Name: Teton Sisteminin Kullanımı Moleküler Mekanizmalar Zebra balığı Yenilenme Eğitim için (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 22 s
Description: Öğrenin TetON sistemini kullanarak Danio rerio'nun yenilenen kuyruk yüzgecinde doku spesifik gen ekspresyonu nasıl sağlanır. Bu yöntem, rejeneratif biyolojide gen fonksiyonlarını incelemek için güçlü bir araç sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar teknik yardım için Christa Haase, Doris Weber ve Brigitte Korte teşekkür ederiz. Weidinger laboratuarında çalışmak Deutsche Forschungsgemeinschaft BİZ 4223 / 3-1 hibe tarafından desteklenen, 4223 / 4-1 ve Deutsche Gesellschaft für Kardiologie bir Oskar-Lapp-Stipendium aracılığıyla ve Klaus-Georg-und-Sigrid- tarafından BİZ Hengstberger-Forschungsstipendium.

<ol><li>Fang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+profiling+of+cardiomyocytes+identifies+an+early+Jak1%2FStat3+injury+response+required+for+zebrafish+heart+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Translational profiling of cardiomyocytes identifies an early Jak1/Stat3 injury response required for zebrafish heart regeneration.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (33), 13416-13421 (2013).</li>
<li>Tryon, R. C., Johnson, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+analysis+of+kit+ligand+a+functional+expression+reveals+lineage-specific+competence+to+promote+melanocyte+rescue+in+the+mutant+regenerating+caudal+fin%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Clonal analysis of kit ligand a functional expression reveals lineage-specific competence to promote melanocyte rescue in the mutant regenerating caudal fin.</a> PloS one. 9 (7), e102317(2014).</li>
<li>Wehner, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt%2Fbeta-catenin+signaling+defines+organizing+centers+that+orchestrate+growth+and+differentiation+of+the+regenerating+zebrafish+caudal+fin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Wnt/beta-catenin signaling defines organizing centers that orchestrate growth and differentiation of the regenerating zebrafish caudal fin.</a> Cell Rep. 6 (3), 467-481 (2014).</li>
<li>Huang, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+expression+of+a+myocardium-specific+transgene+in+zebrafish+transgenic+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Conditional expression of a myocardium-specific transgene in zebrafish transgenic lines.</a> Dev Dyn. 233 (4), 1294-1303 (2005).</li>
<li>Knopf, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dually+inducible+TetON+systems+for+tissue-specific+conditional+gene+expression+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Dually inducible TetON systems for tissue-specific conditional gene expression in zebrafish.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (46), 19933-19938 (2010).</li>
<li>Provost, E., Rhee, J., Leach, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+2A+peptides+allow+expression+of+multiple+proteins+from+a+single+ORF+in+transgenic+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Viral 2A peptides allow expression of multiple proteins from a single ORF in transgenic zebrafish embryos.</a> Genesis. 45 (10), 625-629 (2007).</li>
<li>Suster, M. L., Abe, G., Schouw, A., Kawakami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposon-mediated+BAC+transgenesis+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Transposon-mediated BAC transgenesis in zebrafish.</a> Nat Protoc. 6 (12), 1998-2021 (2011).</li>
<li>Bussmann, J., Schulte-Merker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+BAC+selection+for+tol2-mediated+transgenesis+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Rapid BAC selection for tol2-mediated transgenesis in zebrafish.</a> Development. 138 (19), 4327-4332 (2011).</li>
<li>Yuan, S., Sun, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+mRNA+and+morpholino+antisense+oligonucleotides+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos.</a> J Vis Exp. (27), (2009).</li>
<li>Kim, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+cleavage+efficiency+of+a+2A+peptide+derived+from+porcine+teschovirus-1+in+human+cell+lines%2C+zebrafish+and+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">High cleavage efficiency of a 2A peptide derived from porcine teschovirus-1 in human cell lines, zebrafish and mice.</a> PloS one. 6 (4), e18556(2011).</li>
<li>Matthews, M., Varga, Z. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anesthesia+and+euthanasia+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22ILAR+journal+%2F+National+Research+Council%2C+Institute+of+Laboratory+Animal+Resources%22%5BJournal%5D)">Anesthesia and euthanasia in zebrafish.</a> ILAR journal / National Research Council, Institute of Laboratory Animal Resources. 53 (2), 192-204 (2012).</li>
<li>Hyde, D. R., Godwin, A. R., Thummel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+electroporation+of+morpholinos+into+the+regenerating+adult+zebrafish+tail+fin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">In vivo electroporation of morpholinos into the regenerating adult zebrafish tail fin.</a> J Vis Exp. (61), (2012).</li>
<li>Meeker, N. D., Hutchinson, S. A., Ho, L., Trede, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+isolation+of+PCR-ready+genomic+DNA+from+zebrafish+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Method for isolation of PCR-ready genomic DNA from zebrafish tissues.</a> Biotechniques. 43 (5), 610(2007).</li>
<li>Thermes, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((I-SceI+meganuclease+mediates+highly+efficient+transgenesis+in+fish%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">I-SceI meganuclease mediates highly efficient transgenesis in fish.</a> Mech Dev. 118 (1-2), 91-98 (2002).</li>
<li>Suster, M. L., Kikuta, H., Urasaki, A., Asakawa, K., Kawakami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenesis+in+zebrafish+with+the+tol2+transposon+system%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Transgenesis in zebrafish with the tol2 transposon system.</a> Methods Mol Biol. , 56141-56163 (2009).</li>
<li>Grabher, C., Wittbrodt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meganuclease+and+transposon+mediated+transgenesis+in+medaka%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Meganuclease and transposon mediated transgenesis in medaka.</a> Genome Biol. 8, Suppl 1S10. (2007).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

yetişkin zebrabalıkları başarıyla birçok iç organları ve ekleri yenilemek için inanılmaz bir kapasiteye sahiptir. Katılan moleküler ve hücresel mekanizmaların bir anlayışa gen fonksiyonları ve sinyal yollarının doku spesifik analiz gerektirir. Bu doğru, Teton sistemi embriyonik ve yetişkin zebrafish spatiotemporally kontrollü gen ifadesi için etkin bir araç sağlar. Bu yazıda anlatılan Teton sistem yapıları ve metodoloji başarıyla laboratuvar 3 son bir çalışmada kullanılmıştır. teton sistemini kurarken aşağıda...

Zebra balığı geliştirme, fizyoloji, hastalık ve yenilenme birçok yönlerini incelemek için iyi kurulmuş bir omurgalı model organizmadır. Gen ekspresyonu ya da sinyalleme yollarının indüklenebilir, dokuya özgü manipülasyon için post-embriyonik biyolojik süreçler, deney aletleri için bir model olarak zebrabalıkları artan kabulü ile giderek daha önemli hale gelmektedir. Özellikle yetişkin Zebra balığı organ ve apendiks rejenerasyon içine çalışmalar bu rejeneratif sürecinde sinyal yolları uzay-zamansal gereksinimleri diseksiyon için bir araç eksikliğinden muzdarip. Şu anda, üç farklı sistem koşullu, dokuya özgü, yetişkin zebrabalıkları organlarını rejenere içinde gen ekspresyonunu elde etmek için kullanılmıştır: Cre-lox sistemi, transpozon-aracılı somatik transgenesis kullanılarak ısı-şoku uyarılabilir transgenlerin mozaik ifadesi ve teton sistemi 1 -3. Teton bir tetrasiklin-CONT bir türevi anlamına gelirsentezleme antibiyotik tetrasiklin veya bunun bir türevini, örneğin doksisiklin mevcudiyetinde aktive haddelenmiş transkripsiyonel aktivasyon sistemi. Şimdiye kadar yetişkin balıklarda kullanıldıktan Cre-lox sistemi, ekspresyonu uzamsal dokuya özel düzenleyici elementler tarafından kısıtlanan bir Tamoksifen kontrollü Cre rekombinazın (CreERT2) dayanır. DUR kasetinin Cre güdümlü çıkarılması tüm hücre tipleri 1 aktif olması gereken bir promoter tarafından tahrik edilen ilgili gen ekspresyonunu kolaylaştırır. Mosaically ifade somatik transgenlerin transpozon aracılı oluşturma tek tek hücre soyları indüklenebilir transgen ifadesi için bir sistem sağlamaktadır. Tipik olarak sadece bir yenileyici organın 2 ayrı hücre soyları içinde transgeni taşıyan kimerik bireyde bir ısı şoku promotör sonuçları transkripsiyonel kontrolü altında ilgi konusu bir geni taşıyan bir Tol2 transpozonu sahip zebra balığı embriyoların enjeksiyonu. Her iki sistem şartlı doku SPE için izin ikenreli gen ifadesi, Cre-lox sistemi geri dönüşümlü değildir ve transpozon tabanlı klonal etiketleme kullanarak stratejisi stokastik doğası muzdarip. Böylece, ve diğerleri en son zamansal ve ilave ayarlanabilir ve geri 3-5 olan uzamsal olarak kontrollü gen ekspresyonu kolaylaştırmak zebrabalıkları kullanım için transgenik teton sistemleri, adapte edilmiştir. Burada kullanılan teton sistemi Doksisiklin (DOX) -inducible transkripsiyonel aktivatör (ters tetrasiklin transaktivatör, irtTA kısa Tet geliştirilmiş) dokuya-özgü genom düzenleyici dizilerin kontrolü altında olduğu bir transgenik sürücü hattı (TetActivator) içerir. (; TetRE Tet yanıt elemanı) (Şekil 1A) İkinci olarak, bir transgenik cevap hattı tetrasiklin operatör transkripsiyonel kontrolü altında ilgi konusu bir geni barındıran (TetResponder) gerektirir. Bu nedenle, TetActivator ve TetResponder hatları özel kombinasyonlarının kullanımı koşullu doku speci sağlargen ifadesinin fic manipülasyon. Biz son zamanlarda Zebra balığı kuyruk yüzgeci 3 yenileyici yetişkin Wnt / beta-katenin sinyalizasyon doku-spesifik fonksiyonlar için prob teton sistemini kullanmışlardır. Burada özetlenen protokolde yüzgeç yenilenme çalışmaları için özellikle zebrafish Teton sisteminin set-up ve kullanım için bir iş akışı açıklanmaktadır. Bu detaylı istikrarlı transgenik TetActivator ve TetResponder hatlarını oluşturmak için nasıl talimatlar ve embriyo ve yetişkin zebrabalıkları transgen indüksiyon için bir protokol içerir. Ayrıca, yetişkin zebrabalıkları kanatların cryosections hazırlanması için bir protokol içeren kanatçık yenilenme bölgesindeki dokuya özel gen ekspresyonunun doğrulanması için teknikler tarif eder. Ayrıca, TetResponder ifade TetActivator transgen tasarımı, bir transgenesis yönteminin seçimi ve tespiti için tartışılacaktır. Bu nedenle, bu protokolün genel amacı, bir plan olarak hizmet etmektirkurulma fonksiyonel teton sistemi zebrabalıkları daki herhangi bir dokuya uygulanabilir koşullu dokuya-özgü gen ekspresyonunu elde etmek için. Biz I-SceI veya kısa genomik düzenleyici diziler kullanılarak stabil TetActivator hatlarının Tol2 aracılı üretimi için izin veren bir TetActivator vektör oluşturduk (güçlendirici fragmanları; Weidinger laboratuar plazmid veritabanı henüz 1247;. Şekil 1B). Bu yapı, Herpes simpleks virüsü VP16 transaktivasyon alanı türev 3F [irtTAM2 (3F)] ile kaynaşmış ters Tet bastırıcı etki M2 mutant varyantı aşağıdakilerden oluşan bir TetActivator kaseti içerir. Bu ko-eksprese aynı açık okuma çerçevesi arasında fluorofor AmCyan sahip olduğu TetActivator (TETA) sentezlenmesi, kolayca izlenebilir; 1 oranında 5,6: a P2A peptit 1 ayrı proteinler olarak teta ve AmCyan üretimi ile sonuçlanmalıdır ribozomal atlama, aracılık eder. Bu yapı, T &#39;, bir poylinker 5 içeriretActivator kaseti, klasik klonlama yöntemleri kullanılarak ilgili genomik düzenleyici diziler sokulmasını kolaylaştırmak için. (Büyük bir genomik bölgeyi ihtiva eden bir bakteriyel yapay kromozom içine yeniden birleştirilebilir, (BAC), Buna ek olarak, yukarıda tarif edilen TetActivator kaset ve bir kanamisin seçme kaseti (Şekil 1C. Weidinger laboratuar plazmid veri tabanında bir 1180) &#39;den oluşan bir yapı oluşturduk Genellikle ekspresyon paterni olan transgen tarafından taklit edilecek) bir genin başlangıç ​​kodonunun halinde. Her iki yapılar istek üzerine Weidinger laboratuarında temin edebilirsiniz.

<table><tbody><tr><td>Üreme kutuları</td><td>Aqua Schwarz</td><td>AquaBox 1</td><td></td></tr><tr><td>Bileşik floresan mikroskop</td><td>, örneğin, Leica, Zeiss,</td><td>floresan doku bölümlerini görüntülemek için üreticiye</td><td>göre değişir</td></tr><tr><td>Konfokal mikroskop</td>, <td>örneğin, Leica, Zeiss,</td><td>floresan doku bölümlerini görüntülemek için üreticiye</td><td>göre değişir</td></tr><tr><td>Kriyostat</td>, <td>örneğin, Leica, Thermo-Scientific</td><td>ile değişir. </td><td>kriyoseksiyon için</td>üretici</tr><tr><td>4 ', 6-diamidino-2-fenilinodol (Dapi)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td>, <td>çekirdeklerin görselleştirilmesi için PBS 'de 1/5,000 kullanır</td></tr><tr><td>Doksisiklin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9891</td>, <td>TetResponder indüksiyonu Paraformaldehit (PFA) Sigma-Aldrich P6148 için 50 mg / ml'de (97 mM) 'de% 50 EtOH'de stokları hazırlayın</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>PBS'de %4 (a/h) paraformaldehit, fiksasyon için pH 7.5 </td></tr><tr><td>1x Fosfat tampon salin (PBS)</td><td></td><td></td><td>1.7 mM KH2PO4, 5.2 mM Na2HPO4, 150 mM NaCl, pH 7.5</td></tr><tr><td>1x Fosfat tampon salin + Tween 20 (PBT)</td><td></td><td></td><td>%0.1 ile 1x PBS Tween 20</td></tr><tr><td>Superfrost Ultra Plus yapışma mikroskobu slaytları</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>Doku kesitlerinin toplanması için</td> <td>1014356190</td></tr><tr><td>Stereo floresan mikroskop</td><td>, örneğin Leica, Zeiss,</td><td>floresan bazlı genotipleme için</td><td>üreticiye göre değişir</td></tr><tr><td>Thermocycler</td><td>, örneğin, Biorad, Applied Biosystems,</td><td>PCR tabanlı genotipleme için</td><td>üreticiye göre değişir</td></tr><tr><td>Doku dondurma ortamı (TFM)</td><td>Triangel Biyomedikal Bilimler</td> Doku gömmek için <td>TFM-C</td><td> E3</td></tr><tr><td>embriyo ortamında 1 mg / ml'de anestezi kullanımı için</td> <td>Trikain (L-Etil-m-amino-benzoat-metan sülfonat / MS-222)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521</td></tr></tbody></table> örnekleri

teton sisteminin kullanımı moleküler mekanizmalar zebra balığı yenilenme eğitim için

Use of the TetON System to Study Molecular Mechanisms of Zebrafish Regeneration

Zebra balığı, omurgalı gelişimi, fizyolojisi, hastalığı ve doku yenilenmesini incelemek için çok önemli bir model organizma haline gelmiştir. İlgili moleküler ve hücresel mekanizmaların kapsamlı bir şekilde anlaşılması, gen ekspresyonunun veya sinyal yollarının indüklenebilir, dokuya özgü manipülasyonuna izin veren deneysel araçlar gerektirir. Bu nedenle, biz ve diğerleri yakın zamanda TetON sistemini zebra balıklarında kullanılmak üzere uyarladık. TetON sistemi, zamansal ve mekansal olarak kontrol edilen gen ekspresyonunu kolaylaştırır ve yakın zamanda bu aracı, zebra balığı kuyruk yüzgeci rejenerasyonu sırasında Wnt / beta-katenin sinyallemesinin dokuya özgü işlevlerini araştırmak için kullandık. Burada, yetişkin yenilenen zebra balığı kuyruk yüzgecinde indüklenebilir, dokuya özgü gen ekspresyonu elde etmek için TetON sistemini kullanmak için iş akışını açıklıyoruz. Bu, stabil transgenik TetAktivatör ve TetResponder hatlarının oluşturulmasını, transgen indüksiyonunu ve kanat rejenerasyonunda dokuya özgü gen ekspresyonunun doğrulanması için teknikleri içerir. Bu nedenle, bu protokol, zebra balığında işlevsel bir TetON sistemi kurmak ve özellikle yüzgeç rejenerasyonunu incelemek için sonraki kullanımı için bir plan görevi görür.

Dokuya özel olarak uyanlabilir bir gen ekspresyonu, transgenik TetActivator ve TetResponder hatları için işlevsel teton sistemi kurmak için, üretilen (Şekil 1A) olması gerekir. Erken zebra balığı embriyolar ve daha sonra mikrop hattı entegrasyon inşa ya TetResponder (Şekil 1E) - Bu TetActivator (Cı Şekil 1B) microinjecting ile gerçekleştirilir. Fonksiyonel TetActivator konstruktları, ya ilgili gen (Şekil 1C) düzenleyici elemanları ihtiva eden bir BAC iç...

Burada, yetişkin yenilenen zebra balığı kuyruk yüzgecinde dokuya özgü gen ekspresyonu elde etmek için TetON sistemini kullanmak için iş akışını özetliyoruz.

Teton Sisteminin Kullanımı Moleküler Mekanizmalar Zebra balığı Yenilenme Eğitim için

The zebrafish has become a very important model organism for studying vertebrate development, physiology, disease, and tissue regeneration. A thorough ...

Bu prosedürün genel amacı, bu videodaki rejenerasyon geçiren kuyruk yüzgecinde gösterildiği gibi, koşullu dokuya özgü gen ekspresyonu sağlamak için zebra balıklarında fonksiyonel bir TED on sistemi kurmaktır. Bu işlem, öncelikle ilgili dokuda am cyan ile etiketlenmiş tetrasiklinle indüklenebilen bir transkripsiyonel aktivatör eksprese eden Tet aktivatör transgenik hatlarının ve Tet yanıt elemanlarının kontrolü altında bir ype etiketli hedef gen içeren Tet yanıtlayıcı hatlarının oluşturulmasıyla gerçekleştirilir. Ardından, Tet aktivatör ve Tet yanıtlayıcı çift transgenik balıkların spesifik kombinasyonları oluşturulur.Ardından, doksisiklin uygulaması yoluyla dokuya özgü Tet yanıtlayıcı transgen ekspresyonu indüklenir. Son olarak, burada yüzgeç rejeneratlarının doku kesitleri hazırlanarak Tet yanıtlayıcı transgen ekspresyonu doğrulanır. Nihayetinde, dokuya özgü Tet yanıtlayıcı transgen ekspresyonunu görselleştirmek için immünofloresans kullanılır.Bu tekniğin, ısı şokuyla indüklenen gen ekspresyonu gibi diğer yöntemlere göre temel avantajı, sistemin dokuya özgü bir şekilde indüklenebilir ve geri döndürülebilir gen ekspresyonuna olanak tanımasıdır. Bu yöntem, sinyal yolaklarının ve gen fonksiyonlarının münferit dokularda analiz edilmesine imkan tanıdığı için, zebra balığı yüzgeç rejenerasyonunu yönlendiren moleküler sinyal ağlarının daha derinlemesine anlaşılmasına yardımcı olabilir. Biz bu teknolojiyi zebra balığı yüzgeç rejenerasyonunu incelemek için kullansak da, gen fonksiyonunun dokuya özgü manipülasyonunu gerektiren diğer birçok bağlamda da yararlı olabilir.Metin protokolüne uygun olarak Tet yanıtlayıcı balık hatları oluşturulduktan sonra, tek tek G sıfır balıklarını önceden oluşturulmuş bir Tet aktivatör hattı ile çiftleştirerek transgenin germ hattı entegrasyonunu ve indüklenebilirliğini değerlendirin. Ardından embriyoları toplayın ve Tet yanıtlayıcı indüksiyonunun değerlendirilebileceği bir aşamaya kadar büyütün. Doksisiklinleri çözmek için %50 etanol kullanarak 50 mg/mL konsantrasyona ulaşan 2000 x doksisiklin stok çözeltisi hazırlayın.Docks alikotlarını ışıktan koruyarak -20 °C'de saklayın. Ardından, 25 µg/mL nihai konsantrasyonda docks içeren E3 embriyo medyumu hazırlayın. Sonrasında, embriyoların üzerindeki E3 medyumunun büyük kısmını boşaltın.Bunu E3 besiyeri içeren solüsyonla değiştirin ve embriyoları en az altı saat boyunca 28.5 °C'ye geri döndürün. İnkübasyonun ardından, embriyoları YFP floresansı açısından taramak için floresan stereomikroskop kullanın. Az önce tanımlanan kurucu bireylerden birkaç stabil transgenik Tet yanıtlayıcı hat oluşturun.Beklenen ekspresyon alanı içerisinde güçlü indüksiyon sağlayan, düşük mozaisizm gösteren ve bireysel embriyolar arasında az varyasyon sergileyen hatlar seçin. TED aktivatör ve Tet responder balık hatları oluşturulduğunda, çift transgenik üretmek için Tet aktivatör taşıyıcıları ile Tet responder taşıyıcılarını çiftleştirin. Stereo mikroskop altında am cyan floresansı taraması yaparak Tet aktivatör transgenini taşıyan embriyoları seçin ve am cyan pozitif embriyoları yetişkinliğe kadar büyütün.PCR tabanlı genotipleme ile veya ilgili dokuda Tet Responder ekspresyonunu indükleme yetenekleri aracılığıyla, Tet aktivatörüne ek olarak Tet responder taşıyan çift transgenik yetişkin balıkları belirleyin. Kuyruk yüzgeci boyama işlemini gerçekleştirmek için, yetişkin zebra balıklarını mililitre başına 160 µg trikain içeren balık suyu ile dolu bir beherde anesteziye alın. Balık hareket etmeyi bıraktığında, cımbız kullanarak onu dikkatlice ters çevrilmiş bir Petri kabına aktarın ve doksisiklin ile tedavi etmek amacıyla bir skalpel yardımıyla kuyruk yüzgecinin kısmi amputasyonunu gerçekleştirin. Mililitre başına 25 µg doksisiklin içeren bir litre balık sistem suyu ile üretim kutularını hazırlayın.Negatif kontrol olarak, bir litre balık sistem suyu içeren çiftleştirme kutularına doksisiklin yerine 250 microliters etanol ekleyin; her bir çiftleştirme kutusuna 10 adede kadar çift transgenik balık aktarın ve stresi azaltmak için kutuları karanlığa yerleştirin. Minimum altı saat sonra, işlem görmüş balıkları anestezi altına alarak ıslak aros kaplı bir kaba aktarın ve kuyruğu yaymak için cımbız kullanın. Ardından, bir floresan mikroskobu altında, rejenerasyon gösteren doku içerisinde Y PET görünümü açısından balıkları tarayın.Ardından balıklar daha ileri işlemler için kullanılabilir veya kısmi yüzgeç amputasyonunun ve doks tedavisinin ardından responder transgen indüksiyonunu sonlandırmak için balık barındırma sistemine geri döndürülebilir. Daha önce bu videoda açıklandığı üzere, deneysel düzeneğinize bağlı olarak belirlenen bir zaman noktasında, başlangıç amputasyon düzleminin proksimalinde yaklaşık dört ila beş kemik segmenti boyunca yüzgeç rejeneratlarını cımbızla ve dokunun sadece güdük kısmından tutarak yeniden ampute edin. Doku rejeneratlarını, içinde ağırlık/hacim cinsinden %4 PFA içeren PBS bulunan küçük bir Petri kabına dikkatlice düz bir şekilde yerleştirin ve 4 °C'de gece boyunca sabitleyin. Ertesi gün, rejeneratları 0,5 molar EDTA-PBS içerisine aktarmadan önce PBS ile iki kez yıkayın ve kemik matrisini dekalsifiye etmek için 4 °C'de gece boyunca bekletin. Ardından, rejeneratları oda sıcaklığında, her biri 30 dakika sürecek şekilde bir sükroz PBS serisinde inkübe edin ve son olarak eşit parçalar halinde %30 sükroz PBS ve doku dondurma ortamında ek 30 dakika daha bekletin.Yüzgeçleri doku dondurma ortamına aktarın ve en az iki saat boyunca dört derece Celsius'ta inkübe edin. Ardından, kriyomoldları bir mikroskop lamı üzerine yerleştirin ve içlerini doku dondurma ortamıyla doldurun. Rejeneratları kriyomoldların içine aktarın ve boyuna veya enine kesitler elde etmek için dokuyu yönlendirin.Kesme işlemini kolaylaştırmak için rejeneratın düz olduğundan emin olun. Dondurma işlemini başlatmak için, mikroskop lamı ile birlikte kriyo kalıpları kuru buz yatağına yerleştirilmiş bir metal rafa aktarın. Ortam katılaştığında, ortamın plastik ara yüzeyde çözülmesine izin vermek için kriyo kalıpları tekrar oda sıcaklığına getirin.Ardından, kalem gibi bir alet kullanarak dondurulmuş bloğu kriyokalıptan dışarı itin ve kriyomikrotom ile kesit alıncaya kadar -80 °C'de saklayın. Adezyon mikroskop lamları üzerine 10 ila 14 µm kalınlığında kesitler toplayın ve lamları ihtiyaç duyulana kadar -20 °C'de saklayın. Yüzgeç kesitlerindeki Tet yanıtlayıcı ekspresyonunu karakterize etmek için, kesitleri -20 °C'ye kadar soğutulmuş %100 MEOH ile 30 dakika boyunca işleyin.Sıvıyı bir kağıt havlu kullanarak dikkatlice alın. Ardından kesitleri iki kez PBT ile ve bir kez PBS ile beşer dakika boyunca yıkayın. PBS ile iki kez 10'ar dakika yıkamadan önce kesitleri 10 dakika boyunca dappy içerisinde inkübe edin.Ardından, zebra balıklarında fonksiyonel bir TET-on sisteminin kurulduğunu belirlemek için konfokal veya geniş alan floresan mikroskobisi ile görüntüleme yapmadan önce, örnekleri sabitlemek için Antifade montaj sıvısı ve lamel kullanın. Bu sistem, münferit dokularda gen veya sinyal yolu fonksiyonlarını test etmek için kullanılabilir. Burada gösterildiği gibi, HER 4.3 promotörü tarafından sürülen tet aktivatörü, TED yanıtlayıcı ekspresyonunu rejenerasyonun yalnızca belirli bir doku alt kümesinde indükler; proliferatif proksimal blastemada YFP floresansı tespit edilirken, distal blastema ve epidermiste ekspresyon görülmez.HER 4.3 domainindeki proliferatif blastema hücrelerinde WNT beta-Katenin antagonisti Axin 1'in ekspresyonunun, şaşırtıcı bir şekilde rejeneratif hücre proliferasyonu üzerinde hiçbir etkisi yoktur. Bu durum, proliferatif proksimal blastemadaki Wnt beta-Katenin sinyal yolunun, blastema hücre proliferasyonunun düzenlenmesinde temel bir rol oynamadığını göstermektedir. Buna karşılık, yüzgeç rejeneratının tüm dokularında Axin 1 ekspresyonunu indüklemek için ubiquitin promotörü ile güdümlü Tet aktivatör hattının kullanılması, rejeneratif hücre proliferasyonunu güçlü bir şekilde engellemektedir.Buna ek olarak, osteoblastları içermeyen HER 4.3 alanında axon one ekspresyonu, rejeneratadaki kemik oluşumunu güçlü bir şekilde engellemektedir. Bu nedenle, TE on sistemi kullanılarak wind sinyallemesinin dokuya özgü şekilde engellenmesi, wind sinyallemesinin hücre proliferasyonu ve kemik rejenerasyonu regülasyonundaki beklenmedik dolaylı işlevlerini ortaya koymaktadır. Bir kez ustalaşıldığında, bu teknik ilgi duyulan herhangi bir dokuda indüklenebilir hedeflenmiş gen ekspresyonu için kullanılabilir.Bu yöntemi, rejenerasyon geçiren S balığı kuyruk yüzgecindeki wind bed nikotin sinyalleşmesinin dokuya özgü işlevlerini araştırmak için başarıyla uyguladık. Bu yöntemin kullanımı, doku rejenerasyonunu düzenleyen moleküler belirleyicilerin daha kapsamlı bir şekilde anlaşılmasına yardımcı olacaktır.

use-teton-system-to-study-molecular-mechanisms-zebrafish

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Biz, koşullu yetişkin zebrabalıkları fin rejenerasyon sırasında bir hedef protein ifadesini demonte için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu teknik, mikro-enjeksiyon ve yara iyileşmesi, blastem oluşumu ve rejeneratif akıbet de dahil olmak üzere yüzgeç yenilenmesi çeşitli aşamalarında, proteinin rolünü test verir fin dokuya antisens oligonükleotid morpholinos electroporating içerir.

Yenileyici Yetişkin Zebra balığı Tail Fin içine Morpholinos in vivo olarak Elektroporasyon

Burada sunulan yöntem, yüksek enerjili lazer darbeleri ve zamanla bu yaralanmalar ve kurtarma ileri analizi ile canlı zebrafish embriyo kesin hasar oluşur. Ayrıca genetik olarak tek etiketli veya iskelet kas hücre gruplarının sırasında ve lazer ışık kaynaklı hasar sonrası takip edilebilir göstermek.

Zebra balığı Embriyonik İskelet Kası Lazer-yaralama

Spinal Transeksiyon sonra, yetişkin zebrabalıkları altı hafta sonrası yaralanma ile fonksiyonel iyileşme var. Larva şeffaflık ve hızlı iyileşme yararlanmak için, larva omurilik transecting için bir yöntem mevcut. Transeksiyon sonra, 3 gün sonrası yaralanma ile 2 gün sonrası yaralanma başlayan duyusal iyileşme gözlemlemek, ve C-bend hareketi.

Larva Zebra balığı Omurilik Kesisi

Bu tür gen-spesifik morpholinos intraventriküler enjeksiyonları kullanarak doku rejenerasyonu gibi gelişme ve fizyolojik homeostasis sonraki aşamalarında gen fonksiyonunu değerlendirmek için zebrabalıkları için uyarlanabilir ters genetik bir yöntem.

Zebra balığı Larva Çoklu Zor-hedef dokular geçiştirilmesi için Kardiyak Ventriküler Injection kullanarak Genetik Morfolino Yaklaşım ters

Zebra balığı yetişkin nörogenezi ve rejenerasyonunun hücresel ve moleküler mekanizmalarına ışık tutmak için, zebra balığı yetişkin telensefalonunda mekanik yaralanmalara neden olan invaziv cerrahi ve ardından bıçaklanmış hemisferdeki değişikliklerin immünohistokimya veya in situ hibridizasyon ile izlenmesi için bir protokol geliştirdik.

Zebra balığı Yetişkin telencephalon stab Yara Yaralanma: Omurgalı Beyin nöron ve Rejenerasyon Soruşturma Bir Yöntem

Burada, gentamisin enjeksiyonu ile akut böbrek hasarını indükleyerek erişkin böbrek rejenerasyonunu incelemek için güvenilir bir yöntem sunuyoruz. Yaralanmanın gentamisin dozajına ve çevre sıcaklığına bağlı olduğunu, lhx1a+'yı etiketlemek için yerinde hibridizasyon kullanarak, yeni nefronlar geliştirdiğini gösterdik.

Gentamisin Kaynaklı Sakatlık tarafından Yetişkin Zebra balığı Böbrek Rejenerasyon

Zebra balığı larva kuyruk yüzgeci rejenerasyonunun dinamiklerini parlak alan tabanlı stereomikroskopi kullanarak tüm doku ölçeğinde yakalamak için bir protokol sunuyoruz. Bu teknik, tek hücre çözünürlüğü ile rejenerasyon dinamiklerinin yakalanmasını sağlar. Bu metodoloji, bir CCD kamera ve hızlandırılmış yazılım ile donatılmış herhangi bir stereomikroskoba uyarlanabilir.

Time-lapse aydınlık stereomikroskobi ile Zebra balığı Larva Doku Onarım yakalama

İskelet kas rejenerasyonu, kas distrofisi gibi birçok kas hastalığında bozulan doku yerleşik kas kök hücreleri tarafından yönlendirilir ve bu da kasın yenilenememesi ile sonuçlanır. Burada, kas hastalığının zebra balığı modellerinde kas yenilenmesinin incelenmesini sağlayan bir protokol açıklıyoruz.

Kas Hastalığının Zebra Balığı Modellerinde Kas Yenilenmesinin İncelenmesi

Yetişkin zebra balıklarında mekanik bir beyin hasarı modeli, yüksek rejeneratif kapasitelerini düzenleyen moleküler mekanizmaları araştırmak için tanımlanmıştır. Yöntem, floresan immünoboyama kullanarak rejeneratif yanıtları değerlendirmek için birden fazla küçük balık türünün optik tektumunda bir bıçak yarası yaralanması oluşturmayı açıklar.

Rejeneratif Kapasitenin Karşılaştırmalı Analizi için Zebra Balığı ve Medaka Kullanan Yetişkin Optik Tektumunun Bıçak Yarası Yaralanma Modeli

Bu protokol, larva elleçlemesi için otomatik bir mikroakışkan platform ile birleştirilmiş bir lazer lezyon sistemi kullanarak zebra balığı larvalarında dokuya özgü ve yüksek oranda tekrarlanabilir yaralanmaları indüklemek için bir yöntemi açıklamaktadır.

Zebra Balığı Larvalarında Omurilik Rejenerasyonunu İncelemek için Kontrollü Yarı Otomatik Lazer Kaynaklı Yaralanmalar

Burada, zebra balığı embriyolarında ve larvalarında döllenmeden en az 1 ila 7 gün sonra herhangi bir aşamada yüksek uzamsal ve zamansal çözünürlüğe sahip hücrelerin nakli için bir protokol sunuyoruz.

Embriyonik ve Larva Zebra Balıklarında Yüksek Çözünürlüklü Hücre Nakli

Öğrenin TetON sistemini kullanarak Danio rerio'nun yenilenen kuyruk yüzgecinde doku spesifik gen ekspresyonu nasıl sağlanır. Bu yöntem, rejeneratif biyolojide gen fonksiyonlarını incelemek için güçlü bir araç sunar.

Teton Sisteminin Kullanımı Moleküler Mekanizmalar Zebra balığı Yenilenme Eğitim için

Daha fazla video keşfet