ul bir hacim de, toplam% 10&#39;luk bir konsantrasyon vermek için gereklidir. Bu hesaplanır9 (140 ul / 9 = 15.6 ul) mevcut medya hacmine bölünmesi. </li><li> Işıksız bir ortamda 37 ° C &#39;de 6 saat süre ile her bir göze ilave hücre canlılığı maddesi ile plaka inkübe edin. </li><li> Bir mikro-plaka okuyucusu içinde plakayı ve sırasıyla 560 nm ve 590 nm&#39;lik eksitasyon ve emisyon dalga boyunda floresan sinyalini okur. </li><li> Aynı muamele şartlarından değerlerinin ortalaması sonra kontrol kuyularının edilene işlenmiş olan gözeneklerden elde floresan sinyali normalize edilmesi ile küremsi hücrelerin yüzde canlılığı hesaplayın. </li></ol>

<ol><li>Butcher, E. C., Berg, E. L., Kunkel, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systems+biology+in+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Systems biology in drug discovery.</a> Nat. Biotechnol. 22, 1253-1259 (2004).</li>
<li>Gonzalez-Nicolini, V., Fussenegger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+assays+for+anticancer+drug+discovery--a+novel+approach+based+on+engineered+mammalian+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Anticancer+Drugs%22%5BJournal%5D)">In vitro assays for anticancer drug discovery--a novel approach based on engineered mammalian cell lines.</a> Anticancer Drugs. 16, 223-228 (2005).</li>
<li>Castel, D., Pitaval, A., Debily, M. A., Gidrol, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+microarrays+in+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov.+Today%22%5BJournal%5D)">Cell microarrays in drug discovery.</a> Drug Discov. Today. 11, 616-622 (2006).</li>
<li>Gidrol, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2D+and+3D+cell+microarrays+in+pharmacology%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opin.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">2D and 3D cell microarrays in pharmacology.</a> Current Opin. Pharmacol. 9, 664-668 (2009).</li>
<li>LaBarbera, D. V., Reid, B. G., Yoo, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+multicellular+tumor+spheroid+model+for+high-throughput+cancer+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin.+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">The multicellular tumor spheroid model for high-throughput cancer drug discovery.</a> Expert Opin. Drug Discov. 7, 819-830 (2012).</li>
<li>Ward, D. J., Martino, O. I., Simpson, S., Stevens, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decline+in+new+drug+launches%3A+myth+or+reality%3F+Retrospective+observational+study+using+30+years+of+data+from+the+UK%5BTitle%5D)+AND+%22BMJ+Open%22%5BJournal%5D)">Decline in new drug launches: myth or reality? Retrospective observational study using 30 years of data from the UK.</a> BMJ Open. 3, (2013).</li>
<li>Yamada, K. M., Cukierman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+tissue+morphogenesis+and+cancer+in+3D%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D.</a> Cell. 130, 601-610 (2007).</li>
<li>Hirschhaeuser, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicellular+tumor+spheroids%3A+An+underestimated+tool+is+catching+up+again%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Multicellular tumor spheroids: An underestimated tool is catching up again.</a> J. Biotechnol. 148, 3-15 (2010).</li>
<li>Ghajar, C. M., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+engineering%3A+the+other+face+of+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+A%22%5BJournal%5D)">Tumor engineering: the other face of tissue engineering.</a> Tissue Eng. A. 16, 2153-2156 (2010).</li>
<li>Kenny, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+morphologies+of+breast+cancer+cell+lines+in+three-dimensional+assays+correlate+with+their+profiles+of+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Oncol%22%5BJournal%5D)">The morphologies of breast cancer cell lines in three-dimensional assays correlate with their profiles of gene expression.</a> Mol. Oncol. 1, 84-96 (2007).</li>
<li>Carlsson, J., Yuhas, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liquid-overlay+culture+of+cellular+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Rec.+Results+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Liquid-overlay culture of cellular spheroids.</a> Rec. Results Cancer Res. 95, 1-23 (1984).</li>
<li>Wartenberg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-induced+angiogenesis+studied+in+confrontation+cultures+of+multicellular+tumor+spheroids+and+embryoid+bodies+grown+from+pluripotent+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Tumor-induced angiogenesis studied in confrontation cultures of multicellular tumor spheroids and embryoid bodies grown from pluripotent embryonic stem cells.</a> FASEB J. 15, 995-1005 (2001).</li>
<li>Tekin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimuli-responsive+microwells+for+formation+and+retrieval+of+cell+aggregates%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+chip%22%5BJournal%5D)">Stimuli-responsive microwells for formation and retrieval of cell aggregates.</a> Lab chip. 10, 2411-2418 (2010).</li>
<li>Patra, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+device+for+uniform-sized+cell+spheroids+formation%2C+culture%2C+harvesting+and+flow+cytometry+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">A microfluidic device for uniform-sized cell spheroids formation, culture, harvesting and flow cytometry analysis.</a> Biomicrofluidics. 7, 54114(2013).</li>
<li>Frey, O., Misun, P. M., Fluri, D. A., Hengstler, J. G., Hierlemann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconfigurable+microfluidic+hanging+drop+network+for+multi-tissue+interaction+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Reconfigurable microfluidic hanging drop network for multi-tissue interaction and analysis.</a> Nat. Commun. 5, 4250(2014).</li>
<li>Hsiao, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-ring+structures+stabilize+microdroplets+to+enable+long+term+spheroid+culture+in+384+hanging+drop+array+plates%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed.+Microdev%22%5BJournal%5D)">Micro-ring structures stabilize microdroplets to enable long term spheroid culture in 384 hanging drop array plates.</a> Biomed. Microdev. 14, 313-323 (2012).</li>
<li>Mehta, G., Hsiao, A. Y., Ingram, M., Luker, G. D., Takayama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opportunities+and+challenges+for+use+of+tumor+spheroids+as+models+to+test+drug+delivery+and+efficacy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Control.+Release%22%5BJournal%5D)">Opportunities and challenges for use of tumor spheroids as models to test drug delivery and efficacy.</a> J. Control. Release. 164, 192-204 (2012).</li>
<li>Mueller-Klieser, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+cell+cultures%3A+from+molecular+mechanisms+to+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional cell cultures: from molecular mechanisms to clinical applications.</a> Am. J. Physiol. 273, C1109-C1123 (1997).</li>
<li>Minchinton, A., Tannock, I. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+penetration+in+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Drug penetration in solid tumors.</a> Nat. Rev. Cancer. 6, 583-592 (2006).</li>
<li>Jeong, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+tension-mediated%2C+concave-microwell+arrays+for+large-scale%2C+simultaneous+production+of+homogeneously+sized+embryoid+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Healthc.+Mater%22%5BJournal%5D)">Surface tension-mediated, concave-microwell arrays for large-scale, simultaneous production of homogeneously sized embryoid bodies.</a> Adv. Healthc. Mater. 2, 119-125 (2013).</li>
<li>Cavnar, S. P., Salomonsson, E., Luker, K. E., Luker, G. D., Takayama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfer+imaging%2C+and+analysis+plate+for+facile+handling+of+384+hanging+drop+3D+tissue+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22JALA%22%5BJournal%5D)">Transfer imaging, and analysis plate for facile handling of 384 hanging drop 3D tissue spheroids.</a> JALA. 19, 208-214 (2014).</li>
<li>Atefi, E., Lemmo, S., Fyffe, D., Luker, G. D., Tavana, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput%2C+polymeric+aqueous+two-phase+printing+of+tumor+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Func.+Mater%22%5BJournal%5D)">High throughput, polymeric aqueous two-phase printing of tumor spheroids.</a> Adv. Func. Mater. 24, 6509-6515 (2014).</li>
<li>Lemmo, S., Atefi, E., Luker, G. D., Tavana, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+aqueous+biphasic+tumor+spheroid+microtechnology+for+anti-cancer+drug+testing+in+3D+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Mol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Optimization of aqueous biphasic tumor spheroid microtechnology for anti-cancer drug testing in 3D culture.</a> Cell. Mol. Bioeng. 7, 344-354 (2014).</li>
<li>Albertsson, P. -A., Tjerneld, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+diagrams%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzym%22%5BJournal%5D)">Phase diagrams.</a> Methods Enzym. 228, 3-13 (1994).</li>
<li>Frampton, J. P., White, J. B., Abraham, A. T., Takayama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+co-culture+patterning+using+aqueous+two-phase+systems%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Cell co-culture patterning using aqueous two-phase systems.</a> J. Vis. Exp. (73), (2013).</li>
<li>Frampton, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aqueous+two-phase+system+patterning+of+detection+antibody+solutions+for+cross-reaction-free+multiplex+ELISA%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Aqueous two-phase system patterning of detection antibody solutions for cross-reaction-free multiplex ELISA.</a> Sci. Rep. 4, 4878(2014).</li>
<li>Lai, D., Frampton, J. P., Tsuei, M., Kao, A., Takayama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+direct+visual+analysis+of+hydrolytic+enzyme+activity+using+aqueous+two-phase+system+droplet+phase+transitions%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Label-free direct visual analysis of hydrolytic enzyme activity using aqueous two-phase system droplet phase transitions.</a> Anal. Chem. 86, 4052-4057 (2014).</li>
<li>Petrak, D., Atefi, E., Yin, L., Chilian, W., Tavana, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+spatio-temporally+controlled+cell+microprinting+with+polymeric+aqueous+biphasic+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biotech.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Automated spatio-temporally controlled cell microprinting with polymeric aqueous biphasic system.</a> Biotech. Bioeng. 11, 404-412 (2014).</li>
<li>Tavana, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanolitre+liquid+patterning+in+aqueous+environments+for+spatially+defined+reagent+delivery+to+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Mater%22%5BJournal%5D)">Nanolitre liquid patterning in aqueous environments for spatially defined reagent delivery to mammalian cells.</a> Nat. Mater. 8, 736-741 (2009).</li>
<li>Tavana, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymeric+aqueous+biphasic+system+rehydration+facilitates+high+throughput+cell+exclusion+patterning+for+cell+migration+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Func.+Mater%22%5BJournal%5D)">Polymeric aqueous biphasic system rehydration facilitates high throughput cell exclusion patterning for cell migration studies.</a> Adv. Func. Mater. 21, 2920-2926 (2011).</li>
<li>Tavana, H., Mosadegh, B., Takayama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymeric+aqueous+biphasic+systems+for+non-contact+cell+printing+on+cells%3A+engineering+heterocellular+embryonic+stem+cell+niches%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Mater%22%5BJournal%5D)">Polymeric aqueous biphasic systems for non-contact cell printing on cells: engineering heterocellular embryonic stem cell niches.</a> Adv. Mater. 22, 2628-2631 (2010).</li>
<li>Tavana, H., Mosadegh, B., Zamankhan, P., Grotberg, J. B., Takayama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microprinted+feeder+cells+guide+embryonic+stem+cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Microprinted feeder cells guide embryonic stem cell fate.</a> Biotechnol. Bioeng. 108, 2509-2516 (2011).</li>
<li>Kalluri, R., Zeisberg, M. Nat Rev Cancer. 6, 392-401 (2006).</li>
<li>Olsen, C. J., Moreira, J., Lukanidin, E. M., Ambartsumian, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+mammary+fibroblasts+stimulate+invasion+of+breast+cancer+cells+in+a+three-dimensional+culture+and+increase+stroma+development+in+mouse+xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Human mammary fibroblasts stimulate invasion of breast cancer cells in a three-dimensional culture and increase stroma development in mouse xenografts.</a> BMC Cancer. 10, 444(2010).</li>
<li>Ozdemir, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depletion+of+carcinoma-associated+fibroblasts+and+fibrosis+induces+immunosuppression+and+accelerates+pancreas+cancer+with+reduced+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Depletion of carcinoma-associated fibroblasts and fibrosis induces immunosuppression and accelerates pancreas cancer with reduced survival.</a> Cancer Cell. 25, 719-734 (2014).</li>
<li>Hsiao, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+system+for+formation+of+PC-3+prostate+cancer+co-culture+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Microfluidic system for formation of PC-3 prostate cancer co-culture spheroids.</a> Biomaterials. 30, 3020-3027 (2009).</li>
<li>Friedrich, J., Seidel, C., Ebner, R., Kunz-Schughart, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spheroid-based+drug+screen%3A+considerations+and+practical+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Spheroid-based drug screen: considerations and practical approach.</a> Nat. Protoc. 4, 309-324 (2009).</li>
<li>Weigelt, B., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unraveling+the+microenvironmental+influences+on+the+normal+mammary+gland+and+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Cancer+Biol%22%5BJournal%5D)">Unraveling the microenvironmental influences on the normal mammary gland and breast cancer.</a> Semin. Cancer Biol. 18, 311-321 (2008).</li>
<li>Mueller, M. M., Fusenig, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Friends+or+foes+-+bipolar+effects+of+the+tumour+stroma+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cance%22%5BJournal%5D)">Friends or foes - bipolar effects of the tumour stroma in cancer.</a> Nature Reviews Cance. 4, 839-849 (2004).</li>
<li>Bissell, M. J., Radisky, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Putting+tumours+in+context%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Putting tumours in context.</a> Nat. Rev. Cancer. 1, 46-54 (2001).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Sferoidler iyi tümör fizyolojisini ve ilaç etkinliğini anlamak ve anti-kanser ilaç keşfi için yararlı bir araç sağlamak için gerçekçi bir modeli sunuyoruz. Bu tür uygulamalar büyük ölçüde yalnızca standart laboratuar aletlerinin, sıvı taşıma araçları ve tarama ekipmanı gerektirmeyen basit sfero üretimi ve bakım teknikleri yararlanacak. sulu iki-fazlı sistemde açılan faz içinde kendiliğinden agrega kanser hücrelerinin kullanılması verimli üretim ve robotik sıvı işleyicilerle sferoitlerin bakım ve yerinde ilaç te...

Hücre bazlı analizler geliştirme ve yeni bir anti-kanser ilaçların bulunması için önemli bir araç sağlar. 1,2 Tarihsel, kanser hücrelerinin tek tabakalı kültürleri kanser hücrelerinin belirli türlerine karşı aday bileşiklerinin etkinliğini araştırmak üzere istihdam edilmiştir. standart kültür plakaları içinde tek tabakalı kültürler bakım kolaylığı, reaktifler ilave edildikten ticari robotik araçlar ile standart levha uyumluluğu ve kimyasal bileşikler hücresel tepkilerin alt analizi için tarama ekipmanı ile 2D Kültürlerin çekici bir araç kılan en önemli yararlar uyuşturucu testi için. 3 yazık ki, tek tabakalı hücre deneyleri genellikle ilaç geliştirme ve keşif son derece pahalı verme süreci, in vivo bileşiklerin etkinliğini tahmin etmek başarısız. 4,5 ilaç şirketleri ve akademik birimler, sadece ~% 1 önemli yatırım ve çaba rağmen Kanser karşıtı klinik çalışmalarda ilaç onaylanmıştırSon yirmi yıl içinde FDA tarafından. 2B kültürleri ve in vivo olarak kanser hücrelerinin, karmaşık 3 ortamı arasında 6 eşitsizlik tek tabakalı kültürü sistemlerinin önemli bir eksikliktir. 7 Bu nedenle, ortamda tümör hücrelerine karşı Aday bileşiklerin tarama daha yakından benzemektedir 3D tümör çevre roman kemoterapi ilaçlarının gelişimini hızlandırmak olabilir. 8 Kanser hücresi sferoidler, in vitro olarak ilgili bir 3D tümör modeli sunar. 9,10 olan sferoitler hususiyetlerini yapışmayan yüzeylerde ya da dönen bir şişede, sıvı kaplama, mikrofabrike mikro gibi teknikler kullanılarak süspansiyon içinde kanser hücrelerinin kendiliğinden ya da neden olduğu bir montaj ile oluşturan yoğun kümeleri . diziler, mikroakışkanlar ve asılı damla de 11-16 sferoitler geometri ve merkezi bölgeye oksijen, besin ve ilaç bileşiklerinin sınırlı ulaşım dahil olmak üzere katı tümörlerin temel özelliklerini taklit; dolayısıyla, onlar daha yakından uyuşturucu yanıtlayanların yenidentek tabakalı kültürleri ile karşılaştırıldığında katı tümörlerin bir bileşiğe dönüştürülebilir. Bu belirgin yarar rağmen 17-19 sferoidler rutin kanser hücrelerine karşı kimyasal bileşiklerin taranması için kullanılmamaktadır. Piyasada mevcut robotik ve tarama / görüntüleme araçları ile uyumlu bir standart yüksek kapasiteli ortamda üniforma ölçekli spheroidler üreten Zorluk ilaç geliştirme boru hattına sfero kültürünün birleşmesini engellemektedir. Özel malzemeler ve plakalar son zamanlarda bu ihtiyacı gidermek için piyasada mevcut hale gelmiştir rağmen, maliyet düşünceler onların yaygın kullanımını engellemek. Yeni asılı damla platformu ve mikrofabrike mikro-kuyuları kullanmak yüksek verimlilik tutarlı ölçekli spheroidler üretme yeteneği ile iki önemli teknikler. 13,16,20 Ancak, her iki yaklaşım özel plakaları ve imal pahalı ve uç nokta kullanıcılar için sakıncalı olan cihazlar gerektirir temel araştırma merkezleri ve ilaç sanayi, en büyük ef içindeyeni anti-kanser ilaç keşfi için kale yapılır. Damla plakaları asılı bir son tasarımı ile hücre içeren damla istikrar bazı iyileşmelere rağmen, plakanın sadece her delik hala damla yayılması / birleştirilmesi önlemek için kültür sırasında kullanılır. 16 Bu önemli ölçüde deneysel verim azalır. İlaç ilave ve yenileme kılavuzuna veya robotik pipetle zor ve bu plaka konfigürasyonu gibi plaka okuyucu gibi geleneksel tarama donanımları ile kolayca uyumlu olmadığı için sferoidler biyokimyasal analiz için standart bir plaka aktarılır gerekir. 21 Mikro-kuyuları da yumuşak litografi kullanarak imal Kontrollü boyutu sfero üretimine izin. 13,20 Ancak, standart pipet araçları ile bu platformun uyumsuzluk tek bir tedavi durumu tüm sferoitleri açığa farklı ilaç bileşikleri / konsantrasyonları ile bireysel küremsi tedavi önler. Bu nedenle, bu yöntem için uygun değildirçok sayıda bileşik / konsantrasyonları aynı anda test gerektirir akış bileşik taraması. Bu engellerin üstesinden gelmek için, standart 96 oyuklu plakalar içinde sürekli boyutlu kanser hücresi sferoitlerin yüksek verimli üretimi için yeni bir teknik geliştirilmiştir. 22,23 yaklaşım polietilen glikol ile bir polimer sulu bir, iki fazlı bir sistem (ATPS) (dayanır faz oluşturucu polimerler PEG) ve dekstran (Dex). 24 ATPSs son hücre micropatterning sağlamak için yeni bir hücre, biyolojik bir dizi uygulamada kullanılabilir ve son derece sulu ortam içinde hücrelerin biyolojik tepkin maddelerin sağlanmasını lokalize edilmiştir. 25-32 bir oluşturmak küremsi, kanser hücreleri, sulu deksmedetomidin faz ve elde edilen süspansiyon bir alt mikrolitre damla karıştırılır iyi olarak ihtiva eden daldırma sulu PEG faz çözeltisi içine pipetlenir. damlası sfero oluşumunu kolaylaştırmak için daldırma aşaması sınırladığını hücrelerden karışmayan kalır. İthortantly yüksek sulu daldırma aşaması sfero hücrelerine besin sağlar ve ortam osmolalitesinin değişiklikler ve ilaç konsantrasyonlarının dalgalanmalara neden olur başka deneyler için ortak ortam buharlaştırma ile bilinen bir sorun en aza indirir. Bu teknik, küremsi üretim ve yalnızca standart 96 oyuklu plakalar içinde ticari olarak temin edilebilen reaktifler ve pipetleme araçlarını kullanarak ilaç tedavisi sağlar. Önemli bir şekilde, küremsilerin hücresel tepkilerin analizi standart biyokimyasal tahlilleri ve plaka okuyucu kullanarak aynı plakada gerçekleştirilir. Robotik sıvı taşıma yaklaşım ATP ve adaptasyon ile çalışma kolaylığı mono-kültür ve ko-kültür hem de yüksek verim nesil basit bir laboratuar tekniği sferoitlerin yapar. Bu yeni yaklaşım, geliştirilmiş test hacmi ve test bileşiklerin ve Redu artan sayıda maliyet-etkililik (ilaç geliştirme ve keşif süreçlerine kanser hücresi sferoitlerin entegrasyonu yönünde atılmış büyük bir adım olacakCED reaktif tüketimi) ve verimlilik (zaman eller azaltıcı). ATPS yaklaşım kullanılarak 96 oyuklu plakalar içinde kanser hücresi sferoitlerin robot üretimi için ayrıntılı bir protokol, aşağıda tarif edilmiştir. Buna ek olarak, sonuçta elde edilen sferoitlerin ve ticari bir biyokimyasal analizi kullanılarak hücresel tepkilerin alt analizi ilaç tedavisi ayrıntıları sunulmaktadır.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reaktifler ve Sarf Malzemeleri</td></tr><tr><td>Polietilen glikol, MW: 35.000</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>94646</td><td></td></tr><tr><td>Dextran, MW: 500.000</td><td>Pharmacosmos</td><td>5510 0500 9007</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco'nun Modifiye Eagle Medium (DMEM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6429</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>12306C</td><td></td></tr><tr><td>Glutamin</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Antibiyotik</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>Clacein</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>C3100MP</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>33342</td><td></td></tr><tr><td>Sisplatin</td><td>Spektrum Kimyasalları</td><td>15663-27-1</td><td></td></tr><tr><td>PrestoBlue</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>A-13261</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-108</td><td>Sigma Aldrich</td><td>542342</td><td></td></tr><tr><td>Tek Kullanımlık Uçlar (10 & mikro; l)</td> <td>Fluotics</td><td>C-P10V11.ST</td><td></td></tr><tr><td>Tek Kullanımlık Uçlar (70 & mikro; l)</td> <td>Fluotics</td><td>C-P70V11.ST</td><td></td></tr><tr><td>Yuvarlak tabanlı 96 oyuklu plakalar</td><td>Nunc</td><td>268200</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>Liquid Handler</td><td>Agilent Technologies</td><td>SRT Bravo</td><td></td></tr><tr><td>Mikroplaka Okuyucu</td><td>Biotek Instruments</td><td>Synergy H1M</td><td></td></tr></tbody></table>

İlaç test için bir sulu iki-fazlı bir sistem ile cancer celi sferoitlerin robotik üretimi

Robotic Production of Cancer Cell Spheroids with an Aqueous Two-phase System for Drug Testing

Kanser hücresi sferoidleri, anti-kanser ilaç testi uygulamaları için ilgili bir in vitro avasküler tümör modeli sunar. Bu çalışmada, yüksek verimli 96 oyuklu plaka formatında hem mono-kültür hem de ko-kültür sferoidleri üretmek için ayrıntılı bir protokol açıklanmaktadır. Bu yaklaşım, hücreleri ikinci sulu fazın içine daldırılmış daha yoğun sulu fazın bir damlasına sınırlamak için sulu iki fazlı bir sistem kullanır. Damla kuyu yüzeyinde durur ve hücreleri tek bir küre oluşturmak için yakın tutar. Bu teknoloji, boyut kontrollü sferoidler üretmek ve bileşik tarama uygulamaları için sferoid üretim sürecini hızlandırmak için robotik bir sıvı işleyiciye uyarlanmıştır. Klinik olarak kullanılan bir ilaçla tedavi edilen sferoidler, ilaç dozundaki artışla hücre canlılığında azalma gösterir. Sferoid üretimi için standart bir mikro kuyucuklu plakanın kullanılması, ilaçla tedavi edilen sferoidlerin kanser hücrelerinin canlılığını bir mikro plaka okuyucu ile analiz etmeyi kolaylaştırır. Bu teknolojinin hem robotik olarak hem de manuel pipetler gibi diğer sıvı işleme araçlarıyla uygulanması kolaydır.

Robotik sıvı işleyici iş istasyonu. Şekil 1&#39;de gösterildiği pipetleme baş ve bölüm 4.6 sferoidlerinin robotik baskıda kullanılan tüm istasyonlar etiketli edilir. Görüntü ucu kutuları için iki farklı istasyonda (bir karıştırma ipuçları grubu ve hücre süspansiyonu sulu deksmedetomidin faz karışımının / dağıtılmasını emilmesi için ikinci kümesinin) kullanımını göstermektedir. tüm kurulum kısırlık korumak için bir standart biyolojik güvenlik kabini içinde yer almaktadır. 2 sulu iki-fazl...

Sulu iki fazlı bir sistem kullanılarak yüksek verimli 96 oyuklu plaka formatında kanser hücresi sferoidlerinin robotik baskısı için bir protokol sunulmaktadır.

İlaç test için bir sulu iki-fazlı bir sistem ile Cancer Celi sferoitlerin Robotik üretimi

Cancer cell spheroids present a relevant in vitro model of avascular tumors for anti-cancer drug testing applications. A detailed protocol for producing ...

Bu prosedürün genel amacı, antikanser ilaç testlerinde kullanmak üzere, standart yüksek kapasiteli bir formatta kanser hücresi pH değerini oluşturmaktır. Bu işlem, öncelikle başarılı bir sulu iki fazlı sistem oluşturmak için polietilen glikol ve dekstran adlı iki polimerin, önceden belirlenmiş konsantrasyonlarda hücre kültür ortamında çözülmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, ilgili hücrelerin istenen hücre yoğunluğunun iki katı olacak şekilde hazırlanması ve hücre süspansiyonunun eşit hacimdeki sulu dekstran fazı ile karıştırılmasıdır.Ardından, 96 kuyucuklu bir plakayı sulu polietilen glikol fazı ile doldurun ve bir sıvı taşıma robotu kullanarak, hücre içeren dekstran fazı damlacıklarından sub mikrolitre miktarlarda kuyucuklara aktarın. Bir sonraki adım, 24 saatlik inkübasyonun ardından 96 kuyucuklu plakalarda sferoid oluşumunu doğrulamak ve ilgilenilen antikanser ilaçları doğrudan kuyucuklara eklemektir. Son olarak, kontrol grubundaki işlem görmemiş sferoitlere göre normalize edilmiş, ilaçla işlem görmüş sferoitlerin yüzde canlılığını göstermek için standart bir plaka okuyucuyla uyumlu canlılık analizi kullanılır.Bu tekniğin, asılı damla yöntemi veya mikro üretilmiş kuyu yaklaşımı gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, özelleştirilmiş plakalar veya cihazlar gerektirmemesi ve yüksek verimli sfer oluşumuna ve ilaç testlerine olanak sağlamasıdır. Bu yöntem, kanser araştırmalarındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir ve antikanser kemoterapötiklerin keşfini hızlandırabilir. Yeni antikanser ilaçları belirlemek için daha ilgili tümör modelleriyle kimyasal bileşiklerin yüksek verimli taranmasına imkan tanıdığından, bu tekniğin etkileri kanser tedavisine kadar uzanmaktadır.Bu yöntemi ilk kez kullanacak kişiler, kanser hücresi steroidlerini ve mikro kuyucuklu plakaları kolaylıkla oluşturabilecek ve standart laboratuvar ekipmanları ile robotik araçları kullanarak ilaç uygulama deneylerini rahatça gerçekleştirebilecektir. Başlamak için, 0,5 g polietilen glikol tartın ve bunu steril 15 mL'lik konik bir tüp içindeki 9,5 mL tam büyüme ortamına ekleyin; %5 (ağırlık/hacim) sulu polietilen glikol fazının 10 mL'sini hazırlamak için karışımı bir dakika boyunca vorteksleyin. Ardından, 0,128 g dekstran tartın ve bunu 0,87'ye ekleyin.Steril 1,5 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpü içindeki iki mililitre komple büyüüme ortamını, %12,8 ağırlık/hacim oranında bir mililitrelik sulu dekstran fazı hazırlamak için bir dakika boyunca vorteksleyiniz. Hem polietilen glikol hem de dekstran çözeltilerini bir saat boyunca 37 °C'lik bir su banyosuna yerleştiriniz.Tam çözünmeye yardımcı olmak için. Bir saat sonra olası kontaminasyonu önlemek için kapakların su seviyesinin üzerinde kaldığından emin olun. Polietilen glikol yüzey çözeltisini çıkarın ve beş mililitrelik steril bir plastik şırıngaya doldurun.Her türlü safsızlığı gidermek için çözeltiyi 0,2 mikron gözenekli bir şırınga ucu filtresinden geçirin. Hem polietilen glikol hem de dekstran faz çözeltilerini kullanmadan önce dört derece Celsius'ta 24 saate kadar saklayın. M-D-A-M-B 1 57 meme kanseri hücre hattı gibi ilgili kanser hücrelerini %90 ila %100 konfluens düzeyine ulaşana kadar büyütün.Ardından hücreleri standart teknikler kullanarak hasat edin ve verimi bir hemositometre ile sayın; pelletlemi hücreleri, yarı büyüme medyumu ve yarı strand çözeltisi karışımı içinde mililitrede 50 milyon hücre konsantrasyonuna gelecek şekilde yeniden süspande edin. Bu, 0,3 µL damla başına yaklaşık 15.000 hücrelik bir yoğunluk sağlar; beraberindeki metin protokolünde açıklandığı üzere onic ile önceden kodlanmış yapışmayan 96 kuyucuklu bir plakanın her bir kuyucuğuna, filtrelenmiş %5'lik sulu polietilen glikol fazından 50 µL dağıtın. Polietilen glikol eklemesi, çok kanallı pipetle manuel olarak veya bir sıvı aktarıcı robot yardımıyla yapılabilir; hücre süspansiyonunu, resüspansiyon için nazikçe yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın.Zamanla çökmüş olan hücreleri süspanse edin. Bir 384 kuyucuklu plakanın bir sütunundaki her iki kuyucuğa 20 µL süspansiyon ekleyin. Ardından sıvı taşıyıcıyı açın ve pipetleme kafasını başlangıç konumuna getirin.Koordinatları kaydetmek için kaynak plakayı, hedef plakayı ve pipet ucu kutularını sıvı aktarım cihazının çalışma istasyonundaki tanımlanmış konumlarına yerleştirin. Otomatik sıvı aktarım cihazını kullanarak, hücre süspansiyon hacminin yaklaşık üçte biri kadar bir karıştırma hacmi seçin ve sıvı aktarım cihazının pipetleme başlığındaki bir sütun varili çalışma istasyonundaki karıştırma pipet uçlarıyla doldurun. 384 kuyucuklu kaynak plaka içindeki hücre süspansiyonunu karıştırmak için sıvı aktarım cihazını kullanın.Ardından uçları boş bir atık uç kutusuna atın. Sonra, pipetleme başlığının bir sütunundaki gövdelerini 10 µL dağıtıcı pipet uçlarıyla doldurun. Kaynak plakadaki hücre süspansiyonundan her bir pipet ucuna 0.3 µL aspire etmek için sıvı işleyiciyi kullanın.Ardından, hücre süspansiyonunu, %5 polietilen glikol fazından 50 µL içeren hedef plakanın bir sütunundaki kuyucuklara dağıtın. 0,5 mm dağıtım yüksekliği kullanın ve damlayı saniyede bir µL veya daha yavaş bir akış hızında dağıtın. Bu işlemi, hedef plakadaki tüm sütunlara hücreler yerleşene kadar tekrarlayın; işlem tamamlandığında hedef plakayı çalışma istasyonundan dikkatlice çıkarın ve herhangi bir ilaç uygulamasından önce hücreleri nemlendirilmiş bir ortamda, 37 °C ve %5 karbondioksit altında 24 saat boyunca inkübe edin.Kültürde 24 saat bekletildikten sonra 96 kuyucuklu plakanın her bir kuyucuğunda steroid oluşumunu görsel olarak onaylar. Test için cisplatin gibi ilgilenilen bir ilacı hazırlamak için seri dilüsyon yöntemini kullanın. Her bir dilüsyon, istenen nihai konsantrasyonun iki katı olacak şekilde stok ilaç çözeltisini kültür ortamında seyreltin.96 kuyucuklu plaka başına beş farklı konsantrasyona kadar test yapılabilir. Her kuyucuğun polietilen glikol fazına 50 µL ilaç çözeltisi ekleyin. Yalnızca besiyerinin eklendiği kontrol grubu dahil olmak üzere, tedavi grubu başına sekiz kuyucuktan oluşan iki kolon kullanın.Steroidleri ilaçla birlikte 37 °C'de ve %5 karbondioksit ortamında, ışıdan koruyarak 48 saat boyunca inkübe edin. 48 saat sonra, taze ilaç dilüsyonları hazırlayın ve istenen konsantrasyonda taze ilaç içeren ek 50 µL besiyeri ekleyerek ilacı yenileyin. PHE'yi 37 °C'de ve %5 karbondioksit ortamında, ışıdan koruyarak 48 saat daha inkübe edin.Ardından, beraberindeki metin protokolünde açıklandığı üzere her kuyucuğa bir hücre canlılığı reaktifi ekleyin ve plakayı 37 °C'de, %5 karbondioksit altında ve ışıktan korunmuş şekilde altı saat boyunca inkübe edin. Analiz tamamlandığında, plakayı bir mikroplaka okuyucuya yerleştirin ve floresan sinyalini sırasıyla 560 ve 590 nanometre uyarılma ve emisyon dalga boylarında okuyun. Anti-kanser ilaçların yüksek kapasiteli taraması, yüzlerce tek tip boyutlu steroid oluşturmak için tekrarlanabilir bir yöntem gerektirir.Burada gösterilen grafik, sferoit oluşturmak için kullanılan bu yöntemin tekrarlanabilirliğini vurgulamaktadır. Standart bir 96 kuyucuklu plakada, çap ortalaması 332 mikron ve standart sapması %10'dan düşük olan sferoit çaplarındaki varyasyonların, normal bir dağılıma uygun olduğu bulunmuştur. Sferoitler, klinik bir kemoterapötik ilaç olan cisplatin'in farklı konsantrasyonlarına dört gün boyunca maruz bırakıldığında, tedavilere karşı doza bağımlı bir yanıt göstermişlerdir.Sonuç olarak, %50 letal doz ilaç konsantrasyonunun 4,67 Micromolar olduğu bulunmuştur. Letal konsantrasyonlardaki ilaç tedavisi kanser hücrelerini parçalamıştır. Bu teknikten sonra, işlem yaklaşık iki saatte tamamlanabilir. Bu prosedürü uygularken, steroid baskılama deneylerine geçmeden önce sulu iki faz oluşumunun hızla kontrol edilmesinin önemli olduğunu unutmamak gerekir. Bu prosedürün ardından, kanser hücre steroidlerindeki ilaçların moleküler hedefleriyle ilgili ek soruları yanıtlamak için örneklerin steroid immünohistokimyasal boyamasının kriyoseksiyonu ve diğer biyolojik analizler gibi diğer yöntemler uygulanabilir.Bu videoyu izledikten sonra, 3D kanser hücresi kültürlerinin nasıl kolay bir şekilde oluşturulacağı ve standart plakalar ile cihazlar kullanılarak yüksek kapasiteli ilaç testlerinin nasıl gerçekleştirileceği konusunda kapsamlı bir bilgiye sahip olmalısınız.

robotic-production-cancer-cell-spheroids-with-an-aqueous-two-phase

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Bu ticari olarak temin edilebilen mikro plakalar kullanılarak, üniform bir boyut ve bileşimin kontrollü tümör küremsi (bin yüz binlerce) büyük sayılar üretmek için bir protokol getirmektedir.

Microwell Tabaklar kullanma büyüklüğü kontrollü Tümör küremsi Büyük Sayılar üretimi

Burada, hücre agregasyonu yoluyla 3B hücre sferoidlerinin oluşumu için hızlı ve esnek bir protokol açıklıyoruz. Bu, birden fazla hücre tipine kolayca uyarlanır ve hücre göçü, istila veya anoikis tahlilleri dahil olmak üzere çeşitli uygulamalarda ve hücre-matris etkileşimlerini görüntülemek ve ölçmek için uygundur.

3D Sfero Üretim için bir Verimli ve esnek Hücre Toplama Yöntemi

Terapi değerlendirilmesi amaçlayan deneysel tedavi rejimleri hücre hatları, baş ve boyun Skuamöz hücreli karsinom için geçerli standart test etmemizi sağlayan bir küresel tabanlı, üç boyutlu vitro modeli evrimi tarif duyarlılık ve direnci Primer hücre insan örnekler üzerinden üzerinde içinde belgili tanımlık gelecek.

Baş ve boyun Skuamöz hücreli karsinom için bir küresel tabanlı 3D hücre kültür modelinde test terapi

Hastalık göstergeler çok çeşitli, daha fizyolojik ilgili modelleri gelişmiş ve içine uygulanan ilaç bulma programları davranıyorsun. Burada açıklanan yeni modeli sistemi pulcuklarının kültürlü ve yeni Onkoloji uyuşturucu aramak için bir yüksek üretilen iş 1536-şey plaka tabanlı sistem festivalde nasıl üç boyutlu tümör göstermektedir.

Yüksek işlem hacmi üç boyutlu tümör pulcuklarının nesil uyuşturucu taraması

Bu iletişim kuralı immunotherapeutic yeniden yönlendirilen T-hücre (araba T-hücreli) sitotoksisite karşı 3D yapılandırılmış kanserli hücreleri (pulcuklarının) gerçek zamanlı olarak değerlendirmek için tasarlanmıştır.

Bir küresel öldürme tahlil araba T hücreleri tarafından

Bu protokol, ilacın belirlenmesi için, hastanın türetildiği kürlerin oluşumunu, proliferasyonun ölçülmesi, sitotoksisite testi, akış sitometri, immünofluoresesans boyama ve konfoksel görüntüleme gibi aşağı akış analizini açıklar. anti-neoplastik terapötik olarak adayların potansiyeli. Bu protokol her hasta ve hastalığın aşaması için spesifik ilaçların tanımlanması ile hassas ilacı destekler.

Fizyolojik hasta, kanser kök hücrelerini hedef alan anti-neoplastik Ilaç taraması için 3B kürler türetilmiştir

Bu protokol, üç farklı sferoid tipinin üretimi için bir yöntemi, onları büyük ölçekli yüksek içerikli tarama ve analiz için uygun hale getirecek şekilde detaylandırmaktadır. Ek olarak, küresel ve bireysel hücre seviyelerinde nasıl analiz edilebileceğini gösteren örnekler sunulmaktadır.

Yüksek İçerikli Tarama ve Analiz Uygulamaları için Büyük Ölçekli Sferoid Üretimi için Sağlam Bir Yöntem

Bu protokol, primer kanser hücrelerinden 3D tümör kültürü modelleri oluşturmayı ve hücre canlılık testleri ve mikroskobik incelemeler kullanarak ilaçlara duyarlılıklarını değerlendirmeyi açıklamaktadır.

Hasta Kaynaklı Tümör Örneklerinden 3 Boyutlu Sferoidlerin Oluşturulması ve İlaçlara Duyarlılıklarının Değerlendirilmesi

Görüntü yakalama ve proteomik kullanarak yüksek tekrarlanabilirliğe sahip sferoidlerin yetiştirilmesi ve fenotipik karakterizasyonu için bir protokol sunuyoruz.

Fonksiyonel 3D Küresel Hücre Kültürlerinin Yarı Otomatik Fenotipik Analizi

Bu makalede, üç boyutlu tümör sferoidlerinin oluşturulması için standartlaştırılmış bir yöntem gösterilmektedir. Otomatik bir görüntüleme sistemi kullanarak küresel gözlem ve görüntü tabanlı derin öğrenme analizi için bir strateji de açıklanmaktadır.

İlaç Değerlendirme Çalışmaları için 3D Tümör Sferoidlerinin Üretimi

Burada, takip çok parametreli canlı hücre mikroskobu gerçekleştirmek için farklı çok hücreli sferoid oluşturma yöntemlerini açıklıyoruz. Floresan ömür boyu görüntüleme mikroskobu (FLIM), hücresel otofloresan, boyama boyaları ve nanopartiküller kullanılarak, canlı üç boyutlu (3D) kanser ve kök hücre türevli sferoidlerde hücre metabolizması, hipoksi ve hücre ölümünün analizi için yaklaşım gösterilmiştir.

Çok Hücreli Sferoidlerin Üretimi ve Çok Parametreli Canlı Hücre Floresan Ömür Boyu Görüntüleme Mikroskobu (FLIM)

Keşfedin kanser hücre sferoitlerinin robotik üretimini, sulu iki-fazlı sistem kullanarak yüksek verimli ilaç testi için. Bu yöntem, anti-kanser ilaç etkinliğini standart 96-kuyucuk plakalarda değerlendirir.

İlaç test için bir sulu iki-fazlı bir sistem ile Cancer Celi sferoitlerin Robotik üretimi

Daha fazla video keşfet