Name: Nanopartikül Aşılama sonrası analizi antijene özgü CD8 + T hücresi tepkileri için tüm hayvan Görüntüleme ve Akış Sitometrisi Teknikleri (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 7 s
Description: Öğrenin lipid bazlı aşı nanopartiküllerinin sentezi ve antijene özgü CD8+ T hücre yanıtlarının bütün hayvan görüntüleme ve akış sitometrisi ile değerlendirilmesi. Bu yöntem aşı geliştirme çalışmalarına katkı sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüsü 1K22AI097291-01 hibe tarafından desteklenen ve Ödül Numarası UL1TR000433 altında Ulusal Sağlık Enstitüleri Translasyonel Bilimler ilerlemek için Ulusal Merkezi tarafından yapıldı. Biz de aşı nanopartiküller ve OT-I / Luc transgenik fareler üzerinde ilk çalışmaları katkılarından dolayı Fred Hutchinson Kanser Merkezi&#39;nde MİT ve Prof. Matthias Stephan Prof. Darrell Irvine kabul etmiş sayılırsınız.

Bu protokol açıklanan tüm deneyler belirlenen politika ve kurallarına göre Kullanımı ve Michigan Üniversitesi&#39;nde Hayvanlarının Bakımı (UCUCA) Üniversite Komitesi tarafından onaylandı ve yapıldı. 1. Sentezi ve Karakterizasyonu Protein ICMVs Antijen ve Adjuvan Moleküller ile Co-yüklü <ol><li> Karışım 1: 1,2-dioleoil-sn--glisero-3-fosfokolin (DOPC) ve 1,2-dioleoil-sn--glisero-3-phosphoethanolamine- N 1 mol oranı - [4- (p -maleimidophenyl) bütiramit] kloroform (MPB), yığın başına 1.26 umol toplam lipit miktarı tutulması (örneğin, DOPC, 500 ug ve MPB 630 ug) 20 ml bir cam şişe (çap = 28 mm, yükseklik = 61 mm). </li><li> Istenilen konsantrasyonda lipit solüsyonuna, örneğin monofosforil lipid A (MPLA) ya da lipofilik boyalar (örneğin, yaptığımız) gibi lipofilik ilaçlar, ekleyin. İyice ekstra kuru nitroge ile tasfiye ederek organik çözücü kaldırmakn gaz ve vakum O / N altında örnekler yerleştirerek. </li><li> Suda çözünür ilaçlar (örneğin, protein antijenleri) ihtiva eden 10 mM Bis-Tris propan (BTP, pH 7.0), 200 ul ekleyerek lipid filminin hidratı. 10 saniye oda sıcaklığında 1 saat süre ile, her 10 dakika vorteksleyin. </li><li> Cam içeriği, bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içine ufak şişe yer örnekleri, bir buz-su banyosu içinde, 125 W / 20 kHz prob ucu sonikatör ayarı% 40 yoğunluk kullanılarak 5 dakika boyunca sürekli olarak sonikasyon aktarın. </li><li> Her parti (çalışma konsantrasyonu 2.4 mM), girdap ve masa mikro santrifüj kullanılarak kısa bir süre santrifüje 150 mM ditiyotreitol (DTT), 4 ul ekle. </li><li> 200 mM CaCI2 40 ul ekleyin ve pipet (çalışma konsantrasyonu 33 mM) ile karıştırın. DTT ile lipit katman MPB-ihtiva eden çapraz bağlanmasını sağlamak için 1 saat boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Santrifüj numuneleri 15 dakika için 20,000 x g&#39;de, ddiH 2 O 200 ul supernatant, ve tekrar süspansiyon kaldırma </li><li> Adımı yineleyin 1.7 ve santrifüj yeniden ikinci ddiH 2 O yıkamadan sonra süpernatanından CaCl 2, reaksiyona girmemiş DTT ve kapsüllenmemiş kargo malzemelerini çıkarmak için. </li><li> DdiH 2 O 2 kDa polietilen glikol-tiol (PEG-SH), 10 mg / ml hazırlayın PEG-SH çözeltisi 100 ul her bir ICMV örnek yeniden süspanse edin ve 30 dakika boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> İki ddiH 2 O yıkar (adım 1.7) gerçekleştirin ve 4 ° C&#39;de son ICMV PBS pelet ve mağaza tekrar süspansiyon. Parçacıklar uzun süreli depolamadan sonra dibe olabilir önce ICMV süspansiyonu karıştırmak, kullanmak için. </li><li> Partiküllerin karakterizasyonu için, her partiden ICMVs küçük bir kısım (~% 10) kaldırıp ddiH 2 O, 1 ml bir toplam hacim içinde ayrı ayrı seyreltik Bir Zetasizer hücresi ve ölçü parçacık boyutu, polidispersite indeksi ve DLS ve (imalatçının protokolüne göre) zeta potansiyeli ölçüm sistemi kullanılarak numunelerin zeta potansiyeli tek bir örnek yerleştirin. </li></ol> Ve Lenf Nodu Boşaltma 2. Sınav Konfokal Mikroskopi ile ICMVs Floresan-etiketli <ol><li> ICMVs hazırlanması florofor-etiketli antijen ve lipofilik bir floresan boya ile yüklenir <ol><li> Üreticinin talimatlarına uygun olarak, ovalbümin Alexa Fluor 555-süksinimidil ester ile reaksiyona sokulmaktadır gibi florofor-etiketli protein, hazırlayın. </li><li> Lipid kabuk fluorofor ile etiketlenmiş ICMVs hazırlamak için, lipofilik floresan boya (örneğin, 1,1-dioktadesil-3,3,3 &#39;, 3&#39;-Tetramethylindodicarbocyanine, () yaptı) (lipit filmin hazırlanması sırasında Adım ekleme 1.2)% 0.05 molar lipid miktarda. Lipid filmi hidrasyon (Basamak 1.3), florofor etiketli antijen ihtiva eden kullanımı tamponu ve tam ICMV sentezi için adımlar 1,4-1,11 belirtildiği gibi. </li></ol></li><li> Kuyruk dibinde nanopartiküllerin deri altı uygulama <ol><li> Indüksiyon odasında u ile donatılmış kontrollü bir akış buharlaştırıcı kullanılarak fare anestezisiIACUC göre% 3 izofluran ve oksijen akışının 1.5 L / dak tilizing hayvan protokolü onayladı. Fare bilinçsiz sonra, enjeksiyon yerinde optimal erişime izin ve hayvan rahatsızlığı en aza indirmek için kapalı giyen anestezi hızlı bir şekilde önce aşağıdaki adımları uygulayın. Alternatif olarak, anestezi korumak için uygun bir uydurma burun konisi kullanın. Farenin uzunluğu 5 dakika için anestezi uygulanır ise, işlemden sonra tahrişi en aza indirgemek için gerekli olan göz madeni uygulanır. </li><li> Sterilize ve deri altına iğne görselleştirmek için kullanılabilir görebilir deri, küçük bir yama ortaya çıkarmak için kürk Bölüm ıslak saç ıslak% 70 etanol ile kuyruğun tabanına püskürtün. </li><li> Istenen antijen miktarı ve PBS içinde aşı dozu, 100 ul başına yardımcı madde ihtiva eden parçacık püskürtme süspansiyonu hazırlayın (örneğin, 10 ug OVA ve enjeksiyon doz 100 ul başına 0,3 ug MPLA son 6,9 kullanılmıştır). </li><li> Parçacık süspansiyon int Beraberlikoa bir 27-29 G iğne ile şırınga ve kuyruk dibinde iğneyi (~ çizgisi 5 mm) eğim ile yukarı bakacak ve partikül süspansiyonu 22 50 ul enjekte edilir. </li><li> Aşırı geri akışı önlemek ve iğneyi çekin eşitlemek için baskı için birkaç saniye bekleyin. Her iki drenaj kasık LN hedef kuyruk tabanının diğer tarafta enjeksiyon tekrarlayın. </li></ol></li><li> Konfokal mikroskobu ile lenf nodu cryosections hazırlanması ve incelenmesi. <ol><li> Bir IACUC hayvan protokolü onayladı göre uyarılan pnömotoraks ardından CO 2 boğulma ile fare, Euthanize. Bedoya 23 gösterilen protokole uygun olarak kasık lenf nodları ekstrakte edin ve 4 ° C&#39;de PBS içinde 1 ml dokuları yerleştirerek kan yıkayın. </li><li> Dokularıyla dokulardan PBS emilmesini ve doku cryomolds doku yer (10 x 10 x 5 mm3) Ekim ortamı 24 donan üstüne önceden doldurulmuş. Yapış tis dondurmak30 saniye için sıvı azot içinde blok dava. Seçenek olarak ise, 30 dakika boyunca kuru buz üzerinde doku bloğu yerleştirin. ° C derin dondurucuda -80 dondurulmuş doku saklayın. </li><li> -20 ° C&#39;de 24 ayarlanmış bir kriyostat 5-10 mikron kalınlığında doku bölümleri kesin. </li><li> Gerekirse, immunofloresan etiketleme gerçekleştirmek ve daha önce 24 gösterildiği gibi konfokal mikroskobu ile doku inceleyin. </li></ol></li></ol> Antijen-spesifik 3. İzleme Genişleme, Tüm Hayvan Görüntüleme ile Nanopartikül Aşı sonrası CD8 + T Hücreleri Lusiferaz-ifade <ol><li> OT-I / Luc transgenik farelerden OVA257-264-spesifik, lusiferaz sentezleyen CD8 + T hücrelerinin izolasyonu <ol><li> CO 2 boğulma ile bir OT-I / Luc transgenik fare Euthanize ve bir IACUC göre pnömotoraks hayvan protokolü onayladı neden olur. Pankreas 23 doku ayrılmakta dikkatle periton boşluğuna erişim ve steril bir şekilde dalak Hasat vedoku kültürü kaputu transferi için 4 ° C PBS +% 2 FBS içinde 5 ml bir yer. </li><li> (Bir seferde 3 dalak kadar) 50 ml konik santrifüj tüpü üzerinde 70 mikron naylon süzgeç üzerinde dalak yerleştirin. 3 ml şırınga bir dalgıç kullanarak, süzgeç vasıtasıyla hücrelere eziyet. </li><li> Piston ve PBS +% 2 FBS ile süzgeç yıkayın ve atın. 300 x g, 10 dakika boyunca, 10 ml / 50 ml tüp içinde dalak toplam hacmi getirmek hemositometre ile saymak için hücre süspansiyonu küçük bir örnek alır ve santrifüjlenir. </li><li> Ticari olarak mevcut olan manyetik negatif seçim seti kullanılarak, imalatçının talimatları izlenerek CD8 + T hücre popülasyonu izole eder. </li><li> Hücrelerin PBS ile yıkandıktan sonra, izole edilmiş CD8 + T hücrelerinin sayısı. Izole edilmiş CD8 + T hücrelerinin saflığını değerlendirmek için, daha sonra αCD8 APC antikorun 20 ul, 10 dakika süre ile, fare CD16 / 32 antikoru (0.025 mg / ml) 20 ul ~ 20.000-30.000 hücrelerin inkübe (0.005 mg / ml) ve 30 dakika boyunca inkübe edin. PeBSA a / h PBS içinde 4 ° C&#39;de +% 1 Bütün inkübasyonlar, rform. Akım sitometri analizi 25 gerçekleştirin. </li></ol></li><li> Genişleme sonrası aşılama evlatlık izole CD8 + T hücrelerinin transferi ve görselleştirme <ol><li> Intravenöz kuyruk damarından 22 (gün -1) ile PBS içinde 200 ul hacim içinde 1-10 x 10 5 hücre uygulanmasıyla saf C57BL / 6 farelerine izole OT-I / Luc CD8 + T hücrelerinin adoptif transferini gerçekleştirir. C57BL / 6 farelerde bu kürk ve siyah deri yamaları dikkate alındığında bioluminescent sinyal engel olabilir, traş albino C57BL / 6 fareler bu çalışmalar için idealdir. </li><li> Daha önce (bölüm 2.2) açıklandığı gibi bir gün (gün 0) sonra aşı yönetmek. </li><li> Intraperitonal PBS 300 ul hacim içinde kg fare vücut ağırlığı başına luciferase 150 mg uygulayın. 10 dakika sonra, (aşama 2.2.1 gibi) izofluran fareler anestezi ve 5-10 dakika w biyoışıldama sinyali alarak OT-I / Luc CD8 + T hücreleri görselleştirmekBir bütün hayvan görüntüleme sistemi i (IVIS, detaylı talimat Wilson 26 bakınız). Uzunlamasına çalışmalar için gerekli tekrarlayın. </li></ol></li></ol> Analiz PBMC&#39;ler 4. Peptid-MHC tetramer boyama antijene özgü CD8 + T hücreleri, Not: Aşağıdaki protokol prosedürü adoptif adoptif transfer olmadan OT-I / Luc CD8 + T hücreleri ya da C57BL / 6 fareler ile transfer C57BL / 6 fareleri kullanılarak gerçekleştirilebilir. <ol><li> Aşılamadan sonra, arzu edilen bir zaman noktasında, K 2 EDTA ile kaplanmış bir tüp içine submandibuler kanama tekniği 27 vasıtasıyla farelerden kan yaklaşık 100 ul (4-6 damla) toplamak ve pıhtılaşmayı önlemek için birkaç kez ters çevirin. </li><li> Bir mikrosantrifüj tüpüne kan 100 ul aktarma liziz tamponu için 1 ml ekleyin ve kırmızı kan hücrelerini (RBC) ortadan kaldırmak amacıyla 2 dakika ila 3 inkübe edin. Santrifüj örnekleri 1,500 xg&#39;de 5 dakika boyunca ve supernatant çıkarın. Yine de pelet halinde(RBCs eksik kaldırılmasını belirtir) kırmızı ppears, lizis tamponu kısa bir inkübasyon (&lt;1 dakika) ile parçalama adımı tekrarlayın. </li><li> 5 dakika boyunca 1,500 x g&#39;de 1 (/ hac BSA, PBS +% 1) FACS tamponu ilave edildi ve santrifüj ile geriye kalan PBMC&#39;ler yıkayın. </li><li> Aspire süpernatan ve spesifik olmayan ve FcR aracılı antikor engellemek için fare CD16 / 32 antikorunun 20 ul örnek (0.025 mg / ml) yeniden süspanse edin. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca inkübe edin. </li><li> 4 ml yuvarlak dipli FACS tüpler içine mikrosantrifüj tüpler hücreleri aktarın. Her bir örnek için, üreticinin spesifikasyonlarına göre OVA Tetramer-SIINFEKL-PE çözelti B, H-2K 20 ul eklenir ve buz üzerinde 30 dakika inkübe edilir. </li><li> Antikor kokteyli hazırlayın (örneğin, αCD8-APC, αCD44-FITC ve αCD62L-PECy7 antikorlar (sırasıyla 0.005, 0.005, ve 0.002 mg / ml konsantrasyon)). Her bir deney örneği 20 ul ekleyin ve buz üzerinde 20 dakika inkübe edilir. La tarafından tek fluorofor kontrolleri hazırlayınYukarıda belirtilen konsantrasyonda her florofor ile işaretlenmiş tetramer veya antikor ile hücreler Beling. </li><li> FACS tamponu ile 2 kez yıkanır ve DAPI 2 ug / ml ihtiva eden FACS tamponu nihai pelletini. analizi (ayrıntılar ve örnekler Scheffold 25 bulunabilir) sitometri hücreleri artık akışı için hazırız. </li></ol>

Perkin Elmer, bu makalenin yayınlanması sırasında katlanılan üretim maliyeti sağladı.

Bu makalede sağlanan protokol ICMVs olarak adlandırılan sentezi ve yeni bir lipid bazlı nanopartikül sisteminin karakterizasyonu açıklanmaktadır, ve antijene spesifik CD8 + T hücresi tepkilerini indükleme nanopartikül bazlı aşı formülasyonlarının etkinliğinin doğrulanması için bir işlem sağlar. ICMV sentezi genellikle kaybı ile sonuçlanan, tipik olarak hazırlanması için, organik çözücüler gerektiren diğer yaygın olarak kullanılan polimer nano partikül sistemleri (örneğin, poli (laktid-ko-glikolit) asit parçacık...

Geleneksel aşı geliştirme ağırlıklı deneme-yanılma ampirik bir yaklaşım uygulamaktadır. Ancak, biyomalzeme ve immün aktivasyon moleküler belirleyicileri keşif geniş bir yelpazeye son gelişme ile, bu rasyonel patojenlerin 1,2 türetilen biyofiziksel ve biyokimyasal ipuçları ile aşı formülasyonları tasarlamak artık mümkün. Özellikle, çeşitli parçacık halinde ilaç iletim platformları, lenf içinde bulunan bozunmadan, aşı bileşenleri korumak ve antijen sağlayan hücrelere (APC) kendi eş sevkini iyileştirmek, bu alt birim antijen ve immünostimülatör maddelerle birlikte yüklenebilecek aşı taşıyıcıları olarak incelenmiştir düğümler (LN), böylece bağışıklık uyarımı ve aktivasyonunu 3-5 maksimize. Daha önce güçlü bir aşı platfor olarak gösterilmiştir, bu yazıda, bir &quot;patojen taklit eden&quot; nanopartikül sisteminin sentezini tarif adlandırılan interbilayer-çapraz bağlanmış çok-lamelli veziküller (ICMVs),Sağlam sitotoksik T lenfosit (CTL) ve sistemik ve mukoza dokusu bölümlerinde 6-9 hem de humoral bağışıklık karşılıklarının ortaya çıkartıldığını m. Özellikle, ICMVs ile aşılama büyük oranda geleneksel yardımcı maddeler (örneğin, şap ve Montanide) 7 ile aşılama ile karşılaştırıldığında, bir sıtma antijene karşı serum IgG düzeyleri gelişmiş ve aynı zamanda tümör hücreleri ve fareler 9 viral meydan modellerine karşı güçlü CTL yanıtları ortaya başararak. Burada bir model aşı nanoparçacık sistemi olarak ICMVs kullanarak, biz partikül büyüklüğü ve zeta potansiyeli ölçümleri ve boşaltma LN parçacık ticareti izleme cryosectioned dokuların 7 konfokal görüntüleme kullanan (dLNs dahil) aşı nano-formülasyonlar karakterizasyonu için yöntemler açıklanmaktadır. Buna ek olarak, lusiferaz sentezleyen bir antijen-özgül CD8 + T hücrelerinin 9,10 adoptif nakli sonrasında farelerde CTL yanıtlarının genişleme analiz bir bütün hayvan görüntüleme tabanlı bir yöntem sunulmaktadır. Son olarak biz denanopartiküller 6,9 ile aşılanmış farelerde endojen T hücresi tepkilerinin uzunlamasına ölçümü için periferal kan tek-çekirdekli hücreleri (PBMC), çizici tetramer boyaması. ICMVs daha sonra kimyasal olarak çapraz bağlayıcı ditiyol 6 lipid tabakaları içinde çapraz bağlama maleimid-işlevselleştirilmiş fosfolipid baş grupları tarafından stabilize edilir çok katmanlı yapılar, içine basit lipozomlar kontrol füzyon tarafından sentezlenen bir lipid bazlı nanopartikül formülasyonu vardır. ICMVs sentez edildikten sonra, nano partiküllerin küçük bir kısmı parçacık boyutuna ve zeta potansiyeli, dinamik ışık saçılımı (DLS) sistemi ve zeta potansiyeli analizcisi ile (parçacıkların, yani, yüzey yükü) belirlemek için kullanılabilir. Difüzyon katsayısı belirlenmesi ve parçacıkların 11 hidrodinamik boyutu izin parçacık süspansiyonları ışık saçılması DLS ölçer değişiklikler. Toplu sentezine toplu tutarlı parçacık büyüklüğü sağlanması önemlidirparçacık boyutu yana APCler 12,13 tarafından dLNs ve daha sonra hücre içine kabul edilmesine aşı parçacıkların lenf boşaltma etkileyen ana faktörlerden biridir. Buna ek olarak, zeta potansiyeli partikülleri ve partikül yüzey yükünün 11 elektroforetik hareketlilik belirlenmesini sağlayan bir elektrik akımı uygulanır parçacık hızını ölçerek elde edilebilir. Parçacıkların yüzey yükü depolama sırasında ve in vivo uygulama 14,15 sonra parçacık dağılım üzerinde doğrudan etkisi vardır koloidal istikrarı belirler çünkü parçacıkların tutarlı zeta potansiyeli değerlerin sağlanmasında çok önemlidir. DLNs partikül yerelleştirme izlemek amacıyla, ICMVs lipofilik boyalar ve kovalent etiketli antijenler de dahil olmak üzere istenilen floroforlar ile etiketli olabilir. Aşılamadan sonra, fareler, dLNs rezeke, çeşitli zaman noktalarında ötenazi cryosectioned ve konfokal mikroskobu ile analiz edilebilir. Bu teknik lenfatik DraI görselleştirme sağlarnanoparçacık aşı taşıyıcıları ve dLNs antijenin hem eğirme. Daha önce 7 gösterildiği gibi doku bölümleri ilave olarak antijen ve germinal merkezlerin oluşumu ile bağlantılı hücre türleri gibi floresan etiketli antikorlar ve daha fazla bilgi elde etmek için kullanılan ile boyanmış olabilir. Parçacık sentezi optimize edilmiştir ve dLNs insan ticareti onaylandıktan sonra, in vivo CTL genişleme aydınlatılması doğrulamak için önemlidir. Nanoparçacık aşılamaya verdikleri yanıt olarak antijene özgü CD8 + T hücrelerinin ortaya konmasını analiz etmek amacıyla, detaylı bir immünolojik analizler sağlar OVA 257-264 peptit (SIINFEKL) immünodominant CD8 + T hücre epitopu ile bir model antijen, ovalbümin (OVA) kullanmıştır Başlangıç ​​aşı geliştirme 16,17 için antijen-spesifik T hücresi tepkilerinin. Özel olarak, genleşme ve antijene özgü CD8 + T hücrelerinin göç dinamiklerini sorgulamak için, biz oluşturulan adresT-hücresi reseptörü (H-2K ile birlikte b) SIINFEKL için spesifik (TCR) ile CD8 + T hücreleri sahip OT-I transgenik farelerin transgenik fareler (Luc), lusiferaz sentezleyen ateşböceği geçerek çift transgenik fare modeli. Bu OT-I / Luc Farelerden, lusiferaz sentezleyen, OT-I, CD8 + T hücreleri, izole edilebilir ve saf C57BL / 6 farelerine adoptif transfer için hazırlanmıştır. Tohumlanmış sonra, OVA-içeren nanopartiküller ile başarılı bir aşı, bir bütün hayvan görüntüleme sistemi 9,10 ile biyoışıldama sinyalinin izlenmesi ile takip edilebilir şekilde nakledilen T hücrelerinin genişlemesine neden olur. Bu non-invazif tüm vücut görüntüleme tekniği uzunlamasına bir şekilde periferal dokularda T hücresi lenfoid dokularda genişleme ve yayılması ilgili işlemleri ifşa son 18-20 diğer viral veya tümör antijenleri ile kullanılmıştır. Adoptif transfer antijene özgü CD8 + T hücre analizi, tamamlayıcı, endogenoBize T hücresi tepkileri kullanıldığında, aşılama dört florofor ile işaretlenmiş MHC-sınıf I molekülleri içeren bir peptit-MHC kompleksi tetramer, peptit epitopları ile yüklü olan peptid ana histokompatibilite kompleksi (MHC) tetramer denemesi 21 ile incelenebilir yayınlamak bir antijen-spesifik bir şekilde, TCR ve etiket, CD8 + T hücrelerini bağlamak için. peptid-MHC tetramer denemesi lenfoid ve periferik dokularda antijen spesifik CD8 + T hücrelerini teşhis etmek için, terminal Otopsi çalışmaları ya da seri kan çekilir elde edilen periferal kan mononükleer hücreleri (PBMC) ile uzunlamasına çalışmalarda da gerçekleştirilebilir. Peptid-MHC tetrameri ile lenfositlerin boyama sonra, akış sitometri analizine CD8 + T-hücreleri arasında kendi frekans CTL&#39;lerin fenotipinde veya nicelenmesine detaylı analizler için gerçekleştirilir.

<table><tbody><tr><td colspan="4">1. Protein antijeni ve adjuvan moleküllerle birlikte yüklenmiş ICMV'lerin sentezi ve karakterizasyonu</güçlü></td></tr><tr><td>1,2-dioleoil-sn-glisero-3-fosfoetanolamin-N-[4- ( p -maleimidofenil) butiramide] (sodyum tuzu) (MPB)</td> <td>Avanti Polar Lipids, INC.</td><td></td><td></td>870012</tr><tr><td>1,2-dioleoil- sn-glisero-3-fosfokolin (DOPC)</td> <td>Avanti Polar Lipids, INC.</td><td></td><td></td>850375</tr><tr><td>Monofosforil Lipid A (Sentetik) (PHAD&trade;) (MPLA)</td><td>Avanti Polar Lipids, INC.</td><td>699800</td><td></td></tr><tr><td>20 ml cam şişeler</td><td>Wheaton</td><td>0334125D</td><td></td></tr><tr><td>Symphny Vakumlu Fırın</td><td>VWR</td><td>414004-580</td><td></td></tr><tr><td>Ovalbumin (OVA)</td> <td>Worthington</td><td>3054</td><td></td></tr><tr><td>Bis-Tris Propan (BTP)</td> <td>Fisher</td><td>BP2943</td><td></td></tr><tr><td>Q125 Sonikatör (125 & nbsp; W/20&nbsp; kHz)</td><td>Qsonica</td><td>Q125-110</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Fisher</td><td>BP172</td><td></td></tr><tr><td>2 kDa Tiyollenmiş Polietilen Glikol (PEG-SH)</td><td>Laysan Bio</td><td>MPEG-SH-2000-1g</td><td></td></tr><tr><td>Malvern ZetaSizer Nano ZSP&nbsp;</td><td>Malvern</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ZetaSizer Küvetleri</td><td>Malvern</td><td>DTS1070</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">2. Floresan işaretli ICMV'lerin lenf nodu drenajının konfokal mikroskopi ile incelenmesi</güçlü></td></tr><tr><td>1,1'-Dioktadesil-3,3,3',3'-Tetrametilindodikarbosiyanin, 4-Klorobenzensülfonat Tuzu (DID)</td><td>Life Technologies</td><td>D-7757</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555-süksinimidil ester (AF555-NHS)</td><td>Life Technologies</td><td>A37571</td><td></td></tr><tr><td>Doku-Tek OCT dondurma ortamı&nbsp;</td><td>VWR</td><td>25608-930</td><td></td></tr><tr><td>Doku Kriyokalıpları</td><td>VWR</td><td>25608-922</td><td></td><</tr><tr>td colspan="4">3. Tüm hayvan görüntüleme ile nanopartikül aşılamasından sonra antijene özgü, lusiferaz eksprese eden CD8 + T hücrelerinin genişlemesinin izlenmesi</güçlü></td></tr><tr><td>C57BL/6 fareler</td><td>Jackson</td><td>000664</td><td></td></tr><tr><td>Albino C57BL/6 fareler</td><td>Jackson</td><td>000058</td><td></td></tr><tr><td>OT-1 C57BL/6 fareler</td><td>Jackson</td><td>003831</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu; m naylon süzgeç</td><td>BD</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>EasySep&trade; Fare CD8+ T Hücre İzolasyon Kiti</td><td>StemCell</td><td>19853</td><td></td></tr><tr><td>IVIS&reg; tüm hayvan görüntüleme sistemi</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">4. Antijene özgü CD8+ T hücrelerinin akış sitometrik analizi için periferik kan mononükleer hücrelerinin (PBMC'ler) peptit-MHC tetramer boyaması</güçlü></td></tr><tr><td>K2EDTA tüpleri</td><td>BD</td><td>365974</td><td></td></tr><tr><td>ACK lizis tamponu</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>A10492-01&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD16 / 32 Fc Blok</td><td>Ebioscience</td><td>14-0161-86</td><td></td></tr><tr><td>H-2K b OVA Tetramer</td><td>MBL</td><td>TS-5001-1C</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD8-APC</td><td>BD</td><td>553031</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD44-FITC</td><td>BD</td><td>553133</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD62L-PECy7</td><td>Ebioscience</td><td>25-0621-82</td><td></td></tr><tr><td>4 & prime;, 6- Diamidino-2-fenilindol dihidroklorür (DAPI)</td><td>SIGMA</td><td>D8417-10MG</td><td></td></tr><tr><td>CyAn Akış Sitometresi</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FlowJo Yazılımı</td><td>FlowJo</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

nanopartikül aşılama sonrası analizi antijene özgü cd8 + t hücresi tepkileri için tüm hayvan görüntüleme ve akış sitometrisi teknikleri

Whole-animal Imaging and Flow Cytometric Techniques for Analysis of Antigen-specific CD8+ T Cell Responses after Nanoparticle Vaccination

Şap gibi geleneksel aşı adjuvanları, suboptimal CD8+ T hücresi yanıtlarını ortaya çıkarır. Aşı geliştirmedeki bu büyük zorluğun üstesinden gelmek için, drene lenf düğümlerine antijen iletimini iyileştirmek ve antijen sunan hücreler tarafından antijen alımını artırmak için patojenlerin özelliklerini taklit etmek üzere çeşitli nanopartikül sistemleri tasarlanmış ve antijene özgü CD8+ T hücresi yanıtlarının indüksiyonu için optimize edilmiş yeni aşı formülasyonlarına yol açmıştır. Bu makalede, alt birim antijenlerin ve immünostimülatör ajanların birlikte verilmesi ve güçlü sitotoksik CD8+ T lenfosit (CTL) yanıtlarının ortaya çıkarılması için etkili bir aşı taşıyıcısı olarak hizmet edebilen iki tabakalı çapraz bağlı çok katmanlı veziküller (ICMV'ler) olarak adlandırılan "patojeni taklit eden" bir nanopartikül sisteminin sentezini açıklıyoruz. Dinamik ışık saçılımı ve zeta potansiyel analizörü ile aşı nanopartiküllerinin hidrodinamik boyutunu ve yüzey yükünü karakterize etmek için yöntemleri açıklıyoruz ve drene lenf düğümlerine nanopartikül aracılı antijen iletimini analiz etmek için konfokal mikroskopi tabanlı bir prosedür sunuyoruz. Ayrıca, lusiferaz eksprese eden, antijene özgü CD8 + T hücrelerinin alıcı farelere evlat edinici transferini ve ardından CTL'lerin genişleme ve kaçakçılık modellerinin gerçek zamanlı olarak non-invaziv sorgulamasına izin veren nanopartikül aşılamasını kullanan yeni bir biyolüminesans tam hayvan görüntüleme tekniği gösteriyoruz. Ayrıca, nanopartiküllerle aşılanmış farelerde endojen T hücresi yanıtlarının uzunlamasına kantitifikasyonu için periferik kan mononükleer hücrelerinin tetramer boyamasını ve akış sitometrik analizini de tanımladık.

ICMVs sentezinde yer alan basamaklar, Şekil 1 &#39;6&#39;da tasvir edilmiştir. Kısaca, bir lipofilik ilaçlar ya da floresan boyalar ihtiva eden bir lipid filmi hidrofilik ilaçların mevcudiyetinde hidratlanır. Örneğin Ca2 + gibi iki değerli katyonlar, çok katmanlı vezikülleri içine anyonik lipozomların füzyon sürmek için ilave edilir. DTT gibi, yağ katmanları apposing, ve son olarak, dış maleimid grupları, kalan &quot;elyaf&quot; maleimid işlevselleştirilmiş lipidlere eklenir ditiyo...

Bir murin aşılama modelinde nanopartiküllerle bağışıklamaya yanıt olarak antijene özgü CD8+ T hücrelerinin genişlemesini izlemek için tüm hayvan görüntüleme ve akış sitometrisi tabanlı teknikleri açıklıyoruz.

Nanopartikül Aşılama sonrası analizi antijene özgü CD8 + T hücresi tepkileri için tüm hayvan Görüntüleme ve Akış Sitometrisi Teknikleri

Traditional vaccine adjuvants, such as alum, elicit suboptimal CD8+ T cell responses. To address this major challenge in vaccine development, various ...

Bu deneyin genel amacı, lipid tabanlı aşı nanoparçacıkları sentezlemek ve karakterize etmek ve bunların in vivo ortamda antijene özgü sitotoksik T lenfosit ekspansiyonunu tetikleme yeteneklerini değerlendirmektir. Bu, naif farelerin aşılanması için antijen ve adjuvan ile birlikte yüklenmiş, patojeni taklit eden çift katman arası çapraz bağlı multilamel veziküller veya I CMV'ler tasarlanarak gerçekleştirilir. Lüsiferaz eksprese eden antijene özgü CD8 pozitif T hücreleri adaptif olarak transfer edilir.İkinci adımda, antijene özgü CD eight pozitif T hücrelerinin genişlemesi, tüm hayvan in vivo görüntüleme ile değerlendirilir. Ardından, ICMV ile immünize edilmiş hayvanlardan toplanan periferik kan mononükleer hücreleri, floresan işaretli tetramerlerle boyanır ve sistemik kompartıman içindeki endojen antijene özgü CD eight pozitif T hücrelerinin frekansını belirlemek için akış sitometrisi ile analiz edilir. Son olarak, nanopartikül aşısına yanıt olarak antijene özgü sitotoksik T lenfositlerinin genişlemesini izlemek için biyolüminesans görüntüleme kullanılabilir.Bu yöntemler, sitotoksik T lenfosit ekspansiyonunun kapsamı nedir ve bu hücreler nanoparçacık aşısına yanıt olarak çeşitli dokulara nasıl taşınır gibi aşı tasarımındaki temel ön soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin, doku nekropsisi sonrası in-situ T hücresi analizi gibi mevcut yöntemlere karşı temel avantajı, T hücresi yanıtının in vivo görüntülemesinin non-invaziv olmasıdır. Bu durum, aynı hayvanın boylamsal olarak izlenmesine olanak tanır. Bir adet 20 mililitrelik cam şişe içinde, her bir grup için toplam lipid miktarını 1,26 µmol düzeyinde tutarak, kloroform içerisinde birer eş molar oranda DOPC ve MPB karıştırarak başlayın.Ardından, lipofilik kargoyu istenen konsantrasyonda lipid solüsyonuna ekleyin ve organik çözücüyü tamamen uzaklaştırmak için solüsyonu ekstra kuru azot gazı ile süpürün. Numuneyi gece boyunca vakum altında bekletin; ertesi sabah lipid filmini hidrat etmek için 200 µL 10 mM BTP içeren ve ilgili suda çözünür kargonun bulunduğu solüsyona ekleyin, elde edilen solüsyonu oda sıcaklığında bir saat boyunca her 10 dakikada bir 10 saniye boyunca vorteksleyin. Daha sonra içeriği 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.Ardından tüpü, 125 watt 20 kilohertz prob uç sonikatörün %40 yoğunluk ayarı kullanılarak sürekli sonikasyona tabi tutulacak şekilde buzlu su banyosuna yerleştirin. Beş dakika sonra, tüpe dört µL 150 mM DTT ekleyin, karıştırmak için vorteksleyin ve örneği bir mikro santrifüjde çöktürün. Daha sonra, örneğe 40 µL 200 mM kalsiyum klorür ekleyin ve ardından lipid tabakaları içeren MPB'leri DTT ile 37 °C'de bir saat boyunca çapraz bağlayın.İnkübasyonun sonunda, süpernatanttaki kalıntı kalsiyum klorürü, reaksiyona girmemiş DTT'yi ve enkapsüle edilmemiş kargo materyallerini uzaklaştırmak için solüsyonu üç kez santrifüjleyin; ikinci ve üçüncü santrifüj işlemleri sırasında 200 µL çift distile su ekleyin. Son santrifüjden sonra, I CMV'leri 37 °C'de 30 dakika boyunca 100 µL taze hazırlanmış pegol içerisinde süspanse ediyoruz. Ardından vezikülleri çift distile su ile iki kez daha yıkayın.Final peleti PBS içinde resüspande edin ve ICMV'leri dört derece Celsius'ta saklayın. Partikülleri karakterize etmek için, örneğin küçük bir alikotunu toplam bir mililitre çift distile su hacminde dilüe etmeden önce soğuk ICMV süspansiyonunu karıştırın. Ardından, ICMV'leri bir zeta sizer hücresine yerleştirin ve üretici talimatlarına göre örneklerin partikül boyutunu, polidispersite indeksini ve zeta potansiyelini ölçmek için bir dinamik ışık saçılımı ve zeta potansiyeli ölçüm sistemi kullanın.Luciferaz eksprese eden CD8 pozitif T hücrelerini izole etmek için öncelikle OT-1 luciferaz transgenik farelerden dalakları hasat edin. Dokuları, 5 mL buz gibi soğuk PBS ve %2 FBS içeren bir kaba yerleştirin ve ardından doku kültürü kabinine alın.Üç mililitrelik bir şırınganın pistonunu kullanarak, üç adede kadar dalak dokusunu aynı anda 70 mikronluk bir süzgeçten geçirerek 15 mililitrelik konik tüpe ezin. Pistonu ve süzgeci PBS ve %2 FBS ile yıkayın. Ardından, hücre süspansiyonunun toplam hacmini dalak başına 10 mililitreye tamamlayın.Toplam hücre sayısını belirleyin ve ardından hücreleri santrifüj ederek çöktürün. Daha sonra, üretici talimatlarına uygun olarak CD8 pozitif dalak hücrelerini izole etmek için ticari olarak temin edilebilen bir manyetik negatif seleksiyon kiti kullanın. Ardından T hücrelerini PBS ile yıkayın.Hücreleri sayın ve 20 µL fare CD 1632 bloklama antikoru içerisinde 2 ila 3 × 10⁵ hücreyi inkübe edin. 10 dakika sonra, hücrelere 30 dakika boyunca 20 µL anti CD 8 APC antikoru ekleyin ve manyetik boncukla izole edilen CD 8 pozitif T hücresi popülasyonunun saflığını akış sitometrisi ile değerlendirin. Ardından, 24 saat sonra, 1 ila 10 × 10⁵ OT 1 lusiferaz CD 8 pozitif T hücresini, 200 µL PBS içerisinde naif, tüyleri tıraşlanmış albino C 57 black six farelerin kuyruk venine intravenöz enjeksiyon yoluyla adaptif olarak transfer edin; aşılamadan sonraki uygun günlerde aşının uygulanmasını sağlayın.Hayvanlara 10 dakika sonra kilogram başına 150 miligram Lucifer enjekte edin ve uygun zamanda antijen spesifik CD8 pozitif T hücrelerinin sayısını belirlemek amacıyla OT-I Lucifer CD8 pozitif T hücrelerini görselleştirmek için tüm hayvan görüntüleme sistemi ile beş ila 10 dakika boyunca biyolüminesans sinyalini alın. Aşılamadan sonra, aşılanmış farelerden submandibüler kanama tekniği ile yaklaşık 100 mikrolitre kanı potasyum EDTA kaplı bir tüpe toplayın ve pıhtılaşmayı önlemek için tüpü birkaç kez ters çevirin. Ardından 100 mikrolitre kanı bir mikro santrifüj tüpüne aktarın ve bir mililitre ACK lizis tamponu ekleyin.İki ila üç dakika sonra, hücreleri santrifüjleyin ve süpernatantı uzaklaştırın. Kalan pbmc'leri bir mililitre fax tamponu ile yıkayın ve az önce gösterildiği gibi CD 1632 ile spesifik olmayan bağlanmayı bloke edin. 10 dakika sonra, hücre süspansiyonunu dört mililitrelik yuvarlak tabanlı fax tüplerine bölün ve üretici spesifikasyonlarına uygun olarak her bir örneğe 20 mikrolitre H two KB over tetramer syn fecal PE çözeltisi ekleyin.Buz üzerinde 30 dakika beklettikten sonra, her bir deneysel örneğe 20 µL uygun antikor kokteyli ve her bir fluoro four tag tetramer veya antikoru için her bir kontrol örneğine tekli fluoro four kontrol antikorları ekleyin. Son olarak, 20 dakikalık başka bir inkübasyonun ardından, tüm örnekleri fax buffer ile yıkayın, peletleri DPI takviyeli fax buffer içinde yeniden süspande edin ve örnekleri akış sitometrisi ile analiz edin. Fluoro four tact protein antijenleri ve floresan lipofilik boyalarla birlikte yüklenen CMV'ler, antijen ve nanoparçacık iletiminin in vivo görselleştirilmesini sağlar. Örneğin, konfokal mikroskopi görüntülemesi, kuyruk tabanına deri altına iletilen çözünür antijenin, uygulamadan sonraki dört saat içinde drenaj lenf düğümlerine ulaştığını ve 24 saat içinde temizlendiğini göstermektedir.Buna karşılık, aşırı yüklü I CMV'ler, uygulama sonrası 24 saat içinde ilk olarak drenaj lenf düğümlerinin çevresinde tespit edilir ve devam eden birikim, drenaj lenf dokusu içinde büyük bir ova I CMV birikintisiyle sonuçlanır. Dördüncü güne gelindiğinde, aşılama günü OT one Luciferase CD eight pozitif T hücreleri adoptif olarak transfer edilen C 57 BL six farelerin biyolüminesans görüntülemesi, aşılama sonrası dördüncü güne kadar minimal bir OT one lusiferaz T hücresi arka plan seviyesi göstermektedir. Ancak, ova MPI CMV'ler ile bağışıklanmış fareler, drenaj inguinal lenf düğümleri içinde güçlü bir biyolüminesans sinyali sergiler.Öte yandan, çözünür ova ile aşılanan fareler, drenaj lenf düğümlerinde OT-1 Lucifer CD8 pozitif T hücrelerinin çok daha düşük bir ekspansiyonu göstermektedir. Antijen spesifik T hücrelerinin adaptif transferi yapılmadan, çözünür ova ve MPLA ile bağışıklanan diğer farelerde, PBMC'lerin haftalık takibiyle belirtildiği üzere, ova spesifik CD8 pozitif T hücrelerinde belirgin bir ekspansiyon görülmemiştir. Ancak, ICMV aşısı, PBMC'ler arasında CD8 pozitif T hücresi kompartmanında 41. güne kadar %28'lik bir zirveye ulaşan, anlamlı derecede daha güçlü ve endojen bir CD8 pozitif T hücresi yanıtı oluşturmaktadır. Bu videoyu izledikten sonra, lipid tabanlı nanopartiküllerin nasıl sentezleneceği, bağışıklamaların nasıl gerçekleştirileceği ve CTL ekspansiyonunun in vivo olarak nasıl görselleştirilip nicelendirileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.CTL yanıtı hakkında ek bilgiler elde etmek için bu yöntemler daha da geliştirilebilir. Örneğin, hücrelerin hafıza fenotipini değerlendirmek için teer boyama deneyi CD 1 27, BCL two ve K lrg one gibi ek belirteçlerle desteklenebilir.

whole-animal-imaging-flow-cytometric-techniques-for-analysis-antigen

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bu yazıda, RAW 264.7 hücreleri tarafından polianhidrid nanopartiküller veya bakteri içselleştirilmesi ölçmek için multi-spektral görüntüleme sitometrisi kullanan bir metodu tanımlar.

Çoklu-spektral Görüntüleme Akım Sitometri tarafından Nanopartiküller ve Bakterilerin Hücresel İçselleştirilmesi Analizi

Bu videoda, antijenik peptit yüklü MHC-Ig'ler ve anti-CD28 antikorları ile işlevselleştirilmiş manyetik nanopartikül bazlı yapay antijen sunan hücreler (aAPC'ler) kullanılarak nadir antijene özgü CD8+ T hücrelerinin izole edilmesi için bir protokol açıklanmaktadır. aAPC'lerin, antijenik peptit hedefli T hücresi reseptörlerini spesifik olarak eksprese eden CD8 + T hücreleri ile etkileşimi ve ardından in vitro genişlemeleri, bu CD8 + T hücresi popülasyonunun zenginleşmesi ve genişlemesi ile...

Antijene Özgü CD8+ T Hücrelerinin Nanopartikül Bazlı Zenginleştirilmesi ve Genişletilmesi

Bu video, farklı hücre döngüsü aşamalarında antijene özgü CD8+ T hücrelerini analiz etmek için bir testi göstermektedir. Floresan etiketli canlı hücreler, akış sitometrisi kullanılarak seçilir ve farklı hücre döngüsü aşamalarındaki hücreler, hücre çoğalması ile ilişkili nükleer proteine ve bir nükleik asit boyasına karşı antikorlar kullanılarak DNA içerikleri ile tanımlanır.

Antijene Özgü CD8+ T Hücrelerinin Hücre Döngüsü Analizi için Bir Test

Video, in vivo adjuvan kaynaklı sitotoksik T lenfosit veya CTL üretimini izlemek için immünolojik bir yöntemi göstermektedir. Bir fareye genetik olarak tasarlanmış, proliferatif boya lekeli donör CD8 + T lenfositleri önceden enjekte edilir. Ovalbüminin adjuvanlarla deri altı enjeksiyonu, hasat sonrası immün boyama ve akış sitometrisi yoluyla tanımlanan sitotoksik CD8 + T lenfositleri oluşturur.

Adjuvan Aracılı Sitotoksik T Lenfosit Oluşumunu İzlemek İçin İmmünolojik Bir Teknik

Akış sitometresi ile bağışık hücrelerin tanımlanmış alt grupları ile nanopartikül etkileşim analizi.

Sitometrisi ile Primer İmmün hücre alt Floresan Nanoparçacık Etkileşimleri Algılama

Bu protokol, florofor etiketli nanokorlar ve geleneksel antikorlar kullanan farelerde in vivo yakın kızılötesi floresan ksenogreft görüntüleme deneylerinin ex vivo doğrulamasını gerçekleştirmek için gereken adımları ana hatlarıyla belirtir.

Nanobody ve Antikor Temelli Doğrulama<em&gt; İn Vivo</emFarelerde&gt; Tümör Xenograftlarında NIRF-görüntüleme Deneyler kullanma<em&gt; Ex vivo</em&gt; Sitometrisi ve Mikroskopi

Burada, biz birincil insan T hücreleri ve antijen sunan hücreler arasındaki bağışıklık sinapslarda nitel ve nicel analizi için tam bir iş akışı tanımlamak. Yöntem alma ve nispeten kısa bir süre içinde birkaç bin hücre görüntülerin değerlendirme sağlar görüntüleme akış sitometresi temel alır.

Akış Sitometresi Imaging kullanılarak insan sisteminde bağışıklık Synapse nitel ve nicel analiz

Antijen spesifik T hücreleri ayırdetmek veya tedaviler nedeniyle onların son derece düşük frekanslı kullanmak zordur. Burada, bu hücreler zenginleştirmek için antijen spesifik T hücrelere bağlayabilirsiniz bir manyetik parçacık geliştirmek için bir protokol sağlar ve daha sonra bunları birkaç genişletmek için hundred-fold karakterizasyonu ve tedavisi için.

Zenginleştirmek ve nadir antijen spesifik T hücreleri Manyetik Nano tanecikleri ile genişletin

Burada, eski için bir iletişim kuralı mevcut antijen spesifik CD8 vivo nitel tespiti+ T hücreleri. Analiz tek hücre süspansiyonlar organları veya küçük miktarda kan ile mümkündür. Çok çeşitli çalışmalar sitotoksik T hücre yanıt (aşı ve kanser immünoterapi çalışmaları) analizini gerektirir.

Anti-vektör ve Anti transgene özel CD8 eşzamanlı miktar+ T hücreleri MHC ile ben Tetramer sonrasi hipererjik bir Viral vektör ile boyama

Klonal genleşme antijene özgü T hücre yanıtının önemli bir özelliğidir. Bununla birlikte, antijen yanıt veren T hücrelerinin hücre döngüsü, kısmen teknik sınırlamalar nedeniyle kötü bir şekilde araştırılmıştır. Aşılanmış farelerin dalak ve lenf düğümlerinde klonal olarak genişleyen antijene özgü CD8 T hücrelerini analiz etmek için bir akış sitometrik yöntemi açıklıyoruz.

Aşılanmış Farelerde Antijene Özgü CD8 T Hücrelerinin Hücre Döngüsü Analizi için DNA/Ki67 Tabanlı Akış Sitometrisi Tahlili

Protokol, nanoemülsiyon ofiyopogonin D adjuvanının etkili hücresel immün yanıtları destekleyip desteklemediğini değerlendirmek için ayrıntılı yöntemler sunar.

İn Vitro Nanoemülsiyon Aşısı Adjuvan Ophiopogonin D'nin Hücresel Aktivitesinin Değerlendirilmesi

Öğrenin lipid bazlı aşı nanopartiküllerinin sentezi ve antijene özgü CD8+ T hücre yanıtlarının bütün hayvan görüntüleme ve akış sitometrisi ile değerlendirilmesi. Bu yöntem aşı geliştirme çalışmalarına katkı sağlar.

Nanopartikül Aşılama sonrası analizi antijene özgü CD8 + T hücresi tepkileri için tüm hayvan Görüntüleme ve Akış Sitometrisi Teknikleri (Video) | JoVE Journal

Nanopartikül Aşılama sonrası analizi antijene özgü CD8 + T hücresi tepkileri için tüm hayvan Görüntüleme ve Akış Sitometrisi Teknikleri

Daha fazla video keşfet