Teton Sisteminin Kullanımı Moleküler Mekanizmalar Zebra balığı Yenilenme Eğitim için

Bu prosedürün genel amacı, bu videodaki rejenerasyon geçiren kuyruk yüzgecinde gösterildiği gibi, koşullu dokuya özgü gen ekspresyonu sağlamak için zebra balıklarında fonksiyonel bir TED on sistemi kurmaktır. Bu işlem, öncelikle ilgili dokuda am cyan ile etiketlenmiş tetrasiklinle indüklenebilen bir transkripsiyonel aktivatör eksprese eden Tet aktivatör transgenik hatlarının ve Tet yanıt elemanlarının kontrolü altında bir ype etiketli hedef gen içeren Tet yanıtlayıcı hatlarının oluşturulmasıyla gerçekleştirilir. Ardından, Tet aktivatör ve Tet yanıtlayıcı çift transgenik balıkların spesifik kombinasyonları oluşturulur.

Ardından, doksisiklin uygulaması yoluyla dokuya özgü Tet yanıtlayıcı transgen ekspresyonu indüklenir. Son olarak, burada yüzgeç rejeneratlarının doku kesitleri hazırlanarak Tet yanıtlayıcı transgen ekspresyonu doğrulanır. Nihayetinde, dokuya özgü Tet yanıtlayıcı transgen ekspresyonunu görselleştirmek için immünofloresans kullanılır.

Bu tekniğin, ısı şokuyla indüklenen gen ekspresyonu gibi diğer yöntemlere göre temel avantajı, sistemin dokuya özgü bir şekilde indüklenebilir ve geri döndürülebilir gen ekspresyonuna olanak tanımasıdır. Bu yöntem, sinyal yolaklarının ve gen fonksiyonlarının münferit dokularda analiz edilmesine imkan tanıdığı için, zebra balığı yüzgeç rejenerasyonunu yönlendiren moleküler sinyal ağlarının daha derinlemesine anlaşılmasına yardımcı olabilir. Biz bu teknolojiyi zebra balığı yüzgeç rejenerasyonunu incelemek için kullansak da, gen fonksiyonunun dokuya özgü manipülasyonunu gerektiren diğer birçok bağlamda da yararlı olabilir.

Metin protokolüne uygun olarak Tet yanıtlayıcı balık hatları oluşturulduktan sonra, tek tek G sıfır balıklarını önceden oluşturulmuş bir Tet aktivatör hattı ile çiftleştirerek transgenin germ hattı entegrasyonunu ve indüklenebilirliğini değerlendirin. Ardından embriyoları toplayın ve Tet yanıtlayıcı indüksiyonunun değerlendirilebileceği bir aşamaya kadar büyütün. Doksisiklinleri çözmek için %50 etanol kullanarak 50 mg/mL konsantrasyona ulaşan 2000 x doksisiklin stok çözeltisi hazırlayın.

Docks alikotlarını ışıktan koruyarak -20 °C'de saklayın. Ardından, 25 µg/mL nihai konsantrasyonda docks içeren E3 embriyo medyumu hazırlayın. Sonrasında, embriyoların üzerindeki E3 medyumunun büyük kısmını boşaltın.

Bunu E3 besiyeri içeren solüsyonla değiştirin ve embriyoları en az altı saat boyunca 28.5 °C'ye geri döndürün. İnkübasyonun ardından, embriyoları YFP floresansı açısından taramak için floresan stereomikroskop kullanın. Az önce tanımlanan kurucu bireylerden birkaç stabil transgenik Tet yanıtlayıcı hat oluşturun.

Beklenen ekspresyon alanı içerisinde güçlü indüksiyon sağlayan, düşük mozaisizm gösteren ve bireysel embriyolar arasında az varyasyon sergileyen hatlar seçin. TED aktivatör ve Tet responder balık hatları oluşturulduğunda, çift transgenik üretmek için Tet aktivatör taşıyıcıları ile Tet responder taşıyıcılarını çiftleştirin. Stereo mikroskop altında am cyan floresansı taraması yaparak Tet aktivatör transgenini taşıyan embriyoları seçin ve am cyan pozitif embriyoları yetişkinliğe kadar büyütün.

PCR tabanlı genotipleme ile veya ilgili dokuda Tet Responder ekspresyonunu indükleme yetenekleri aracılığıyla, Tet aktivatörüne ek olarak Tet responder taşıyan çift transgenik yetişkin balıkları belirleyin. Kuyruk yüzgeci boyama işlemini gerçekleştirmek için, yetişkin zebra balıklarını mililitre başına 160 µg trikain içeren balık suyu ile dolu bir beherde anesteziye alın. Balık hareket etmeyi bıraktığında, cımbız kullanarak onu dikkatlice ters çevrilmiş bir Petri kabına aktarın ve doksisiklin ile tedavi etmek amacıyla bir skalpel yardımıyla kuyruk yüzgecinin kısmi amputasyonunu gerçekleştirin. Mililitre başına 25 µg doksisiklin içeren bir litre balık sistem suyu ile üretim kutularını hazırlayın.

Negatif kontrol olarak, bir litre balık sistem suyu içeren çiftleştirme kutularına doksisiklin yerine 250 microliters etanol ekleyin; her bir çiftleştirme kutusuna 10 adede kadar çift transgenik balık aktarın ve stresi azaltmak için kutuları karanlığa yerleştirin. Minimum altı saat sonra, işlem görmüş balıkları anestezi altına alarak ıslak aros kaplı bir kaba aktarın ve kuyruğu yaymak için cımbız kullanın. Ardından, bir floresan mikroskobu altında, rejenerasyon gösteren doku içerisinde Y PET görünümü açısından balıkları tarayın.

Ardından balıklar daha ileri işlemler için kullanılabilir veya kısmi yüzgeç amputasyonunun ve doks tedavisinin ardından responder transgen indüksiyonunu sonlandırmak için balık barındırma sistemine geri döndürülebilir. Daha önce bu videoda açıklandığı üzere, deneysel düzeneğinize bağlı olarak belirlenen bir zaman noktasında, başlangıç amputasyon düzleminin proksimalinde yaklaşık dört ila beş kemik segmenti boyunca yüzgeç rejeneratlarını cımbızla ve dokunun sadece güdük kısmından tutarak yeniden ampute edin. Doku rejeneratlarını, içinde ağırlık/hacim cinsinden %4 PFA içeren PBS bulunan küçük bir Petri kabına dikkatlice düz bir şekilde yerleştirin ve 4 °C'de gece boyunca sabitleyin. Ertesi gün, rejeneratları 0,5 molar EDTA-PBS içerisine aktarmadan önce PBS ile iki kez yıkayın ve kemik matrisini dekalsifiye etmek için 4 °C'de gece boyunca bekletin. Ardından, rejeneratları oda sıcaklığında, her biri 30 dakika sürecek şekilde bir sükroz PBS serisinde inkübe edin ve son olarak eşit parçalar halinde %30 sükroz PBS ve doku dondurma ortamında ek 30 dakika daha bekletin.

Yüzgeçleri doku dondurma ortamına aktarın ve en az iki saat boyunca dört derece Celsius'ta inkübe edin. Ardından, kriyomoldları bir mikroskop lamı üzerine yerleştirin ve içlerini doku dondurma ortamıyla doldurun. Rejeneratları kriyomoldların içine aktarın ve boyuna veya enine kesitler elde etmek için dokuyu yönlendirin.

Kesme işlemini kolaylaştırmak için rejeneratın düz olduğundan emin olun. Dondurma işlemini başlatmak için, mikroskop lamı ile birlikte kriyo kalıpları kuru buz yatağına yerleştirilmiş bir metal rafa aktarın. Ortam katılaştığında, ortamın plastik ara yüzeyde çözülmesine izin vermek için kriyo kalıpları tekrar oda sıcaklığına getirin.

Ardından, kalem gibi bir alet kullanarak dondurulmuş bloğu kriyokalıptan dışarı itin ve kriyomikrotom ile kesit alıncaya kadar -80 °C'de saklayın. Adezyon mikroskop lamları üzerine 10 ila 14 µm kalınlığında kesitler toplayın ve lamları ihtiyaç duyulana kadar -20 °C'de saklayın. Yüzgeç kesitlerindeki Tet yanıtlayıcı ekspresyonunu karakterize etmek için, kesitleri -20 °C'ye kadar soğutulmuş %100 MEOH ile 30 dakika boyunca işleyin.

Sıvıyı bir kağıt havlu kullanarak dikkatlice alın. Ardından kesitleri iki kez PBT ile ve bir kez PBS ile beşer dakika boyunca yıkayın. PBS ile iki kez 10'ar dakika yıkamadan önce kesitleri 10 dakika boyunca dappy içerisinde inkübe edin.

Ardından, zebra balıklarında fonksiyonel bir TET-on sisteminin kurulduğunu belirlemek için konfokal veya geniş alan floresan mikroskobisi ile görüntüleme yapmadan önce, örnekleri sabitlemek için Antifade montaj sıvısı ve lamel kullanın. Bu sistem, münferit dokularda gen veya sinyal yolu fonksiyonlarını test etmek için kullanılabilir. Burada gösterildiği gibi, HER 4.3 promotörü tarafından sürülen tet aktivatörü, TED yanıtlayıcı ekspresyonunu rejenerasyonun yalnızca belirli bir doku alt kümesinde indükler; proliferatif proksimal blastemada YFP floresansı tespit edilirken, distal blastema ve epidermiste ekspresyon görülmez.

HER 4.3 domainindeki proliferatif blastema hücrelerinde WNT beta-Katenin antagonisti Axin 1'in ekspresyonunun, şaşırtıcı bir şekilde rejeneratif hücre proliferasyonu üzerinde hiçbir etkisi yoktur. Bu durum, proliferatif proksimal blastemadaki Wnt beta-Katenin sinyal yolunun, blastema hücre proliferasyonunun düzenlenmesinde temel bir rol oynamadığını göstermektedir. Buna karşılık, yüzgeç rejeneratının tüm dokularında Axin 1 ekspresyonunu indüklemek için ubiquitin promotörü ile güdümlü Tet aktivatör hattının kullanılması, rejeneratif hücre proliferasyonunu güçlü bir şekilde engellemektedir.

Buna ek olarak, osteoblastları içermeyen HER 4.3 alanında axon one ekspresyonu, rejeneratadaki kemik oluşumunu güçlü bir şekilde engellemektedir. Bu nedenle, TE on sistemi kullanılarak wind sinyallemesinin dokuya özgü şekilde engellenmesi, wind sinyallemesinin hücre proliferasyonu ve kemik rejenerasyonu regülasyonundaki beklenmedik dolaylı işlevlerini ortaya koymaktadır. Bir kez ustalaşıldığında, bu teknik ilgi duyulan herhangi bir dokuda indüklenebilir hedeflenmiş gen ekspresyonu için kullanılabilir.

Bu yöntemi, rejenerasyon geçiren S balığı kuyruk yüzgecindeki wind bed nikotin sinyalleşmesinin dokuya özgü işlevlerini araştırmak için başarıyla uyguladık. Bu yöntemin kullanımı, doku rejenerasyonunu düzenleyen moleküler belirleyicilerin daha kapsamlı bir şekilde anlaşılmasına yardımcı olacaktır.