Nanopartikül Aşılama sonrası analizi antijene özgü CD8 + T hücresi tepkileri için tüm hayvan Görüntüleme ve Akış Sitometrisi Teknikleri

Bu deneyin genel amacı, lipid tabanlı aşı nanoparçacıkları sentezlemek ve karakterize etmek ve bunların in vivo ortamda antijene özgü sitotoksik T lenfosit ekspansiyonunu tetikleme yeteneklerini değerlendirmektir. Bu, naif farelerin aşılanması için antijen ve adjuvan ile birlikte yüklenmiş, patojeni taklit eden çift katman arası çapraz bağlı multilamel veziküller veya I CMV'ler tasarlanarak gerçekleştirilir. Lüsiferaz eksprese eden antijene özgü CD8 pozitif T hücreleri adaptif olarak transfer edilir.

İkinci adımda, antijene özgü CD eight pozitif T hücrelerinin genişlemesi, tüm hayvan in vivo görüntüleme ile değerlendirilir. Ardından, ICMV ile immünize edilmiş hayvanlardan toplanan periferik kan mononükleer hücreleri, floresan işaretli tetramerlerle boyanır ve sistemik kompartıman içindeki endojen antijene özgü CD eight pozitif T hücrelerinin frekansını belirlemek için akış sitometrisi ile analiz edilir. Son olarak, nanopartikül aşısına yanıt olarak antijene özgü sitotoksik T lenfositlerinin genişlemesini izlemek için biyolüminesans görüntüleme kullanılabilir.

Bu yöntemler, sitotoksik T lenfosit ekspansiyonunun kapsamı nedir ve bu hücreler nanoparçacık aşısına yanıt olarak çeşitli dokulara nasıl taşınır gibi aşı tasarımındaki temel ön soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin, doku nekropsisi sonrası in-situ T hücresi analizi gibi mevcut yöntemlere karşı temel avantajı, T hücresi yanıtının in vivo görüntülemesinin non-invaziv olmasıdır. Bu durum, aynı hayvanın boylamsal olarak izlenmesine olanak tanır. Bir adet 20 mililitrelik cam şişe içinde, her bir grup için toplam lipid miktarını 1,26 µmol düzeyinde tutarak, kloroform içerisinde birer eş molar oranda DOPC ve MPB karıştırarak başlayın.

Ardından, lipofilik kargoyu istenen konsantrasyonda lipid solüsyonuna ekleyin ve organik çözücüyü tamamen uzaklaştırmak için solüsyonu ekstra kuru azot gazı ile süpürün. Numuneyi gece boyunca vakum altında bekletin; ertesi sabah lipid filmini hidrat etmek için 200 µL 10 mM BTP içeren ve ilgili suda çözünür kargonun bulunduğu solüsyona ekleyin, elde edilen solüsyonu oda sıcaklığında bir saat boyunca her 10 dakikada bir 10 saniye boyunca vorteksleyin. Daha sonra içeriği 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.

Ardından tüpü, 125 watt 20 kilohertz prob uç sonikatörün %40 yoğunluk ayarı kullanılarak sürekli sonikasyona tabi tutulacak şekilde buzlu su banyosuna yerleştirin. Beş dakika sonra, tüpe dört µL 150 mM DTT ekleyin, karıştırmak için vorteksleyin ve örneği bir mikro santrifüjde çöktürün. Daha sonra, örneğe 40 µL 200 mM kalsiyum klorür ekleyin ve ardından lipid tabakaları içeren MPB'leri DTT ile 37 °C'de bir saat boyunca çapraz bağlayın.

İnkübasyonun sonunda, süpernatanttaki kalıntı kalsiyum klorürü, reaksiyona girmemiş DTT'yi ve enkapsüle edilmemiş kargo materyallerini uzaklaştırmak için solüsyonu üç kez santrifüjleyin; ikinci ve üçüncü santrifüj işlemleri sırasında 200 µL çift distile su ekleyin. Son santrifüjden sonra, I CMV'leri 37 °C'de 30 dakika boyunca 100 µL taze hazırlanmış pegol içerisinde süspanse ediyoruz. Ardından vezikülleri çift distile su ile iki kez daha yıkayın.

Final peleti PBS içinde resüspande edin ve ICMV'leri dört derece Celsius'ta saklayın. Partikülleri karakterize etmek için, örneğin küçük bir alikotunu toplam bir mililitre çift distile su hacminde dilüe etmeden önce soğuk ICMV süspansiyonunu karıştırın. Ardından, ICMV'leri bir zeta sizer hücresine yerleştirin ve üretici talimatlarına göre örneklerin partikül boyutunu, polidispersite indeksini ve zeta potansiyelini ölçmek için bir dinamik ışık saçılımı ve zeta potansiyeli ölçüm sistemi kullanın.

Luciferaz eksprese eden CD8 pozitif T hücrelerini izole etmek için öncelikle OT-1 luciferaz transgenik farelerden dalakları hasat edin. Dokuları, 5 mL buz gibi soğuk PBS ve %2 FBS içeren bir kaba yerleştirin ve ardından doku kültürü kabinine alın.

Üç mililitrelik bir şırınganın pistonunu kullanarak, üç adede kadar dalak dokusunu aynı anda 70 mikronluk bir süzgeçten geçirerek 15 mililitrelik konik tüpe ezin. Pistonu ve süzgeci PBS ve %2 FBS ile yıkayın. Ardından, hücre süspansiyonunun toplam hacmini dalak başına 10 mililitreye tamamlayın.

Toplam hücre sayısını belirleyin ve ardından hücreleri santrifüj ederek çöktürün. Daha sonra, üretici talimatlarına uygun olarak CD8 pozitif dalak hücrelerini izole etmek için ticari olarak temin edilebilen bir manyetik negatif seleksiyon kiti kullanın. Ardından T hücrelerini PBS ile yıkayın.

Hücreleri sayın ve 20 µL fare CD 1632 bloklama antikoru içerisinde 2 ila 3 × 10⁵ hücreyi inkübe edin. 10 dakika sonra, hücrelere 30 dakika boyunca 20 µL anti CD 8 APC antikoru ekleyin ve manyetik boncukla izole edilen CD 8 pozitif T hücresi popülasyonunun saflığını akış sitometrisi ile değerlendirin. Ardından, 24 saat sonra, 1 ila 10 × 10⁵ OT 1 lusiferaz CD 8 pozitif T hücresini, 200 µL PBS içerisinde naif, tüyleri tıraşlanmış albino C 57 black six farelerin kuyruk venine intravenöz enjeksiyon yoluyla adaptif olarak transfer edin; aşılamadan sonraki uygun günlerde aşının uygulanmasını sağlayın.

Hayvanlara 10 dakika sonra kilogram başına 150 miligram Lucifer enjekte edin ve uygun zamanda antijen spesifik CD8 pozitif T hücrelerinin sayısını belirlemek amacıyla OT-I Lucifer CD8 pozitif T hücrelerini görselleştirmek için tüm hayvan görüntüleme sistemi ile beş ila 10 dakika boyunca biyolüminesans sinyalini alın. Aşılamadan sonra, aşılanmış farelerden submandibüler kanama tekniği ile yaklaşık 100 mikrolitre kanı potasyum EDTA kaplı bir tüpe toplayın ve pıhtılaşmayı önlemek için tüpü birkaç kez ters çevirin. Ardından 100 mikrolitre kanı bir mikro santrifüj tüpüne aktarın ve bir mililitre ACK lizis tamponu ekleyin.

İki ila üç dakika sonra, hücreleri santrifüjleyin ve süpernatantı uzaklaştırın. Kalan pbmc'leri bir mililitre fax tamponu ile yıkayın ve az önce gösterildiği gibi CD 1632 ile spesifik olmayan bağlanmayı bloke edin. 10 dakika sonra, hücre süspansiyonunu dört mililitrelik yuvarlak tabanlı fax tüplerine bölün ve üretici spesifikasyonlarına uygun olarak her bir örneğe 20 mikrolitre H two KB over tetramer syn fecal PE çözeltisi ekleyin.

Buz üzerinde 30 dakika beklettikten sonra, her bir deneysel örneğe 20 µL uygun antikor kokteyli ve her bir fluoro four tag tetramer veya antikoru için her bir kontrol örneğine tekli fluoro four kontrol antikorları ekleyin. Son olarak, 20 dakikalık başka bir inkübasyonun ardından, tüm örnekleri fax buffer ile yıkayın, peletleri DPI takviyeli fax buffer içinde yeniden süspande edin ve örnekleri akış sitometrisi ile analiz edin. Fluoro four tact protein antijenleri ve floresan lipofilik boyalarla birlikte yüklenen CMV'ler, antijen ve nanoparçacık iletiminin in vivo görselleştirilmesini sağlar. Örneğin, konfokal mikroskopi görüntülemesi, kuyruk tabanına deri altına iletilen çözünür antijenin, uygulamadan sonraki dört saat içinde drenaj lenf düğümlerine ulaştığını ve 24 saat içinde temizlendiğini göstermektedir.

Buna karşılık, aşırı yüklü I CMV'ler, uygulama sonrası 24 saat içinde ilk olarak drenaj lenf düğümlerinin çevresinde tespit edilir ve devam eden birikim, drenaj lenf dokusu içinde büyük bir ova I CMV birikintisiyle sonuçlanır. Dördüncü güne gelindiğinde, aşılama günü OT one Luciferase CD eight pozitif T hücreleri adoptif olarak transfer edilen C 57 BL six farelerin biyolüminesans görüntülemesi, aşılama sonrası dördüncü güne kadar minimal bir OT one lusiferaz T hücresi arka plan seviyesi göstermektedir. Ancak, ova MPI CMV'ler ile bağışıklanmış fareler, drenaj inguinal lenf düğümleri içinde güçlü bir biyolüminesans sinyali sergiler.

Öte yandan, çözünür ova ile aşılanan fareler, drenaj lenf düğümlerinde OT-1 Lucifer CD8 pozitif T hücrelerinin çok daha düşük bir ekspansiyonu göstermektedir. Antijen spesifik T hücrelerinin adaptif transferi yapılmadan, çözünür ova ve MPLA ile bağışıklanan diğer farelerde, PBMC'lerin haftalık takibiyle belirtildiği üzere, ova spesifik CD8 pozitif T hücrelerinde belirgin bir ekspansiyon görülmemiştir. Ancak, ICMV aşısı, PBMC'ler arasında CD8 pozitif T hücresi kompartmanında 41. güne kadar %28'lik bir zirveye ulaşan, anlamlı derecede daha güçlü ve endojen bir CD8 pozitif T hücresi yanıtı oluşturmaktadır. Bu videoyu izledikten sonra, lipid tabanlı nanopartiküllerin nasıl sentezleneceği, bağışıklamaların nasıl gerçekleştirileceği ve CTL ekspansiyonunun in vivo olarak nasıl görselleştirilip nicelendirileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

CTL yanıtı hakkında ek bilgiler elde etmek için bu yöntemler daha da geliştirilebilir. Örneğin, hücrelerin hafıza fenotipini değerlendirmek için teer boyama deneyi CD 1 27, BCL two ve K lrg one gibi ek belirteçlerle desteklenebilir.