İlaç test için bir sulu iki-fazlı bir sistem ile Cancer Celi sferoitlerin Robotik üretimi

Sulu iki fazlı bir sistem kullanılarak yüksek verimli 96 oyuklu plaka formatında kanser hücresi sferoidlerinin robotik baskısı için bir protokol sunulmaktadır.

Bu prosedürün genel amacı, anti-kanser ilaç testlerinde kullanmak için kanser hücresi pH'ını standart bir yüksek verimli formatta oluşturmaktır. Bu, başarılı bir sulu iki fazlı sistem oluşturmak için önce iki polimerin, polietilen glikolün ve dekstranın hücre kültürü ortamında önceden belirlenmiş konsantrasyonlarda çözülmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, ilgilenilen hücreleri istenen hücre yoğunluğunun iki katı oranında hazırlamak ve hücre süspansiyonunu eşit miktarda sulu dekstran fazı ile karıştırmaktır.

Daha sonra 96 oyuklu bir plakayı sulu polietilen glikol fazı ile doldurun ve bir sıvı işleme robotu kullanarak dekstran faz içeren hücre damlacıklarını kuyulara mikrolitre altı damlatın. Bir sonraki adım, 24 saatlik inkübasyondan sonra 96 oyuklu plakada sferoid oluşumunu doğrulamak ve kuyucuklara doğrudan anti-kanser ilaçlarını eklemektir. Son olarak, kontrol ile tedavi edilmeyen kürelere karşı normalize edilmiş ilaçla tedavi edilen steroidlerin yüzde canlılığını göstermek için standart bir plaka okuyucu uyumlu canlılık testi kullanılır.

Bu tekniğin, asılı damla yöntemi veya mikro fabrikasyon kuyu yaklaşımı gibi mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, özelleştirilmiş plakalar veya cihazlar gerektirmemesi ve yüksek verimli küre oluşumuna ve ilaç testine izin vermesidir. Bu yöntem, kanser araştırmalarındaki temel soruları yanıtlamaya ve anti-kanser kemoterapötiklerinin keşfini hızlandırmaya yardımcı olabilir. Bu tekniğin etkileri, yeni anti-kanser ilaçlarını tanımlamak için kimyasal bileşiklerin daha ilgili tümör modelleriyle yüksek verimli taranmasına izin verdiği için kanser tedavisine kadar uzanır.

Bu yönteme yeni başlayan kişiler, kanser hücresi steroidleri ve mikro kuyu plakalarını rahatlıkla oluşturacak ve standart laboratuvar aşınması ve robotik aletler kullanarak ilaç tedavisi deneylerini kolayca yapacaklardır. Başlamak için, 0.5 gram polietilen glikolü tartın ve steril 15 mililitrelik konik bir tüp Vorteks içinde 9.5 mililitre tam büyüme ortamına ekleyin, karışım bir dakika boyunca hacim başına% 5 ağırlıkta 10 mililitre hazırlamak için sulu polietilen glikol fazı. Sonra 0.128 gram dekstran tartın ve 0.87'ye ekleyin.

Steril 1.5 mililitrelik mikro santrifüj tüpü Vorteks'te iki mililitre tam büyüme ortamı. Bu karışım, hacim başına ağırlık% 12.8'lik bir mililitre sulu dekstran fazı hazırlamak için bir dakika boyunca. Hem polietilen glikol hem de dekstran çözeltilerini bir saat boyunca 37 santigrat derece su banyosuna yerleştirin.

Tam çözünmeye yardımcı olmak için. Bir saat sonra olası kirlenmeyi önlemek için kapakların su seviyesinin üzerinde kaldığından emin olun. Polietilen glikol yüz solüsyonunu çıkarın ve beş mililitrelik steril plastik bir şırıngaya yükleyin.

Herhangi bir kirliliği gidermek için çözeltiyi 0.2 mikron gözenekli bir şırınga üst filtresinden geçirin. Hem polietilen glikol hem de dekstran faz çözeltilerini kullanmadan önce 24 saate kadar dört santigrat derecede saklayın. M-D-A-M-B 1 57 meme kanseri hücre hattı gibi ilgilenilen kanser hücrelerini% 90 ila 100 birleşene kadar büyütün.

Daha sonra hücreleri standart teknikler kullanarak hasat edin ve verimi bir hemo sitometrede sayın, peleti yarı büyüme, orta ve yarı iplikli çözelti karışımı içinde mililitre başına 50 milyon hücre konsantrasyonuna yeniden süspanse edin. Bu, 0.3 mikrolitrelik damlacık başına yaklaşık 15.000 hücrelik bir yoğunluk sağlar, filtrelenmiş %5 sulu polietilen glikol fazının 50 mikrolitresini, ekteki metin protokolünde açıklandığı gibi onik ile önceden kodlanmış, yapışmayan 96 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna dağıtır. Polietilen glikol baskısı, çok kanallı pipet ile manuel olarak veya bir pipet kullanılarak sıvı bir işleyici ile robotik olarak yapılabilir, hücre süspansiyonunu Resus'a hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın.

Zamanla yerleşen tüm hücreleri askıya alın. 384 oyuklu bir plakanın bir sütunundan her bir oyuğa 20 mikrolitre süspansiyon ekleyin. Ardından sıvı işleyiciyi açın ve pipetleme kafasını yuvaya yerleştirin.

Koordinatları kaydetmek için kaynak plakasını, hedef plakayı ve pipet ucu kutularını sıvı işleyicinin iş istasyonunda tanımlanmış konumlara yerleştirin. Otomatik sıvı işleyiciyi kullanarak, hücre süspansiyon hacminin kabaca üçte biri kadar bir karıştırma hacmi seçin ve iş istasyonundan gelen karıştırma pipet uçlarıyla sıvı işleyicinin pipetleme kafasından bir varil sütunu yükleyin. Hücre süspansiyonunu 384 kuyulu kaynak plakasında karıştırmak için sıvı işleyiciyi kullanın.

Ardından uçları boş bir bel uçları kutusuna çıkarın. Ardından, 10 mikrolitrelik dağıtım pipet ucu ile pipetleme kafasından bir sütun varil yükleyin. Kaynak plakasından her pipet ucuna 0,3 mikrolitre hücre süspansiyonu aspire etmek için sıvı işleyiciyi kullanın.

Daha sonra hücre süspansiyonunu, 50 mikrolitre% 5 polietilen glikol fazı içeren hedef plakanın bir sütununun kuyucuklarına dağıtın. 0,5 milimetrelik bir dağıtım yüksekliği kullanın ve damlayı saniyede bir mikrolitre veya daha yavaş bir akış hızında dağıtın. Hedef plakadaki tüm sütunlar tamamlandıktan sonra hücrelerle oturana kadar bu işlemi tekrarlayın, hedef plakayı iş istasyonundan dikkatlice çıkarın ve hücreleri herhangi bir ilaç tedavisinden önce 24 saat boyunca 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte nemlendirilmiş bir ortamda inkübe edin.

Kültürde 24 saat sonra 96 oyuklu plakanın her bir oyuğunda steroid oluşumunu görsel olarak doğrular. Test için sisplatin gibi ilgilenilen bir ilacı hazırlamak için seri seyreltme kullanın. Stok ilaç çözeltisini kültür ortamına seyreltin, böylece her seyreltme istenen nihai konsantrasyonun iki katı olur.

96'ya kadar beş farklı konsantrasyon test edilebilir. Kuyu plakası, her birinin polietilen glikol fazına 50 mikrolitre ilaç çözeltisi ekleyin. Tek başına ortamın eklendiği bir kontrol grubu da dahil olmak üzere, tedavi grubu başına sekiz kuyucuktan oluşan iki sütun kullanın.

Steroidleri ilaçla 48 saat boyunca 37 santigrat derecede ve% 5 karbondioksitte ışıktan koruyun. 48 saat sonra, taze ilaç seyreltmelerini hazırlayın ve istenen konsantrasyonda taze ilaç içeren 50 mikrolitre daha ekleyerek ilacı yenileyin. PHE'yi 37 santigrat derecede ve ışıktan korunan% 5 karbondioksitte 48 saat daha inkübe edin.

Daha sonra, ekteki metin protokolünde açıklandığı gibi her bir oyuğa bir hücre canlılığı reaktifi ekleyin ve plakayı 37 santigrat derecede ve% 5 karbondioksitte altı saat boyunca inkübe edin. Test tamamlandığında, plakayı bir mikroplaka okuyucuya yerleştirin ve floresan sinyalini sırasıyla 560 ve 590 nanometre uyarma ve emisyon dalga boylarında okuyun. Anti-kanser ilaçlarının yüksek verimli taraması, yüzlerce eşit büyüklükte steroid oluşturmak için tekrarlanabilir bir yol gerektirir.

Burada gösterilen grafik, sferoidler oluşturmak için bu yöntemin tekrarlanabilirliğini vurgulamaktadır. Ortalama çapı 332 mikron olan standart 96 oyuklu bir plakada,% 10'dan daha az bir standart sapma ileSteroid çaplarındaki varyasyonların normal bir dağılım için tipik olduğu bulundu. Sferoidler dört gün boyunca klinik bir kemoterapötik ilaç olan sisplatinin değişen konsantrasyonlarına maruz kaldıklarında, tedavilere doza bağlı bir yanıt gösterdiler.

Elde edilen %50'lik öldürücü doz ilaç konsantrasyonunun 4.67 olduğu bulundu Öldürücü konsantrasyonlarda mikromolar ilaç tedavisi disparçalanmış kanser hücresi sps Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik yaklaşık iki saat içinde tamamlanabilir. Bu prosedürü denerken, steroid baskı deneylerine devam etmeden önce sulu iki faz oluşumunu hızlı bir şekilde kontrol etmeyi unutmamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, kanser hücresi steroidlerindeki ilaçların moleküler hedefleri ile ilgili ek soruları yanıtlamak için steroidin kriyoseksiyonu, örneklerin immünohistokimyasal boyanması ve diğer biyolojik tahliller gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir.

Bu videoyu izledikten sonra, 3D kanser hücre kültürlerinin uygun bir şekilde nasıl oluşturulacağını iyi anlamalı ve standart plakalar ve cihazlar kullanarak ilaç testini yüksek verimli bir şekilde gerçekleştirmelisiniz.