Embriyolar Floresan Etiketleme DNA Özgü Leke Metil Green Uygulaması

Bu videoda, çok yaygın histolojik leke olan metil yeşilinin, tüm embriyolar gibi kalın biyolojik örneklerin lazer konfokal mikroskopisindeki özel uygulamalarla floresan mikroskobunda son derece uygun bir nükleer etiket olarak nasıl kullanılabileceğini göstereceğiz. Metil yeşilini DNA'ya özgü bir leke olarak kısaca tanıttıktan sonra, floresan boyama için stok ve çalışma çözeltileri hazırlama yöntemini açıklayacağız. Daha sonra nükleer boyama elde etmek ve birkaç balık embriyosunu ve elde edilen konfokal görüntü örneklerini tutmak için deneysel prosedürü göstereceğiz.

Son olarak, metil yeşilliklerin mükemmel fiziksel kimyasal özellikleri gösterilecek ve tartışılacaktır. Freddy Misha, 1869'da DNA'yı keşfetti ve birkaç yıl sonra nispeten yeni bir yıllık ve lekeli metil yeşili ile çökeltiler oluşturduğunu gösterdi. Metil yeşili, ana grubundaki DNA ile güçlü bir şekilde etkileşime girmesine izin veren iki pozitif yüke sahiptir, tercihen erişim bölgelerine bağlanır.

Metil yeşilinin en yaygın kullanımı, 20. yüzyılın başında UNA ve Poppen Heim tarafından geliştirilen bir metil olan RNA lekesi perine ile bir burun çözeltisinde kombinasyonudur. Bununla birlikte, metil yeşilinin floresan özellikleri hakkında çok az analiz edilmiştir ve bu nedenle çok yüksek afiniteli ve spesifik bir floresan etiketi olarak kullanılma olasılığını test etmeye karar verdik. Hücrelerdeki DNA için.

Metil yeşili, yedi metil kökü olan bir al metan lekesidir. Bu yedinci grup kolayca kaybolur ve kristal menekşe rengine geri döner. Bu nedenle, kristali çıkarmak için metil yeşili ile karıştırılmış kristal viyolenin varış miktarı vardır.

Menekşe metil yeşili çözeltisi, kristal viyole ekstrakte etmek için kloroform ile yıkanabilir. Bunun için hemen göstereceğimiz gibi çeker ocak altında %4'lük ACU solüsyonu hazırlıyoruz. Faz ayrımını hızlandırmak için en az iki parça kloroform ve santrifüj ile karıştırıyoruz.

Santrifüjlemeden sonra, metil yeşili ile sulu bir faz ve kloroform ve kristal viyole ile daha düşük bir organik faz elde ederiz. Üst fazı geri kazandık ve alt faz net görünene kadar tekrarladık. Sonunda, üst faz geri kazanılır ve seyreltilir.

Bu çözüm, aylarca çalışma tezgahında stabildir. Şimdi, metamfetamin yeşili ile embriyo katmanında tüm MO'ya nasıl bakacağımızı göstereceğiz. Konfokal mikrolama için, yüksek nakilli balık embriyosunu kullanacağız.

Örnek olarak, zebra balığı embriyoları elde edin ve kalıntıları bir süzgeçle yıkayın. Onları akvaryum suyunda veya embriyo ortamında istenen aşamaya kadar inkübe edin. Corium'u ince cımbızla çıkarın, embriyoları bu birkaç saat veya gece boyunca formaldehit için% 4 oranında sabitleyin.

Daha sonra embriyoları PBST'de birkaç kez yıkayın. Stok çözeltisini PBST'de beş ila 10.000 kez seyrelterek bir metil yeşil çalışma çözeltisi hazırlayın. Çözeltideki embriyoları oda sıcaklığında en az üç saat veya dört santigrat derece azaltılmış gece boyunca inkübe edin.

Bu örnekte, spektral dedektörlerle donatılmış daha küçük bir konfokal mikroskopta konfokal görüntüler elde edilecektir. 633 nanometre lazer ile maksimum uyarma elde edilir ve dedektör geniş bir aralığa ayarlanır. Görünür spektrumun kırmızı alanında.

Metil yeşili kırmızı emisyon, tüm embriyolar gibi derin örneklerden bile minimum sinyal kaybıyla kaliteli nükleer görüntüleme elde etmeyi mümkün kılar. Bu ilk seri, çekirdeği pro üçe kadar iyi bilinen bir DNA boyası ile boyanmış bir zebra balığı retinasını göstermektedir. Bir dakika sonra uzaklaşıyoruz.

Aynı deneyi metil yeşili ile yaptığımızda bir ABL tarama bölgesi belirginleşir, belirgin bir ağartma görülmez. Aşağıdaki seride, burada açıklanan protokol kullanılarak nelerin elde edilebileceğinin, mitotik figürlerin gözlemlenebildiği zebra balığı epidermisinden mitotik hücrenin temsili sonuçlarını gösteriyoruz. Nükleer mimarinin görülebildiği aynı örnekten IIC çekirdeği.

Metil yeşil amalin ile etiketlenmiş bir zebra balığı larvası epidermal hücresinin bir parçasının 3D rekonstrüksiyonu, 48 saatlik bir port gübrelemesi, gümüş balığı, br retina içinde farklı nükleer şekillerin daha panoramik bir görünümü. Burada, nükleer etiketlemede kullanılabilecek son derece ucuz bir floresan DNA boyası hazırlamanın kolay bir yolunu gösterdik, Her ne kadar sadece bir örnek olarak göstersek de, birkaç tane tutun. Bu teknik, tüm mount veya kesitsel olarak embriyolarınıza veya dokularınıza uygulanabilir.

Ayrıca jellerde DNA boyama ve fotometri kullanılarak çözeltide DNA tayini için de kullanılabilir.