Name: Bir Robotik Sıvı İşleme Sisteminin Kullanılması Ölçeklenebilir 96-iyi iPSC Kültür Bazlı Plaka ve Üretim (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min
Description: Öğrenin, programlanabilir bir sıvı işleme robotu kullanarak 96-kuyucuklu plakalarda ölçeklenebilir iPSC kültürü nasıl kurulur. Bu yöntem, kardiyomiyositlere farklılaşma için pluripotensiyeli koruyarak yüksek verimli kök hücre genişlemesi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma NIH hibe, R44 GM087784 ve R01 HL109505 tarafından kısmen desteklenmiştir. Yazarlar genişletilmiş teknik destek için, Gilson de INC teknik ve OEM ekibine teşekkür ediyorum.

96 gözlü plaka formatında geleneksel yapışkan kültür koşullarını korurken Aşağıdaki protokoller için Gilson en pipetmaX olan robot sıvı taşıma sistemi, ölçeklenebilir kök hücre kültürü ve otomatik kolaylaştırır. Geleneksel 6-çukurlu plaka kültürü gibi, iPSCs ayrı koloniler, bir tek tabaka olarak değil, 96 oyuklu bir plaka biçiminde, bu protokol ile yetiştirilmektedir. Her oyuk izogenik ya da ayrı olabilir ve robot her bir oyuğa ayrılmış devam çünkü yapılandırma da paralel kültürlenebilir. kültürler özelleştirilebilir bir zamanlama ve kullanıcı böylelikle ekim yoğunluğu ve ölçek oranını kontrol ayrışma yöntemi ve bölme oranını seçer bir geçit programı beslenen bir beslenme programı: Tipik robotik iPSC kültür rutin iki aşaması vardır. Aşağıdaki protokoller yeni bir kültür besleme ve geçit gerçekleştirilir nasıl başladı ve iPSC kültürünü kolaylaştıran ek programlar nasıl açıklar. 1. Hazırlama Ekstrasellüler matris jel kaplı 96 oyuklu levhalar <ol><li> Altı yeni RT 96 oyuklu plakalar ambalajını çıkartın ve pozisyonlar 2, 3, 5, 7, 8, 9 (yatak pozisyonları Şekil 1A bakınız) robot yatak taşıma sıvısı üzerine yerleştirin. </li><li> Yatak konum 6&#39;da bir önceden soğutulmuş, 4 ° C 4-çukurlu çukur yerleştirin. </li><li> Önceden soğutulmuş, 4 ° C 200 ul pipet uçları ile yatak pozisyonunda 1 ucu rafın yük sütunu 12. </li><li> Steril tekniği kullanarak bir kısım dökerek 25 ml 4 ° C DMEM / F12 ile yatak pozisyonunda 6 iyi ilk (sol çoğu) çukur doldurun. Alternatif olarak, transferi tamamlamak için pipet kullanın. </li><li> (PLHR, Şekil 1A bakınız) 96-plaka kapaklarını çıkarın ve özel olarak tasarlanmış plaka kapağı tutan rafın içine her kaydırın. Temastan kaçınınplaka kapakları iç ile. Not: Bir tabak kapağın içini Taşıma veya bir kapağın içinde başka dışında bulaşma için mükemmel bir yoldur dokunan plaka kapakları istifleme. </li><li> Robotik kontrolü dokunmatik tabletin kullanılması, iyi ön ıslatma işlemini başlatmak için düğmeler aşağıdaki dizi basın: <ol><li> &quot;Bir Protokol çalıştır&quot; düğmesine dokunun. </li><li> &quot;Hücre dışı matris jel ön ıslatılmış&quot; seçin ve sonraki dokunun. </li><li> Kullanıcı kararı: Seçilen program önceden test etmek için adım-adım sihirbazı kullanmak için &quot;deneme&quot; dokunun. Not: robot çalışmaz ziyade yazılım yazılım sorunları için protokol sınar. &quot;Kur atlamak&quot; dokunarak kurulan protokolleri ile kabul edilebilir. </li><li> &quot;Run Protokolü&quot; düğmesine dokunun. </li></ol></li><li> Ön ıslatma işlemi (adım 1.6) sırasında 1.8 adıma geçin. </li><li> Büyüme faktörü buz bir 4 mg kısım üzerine çözülme 50 ml içinde bulunan hücre dışı matris jel (GFRM) azalırkonik tüp -80 ° C&#39;de saklandı. Kullanıma hazır olana kadar buz üzerinde kısım tutun. Not: oda sıcaklığına gelmeye bırakılmış ve yararlı olmayacak eğer GFRM katılaşmaktadır. </li><li> 25 ml&#39;lik bir cam pipet ile 24 ml 4 ° C DMEM / F12 içinde 4 mg GFRM kısım yeniden süspanse edin. DMEM / F12 aktarırken, pipet GFRM kısım resuspending önce soğuması için 2-3 saniye duraklama. </li><li> Ön-ıslatma işlemi (adım 1.6) tamamlandığında, 1.11 adıma devam eder. </li><li> Yatakta pozisyonunda 6 çukur dördüncü kuyusuna DMEM / F12 GFRM karışımı 24 ml aktarın. </li><li> Robotik kontrol touch pad kullanarak, hücre dışı matris jel kaplama işlemini başlatmak için düğmeler aşağıdaki dizi basın: <ol><li> &quot;Bir Protokol çalıştır&quot; düğmesine dokunun. </li><li> &quot;Hücre dışı matriks jel kısım&quot; seçin ve sonraki dokunun. </li><li> Kullanıcı kararı: Seçilen program önceden test etmek için adım-adım sihirbazı kullanmak için &quot;deneme&quot; dokunun. Not: robot çalıştırmak ancak rathe değilr yazılım yazılım sorunları için protokol sınar. &quot;Kur atlamak&quot; dokunarak kurulan protokolleri ile kabul edilebilir. </li><li> &quot;Run Protokolü&quot; düğmesine dokunun. </li></ol></li><li> Adım 1.12 tamamlandığında, plaka kapaklarını değiştirin. </li><li> 37 ° C,% 5 CO2 nemlendirilmiş inkübatör hücre dışı matris jel kaplı 96 oyuklu plakalar transfer ve plakalar kullanmak veya hafızaya hazır olacak bu noktada 24 saat orada tutun. Not: hafifletici koşullar altında, yeni kaplanmış hücre dışı matris jel plakaları önerilir inkübasyon, ancak 24 saatlik inkübasyon için O / N, 15-30 dakika sonra kullanılabilir. </li><li> Tekrarlama protokol 1.1, 1.3, GFRM ile DMEM / F12 tüm kadar 1,5-1,6, 1.10 ve 1,12-14 kullanılır adımları. </li></ol> 2. Saklama Ekstrasellüler matris jel kaplı 96 oyuklu levhalar <ol><li> 37 ° C&#39;de,% 5 CO2 nemlendirilmiş inkübatör hücre dışı matris jel kaplı 96 oyuklu plakalar. </li><li> İsteğe bağlı: Ahücre-dışı matrisin llow jel kaplı 96 oyuklu plakalar 2.3 adımına devam etmeden önce, oda sıcaklığına gelmesi. Not: Bu isteğe bağlı bir adımdır plakaları 4 ° C&#39;de konulduğunda yoğunlaşma kurmak azaltacaktır. </li><li> Pozisyonlar 2, 3, 5, 7, 8, 9 (yatak pozisyonları Şekil 1A bakınız) sıvı kotarma robotu yatak plakaları yerleştirin. </li><li> RT 200 ul pipet uçları ile yatak pozisyonunda 1 ucu rafın yük sütunu 12. </li><li> Yatak konum 6&#39;da dört çukur rezervuar yerleştirin. </li><li> (En sağdaki) RT DMEM / F12 ile rezervuarın kuyusunu 4 doldurun. </li><li> 96-plaka kapaklarını çıkarın ve PLHR içine her kaydırın. </li><li> Robotik kontrol touch pad kullanarak, düğmelerin aşağıdaki kombinasyonuna basın: <ol><li> &quot;Bir Protokol çalıştır&quot; düğmesine dokunun. </li><li> &quot;Hücre dışı matriks jel kısım&quot; seçin ve sonraki dokunun. </li><li> Kullanıcı kararı: Seçilen program önceden test etmek için adım-adım sihirbazı kullanmak için &quot;deneme&quot; dokunun. Not: Robot çalışmaz ziyade yazılım yazılım sorunları için protokol sınar. &quot;Kur atlamak&quot; dokunarak kurulan protokolleri ile kabul edilebilir. </li><li> &quot;Run Protokolü&quot; düğmesine dokunun. </li></ol></li><li> Tamamlandığında, plaka kapaklarını değiştirmek ve makine yataktan plakaları çıkarın. </li><li> 6 inç parafın film şeridi ile bir inç her hücre dışı matris jel (kapak plakası karşılayan) kaplı 96 oyuklu plakanın tüm yan etrafında sarılır. Hava geçirmez bir mühür oluşturmak için parafin filmi germek emin olun. </li><li> İsteğe bağlı: tamamlanan hücre dışı matriks jel kaplama tarih plakaları Etiket, hücre dışı matris jel lot numarası, kullanıcı adı ve diğer bilgiler. </li><li> Onlar kadar iki hafta boyunca kullanmak için iyi olacaktır 4 ° C&#39;de plakaları saklayın. Not: Tabaklar başarıyla ancak bu tavsiye edilmez, iki haftalık sınırın ötesine kullanılmıştır. </li></ol> 3. Kök Hücre Colony Yayımlama Yoğunluk SahneCanlı veya dondurulmuş Kültür 96-kuyu Plate Formatında Gradyan: Nasıl başlatın veya bir Kök Hücre Hattı Normal Passage Aralıkları Geri Yükleme <ol><li> Donmuş bir kültür ile başlayan varsa, 3.2 adıma geçin. Zaten bir plaka üzerinde canlı kök hücre kültürü ile başlayan, adım 3.5 başlar. </li><li> Buz sadece küçük bir yığın kalana kadar 37 ° C su banyosu içinde tüp dönen donmuş kültür çözülme. </li><li> İsteğe bağlı: 10 uM Y27632 ihtiva eden taze SCGM süpernatan ortamı aspire ve 7 ml kök hücre pelletini, 300 x g&#39;de 2 dakika süre ile hücre büyüme ortamı (SCGM), santrifüj kök R, 10 ml eritilmiş hücreleri ile seyreltilir. Not: Bu adım donma medya taşınmasını ortadan kaldırır. </li><li> 3.6 Adım geçin. </li><li> Canlı ile başlayan varsa, zaten kök hücreleri kaplama: geçit hücreleri normal olarak enzimatik veya non-enzimatik ayrışma kullanarak. 1,5-3000000 hücrelerinin toplam hasat etmeye çalışın; Genellikle, altı oyuklu plakanın bir de. Hasat hücreler santrifüj2 dk 300 xg&#39;de, süpernatant medya aspire ve 10 mM Y27632 içeren 7 ml taze SCGM kök hücre pelletini. 3.6 Adım geçin. </li><li> Hücreler sağlamak ya donmuş bir ya da canlı kültürden, 10 uM Y27632 7 mi RT SCGM içerisinde süspanse edilir. </li><li> RT 200 ul pipet uçları ile yatak pozisyonunda tek uç rafın yük sütunu 12. </li><li> Yatak 2 konumunda bir dört çukur rezervuar yerleştirin. </li><li> Yerleştirin yeni bir hücre dışı matris jel kaplı 96 oyuklu plaka yatağı 5 konumundaki 37 ° C&#39;ye kadar ön-ısıtılır ve PLHR yerleştirerek kapağı çıkarın. </li><li> Pipetlemeyin ile rezervuarın kuyuya 3 yeniden süspanse hücrelerin 7 ml aktarın veya steril dökün. <ol><li> Robotik kontrol touch pad kullanarak, düğmelerin aşağıdaki kombinasyonuna basın: </li><li> &quot;Bir Protokol çalıştır&quot; düğmesine dokunun. </li><li> &quot;Tohum Yoğunluk Gradient&quot; i seçin ve yanındaki dokunun. </li><li> Kullanıcı kararı: select önceden test etmek için adım-adım sihirbazı kullanmak için &quot;deneme&quot; dokununed programı. Not: robot çalışmaz ziyade yazılım yazılım sorunları için protokol sınar. &quot;Kur atlamak&quot; dokunarak kurulan protokolleri ile kabul edilebilir. </li></ol></li><li> &quot;Run Protokolü&quot; düğmesine dokunun. </li><li> Seyreltme serisi tamamlandığında, aşağıdaki besleme kadar 37 ° C,% 5 CO2 nemlendirilmiş inkübatör plaka ve yeri yeniden kapsamaktadır. </li><li> İsteğe bağlı: Tarihe, gerilme bilgileri, kullanıcı adı, medya türü ve diğer ilgili bilgileri ile plaka etiketleyin. </li><li> Aşağıdaki Protokolü 4 kullanılarak gerektiği gibi önümüzdeki birkaç gün içinde, 96-plaka besleyin. Not: Tipik bir kök hücre plakası tam bir medya değiştireceğim kez her 24 saat gerektirir ve SCGM beslenmesi için Y27632 içermez; Sadece geçtikten sonra ilk tohumlama sırasında. Beslenme öncesinde, kirlenme ve koloni yoğunluğu plaka kontrol edin. Koloni yoğunluğu izleme konusunda daha fazla adım için 3.16 bakın. </li><li> C yakın Önümüzdeki birkaç gün içinde, çeşitli sütunlarplaka girmek (genellikle sütunlar 5-8) geçiş için ideal bir yoğunluk yaklaşım olacaktır; Bu yoğunluk tanımlamak için, akılda aşağıdaki bilgilerle Şekil 3B&#39;de gösterilen yoğunluk aralığında 96-plaka karşılaştırmak: <ol><li> Passage kolonilerin çoğunluk arasındaki boşluk bitişik koloni çapı yaklaşık% 25 olduğu zaman. Not: mantığı geçiş zamanı tanımlamak için beslenme ve büyüme başka bir döngü kaçınılmalıdır temas, yapım kolonilerde neden olduğunu ifade etti. </li></ol></li><li> Üniform seyreltilmiş plaka başlatmak ve düzenli kültürünü başlamak için ideal bir yoğunluk ve geçit olan bir sütun seçin. Geçişine Protokol 5&#39;e bakınız. </li></ol> 4. Besleme 96 oyuklu plaka Kök Hücre kolonileri Not: Aşağıdaki protokol, bir 96 oyuklu kök hücre koloni plakanın besleme tarif etmektedir. teknik, paralel toplam 6 plakaları barındıracak kadar ölçeklendirilebilir. <ol><li> 96-kuyu s kaldır37 ° C ile tem hücre kolonisi levha,% 5 CO2 nemlendirilmiş inkübatör. </li><li> Kirlenme ve hücre yoğunluğu için plaka kontrol edin. Beslemek için, koloni yoğunluğu ideal bir kanalı yoğunluğunun altında olduğundan emin olun. Yoğunluk hakkında bilgi için Şekil 3B bakın. Not: Kirlilik olarak bulanık ortamı sunabilir ve hoş olmayan bir koku eşlik. Küçük, tabii ki sigara iPSC agrega da mikroskobik denetimi altında görülebilir. Hücre yoğunluğu değerlendirmek için yukarıdaki adım 3.16.1 bakın. </li><li> Bir eğimli, 37 ° C rampa yatakta 3 pozisyonunda 96 oyuklu kök hücre koloni plaka koyun. </li><li> RT 200 ul pipet uçları ile yatak pozisyonunda 1 ucu rafın yük sütunu 12. </li><li> Yatakta 2 pozisyonunda 4-iyi bir çukur yerleştirin. </li><li> Steril dökmek veya pipet transferi yoluyla Y27632 olmadan 2 8 ml taze yatak pozisyonu, RT SCGM içinde çukur kuyusunu 3 doldurun. </li><li> PLHR yerleştirerek 96-iyi kök hücre koloni plakası kapağını çıkarın. </li><li> KullanmaRobotik kontrol touch pad, düğmeler aşağıdaki kombinasyonuna basın: <ol><li> &quot;Bir Protokol çalıştır&quot; düğmesine dokunun. </li><li> &quot;Koloni Bir Plaka Yem&quot; ve yanındaki dokunun seçin. </li><li> Kullanıcı kararı: Seçilen program önceden test etmek için adım-adım sihirbazı kullanmak için &quot;deneme&quot; düğmesine dokunun. Not robot çalışmaz ziyade yazılım yazılım sorunları için protokol sınar. &quot;Kur atlamak&quot; dokunarak kurulan protokolleri ile kabul edilebilir. </li><li> &quot;Run Protokolü&quot; düğmesine dokunun. </li></ol></li><li> Besleme protokolü tamamlandığında, 96 oyuklu kök hücre koloni plaka yeniden kapak ve 37 ° C&#39;de geri dönmek için,% 5 CO2, aşağıdaki besleme ya da geçiş kadar nemlendirilmiş bir kuluçka cihazı gereklidir. Bu, genellikle, 24 saat sonra, gereklidir. Not: Tarih, ortam türü, kullanıcı adı ve diğer ilgili bilgilerle plaka kapağında besleme olayı kaydetmek için tavsiye edilir. </li></ol> 5. Pasajlanması 96 oyuklu PlHücre Koloni Kök yedik <ol><li> Birkaç beslenme döngüsünden sonra 96 ​​de kök hücre koloni plaka geçişi için hazır olacaktır. Bu protokol, 01:12 bölme oranını temsil eden, tek bir 96 oyuklu plakaya bir sütun geçişini tarif etmektedir. Kullanıcı bölünmüş oranını tanımlar ve komşu olmayabilir kuyuları seçerek dahil, split kuyular veya sütun herhangi bir sayı seçebilirsiniz. </li><li> Olup kanalı belirlemek için 3B Şekil 96 oyuklu kök hücre koloni plakası yoğunluğu Karşılaştırması. kolonilerin çoğunda arasındaki boşluk, bitişik koloni çapı yaklaşık olarak% 25 ya da daha sonraki bir besleme birbirlerine büyüyen koloniler ile sonuçlanacaktır idealdir geçit yoğunluğudur. </li><li> Hiçbir kirlenme olmadığından emin olmak için mikroskop altında 96-iyi kök hücre koloni plakasını inceleyin. </li><li> Bir eğimli, 37 ° C rampa yatakta 3 pozisyonunda 96 oyuklu kök hücre koloni plaka koyun. </li><li> RT 200 ul pipet ile yatak pozisyonunda 1 ucu yükleme rafa Yük kolonlar 8-12ipuçları. </li><li> Yatakta 2 pozisyonunda 4-iyi bir çukur yerleştirin. </li><li> Boş çukur kuyu 1 bırakın, kuyunun 2 8.5 ml SCGM + 10 uM Y27632 koymak kuyuya 3 3.5 ml 30% proteolitik ve kolajenolitik ayrışma ayıracı (veya EDTA bazlı ayrılma ayıracı) koymak, kuyunun 4 4.5 ml PBS koydu. Not: Bütün reaktifler oda sıcaklığında veya 37 ° C de olabilir. PBS ile seyreltildi% 30 RT proteolitik ve kolajenolitik ayrışma reaktifi adipoz kullanıldı ve fibroblast iPSC kültürü burada tarif edilen. </li><li> Yatak 5 konumundaki yeni bir önceden ısıtılmış 37 ° C hücre dışı matris jel kaplı 96 oyuklu plaka koyun. </li><li> 96 oyuklu kök hücre koloni plakası kapağı, hem de yeni bir 96 oyuklu plaka kapağı çıkarın ve PLHR onları hem yerleştirin. </li><li> Robotik kontrol touch pad kullanarak, düğmelerin aşağıdaki kombinasyonuna basın: <ol><li> &quot;Bir Protokol çalıştır&quot; düğmesine dokunun. </li><li> &quot;Koloni Bölünmüş 01:12 sütun 1&quot; seçin ve sonraki dokunun. </li><li> Kullanıcı kararı: dokunun &quot;test sürüşü&quot; kullanmak içinadım-adım sihirbaz seçilen programı önceden test etmek için. Not: robot çalışmaz ziyade yazılım yazılım sorunları için protokol sınar. &quot;Kur atlamak&quot; dokunarak kurulan protokolleri ile kabul edilebilir. </li><li> &quot;Run Protokolü&quot; düğmesine dokunun. </li></ol></li><li> Geçit protokolü bittikten sonra, her iki plakaları yeniden kapsamaktadır. </li><li> İsteğe bağlı: Gerekli bilgilerle yeni plaka etiketleyin (örneğin, tarih, hücre hattı, geçit sayısı, ortam türü, kullanıcı adı, vb). </li><li> 37 ° C, her iki plakaları Dönüş,% 5 CO2, aşağıdaki besleme ya da geçiş kadar nemlendirilmiş bir kuluçka cihazı gereklidir. Not: Bir sonraki beslenme 24 saat sonra tipik olarak. Not: Hücreler ve koloniler bölme 2-3 saat içinde plaka takmak ve çok yayılmış bakmak gerekir. Bu, Rho-kinaz inhibitörünün varlığı nedeniyle ve hücreleri (örneğin, parke taşı paketlendi koloniler wi karakteristik kök hücre morfolojisi yoğunlaştırmak ve sergileyecekİlk Rho-kinaz inhibitörü ücretsiz beslenme sonrası büyük çekirdek oranı küçük hücreli hacmi) th. </li></ol> Üretim 6. Hasat 96 gözlü levhalar Kök Hücreler Not: Hücre kolonileri kültürü sırasında herhangi bir noktada kullanım için hasat edilebilir Stem. Hücreler geçit hazır olduğunuzda Genellikle bu gerçekleşir (protokolü 5). Bu protokol, 96 oyuklu bir kök hücre koloni plaka on sütun hasat açıklamaktadır. <ol><li> Hiçbir kirlenme olmadığından emin olmak için mikroskop altında 96-iyi kök hücre koloni plakasını inceleyin. </li><li> Bir eğimli, 37 ° C rampa yatakta 3 pozisyonunda 96 oyuklu kök hücre koloni plaka koyun. </li><li> Yük sütunlar RT 200 ul pipet uçları ile yatak pozisyonunda 1 ucu yükleme raf 11 ve 12. </li><li> Yatakta 2 pozisyonunda 4-iyi bir çukur yerleştirin. </li><li> Bırakın yalak kuyu 1 boş, kuyunun 2 8.5 ml SCGM put 3.5 ml% 30 proteolitik ve kolajenolitik ayrışma reaktif (veya EDTA bazlı ayrılma reaktif) kuyuda3, kuyunun 4 4.5 ml PBS koydu. Not: Bütün reaktifler oda sıcaklığında veya 37 ° C de olabilir. </li><li> PLHR 96-de kök hücre koloni plaka kapağı ve yer çıkarın. </li><li> Robotik kontrol touch pad kullanarak, düğmelerin aşağıdaki kombinasyonuna basın: <ol><li> &quot;Bir Protokol çalıştır&quot; düğmesine dokunun. </li><li> &quot;Koloni Hasat Sütunları 2-12&quot; seçin ve sonraki dokunun. </li><li> Kullanıcı kararı: Seçilen program önceden test etmek için adım-adım sihirbazı kullanmak için &quot;deneme&quot; dokunun. Not: robot çalışmaz ziyade yazılım yazılım sorunları için protokol sınar. &quot;Kur atlamak&quot; dokunarak kurulan protokolleri ile kabul edilebilir. </li><li> &quot;Run Protokolü&quot; düğmesine dokunun. Not: toplama işlemi tamamlandıktan sonra, hücreler yalak kuyuya 2 olması ve toplama için hazır olacaktır. </li></ol></li></ol>

Yazarlar MKC, MJG, EEB, NJD ve RO ya da burada açıklanan robotik protokolleri tasavvur ve gelişmiş InvivoSciences geliştirme çalışanlarının, INC zamanında idi. TW InvivoSciences INC CSO olduğunu. SH Gilson INC bir çalışanıdır.

Bu çalışmada küçültüyor ve aynı zamanda verimli ölçek yukarı sağlarken bir 96-plaka biçiminde beslenme ve geçit otomatik iPSC üretimi için robotik kültürün bir yöntem geliştirdi. Bir sıvı kotarma robotu rutin enzimatik ayrılma düzenli aralıklarla iPSC koloniler ve geçiş onları beslemek için kullanılmıştır. Robot, aynı zamanda hücre dışı matris jel kaplanmış plakalar üretilmesi ve tohum yoğunluğu gradyanı gerçekleştirmek için programlanmıştır. Fibroblast ve adipoz türetilmiş iPSCs daha büyük 20 pasajlar, yaklaşık 3 ay boyunca bu sistemde kültürlendi zaman stabil karyotipleri gibi, pluripotense, muhafaza edilmiştir. Her iki hücre dizisi kardiyomiyositlerde farklılaşma sahip idi. Birlikte, burada açıklanan protokollerin koleksiyon kültür kök hücrelere çok az kök hücre kültürü deneyimi veya özel kültür ekipmanına sınırlı erişimi olan kullanıcılar sağlar ve yüksek hücre üretimini ya da çok az emek ve maliyetle taşıma çoklu çizgi elde. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; burada ayrıntılı robot protokoller iPSC üretim ve kullanım, ekonomik olarak üretim için bir yöntem sağlar. Bir avantajı burada ortaya kurulmuş bir plaka bazlı biçimde ölçeklenebilir kök hücre kültürü ve önceden 44,47 - 49 pluripotensini korumak için. Ölçeklenebilir kök hücre kültürü verimi pluripotent hücrelerin diğer formatlar 20,23,29 bu plaka bazlı yöntem adaptasyonu gibi süspansiyon kültür biçiminde esasen hiçbir değişiklik, kimyasal madde veya Rho-kinaz inhibitörü 20 uzun süreli kullanımı köpük önleyici kullanımını gerektirir iken. Kültür koşulları benzer çünkü bu plaka bazlı yöntem, bu nedenle hızlı bir şekilde ve tahmin edilebileceği gibi, yeni çizgiler ağırlayacak. Hastalık modelleme iPSCs kullanımı 4,6,19,50 arttıkça, yeni iPSC çizgileri sürekli olarak üretilir. biçimine üzerine geçiş bariyer l çünkü burada açıklanan teknikler yüksek hacimli ve verimlilik orta kültür yeni hatlar için en uygunah. Bu aynı zamanda sömürgeleri korumak için gerekli emek ve ekipman için de geçerlidir. Biçimi ve taşıma elde ve yönlendirilmiş farklılaşma iPSC hatları, kültür performansını doğrulamak için kullanılan ortam benzer çünkü Son olarak, tahmin edilebilir olması muhtemeldir. Şekil 8, 96 oyuklu plakalar içinde kök hücre üretiminin olarak üretim için bir strateji göstermektedir. Bir tabak (Döngü 0) robot 12 yeni tabaklar, 12 kat artış (1 Çevrim 0) tohum kullanılır. Beslenmenin birkaç gün sonra, oniki plakaları on iki tabak (Döngü 2 Döngü 1) başka bir dizi tohum geçişli olduğunu. Geriye kalan on plakalar diğer kullanımlar için şimdi mevcuttur ve sistemin üretim bileşenini temsil etmektedir. Bu gidişle, bir plaka geçişi 11 tabak her döngü veya 3-4 günde sağlayacaktır. Döngü 3&#39;te Döngü 3. Döngü 2 geçişte görüldüğü gibi birden fazla plakalar geçişli Bu yöntem daha ölçeklendirilebilir, iki tabak vardırHer zaman koloniyi korumak ve 24 yeni plakaları tohum kullanılır. Geri kalan 22 plakaları, her geçiş çevriminden sonra kullanım için daha sonra kullanılabilir. Bakım döngüsü içinde herhangi bir noktada kullanıcı üretimini artırmak için daha fazla tabak tohum yapabilirsiniz. Bir örnek geçişine iki büyüme döngüleri için her sütun olacaktır. birinci geçit on iki plakalara bir plaka dönüştürür, ve on iki plakalarının her biri 144 plakaları tohum için kullanılır. Bu durumda, bir kullanıcı, bir plaka ile başlar ve iki geçit veya kültür yaklaşık 1.5-2 hafta sonra, 144 plakaları yer alır. Örneğin, fibroblast ve adipoz iPSC hatları geçide 96 oyuklu plaka başına yaklaşık 25-75.000.000 hücre hazır olduğunda verim. 144 tabak nedenle yaklaşık 4-7 x 10 9 hücre temsil edebilir. Robotik 144, 96 gözlü levhalar taşıyan iş yükü nedir? Bu iş için amaçlarından biri hücre kültürü kök geleneksel (yani, 6 plaka) ile karşılaştırıldığında emek azaltılmış ölçeklenebilir kök hücre üretimi oldu. Robot accomplishes bu fiziksel beslenme ve Pasajlanması boyunca her plaka ele ihtiyacını azaltarak. Doğrusal bunun gibi 96-plaka üretim ölçekleri, geleneksel 6-kuyucuğu, bir teknisyen plakaları ile çalışan geçirdiği zaman robotik kültürü kullanarak önemli ölçüde daha az olduğu isterken. Robotik kültürünün üretim verimliliği bu fark (Şekil 9) elde edilir. Bu teknisyenler plaka yaklaşık 3.5 dakika, inkübatör 6 plaka çıkarmak mikroskop üzerinde kontrol, daha sonra aspire ve yem olabilir bulundu. Buna karşılık, teknisyenler yaklaşık 30 sn inkübatör 96 çukurlu bir plaka kaldırma ve robot üzerinde yerleştirmeden önce yoğunluğu ve kirlenme mikroskop üzerinde teftiş geçirirler. Yukarıda tarif edilene benzer genişletilmiş bir besleme protokolü ile, altı 96-yuvalı plakalar, yaklaşık 21 dakika ya da plaka başına 3.5 dakika sürer, yüklenip beslenebilir. Bir tabak beslemek için toplam geçen süre robot arasındaki karşılaştırılabilirTeknisyen robot için altı tabak (plaka başına 30 saniye muayene) işleme sadece 3 dakika harcıyor oysa ic ve manuel yöntemler, ancak elle beslemesine 6 tabak, bir teknisyen 21 dakika için gereklidir. Manuel 8 saat karşı ve robot bir hata plakaları kullanırken veya sıvı transferi yapmak asla Şekil 9 görüldüğü gibi, bir teknisyen robot kullanılarak 144 tabak taşıma geçirdiği zamanı yaklaşık 1.2 saattir. Burada açıklanan 96-kuyu iPSC kültür yöntemleri karmaşık tarama görevleri için uysal bir platform sağlamaktadır. Her bir göze, genetik olarak aynı ve aynı başlangıç ​​havuzu, aynı yoğunlukta ekildi olduğu için, değişken plaka boyunca dağıtılmış ve koşulları ayrılmasına ilişkin ticari olarak temin edilebilen rezervuarlı robot tarafından korunabilir. Bu gibi kök hücre büyüme ortamı gelişim 34,35,47, alt-tabaka ya da kültür durumu test ve kök hücreleri kullanılarak toksisite çalışmaları gibi deneyler için faydalı olacaktırHer kök hücre çizgisi optimum koloni büyüklüğü ve geçiş şartları açısından benzersiz olduğu için 51. Bir hasat sütunlar, geçişi sırasında mekanik ajitasyon ve besleme frekansı manipüle ederek ekim yoğunluğu, beslenme sıklığı ve geçit işleme modüle bu sistemi kullanabilirsiniz. Bu değişkenler yineleme kullanıcı hızlı bir şekilde yeni hat kültürü için uygun koşullar bir dizi bulmak ya da yeni kültür teknikleri geliştirmek için izin verecektir. Robotik sistem ayrıca 96 paralel ancak bağımsız kök hücre kolonileri korumak yeteneğine sahiptir. IPSC somatik hücrelerden köken veya genetik manipülasyon sonrasında klonlanmış zaman, birçok paralel klonlar potansiyel iPSC hatları elde etmek için taranır. Tek hücre 96 oyuklu plakalar içerisine ekilir sonra bu sistem besler ve her bir koloni tutma kanalı 96 oyuklu plakalar ayrılmış. Bu potansiyel klonları seçerken çok yüksek verim sağlayan ve fiziksel olarak 96 paralel çizgiler kültürleme zorluk ortadan kaldırır. Bu yöntem, aynı zamanda, birbu materyal paralel analiz için hazır böylece llows her klon üretimini büyütülüyor. Son olarak, biz ve tam otomatik kültürün sağlayan inkübatör plakaları sunan robotik plaka kaçakçılığı sistemi ile bu kültürü teknikleri entegre öngörülüyor. Bu, burada açıklanan temel protokoller diğer levha tabanlı sistemlere devredilemez beri büyük genişleme için izin daha karmaşık robotik ile gerçekleştirilebilir. protokollerde ele ilk kritik adımlar önlemek ve 1.5 ve 4.2 adımları gibi kirlenme kontrol olanlardır. Yukarıda ele alındığı gibi iyi steril bir teknik, genel anlamda kullanılmaktadır Eğer kirlilik, başarılı bir şekilde önlenebilir. Bu belirtilen adımlarda kirlenme ve bu protokolde bunu yapmak için operatör kontrol belirgin kirlenme riskini azaltacağını, ne olursa olsun kök hücre kültürü biçimi, zorunludur. Uygun hücre dışı matris jel uygulaması, ikinci bir ess olduğunuBu protokolün genel başarısı için ential adım. Düzgün 96-iyi plakaları kaplanması olmadan, kök hücreler büyüme olmaz. Bir ortak sorunu eksik kuyu kaplamadır. Deneyim hava kabarcıkları, elektrostatik çekim ve kılcal eylem tam kuyu kaplama engel olduğunu göstermiştir. Ön-ıslatma aşama (1.6) önemli ölçüde de alt kaplama arttırmak için geliştirilen ve atlanır olmamalıdır. Hücre dışı matris jel kaplama eşit şekilde iyi bir tabana ve kenarlara dağıtılmıştır uygulandığında bu ön ıslatma aşaması örneğin, plastik, 96 oyuklu plakanın belirgin hidrofobikliğini indirgemektedir. Ayrıca, bir kez yavaşça da hücre dışı matris jel çözeltisi dağılımını sağlamak için kaplanabilir temiz bir yandan karşı, 96 gözlü levhalar dokunun önerilir. ayrışma parametreleri de optimize etmek için önemlidir. Enzim veya EDTA göre ayrıştırma reaktifi ile genişletilmiş inkübasyon veya geçişi esnasında hedef olabilir de olmayabilir de tek hücreler ile sonuçlanacaktır. Bu nedenle operatörayrışma zamanı, öğütme gücü ve yıkama tekrarı koloni morfolojisi ve sağlığını etkileyebilecek ve buna göre ayarlamak nasıl özel dikkat etmelidir. Burada anlatılan teknikleri sınırlamaları anlamak başarılı çalışması için büyük önem taşımaktadır. Başka bir hücre kültürü ortamında olduğu gibi, 96 oyuklu plakaların kullanımı, nispeten yüksek bir kirlenme riski sunulur. Yukarıda tarif edildiği gibi, bir teknisyenin besleme ve pasajlama boyunca her plaka taşıma olduğu; Örneğin, kapağını açarken robot yatakta plaka koyarak ve mikroskop plaka kontrol ederken. Adım 1.5 sonra belirtildiği gibi, bu nedenle, bu tür yatakta eğimli ısıtma blok veya dikey pimleri gibi herhangi bir plaka kapağın içini dokunmayın veya herhangi bir potansiyel kontamine yüzeye bu bölümü maruz değil zorunludur. Protokol gelişimi sırasında bu sınırlama keşfetti ve sterilite korumak için plaka kapakları tutmak için bir raf geliştirmek için itici güç oldu. Aynı şekilde, oluk rezervuarlar, pipet uçları ve oçevreye açık ve teknisyen tarafından ele çünkü sıvı taşıma robotu yatakta ther malzemeleri kontaminasyon potansiyel kaynaklarıdır. Bu nedenle, iyi steril bir teknik, maruz kalan kültür malzemeler veya açık sıvılar içinde hareketlerini azaltır gibi uygulanmalıdır. Diğer bir kısıtlama protokolü görsel&gt; 100 96-gözlü plakalar, her kuyu kontrol, şekilde ölçeklendirilir hantal olmasıdır. Bu şüpheli kuyu tespit etmek, görsel gibi bulanık medya gibi kontaminasyon belirtileri için bütün plaka incelenerek ele alınabilir. Gelecekteki olarak üretim için, otomatik bir mikroskop ve hücre büyümesi ve potansiyel kirlenme göstergesinin kullanımı dahil edilecektir. Özetle, burada açıklanan yüksek verimli 96-gözlü tabanlı platform bir tabak biçiminde kök hücre kültürü ve üretimi için tekrarlanabilir, yüksek sadakat yöntem sunmaktadır. Bu yöntem, hücre kültürü süre kök adanmış gerekli deneyim, ekipman gerekli ve emek süresini azaltırGeleneksel yapışkan kültür avantajlarını muhafaza.

6 - İnsan uyarılmış pluripotent kök hücreler (iPSCs) kullanımı bileşiği test rejeneratif tıp ve hastalık modelleme 2 2007 1 kendi türetme beri önemli ölçüde artmıştır. Bu talep, benzersiz bir miktarda somatik hücrelere ayırt edilebilir pluripotent hücreler, çok sayıda elde etmek için IPSC kapasitesi gelir. Yönlendirilmiş farklılaşma teknikleri 7 geliştirmek gibi - çok kaliteli iPSCs kitlesel üretim için gereksinimi yok, 14 - 10 ve insan hücre veya doku modelleme ve hücre tedavisinin geliştirilmesi 11 artar. 18 - Bu yaygın diğer hastalıklarda arasında, miyokard infarktüsü veya b-hücresi işlevsel değiştirme IPSC milyarlarca yüz milyonlarca gerektiren bedensel hücreleri 15 türetilmiş olacağı çağırılır. Ilaç keşfi ve t Dahası, giderek daha karmaşık 3D modelleme dokuherapy hücrelerin 9,13,19 çok sayıda talep edecek. Bu örneklerin tamamında, tanımlanan tek tip ve yeniden üretilebilir iPSCs mevcuttur ve üretilmesi kolay olması gerekir. Doku mühendisliği ve nakli için, hücre kaynaklı Biopharmaceutics ve kök hücreleri üretmek için, uygun maliyetli bir hücre üretim teknolojisi gereklidir. Bu teknikler, başarılı bir şekilde büyük ölçekli olmayan IPSC ökaryotik göre üretim için dağıtılan kısmen 28 - mikrotaşıyıcı alt tabakalar 26 kullanımı ile 25 veya süspansiyon - iPSCs ölçeklendirilmiş üretimi, süspansiyon kültüründe 20 odaklanmıştır. Çeşitli gruplar, pluripotent kök hücreleri 20,21,23,24,29 verim süspansiyon kültürü sistemleri göstermiştir. Ancak, bu yaklaşım, doku mühendisliği ve sürüş Laborat yapıyor, yeni farklılaşma programlarının geliştirilmesi araştırmacıların hazır değil pahalı ve karmaşık sistemleri kullananORY çaplı araştırma. Ayrıca, süspansiyon ve mikrotaşıyıcı iPSC kültürleri toplanmasını düzenleyen adaptasyon ve teknikleri ya da Rho-kinaz inhibitörü sürekli kullanımı gibi geleneksel yapışık iPSC kültüründe bulunmayan kimyasallar, köpük önleyici maddeler ve filtrasyon gerektirir. Hücrelere fiziksel stres mekanik ajitasyon yanı sıra mikrotaşıyıcı çarpışma sırasında tanıtıldı, süspansiyon kültüründe daha yaygındır. Bu sorunlar, hücre çizgileri süspansiyon içinde kültürlenebilir yeni kök üretilen hangi öngörülebilirlik ve hızını sınırlar. Diğerleri plaka kültürü teknikleri 30,31 taklit robotik plaka taşıma sistemlerini geliştirdik ama bu platformlar ekipman ve kök hücre kültürü ile ilişkili temel zorlukları yanında faaliyet uzmanlık için önemli yatırımlar talep ediyoruz. Aşağıdaki çalışma kendi kendine yeten, standart 8-kanal robot sıvıyı kullanan geliştirme ve ölçeklenebilir iPSC kültür sisteminin pratiğiişleyici 96 oyuklu plakalar. Bu yöntem laboratuar ölçekli iPSC kültürü ve yüksek hacimli iPSC üretimini köprü için tasarlanmıştır (örneğin, 10 7 - teknisyeni Haftada 1.5 x 10 9 hücre) yeni iPSC teknolojilerin geliştirilmesi olanlar sağlayan kolayca büyük donanım veya işçilik yatırımlar olmadan üretim büyütmek için. Bu yöntem, ayarlamak için nispeten pahalı olmayan bir kök hücre kültürü, bir programlama veya mühendislik deneyimi çok az gerektiren, özel bir hücre kültürü kaputu gerek kalmadan küçük bir ekipman alanına sahiptir, ve otomatik yüksek verimlilik orta sağlamak için standart hücre kültür teçhizatı kullanmaktadır Hücre üretimi. Amaç hücre kültürü kök yeni laboratuvarlar tarafından kullanılabilir ölçeklenebilir kök hücre kültürü yapabilen bir sistem geliştirmekti, manuel ekimi fikirlerini geliştirerek ya da kök hücrelerin çok sayıda üretmek için ekonomik bir vasıta isteyenler için bir engel bulanlar. Burada sunulan platform teknisyen etkisi kaldırırhücre kültürü kök ve tutarlı kök hücre üretimini sağlamak için besleme ve geçiş prosedürlerini normalleştirir.

<table><tbody><tr><td>96 oyuklu plakalar</td><td>Corning</td><td>3596</td>, <td>96 oyuklu; Kuyu hacmi: 360&nbsp; &#956; l; Hücre büyüme alanı: 0.32&nbsp; cm2; Ayrı ayrı sarılmış</td></tr><tr><td>Denizatı Teknesi</td><td>SeahorseBio</td><td>201308-100</td><td>Rezervuar 4 Şeffaf Parça Poli Proplen 73Ml 25/Cs</td></tr><tr><td>Gilson İpuçları</td><td>Gilson</td><td></td><td>F167023 10 raf gilson 96 uç D200 uç</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>12500062</td><td>DMEM/F12 tozu.&nbsp; 1 L saflaştırılmış, hücre kültürü dereceli su ve steril filtrede tekrar süspanse edin.</td></tr><tr><td>Büyüme Faktörü Azaltılmış Matrigel</td><td>Corning</td><td>354230</td><td>Metinde "hücre dışı matris jeli" olarak anılacaktır. Matrigel GFR, 10&nbsp; ml</td></tr><tr><td>mTeSR1</td><td>Kök Hücre Teknolojileri</td><td>5857</td><td>mTeSR1 hES Bakımı için Komple Kit.</td></tr><tr><td>E8 Medya</td><td>Kök Hücre Teknolojileri</td><td>5940</td><td>teSR-E8 hESC / hiPSC Bakımı için</td></tr><tr><td>Kit Y27632</td><td>AdooQ BioScience</td><td>A11001-50</td><td>Kaya inhinitörü Y-27632 2HCI</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Yenilikçi Hücre Teknolojileri</td><td>ACCUTASE</td><td>Metinde "proteolitik ve kollajenolitik ayrışma reaktifi" olarak anılacaktır. Aktataz 500&nbsp; ml steril hücre çözeltisi</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Fisher</td><td>SH30256FS</td><td>PBS, Ca Mg 500&nbsp; ml, 6/pk</td></tr><tr><td>Gilson PIPETMAX</td><td>Gilson</td><td>PIPETMAX</td><td>http://www.gilson.com/en/AI/Products/13.290/Default.aspx#.VCGwRBZmYSk</td></tr></tbody></table>

bir robotik sıvı İşleme sisteminin kullanılması Ölçeklenebilir 96-iyi ipsc kültür bazlı plaka ve Üretim

Scalable 96-well Plate Based iPSC Culture and Production Using a Robotic Liquid Handling System

Pluripotent kök hücre kültüründe Devam ilerleme rejeneratif tıp, ilaç keşfi ve güvenlik testleri, bu hücrelerin kullanımı için tezgah ve Yatağımın arasındaki uçurumu kapatıyor. Doku mühendisliği ve nakli için, hücre kaynaklı Biopharmaceutics ve kök hücreleri üretmek için, uygun maliyetli bir hücre üretim teknolojisi gereklidir. Pluripotensin ve zamanla downstream uygulamalar (örneğin, hücre farklılaşması) hücrelerin istikrarlı performans Bakım büyük ölçekli hücresi üretimi için her şeyden önemlidir. Oysa o operatörün ciddi değişkenlik tanıtmak yanı sıra ölçek-up pahalı olabilir nerede hücrelerin elle kültüre, özellikle elde etmek zor olabilir. Minimal teknisyen katılımını veya deneyim gerektiren sıvı robot taşıma geliştirilen çok kanallı bir tezgah üstü kullanılarak operatör etkisi roman kök hücre kültürü protokolleri yüksek verimlilik, büyük ölçekli kök hücre üretimini etkinleştirmek ve kaldırmak için. IleBu protokoller, insan uyarılmış pluripotent kök hücreler (iPSCs) doğrudan donmuş stoktan besleyici içermeyen koşullar kültürlendi ve 96 oyuklu plakalar içinde muhafaza. Ne zaman geçişine hücre hattı ve istenen ölçek büyütme oranına bağlı olarak, operatörün kolayca bölme için optimal koloni yoğunlukları gösteren görüntülerin bir dizi dayalı belirleyebilirsiniz. Sonra gerekli reaktifler, bir santrifüj aşaması olmadan yeni plakalara bir koloni bölünmüş gerçekleştirmek için hazırız. 20 pasajlar (~ 3 ay) sonra, iki iPSC hatları, kararlı karyotip tutulan kök hücre belirteçleri ifade ve yüksek verimlilik ile kardiyomiyositlere ayrışmıştır. Sistem 96 oyuklu plakalar için tasarlanmış yeni bir farklılaşma protokolleri veya genetik manipülasyon daha sonra, yüksek veri akışı taramasını gerçekleştirmek olabilir. Bu teknoloji uygulamaları sayısız için aynı kök hücrelerin çok sayıda üretmek için emek ve teknik yükünü azaltacaktır.

Açıklanan protokoller, laboratuvarların programlanabilir bir sıvı işleme robotu ve 96 oyuklu plakalar kullanarak minimum işçilik, deneyim ve ekipman yatırım maliyeti ile yüksek verimde ölçeklenebilir, yapışık kök hücre kültürü gerçekleştirmesine olanak tanır. Bu sistemde 20'den fazla kez geçen iPSC'ler pluripotentliği, normal karyotipleri korudu ve kardiyomiyositlere farklılaştı.

Bir Robotik Sıvı İşleme Sisteminin Kullanılması Ölçeklenebilir 96-iyi iPSC Kültür Bazlı Plaka ve Üretim

Continued advancement in pluripotent stem cell culture is closing the gap between bench and bedside for using these cells in regenerative medicine, drug ...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, ölçeklenebilir bir pluripotent hücre kültürünü tekrarlanabilir şekilde kurmaktır. Bu, öncelikle insan pluripotent kök hücrelerini farklı yoğunluklarda ekmek için önceden programlanmış bir sıvı taşıma robotu kullanılarak gerçekleştirilir. İkinci adımda, 96 kuyucuklu bir plaka içinde, paketleme için optimal koloni yoğunluklarına sahip kuyucuklar görsel olarak belirlenir.İndüklenmiş insan pluripotent kök hücreleri, ardından otomatik besleme ve daha ileri paketleme işlemleri için yeni plaklara ekilir. Nihayetinde bu prosedür, insan indüklenmiş pluripotent kök hücrelerin, daha sonra kardiyomiyositlere farklılaşmaları için çoğaltılmasında en uygun ekim yoğunluklarının seçilmesine olanak tanır. Bu tekniğin etkileri, orta ölçekli kişiselleştirilmiş ve rejeneratif tedavilerin geliştirilmesine kadar uzanmaktadır.URI potent kültür robotu, birkaç gün içinde birkaç yüz milyon URI potent kök hücre üretmek için uygundur; bu hücreler daha sonra kişiselleştirilmiş ilaç testleri veya hücre ve doku implant tedavisi için çeşitli hücrelere farklılaştırılabilir. Bu yöntem, optimal pluripotent hücre kültürü ekspansiyonu için ekim yoğunluklarının taranmasında uygulanmış olsa da, diğer çeşitli hücre tipleri için yeni farklılaştırma protokollerinin optimize edilmesi ve belirlenmesinde de kullanılabilir. Prosedürü, laboratuvarımdan Neil Daily isimli farmasötik bilimci uygulamalı olarak gösterecektir. Besleme prosedürüne başlamadan önce, 96 kuyucuklu kök hücre koloni plağını kontaminasyon açısından kontrol edin ve hücre kolonisinin ideal pasaj yoğunluğunun altında olduğunu doğrulayın.Hücreler iyi durumdaysa, plakayı yatağa yerleştirin. Plakayı, sıvı taşıma robotunun 37 °C'lik eğimli rampasındaki üçüncü konuma yerleştirin ve uç rafını yatağa yükleyin. Birinci konuma, oda sıcaklığında, 200 µL pipet uçlarını yerleştirin.Dört kuyucuklu bir hazneyi iki numaralı yatak konumuna yerleştirin ve haznenin üçüncü kuyucuğunu, RO kinaz inhibitörü içermeyen, oda sıcaklığındaki sekiz mililitre taze kök hücre büyüme ortamı ile doldurun. Ardından plakayı plaka tutma rafına aktarın ve robotik kontrol dokunmatik panelini kullanarak sırasıyla Run the protocol colony feed one plate ve next seçeneklerini belirleyin, ardından seçilen programı önceden test etmek için adım adım sihirbazı kullanmak üzere test run düğmesine basın. Protokol onaylandığında, run protocol seçeneğini belirleyin. Besleme işleminin ardından, 96 kuyucuklu kök hücre kolonisi plağını geri alın.Ardından besleme olayının detaylarını plaka kapağına kaydedin ve bir sonraki beslemeye veya pasajlama işlemine kadar 24 saat boyunca hücre kültürü inkübatörüne geri yerleştirin. Bölünecek kuyucuğun seçimi koloni yoğunluğuna bağlıdır. Bu plaka üzerinde bir ekim yoğunluğu gradyanı oluşturulduktan birkaç gün sonra; bölünmek için çok yoğun olan bir kuyucuk, bölünme için ideal yoğunlukta olan bir kuyucuk ve birkaç besleme döngüsünden sonra pasajlama yapılamayacak kadar seyrek olan bir kuyucuk görülmektedir.96 kuyucuklu plaka içindeki kolonilerin çoğunun arasındaki boşluğun, bitişik koloni çapının %25'i kadar olduğunu doğrulayın; aksi takdirde bir sonraki besleme işlemi kolonilerin birbirine karışarak büyümesine neden olacaktır. Ardından, koloni kontamine değilse plakayı yatağa yerleştirin. Plakayı 37 °C rampadaki üçüncü konuma yerleştirin ve uç rafını yatağa yükleyin.Birinci pozisyonu oda sıcaklığında, 200 microliter pipet uçlarıyla hazırlayın. İkinci yatak pozisyonuna dört kuyucuklu bir hazne yerleştirin; ardından, dört kuyucuklu haznenin dördüncü kuyucuğunu boş bırakarak, üçüncü kuyucuğa row kinaz inhibitörü Y 2 7 6 3 2 ile takviye edilmiş 8.5 milliliters kök hücre büyüme ortamı, ikinci kuyucuğa 3.5 milliliters %30 proteolitik ve kollajenolitik disosiyasyon reaktifi ve birinci kuyucuğa 4.5 milliliters PBS ekleyin.Sıradaki adımda, 37 °C'de ön ısıtılmış, hücre dışı matris jeli kaplı yeni bir 96 kuyucuklu plakayı beşinci pozisyondaki yatağa yerleştirin ve eski ile yeni plaka kapaklarını plaka kapak tutucu rafa aktarın. Şimdi, robotik kontrol dokunmatik panelini kullanarak sırasıyla "run a protocol colony split one to 12 column one" seçeneğini ve ardından "next" butonunu seçin. Daha sonra, seçili bir programı ön test etmek için adım adım sihirbazı kullanmak üzere "test run" ve ardından "run protocol" seçeneğini seçin.Pasaj protokolü tamamlandığında, her iki plakayı da geri alın. Yeni plakayı ilgili bilgilerle etiketleyin ve plakaları inkübatöre geri yerleştirin. 24 saat boyunca, hücreler ve koloniler bölünmeden sonraki iki ila üç saat içinde plağa tutunmalı ve RO kinaz inhibitörünün varlığı nedeniyle oldukça yayılmış görünmelidir.İlk RO kinaz inhibitörü içermeyen beslemeden sonra hücreler yoğunlaşacak ve karakteristik parke taşı benzeri kök hücre morfolojisi sergileyecektir. Kök hücre kültürü sırasında kromozomal anomaliler yaygın olarak gözlemlenir, ancak bu görüntülerde gösterilenler gibi plüripotens belirteçlerinin dağılımını etkilemeyebilir; nitekim az önce gösterilen protokolle kültüre edilen hücrelerin karyotip analizi, robotik olarak pasajlanan her iki indüklenebilir pluripotent kök hücre hattının 46 normal kromozoma sahip olduğunu ortaya koymuş ve bu da robotik kültür yönteminin normalde meydana gelebilecek olanın ötesinde bir kromozomal instabiliteye yol açmadığını göstermiştir. Robotik olarak kültüre edilen indüklenebilir pluripotent kök hücre hatlarındaki yerleşik kök hücre gen ekspresyon belirteçlerini incelemek amacıyla toplam RNA da toplanmıştır.Bu deneydeki indüklenebilir pluripotent kök hücre hatlarının her ikisi de benzer pluripotentlik belirteçleri ekspresyonu sergilerken, her bir hattan farklılaşan kardiyomiyositler ve ayrı bir insan dermal fibroblast hattı bu durumu sergilememiştir. Ayrıca, her iki indüklenebilir pluripotent kök hücre hattı kardiyomiyositlere farklılaştırıldığında, belirgin bir sarkomer oluşumu göstermişlerdir. Birlikte değerlendirildiğinde bu veriler, üç aylık ve 20 pasajdan fazla robotik kültürün, pluripotentlik ile uyumlu bir transkripsiyon programı sergileyen ve aynı zamanda kardiyomiyositlere farklılaşma yeteneğine sahip, kromozomal olarak normal hücrelerle sonuçlandığını göstermektedir.Bu videoyu izledikten sonra, pluripotent hücreleri ölçeklenebilir bir şekilde kültüre etmek için bu veya benzeri bir sıvı taşıma robotunun nasıl kullanılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

scalable-96-well-plate-based-ipsc-culture-production-using-robotic

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Mevsimsel hipoksik fiyort dikey derinliği süreklilik çevre genomik DNA izole bir fosmid kütüphane inşaatı açıklanmıştır. Çıkan klon kütüphanesi 384-kuyucuğu içine aldı ve mansap sıralama ve fonksiyonel tarama, otomatik bir koloni toplama sistemi uygulama tarafından arşivlenir.

Büyük Ekle Çevre Genomik Kütüphane Üretim

Kantitatif Spor Analizi (QFA) mikrobiyal kültür uyumu tahmin etmek için deneysel ve hesaplamalı yöntemleri tamamlayıcı bir dizi. QFA genetik mutasyonlar, uyuşturucu ya da mikrop büyümesi üzerine uygulanan diğer tedavilerin etkisi tahmin ediyor. Tek kültür odaklı analiz paralel kültürlerin binlerce deneyler ölçekleme dizayn edilebilir.

Kantitatif Spor Analizi İş Akışı

Sulu iki fazlı bir sistem kullanılarak yüksek verimli 96 oyuklu plaka formatında kanser hücresi sferoidlerinin robotik baskısı için bir protokol sunulmaktadır.

İlaç test için bir sulu iki-fazlı bir sistem ile Cancer Celi sferoitlerin Robotik üretimi

Burada, yüksek verimli tek hücre izolasyonu ve uzun süreli klonal kültüre izin vermek için yeni bir mikro kuyu tasarım konseptini kullanan mikroakışkan bir platformla tek hücreleri izole etmek ve kültürlemek için bir protokol sunuyoruz.

Yüksek verim Tek hücreli İzolasyonu ve Kültür mikroakışkan Platformu

Bir yüksek verimlilik, otomatik, tütün protoplast üretim ve dönüşüm metodolojisi açıklanmıştır. Robotik sistem dışı bir model ürünlere çevrilebilir olmalıdır modeli BY-2 sistemde güçlü paralel gen ifadesi ve keşif sağlar.

Yüksek verim Protoplast İzolasyonu ve Dönüşüm için Robotik Platformu

Otomatik sistemler ve ekranlar çok sayıda rutin hazırlanması için protokoller ve nanoliter kristalizasyon damlacıkları buharı difüzyon deneyler için açıklanan ve tartışıldı.

MRC Laboratuvarı moleküler biyolojinin makromoleküllerin kristalizasyon için protokolleri otomatik

Detaylı bir protokol 48 paralel hücre kültürlerinde bir microbioreactor sisteminde çeşitli koşullar altında eşzamanlı işlem için sunulmaktadır. Hücre kültür süreci, hasat ve sonraki antikor titresi analiz anlatılmıştır.

Yüksek üretilen iş kullanımı otomatik Microbioreactor sistemi modeli Igg1 CHO hücrelerdeki imalatı için

Bu protokol, viskoz malzemelerin yeni bir açık kaynak otomasyon teknolojisi ile standartlaştırılmış ve tekrarlanabilir bir şekilde karıştırılması için kapsamlı bir öğretici görevi görür. Yeni geliştirilen açık kaynaklı bir iş istasyonunun çalışması, açık kaynaklı bir protokol tasarımcısının kullanımı ve tekrarlanabilir karışımları tanımlamak için doğrulama ve doğrulama hakkında ayrıntılı talimatlar sağlanmaktadır.

Hidrojel Tabanlı 3D Kültür Modellerini Otomatik ve StandartLaştırılmış Bir Şekilde Üretecek Açık Kaynaklı Bir Teknoloji Platformu

İnsan kaynaklı pluripotent kök hücre (hiPSC) kültürlerinin otomasyonu ve otomatik görüntüleme ve analiz ile uyumlu nöronal farklılasyonlar gösteriyoruz.

Entegre Canlı Hücre İzleme ile İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücre Kaynaklı Kortikal ve Dopaminerjik Nöronların Otomatik Üretimi

Burada, otomatik bir hücre kültürü sistemi için bir protokol sunuyoruz. Bu otomatik kültür sistemi, işçiliği azaltır ve indüklenmiş pluripotent kök (iPS) hücrelerin bakımından, çeşitli hücre tiplerine farklılaşmaya kadar, indüklenmiş pluripotent kök (iPS) hücrelerin işlenmesine aşina olmayan araştırmacılar da dahil olmak üzere kullanıcılara fayda sağlar.

İnsan kaynaklı pluripotent kök hücrelerin korunması ve ayırt edilmesi için otomatik bir kültür sistemi

Bu protokol, yüksek verimli iskele tabanlı bir kültür platformu olan SPOT'un 96 ve 384 kuyulu formatlarda imalatını ve montajını belgelemektedir. Ayrıca, hem manuel olarak hem de piyasada bulunan bir sıvı işleyici kullanarak SPOT için tohumlama sürecini detaylandırır.

Yüksek Verimli İskele Tabanlı Kültür Platformu Olarak SPOT'un Tekrarlanabilir Üretimi

Öğrenin, programlanabilir bir sıvı işleme robotu kullanarak 96-kuyucuklu plakalarda ölçeklenebilir iPSC kültürü nasıl kurulur. Bu yöntem, kardiyomiyositlere farklılaşma için pluripotensiyeli koruyarak yüksek verimli kök hücre genişlemesi sağlar.

Bir Robotik Sıvı İşleme Sisteminin Kullanılması Ölçeklenebilir 96-iyi iPSC Kültür Bazlı Plaka ve Üretim

Daha fazla video keşfet