Name: Embriyolar Floresan Etiketleme DNA Özgü Leke Metil Green Uygulaması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 59 s
Description: Öğrenin, metil yeşili ile embriyoların floresan boyamasını ve konfokal mikroskopi görüntüleme yöntemini. Bu teknik, kalın biyolojik örneklerde nükleus etiketleme için güçlü bir araç sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar, videonun prodüksiyonu için Patxi Jaso'ya, kısmi finansman için PEDECIBA ve Agencia Nacional de Investigación e Innovación'a (ANII) teşekkür eder.

Boyar 1. Saflaştırma <ol><li> Damıtılmış su, 10 ml leke tozu 0.4 g çözülmesiyle metil yeşili bir% 4 sulu çözelti hazırlayın. Tamamen eritilmesi gelene kadar iyice karıştırınız. </li><li> Bir duman-Kaputun altında, kloroform en az 2 parçaları ile karıştırarak. Bu tüpler kloroform dayanıklı olup olmadığını önceden kontrol edilmesi önemlidir. </li><li> İyice karıştırın ve faz ayrımını hızlandırmak için 2,000 xg&#39;de 1 dakika boyunca santrifüj. </li><li> Santrifüj işleminden sonra, metil yeşili bir üst sulu faz ve kloroform ile daha düşük bir organik faz ve her zamanki gibi kirletici kristal viyole elde edilir. </li><li> Üst fazı kurtarmak ve alt faz kristal viyole tamamen yoksun görünene kadar bu adımı tekrarlayın. </li><li> Sonunda, üst faz elde edilir ve% 2&#39;lik bir metil yeşili bir nihai konsantrasyona kadar su ile seyreltilir. Bu stok çözeltisi, ay tezgahında stabil olduğu ve ışıktan korunması gerekmez. </li></ol><ol><li> Fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) içinde (paraformaldehid ile ilgili) bir karışımı,% 4 formaldehid embriyolar sabitleyin. NOT: Bu bir kaç saat sürebilir gecede embriyoların kalınlığına bağlı olarak. Örneğin, biz bir gecede 48 saat sonrası fertilizasyon (hpf) zebrafish embriyolar sabit. </li><li> 5 dakika boyunca PBS-T (PBS içinde% 1 Triton X-100), embriyolar üç kez yıkayın. deterjanın yüksek konsantrasyonu, kütikül permeabilizes. </li><li> 5,000-1: PBS-T içinde (% 2 stok çözeltiden) metil yeşili 10,000 çözeltisi 1 hazırlayın. inkübasyon sırasında deterjan varlığının örneğin zebra balığı embriyolarının ve larva gibi kalın örneklerde, için kullanışlıdır. </li><li> Hafifçe çalkalanarak, 4 ° C de en az 6 saat boyunca çözelti içinde embriyolar inkübe edin. Yine, embriyo kalınlığı inkübasyon süresi için kalibrasyon parametredir. </li><li> Embriyoların 3 tim yıkayın30 dakika boyunca PBS ile ES deterjan fazlasının ayrılması için. DNA&#39;ya bağlandığı zaman metil, yeşil floresan özelliğinin yalnızca belirgindir, bağlanmamış molekülden dolayısıyla arka ihmal edilebilir düzeydedir. </li><li> Bir kazı slayt veya montaj çözeltisi ile yapımı bölmesi üzerine monte (% 75 gliserol, 0.1 M Tris-HCI, pH 8). NOT: Nükleer boyanma immunolabeling sonra yapılacak ise, metil yeşil bunu yıkayacak gerek kalmadan, çalışma konsantrasyonunda montaj çözüm eklenebilir. </li><li> Mağaza buzdolabında ya da hemen görüntüleme başlatın. 650-750 nm yeşil emisyon 677 nm maksimum ulaşır metil dikkate alarak kayıt ayarlanmış 633 nm ve emisyon filtreleri de uyarma ile bir lazer tarama konfokal (ya da diğer floresan) mikroskop ile görüntüleme gerçekleştirin. NOT: metil yeşil emisyon profili ölçülen verileri, ek malzeme olarak, satın alma yazılımı yüklenecek sağlamak. </li></ol> 3. Floresan Nükleer StMetil Yeşil kullanarak Tüm Chick Embriyolar Tahliye <ol><li> Ilgi sahneye döllenmiş tavuk yumurtaları kuluçkaya yatmaktadır. 4 ° C&#39;de bir gece boyunca PBS (paraformaldehid ile ilgili)% 4 formaldehit embriyolar düzeltildi. 2 saat süre ile, PBS-T içinde embriyolar 3 kere yıkayın. </li><li> 5,000-1: PBS-T içinde (% 2 stok çözeltiden) metil yeşili 10,000 çözeltisi 1 hazırlayın. Gece boyunca 4 ° C sıcaklıkta boyama çözeltisi embriyolar inkübe edin. Embriyolar 3 kere PBS ile 1 saat, her yıkayın. % 75 gliserol, 0.1 M Tris, pH 8, oda içinde monte edin. </li></ol> 4. Görüntüleme Floresan Tüm monte Embriyolar Çekirdeği Etiketli <ol><li> Dikkatli bir mikroskop lamı üzerine elektrik bandı birkaç kat yapışmasını tarafından bir görüntüleme odası hazırlayın içinde embriyolar yerleştirmek için bir neşter ile içine bir delik kesti. Bu görüntüleme sırasında ezilme embriyolar önleyecektir. </li><li> Dikkatli bir şekilde% 75 gliserol, 0.1 M Tris-HCI, pH = 8, üstüne bölmeyi görüntüleme odasına embriyo transferi ve dolgugeçersiz kabarcık oluşumu. </li><li> Bir # 0 lamel kaçınarak veya orta taşan ortadan ile kaplayın. Oje ile mühür. </li><li> Bir 633 uyarılma filtreli veya lazer hattı ile teçhiz edilmiş bir flüoresans mikroskobu, numunenin görüntüleri elde edin. NOT: Emisyon filtreleri metil yeşili 677 emisyon maksimum kapsamalıdır. </li></ol>

<ol><li>Klonisch, T., Wark, L., Hombach-Klonisch, S., Mai, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+imaging+in+three+dimensions%3A+a+unique+tool+in+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+anatomy%22%5BJournal%5D)">Nuclear imaging in three dimensions: a unique tool in cancer research.</a> Annals of anatomy. 192 (5), 292-301 (2010).</li>
<li>Kapuscinski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DAPI%3A+a+DNA-specific+fluorescent+probe%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnic%22%5BJournal%5D)">DAPI: a DNA-specific fluorescent probe.</a> Biotechnic. 70 (5), 220-233 (1995).</li>
<li>Latt, S. A., Stetten, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectral+studies+on+33258+Hoechst+and+related+bisbenzimidazole+dyes+useful+for+fluorescent+detection+of+deoxyribonucleic+acid+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22The+journal+of+histochemistry+and+cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Spectral studies on 33258 Hoechst and related bisbenzimidazole dyes useful for fluorescent detection of deoxyribonucleic acid synthesis.</a> The journal of histochemistry and cytochemistry. 24 (1), 24-33 (1976).</li>
<li>Van Hooijdonk, C. A., Glade, C. P., Van Erp, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TO-PRO-3+iodide%3A+a+novel+HeNe+laser-excitable+DNA+stain+as+an+alternative+for+propidium+iodide+in+multiparameter+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">TO-PRO-3 iodide: a novel HeNe laser-excitable DNA stain as an alternative for propidium iodide in multiparameter flow cytometry.</a> Cytometry. 17 (2), 185-189 (1994).</li>
<li>Beumer, T. L., Veenstra, G. J., Hage, W. J., Destrée, O. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-mount+immunohistochemistry+on+Xenopus+embryos+using+far-red+fluorescent+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+genetics%22%5BJournal%5D)">Whole-mount immunohistochemistry on Xenopus embryos using far-red fluorescent dyes.</a> Trends in genetics. 11 (1), 9(1995).</li>
<li>Prieto, D., Aparicio, G., Morande, P. E., Zolessi, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fast%2C+low+cost%2C+and+highly+efficient+fluorescent+DNA+labeling+method+using+methyl+green%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry+and+cell+biology%22%5BJournal%5D)">A fast, low cost, and highly efficient fluorescent DNA labeling method using methyl green.</a> Histochemistry and cell biology. 142 (3), 335-345 (2014).</li>
<li>Kim, S. K., Nordén, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methyl+green.+A+DNA+major-groove+binding+drug%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+letters%22%5BJournal%5D)">Methyl green. A DNA major-groove binding drug.</a> FEBS letters. 315 (1), 61-64 (1993).</li>
<li>Nordén, B., Tjerneld, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+of+methyl+green+to+deoxyribonucleic+acid+analyzed+by+linear+dichroism%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Physics+Letters%22%5BJournal%5D)">Binding of methyl green to deoxyribonucleic acid analyzed by linear dichroism.</a> Chemical Physics Letters. 50 (3), 508-512 (1977).</li>
<li>Lyon, H., Jakobsen, P., Andersen, aP. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardized+methyl+green-pyronin+Y+procedures+using+pure+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Histochemical+journal%22%5BJournal%5D)">Standardized methyl green-pyronin Y procedures using pure dyes.</a> The Histochemical journal. 18 (2-3), 90-94 (1986).</li>
<li>Amat, F., Keller, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+comprehensive+cell+lineage+reconstructions+in+complex+organisms+using+light-sheet+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Development%2C+growth+%26+differentiation%22%5BJournal%5D)">Towards comprehensive cell lineage reconstructions in complex organisms using light-sheet microscopy.</a> Development, growth & differentiation. 55 (4), 563-578 (2013).</li>
<li>Chung, K., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CLARITY+for+mapping+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+methods%22%5BJournal%5D)">CLARITY for mapping the nervous system.</a> Nature methods. 10 (6), 508-5013 (2013).</li>
<li>Lenz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+measurement+in+thick+tissue+layers+by+linear+or+nonlinear+long-wavelength+excitation%5BTitle%5D)+AND+%22Applied%22%5BJournal%5D)">Fluorescence measurement in thick tissue layers by linear or nonlinear long-wavelength excitation.</a> Applied. 38 (16), 3662-3669 (1999).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Son yıllarda mikroskopi tekniklerinin ilerleyici gelişimi, özellikle floresan mikroskopi varyasyonlarına odaklanarak, tüm embriyolar10,11 dahil olmak üzere bozulmamış doku örneklerinin dinamiklerini ve yapısını keşfetme olasılığına yol açmıştır. Bununla birlikte, önemli bir sınırlama, hücre altı yapıları doğrudan ve hızlı bir şekilde boyamak için kullanılabilecek kaliteli floroforların mevcudiyeti olmuştur. 
DAPI veya Hoechst gibi en sık kullanılan floresan DNA boyaları, UV ışığı il...

DNA'nın floresan boyanması, hem biyolojik araştırmalarda hem de klinik tanıda, nükleer ve kromozomal yapının ayrıntılı çalışması, doku ve hücrelerin karşı boyanması veya hücre döngüsü parametrelerinin incelenmesi için yaygın ve rutin olarak kullanılmaktadır1. Birkaç DNA lekesi mevcut olmasına rağmen, en yaygın olarak kullanılanlar, UV ışığı tarafından uyarılan ve mavi renkte yayanlardır, bu da yeşil ve turuncu-kırmızı yayan floroforlarla birleştirildiğinde çoğu geleneksel epifloresan mikroskopta kullanılan olağan üç filtreli sistemlere uyar, floresan proteinler veya antikorlara bağlı küçük moleküller gibi. Bu mavi yayan DNA lekeleri arasında en yaygın olanları DAPI ve Hoechst minör oluk bağlayıcı ajanlardır2,3. Bununla birlikte, lazer tarama mikroskoplarında çok çeşitli lazer emisyon çizgilerinin ve spektral tespitin dahil edilmesi, araştırmacıların propidyum iyodür (PI) veya TO-PRO 34 gibi uzak kırmızı yayan nükleer lekelerin kullanımını seçmelerine izin vermiştir. Bu lekelerin bir avantajı, birçok hücre ve dokuda, özellikle embriyolarda bulunan otofloresan sorununun üstesinden gelmeleridir5, ancak birçoğunun geniş emisyon profillerine sahip olması veya fotobleaching'e çok duyarlı olmasıgibi farklı sorunları vardır 6.
İsviçreli araştırmacı Friedrich Miescher, DNA'yı 1869'da keşfetti ve onu irinde bulunan beyaz kan hücrelerinin çekirdeklerinden çıkardı. Ona nüklein adını verdi ve birkaç yıl sonra nispeten yeni bir leke olan metil yeşili ile çökeltiler oluşturduğunu gösterdi. Metil yeşili, farklı derecelerde metilasyona sahip üç anilin halkasından oluşur ve DNA7,8'in ana oluğuna güçlü bir şekilde bağlanmasına izin veren iki pozitif yüke sahiptir. Metil yeşili ile DNA boyamanın çok erken bir zamanda spesifik olduğu gösterildi, bu da Unna ve Pappenheim tarafından özellikle RNA'yı etiketleyen pironun ile kombine bir lekenin geliştirilmesine yol açtı. Metil yeşil-pironun o zamandan beri rutin histolojik teknikte yaygın olarak kullanılmaktadır9.
Yakın zamana kadar, metil yeşilinin floresan özellikleri hakkında çok az şey biliniyordu. Bununla birlikte, önceki çalışmamız, 633 nm'de uyarılması, uygun bir Stokes kayması, elektromanyetik spektrumun yakın kızılötesi kısmına yayılması, benzer spektral özelliklere sahip ticari olarak mevcut DNA lekelerinden daha yüksek fotostabilite gibi metil yeşil spektral avantajlardan6 bazılarını ortaya çıkardı ve çok düşük bir maliyetle. Bu nedenle, embriyonik dokularda ve tüm embriyolarda DNA için çok yüksek afiniteli ve spesifik bir floresan etiketi olarak kullanılması için test etmeye karar verdik. Ayrıca, şimdiye kadar metil yeşili nükleer boyama düşük pH'da gerçekleştirildi ve bu da antikor boyaması ile birleştirilmesini zorlaştırdı. Burada ayrıntıları verilen yöntemin amacı, boyama prosedürünü fizyolojik pH'ta gerçekleştirerek yukarıda belirtilen rahatsızlığın üstesinden gelen floresan nükleer DNA boyama protokolüne sahip olmak ve böylece onu bölümler ve tüm dokular üzerinde immünoetiketleme için uygun bir karşı boyama haline getirmektir.

<table><tbody><tr><td>Gliserol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Metil yeşili</td><td>Dr. G. Gr&uuml; bler</td><td></td><td>Ayrıca kristal viyole içermeyen Sigma-Aldrich 323829'yi test etti</td></tr><tr><td>Paraformaldehit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>Lazer taramalı konfokal mikroskopi Leica TCS-SP5</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin&ndash; Tetrametilrodamin B izotiyosiyanat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td> P1951&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>kloroform</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>372978</td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj 5810 R</td><td>eppendorf</td><td>5811 000.010&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>mikroskop kızakları</td><td>Deltalab</td><td>D100004</td><td></td></tr><tr><td>kapak kızakları</td><td>Esco optik</td><td>R525025</td><td></td></tr></tbody></table>

embriyolar floresan etiketleme dna Özgü leke metil green uygulaması

Application of the DNA-Specific Stain Methyl Green in the Fluorescent Labeling of Embryos

Metil yeşili, floresan özellikleri yakın zamana kadar keşfedilmemiş olmasına rağmen, uzun zamandır DNA için spesifik bir afiniteye sahip histolojik bir leke olarak bilinmektedir. Bu makalede, seyreltildiğinde sabit hücreler ve dokular için çok uygun bir floresan nükleer etiket olarak kullanılabilen bir metil yeşili sulu stok çözeltisi hazırlama yöntemini gösteriyoruz. Bütün zebra balığı ve civciv embriyolarını etiketlemek için kolay prosedürler detaylandırılmıştır ve elde edilen görüntü örnekleri gösterilmiştir. Metil yeşili, 633 nm'de kırmızı ışıkla maksimum düzeyde uyarılır ve 677 nm'de zirveye ulaşan nispeten keskin bir spektrumla yayılır. Çok ucuzdur, toksik değildir, çözelti içinde oldukça kararlıdır ve DNA'ya bağlandığında foto ağartmaya karşı çok dirençlidir. Kırmızı emisyonu, kalın örneklerde çekirdeklerin değiştirilmemiş yüksek çözünürlüklü taramalı konfokal görüntülemesine izin verir. Son olarak, bu metil yeşili boyama protokolü, antikor etiketleme veya florofor konjuge falloidin ile aktin filamentleri etiketleme gibi diğer hücre boyama prosedürleriyle uyumludur.

Kalın numunelerin Nükleer boyanma. Burada tarif edilen protokol bütün embriyolar derin yapıların homojen lekelenme başarı sağlar. Gelişmekte mercek çekirdek formu 48 hpf Zebra balığı embriyolar homojen (Şekil 1) etiketlenir. Metil yeşil DNA boyama gibi mitoz veya apoptotik çekirdeklerin (Şekil 2A) tanımlanması gibi hücre döngüsü bağımlı morfolojik farklılıkların ayrımcılığa izin verir. Zebra balığı embriyolar (Şekil 2B) epidermal çekirdekler...

Spesifik DNA etiketi metil yeşili olan sabit biyolojik materyalin floresan boyanması için bir yöntem açıklanmaktadır. Metil yeşili, seyreltilmiş sulu bir çözeltide kullanılır ve foto ağartmaya karşı çok dirençlidir. Uzak kırmızı emisyonu, derin örnek görüntülemeye izin verir ve bu da onu tüm embriyolar için özellikle yeterli hale getirir.

Embriyolar Floresan Etiketleme DNA Özgü Leke Metil Green Uygulaması

Methyl green has long been known as a histological stain with a specific affinity for DNA, although its fluorescent properties have remained unexplored ...

Bu videoda, oldukça yaygın bir histolojik boyama olan metil yeşilinin, tüm embriyolar gibi kalın biyolojik örneklerin lazer konfokal mikroskobisiyle yapılan özel uygulamalarında, floresan mikroskobisinde son derece kullanışlı bir nükleer etiket olarak nasıl kullanılabileceğini göstereceğiz. Metil yeşilini DNA'ya özgü bir boya olarak kısaca tanıttıktan sonra, floresan boyama için stok ve çalışma çözeltilerinin hazırlanma yöntemini açıklayacağız. Ardından, nükleer boyamanın gerçekleştirilmesi için izlenecek deneysel prosedürü gösterecek ve birkaç balık embriyosu ile elde edilen konfokal görüntü örneklerini sunacağız.Son olarak, metil yeşilinin mükemmel fizikokimyasal özellikleri gösterilecek ve tartışılacaktır. Freddy Misha 1869 yılında DNA'yı keşfetti ve birkaç yıl sonra, DNA'nın nispeten yeni bir boya olan metil yeşili ile çökelek oluşturduğunu gösterdi. Metil yeşili, DNA'nın majör oluğunda güçlü etkileşime girmesini ve tercihen AT açısından zengin bölgelere bağlanmasını sağlayan iki pozitif yüke sahiptir.Metil yeşilinin en yaygın kullanımı, 20. yüzyılın başında UNA ve Poppen Heim tarafından geliştirilen bir RNA boyası olan perin ile bir nazal solüsyonda kombinasyonudur. Ancak, metil yeşilinin floresan özellikleri üzerine çok az analiz yapılmıştır ve bu nedenle, hücrelerdeki DNA için çok yüksek afiniteli ve spesifik bir floresan etiket olarak kullanılabilme olasılığını test etmeye karar verdik.Metil yeşili, yedi metil grubuna sahip bir metan boyasıdır. Bu yedinci grup kolayca kaybedilir ve boya kristal viyoleye dönüşür. Bu nedenle, kristal oluşumunu önlemek için metil yeşili ile birlikte belirli bir miktarda kristal viyole karıştırılır.Kristal viyoleyi ekstrakte etmek için viyole metil yeşili çözeltisi kloroform ile yıkanabilir. Hemen ardından göstereceğimiz üzere, bu amaçla bir çeker ocak altında %4 ACU çözeltisi hazırlarız. Bu çözeltiyi en az iki birim kloroformla karıştırır ve faz ayrılmasını hızlandırmak için santrifüj ederiz.Santrifüjleme sonrası, metil yeşili içeren bir sulu faz ve kloroform ile kristal viyole içeren alt bir organik faz elde ederiz. Üst fazı geri kazandık ve alt faz berrak görünene kadar işlemi tekrarladık. Sonunda, üst faz geri kazanılır ve seyreltilir.Bu çözelti, çalışma tezgahı üzerinde aylar boyunca stabildir. Şimdi, embriyo tabakasındaki tüm MO'ların metil yeşili ile nasıl boyanacağını göstereceğiz. Konfokal görüntüleme için yüksek şeffaflıktaki balık embriyolarını kullanacağız.Örnek olarak, zebrafish embriyolarını temin edin ve kalıntıları bir süzgeç yardımıyla yıkayarak uzaklaştırın. Embriyoları, akvaryum suyu veya embriyo ortamında istenen evreye gelene kadar inkübe edin. Korionu ince cımbızla çıkarın ve embriyoları %4'lük formaldehit içerisinde birkaç saat veya gece boyunca sabitleyin.Ardından embriyoları birkaç kez PBST ile yıkayın. Stok çözeltiyi PBST içerisinde 5 ila 10.000 kat seyrelterek bir metil yeşili çalışma çözeltisi hazırlayın. Embriyoları çözeltide oda sıcaklığında en az üç saat veya 4 °C'de gece boyunca inkübe edin.Bu örnekte, spektral detektörlerle donatılmış bir konfokal mikroskoptan konfokal görüntüler elde edilecektir. Maksimum eksitasyon 633 nanometrelik bir lazerle sağlanır ve detektör, görünür spektrumun kırmızı bölgesindeki geniş bir aralığa ayarlanır.Metil yeşili kırmızının emisyonu, tüm embriyolar gibi derin örneklerden bile minimal sinyal kaybıyla yüksek kaliteli nükleer görüntüleme yapılmasını sağlar. Bu ilk seri, çekirdekleri yaygın olarak kullanılan bir DNA boyası ile boyanmış bir zebra balığı retinasını göstermektedir. Bir dakika sonra uzaklaşıyoruz.Metil yeşili ile aynı deney gerçekleştirildiğinde, bir ABL tarama bölgesi belirginleşir ve herhangi bir belirgin ağarma görülmez. Aşağıdaki seride, burada açıklanan protokol kullanılarak elde edilebilecek temsilci sonuçları gösteriyoruz; bunlar, mitotik figürlerin gözlemlenebildiği zebrafish epidermisine ait mitotik hücrelerdir. Aynı örneğe ait, nükleer mimarinin görülebildiği IIC çekirdeği.Metil yeşil amalin ile işaretlenmiş bir zebra balığı larvası epidermal hücresinin bir kısmının 3D rekonstrüksiyonu; döllemeden sonraki 48 saatlik bir gümüş balığı beyninin retina bölgesindeki farklı nükleer şekillerin daha panoramik bir görünümü. Burada, nükleer işaretlemede kullanılabilecek son derece ucuz bir floresan DNA boyasının hazırlanmasının kolay bir yolunu gösterdik; sadece bir örnek olarak sunmuş olsak da, birçok benzer uygulama mümkündür. Bu teknik, embriyolarınıza veya dokularınıza, ister bütün mount ister kesit şeklinde olsun, uygulanabilir.Ayrıca jellerde DNA boyaması ve fotometri kullanarak çözeltide DNA tayini için de kullanılabilir.

application-dna-specific-stain-methyl-green-fluorescent-labeling

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Tüm Dağı In situ Moleküler Biyoloji ve organizma Biyoloji Link Hibridizasyon

Biz, merkezi sinir sistemi içinde tek nöron etiketlenmesine yönelik bir yöntem (CNS)...

Merkez Sinir Sistemi Tek Hücreler Etiketleme<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Biz, (E) 9.5 ve daha sonraki aşamalarında embriyonik gün fare embriyoları olan embriyonik veya pluripotent hücrelerinden elde edilen iç ve aşılanmış hücrelerden hücre kaderine ve fenotipi hem izlenmesi amacıyla, boyalar enjekte DNA vektörleri, virüs, ve hücreler, bir dizi yöntem tarif gelişme.

Embriyonik Fare Kalpler Gelişmekte Hücre Etiketleme ve Enjeksiyon

Xenopus laevis embriyosu, büyük boyutu ve manipülasyon kolaylığı nedeniyle erken gelişim çalışmalarında son derece yararlı olmaya devam ediyor.   Bu model sistemde belirli organların tanımlanmasında kullanılabilecek tam montajlı in situ hibridizasyon protokolü için basitleştirilmiş bir protokol sağlanmıştır.

Anlamak Basitleştirilmiş kullanma Erken Organogenez<em&gt; In Situ</emIçinde&gt; Hibridizasyon Protokolü<em&gt; Ksenopus</em

Gelişmekte olan embriyoya Drosophila küçük moleküllerin giriş yeni bileşikler, ilaçlar, toksinler ve biyolojik aktivitesini karakterize edici hem de temel geliştirme yolunu tarama için büyük bir potansiyel sunmaktadır. Açıklanan yöntemler burada Drosophila embriyo modelin programını genişleterek, bu yaklaşımın doğal engelleri aşmak adımları özetlemektedir.

Geçirgenliği için bir yöntem<em&gt; Drosophila</emKüçük Molekül Faaliyet Tahliller için&gt; Embriyolar

Biz Branchiostoma lanceolatum ve döllenmemiş oosit içine burada mRNA enjeksiyonundan sonra floresan proteinleri sağlam ve verimli bir ifade rapor. Bu bazal kordalısı içinde mikroenjeksiyon tekniği gelişimi, gelişmekte olan bu model sistemde teknik yenilikleri geniş kapsamlı vivo görüntüleme ve gen-spesifik manipülasyonlar dahil önünü açacak.

Floresan protein ifadesindeki Branchiostoma lanceolatum Döllenmemiş Oositlerinin içine mRNA Enjeksiyon

Biz renkli çökeltilerin zıt üç farklı mRNA dağıtım desen eşzamanlı ve belirli algılama izin bozulmamış Drosophila embriyolar bir çoklu hedef kromojenik tüm montaj in situ hibridizasyon (MC-DİLERİZ) prosedürü açıklar.

Çoklu hedef Kromojenik Tüm montaj<em&gt; In Situ</em&gt; Melezleme Gen İfade Etki karşılaştırılması için<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriyolar

Işık levha bazlı floresan mikroskobu ile böcek embriyonlarından morfojenezini Görüntüleme tekniğin durumu haline gelmiştir. Bu protokol ana hatlarıyla ve Tribolium castaneum embriyolar için uygun üç montaj teknikleri karşılaştırır, canlı görüntüleme için uygun iki yeni ısmarlama transjenik çizgileri sunar, önemli bir kalite kontrol anlatılır ve mevcut deney sınırlamaları gösterir.

Işık Levha tabanlı Floresan Yaşayanlar Mikroskopi veya Sabit ve Lekeli<em&gt; Tribullum castaneum</em&gt; Embriyolar

Protokol, mitokondriyal nükleoidlerin ticari olarak kullanılabilen DNA jeli lekesi ile özel etiketlemesini, süper çözünürlüklü yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu (SR-SIM) ile zaman atlamalı canlı etiketli hücrelerin zaman atlamalı serilerinin edinimini ve nükleoid hareketinin otomatik olarak izlenmesini açıklar.

Hızlandırılmış Yapılandırılmış Aydınlatma Mikroskomu için Mitokondriyal Nükleoidlerin Özel Etiketlemesi

Erken Drosophila embriyosunda, birçok organel hareketlidir. Prensip olarak, belirli floresan problar aracılığıyla canlı olarak görüntülenebilirler, ancak yumurta kabuğu embriyoya doğrudan uygulamayı önler. Bu protokol, bu tür probların mikroenjeksiyon yoluyla nasıl tanıtılacağını ve daha sonra parçacık  görüntü velosimetrisi yoluyla toplu organel hareketinin nasıl analiz edileceğini açıklar.

Drosophila Embriyolarında Lipid İçeren Organellerin Sitoiskelete Bağımlı Ticaretinin Görselleştirilmesi

Erken embriyogenezde tek hücrelerde zigotik genom aktivasyonu sırasında yeni başlayan transkripsiyonu görselleştirme yöntemlerini açıklıyoruz.

Erken Embriyoların Tek Hücrelerinde Zigotik Genom Aktivasyonunun Görselleştirilmesi

Öğrenin, metil yeşili ile embriyoların floresan boyamasını ve konfokal mikroskopi görüntüleme yöntemini. Bu teknik, kalın biyolojik örneklerde nükleus etiketleme için güçlü bir araç sunar.

Embriyolar Floresan Etiketleme DNA Özgü Leke Metil Green Uygulaması

Daha fazla video keşfet