Name: Yalıtım için bir optimize Zenginleştirme Tekniği Arthrobacter Bakteriyofaj Türlerinin Toprak Numune İzolatlarının gelen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 24 s
Description: Keşfedin Arthrobacter bakteriyofajlarını toprak örneklerinden izole etmek için optimize edilmiş bir zenginleştirme protokolü. Bu yöntem, mikrobiyoloji ve faj tedavisi araştırmalarında hızlı ve tekrarlanabilir sonuçlar sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu protokolün geliştirilmesi için Fon Yükseköğretim için Güneydoğu Pennsylvania Konsorsiyumu ve Cabrini Koleji Fen Bölümü tarafından sağlanmıştır. Ek finansman ve destek Arcadia Üniversitesi ve Immaculata Üniversitesi&#39;nden geldi. Biz özellikle nazik bizim izole fajların elektron mikroskobik görüntüleri almak için Joseph Üniversitesi&#39;nden Dr. Karen Snetselaar teşekkür ederim. Ek destek Genomik ve Evrimsel Bilimi (SEA-fajlar) programı ilerleyen Howard Hughes Tıp Enstitüsü Fen Bilgisi Öğretmenliği İttifak Phage Hunters tarafından sağlandı.

Faj İzolasyon için Arthobacter Hücreler 1. Hazırlık <ul><li> Kültür Arthrobacter sp. KY3901 koloni 2-3 gün boyunca 30 ° C&#39;de inkübe edilen Luria Bertaini (LB) agar plaka üzerinde çizgi şeklinde. Bir koloni seçin ve 30 ° C&#39;de 225 rpm&#39;de bir çalkalama inkübatöründe saptırma plakalı bir kültür şişesi içinde LB suyu 250 ml eklemek ve inkübe etmek için steril bir döngü kullanılır. </li><li> Büyüme yaklaşık 24 saat faj enfeksiyonu deneyler için geç / erken üstel sabit faz hücreleri elde etmek izin verin. Geç sabit büyüme durumuna orta girmesini engellemek hücreleri yakından bakteriyel büyüme durumunu izleyin. Not: Hücre büyümesi, aşağıda tarif edilen faj izolasyon ve saflaştırma prosedürleri / aşamada 0.5-.0.7 arasında bir optik yoğunluk OD 600 arasında olmalıdır. </li></ul> Toprak Örneklerinden Faj 2. Koleksiyonu <ol><li> İstediğiniz yerden toprak 200-400 gr toplayın. Not: Arthroba bakteri yanacter cins onları enfekte fajlar bulunan ve toprak birçoğuna yaygın olan olabilir bunlar ve ortak toprak bakterilere vardır. </li><li> PB değildir, böylece, en azından 200 ml toprağa faj Tamponu (PB): [68 mM NaCI, 10 mM MgSO 4 ile, 10 mM Tris-CI (pH 7.5)], en az 400 ml ilave edilir ve yeterince büyük bir şişe içinde karıştırın Üstte kalan sıvı kısımdaki ve ekstre edilmesi mümkündür. </li><li> Toprak askıya kadar yavaşça karıştırarak veya dönen karıştırın ve toprak sediment, tipik olarak 30 dakika yerleşmek için izin verir. </li><li> Toprak sediment enkaz kaldırmak için yerçekimi filtrasyon ile filtre kağıdı ile &quot;toprak özü&quot; geçirin. </li><li> LB tozu eklenir ve bir% 2 solüsyon (200 mi toprak özü 4 gr LB toz) yapmak için karıştırın. </li><li> Steril bir süzüntü elde etmek için vakum filtrasyonu ile 0.22 um filtre içinden solüsyonu geçirir. Mümkünse, hemen 2.7 adıma devam. Uygun bir faj partiküllerinin, mağaza devam etmeden önce bir hafta kadar 4 ° C &#39;de numuneler, süzüldü olması gereken, ancak, sayıazalacaktır. </li><li> Kısım birden fazla aseptik teknikler kullanılarak bölmeli kültür şişeleri çalkalama sterilize ayrı 250 ml&#39;lik filtre ile sterilize edilmiş LB / kir özü karışımı, 50 ml bölümleri. Farklı Arthrobacter fajlar farklı CaCl2 koşullar altında en iyi şekilde büyür beri istenen nihai konsantrasyonlarda (0-50 mM), steril 2.0 M CaCl2 çözeltisi ekleyin. NOT: Biz, bize tarafından tanımlanan Arthrobacter fajların çoğunluğu 1 mM-2.5 mM CaCl2 aralığında olduğunu bulmak. Ancak, izole fajların birkaç çok yüksek CaCl2 konsantrasyonlarda 0 mM CaCl2 .ya münhasıran bizim büyüdü. 3.1 adıma hemen geçin. </li></ol> 3. Faj İzolasyonu <ol><li> Şişesinden her geç / erken üslü durağan faz bakteri kültürü 1-2,5 ml ilave edilir. 0,5-0,7 bir OD 600 için, hücreler 1 ml kullanılır. 0.7 OD &#39;den daha yüksek bir OD 600 için 2.5 ml kullanmakHücreler. Not: üslü büyüme fazında hücreler, tipik olarak daha fazla bağlanma fajlarından durağan fazı büyümesinde hücrelerden daha yüksek titrelerini üretmek. </li><li> Bir çalkalama inkübatör içinde yaklaşık 24 saat süreyle 30 ° C&#39;de 250 rpm&#39;de çalkalama. </li><li> 24 saatlik bir kuluçka süresinden sonra çalkalama inkübatör zenginleştirme şişeler çıkarın ve zenginleştirme numuneleri faj tamponu içinde on kat seyreltilir. </li><li> Geç / erken üslü durağan faz bakteri kültürü 0.5 ml kültür tüpleri kurmak ve çeşitli zenginleştirme kültür miktarda kültür tüplerine (PB 10 -1 konsantrasyondan 500 ul 5 ul) ilave edin. NOT: Her toprak örneği zenginleştirme sonra farklı faj titreleri üretir beri konsantrasyonlarının geniş bir yelpazede test etmek önerilir. </li><li> Orijinal zenginleştirme şişede konsantrasyonu mevcut bir nihai konsantrasyon eşit hale getirmek için, kültür tüplerine CaCl2 ekleyin. W çok faj seçmek için farklı CaCl2 bir konsantrasyonu kullanaraki CaCl2 bağımlılıkları değişen. NOT: Çoğu fajlar 1-2.5 mM CaCl2 aralığında izole edilecektir, ancak 0-50 mM CaCl2 konsantrasyonları her yerde en iyi şekilde izole fajlar vardır. Bu nedenle bu eşsiz izole Arthrobacter fajların sayısını arttırmak için CaCl2 konsantrasyonlarının bir dizi kontrol etmek en iyisidir. </li><li> Kültür tüpü içinde LB üst agar 4,5 ml karıştırın ve LB agar plakası üzerine dökün. Eşit plaka üzerinde dağıtılması ve yaklaşık 15 dakika boyunca katılaşması üst agar sağlamak için hafifçe karıştırılır. Not: Agar büyük gruplar (250 mi) ve ilave üst agar hazırlanabilir en oda sıcaklığında depolanır ve en az iki hafta, daha sonraki deneyler için yeniden kullanılabilir. Üst ağarı yapmak için kullanılan çeşitli formüller vardır, ancak biz LB ile karıştırılır agar 7 gr / L kullanılan agar üst yapmak Bir 60 ° C su banyosu içinde yer üst agar bir deney sırasında, sıvı durumunu korumak için. </li><li> Haricindekileri to plaka ve istenilen sıcaklıkta 48 saat için (sıcaklık 30 ° C) göre O / N inkübe edin. Mevcut fajlarla için optimize etmek bu koşullar Vary. En çok izole fajlar 24 saatlik bir kuluçka döneminden sonra 1-2.5 mM CaCl2 konsantrasyonunda 30 ° C &#39;de kuluçkaya yatırılmıştır gelir. </li></ol> 4. Faj Arıtma <ol><li> Plakalar üzerinde plak oluşumu için 24 saat inkübasyon kontrolünden sonra. Hiçbir plaklar belirgin eğer kadar 72 saat inkübasyon devam veya ek plaklar görünüp görünmeyeceğini belirlemek için. Bir haftaya kadar 4 ° C&#39;de önce usul için varsayılan plaklarla, mağaza plakaları Gerekirse. NOT: Bu bir plaka üzerinde farklı plak morfolojileri çeşitli bulmak için nadir değildir. 3 gün inkübasyondan sonra, plaklar bulmak mümkündür, ancak çok nadirdir. </li><li> Çizgi plak yöntemi kullanılarak açık bir şekilde izole plaklardan istenen fajları arındırın. Steril tahta sopa ile bir plaket dokunun. Streak, bir alev ile bir tahta sopa çalışan allowin tarafından plakg sopa kısaca serin ve Şekil 1&#39;de gösterildiği gibi daha sonra yumuşak hareket agar plaka üzerinde sopa ovuşturarak. Her geçişte için temiz bir sopa kullanarak bu işlemi tekrarlayın için. </li><li> Seçenek olarak ise, tek tek faj plakları izole edilmesi için geleneksel bir plak titre deneyi kullanmaktadır. Plak titre deneyi, faj plak izolasyonu için Petri plakaları gibi LB agar ve LB üst agar ve malzeme daha fazla reaktifler kullanılmasını gerektirir. Biz çizgi plak yöntemi kullanılarak son derece başarılı olmuştur ama o plak titre testi kullanılarak bireysel plaklar izole etmek teknik olarak daha kolaydır. </li><li> LB agar plakası üzerine en az üç kez çizgili sonra, farazi faj partiküllerinin en düşük konsantrasyon alanı işareti ve yavaşça üst levha, kalsiyum klorür, aynı konsantrasyonunu içeren (Arthrobacter, 0.5 ml erimiş LB üst agar 4,5 ml uygulamak ) ve plaka boyunca eşit yaymak için izin verir. </li><li> Ters çevirin ve / N plaka O kuluçkaya yatmaktadır. Çizgi plak tekrarlayınsaf faj türü sağlamak üzere en az üç tekrarı için teknik izole edilir. Faj canlılığı kaybı olmadan çizgiler arasında gerekli bir haftaya kadar olduğu gibi 4 ° C&#39;de muhafaza plakalar. </li><li> İstenilen plaklar son çizgi plaka üzerinde yetiştirilen ve izole edilmiş, bir mikropipet ucu ile bir iyi izole plak dokunun ve 100 ul PB yeniden askıya. Seri taze PB 180 ul içine numune 20 ul geçerek 10 -8 seyreltme bu 10 0 çözüm sulandırmak. </li><li> Faj izole etmek için kullanılan CaCI2 aynı konsantrasyonunu içeren erimiş LB üst agar 4.5 ml ile enfekte bakteri karıştırarak 10 dakika oda sıcaklığında ve plaka 5 için, bir kültür tübü içinde yetiştirilen Arthrobacter 0.5 ml için seyreltilerin her birine, 10 ul ekle Orijinal toprak örneğinden. Ertesi güne kadar 4 ° C &#39;de yapılan tüm seyreltiler kaydedin. </li><li> Geleneksel plak titresi olarak kullanarak bir web desen yapmak için gerekli faj seri seyreltme belirleyinsöylüyorlar. Plak titre Bu analizin amacı bir web model plakası elde etmek üzere gerekli olan, faj titresi belirlemektir. Çoğunlukla bakteri yoksun ancak henüz fajlarla tarafından parçalanır henüz bakteri kalıntıları içeren bir web desen plaka tanımlama. Steril bir 50 ml kültür şişesine geç / erken üslü sabit Arthrobacter kültürünün 5 ml ilave edilir. <ol><li> Kültür şişesi içinde seyreltilmesi (yani Arthrobacter kültürü için bir web deseni veren) 100 ul ilave edin ve faj, oda sıcaklığında 5-10 dakika boyunca bakteri hücreleri enfekte etmek için izin verir. Başlangıçta faj belirlemek ve 10 taze LB plakaları üzerine Bu karışımın 5 ml levha için kullanılan CaCI2 aynı konsantrasyonunu içeren erimiş LB üst agar ile karıştırılır. Katılaşmaya ve 30 ° C&#39;de ters plakaları inkübe izin verin. </li></ol></li><li> Bir sonraki gün, 4 ° C&#39;de PB ve mağaza O / N, 5 ml ya da oda sıcaklığında 4 saat web model plakalarını sel. </li><li> 0.22 um&#39;lik bir şırınga filtreden geçirilmiştir faj lizatı Filtreve 4 ° C&#39;de depolayın. Bu faj partiküllerinin elektron mikroskobu görüntüler, standart prosedürler kullanılarak, DNA kısıtlama enzimi analizi ve genomik dizileme için faj genomik DNA izolasyonu gibi ek deneyler için bu son faj stoku kullanın. Faj stokunun uzun süreli depolama için -80 ° C &#39;de hazır arşivleme için küçük şişelerde steril gliserol faj lizatının eşit miktarını ekleyin. NOT: Bu faj teknikleri ile deneyimli olanlar için büyük bir kaynak çevrimiçi erişilebilir www.phagesdb.org sitesidir. </li></ol>

<ol><li>Shapir, N., Mongodin, E. F., Sadowsky, M. J., Daugherty, S. C., Nelson, K. E., Wackett, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+Catabolic+Pathways%3A+Genomic+Insights+into+Microbial+s-Triazine+Metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Evolution of Catabolic Pathways: Genomic Insights into Microbial s-Triazine Metabolism.</a> J Bacteriol. 189 (3), 674-682 (2007).</li>
<li>Qingyan, L., Ying, L., Xikun, Z., Baoli, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Characterization+of+Atrazine+Degrading+Arthrobacter+sp.+AD26+and+Use+of+this+Strain+in+Bioremediation+of+Contaminated+Soil%5BTitle%5D)+AND+%22J+Environ+Sci%22%5BJournal%5D)">Isolation and Characterization of Atrazine Degrading Arthrobacter sp. AD26 and Use of this Strain in Bioremediation of Contaminated Soil.</a> J Environ Sci. 20, 1226-1230 (2008).</li>
<li>Wang, J., Zhu, L., Liu, A., Ma, T., Wang, Q., Xie, H., Wang, J., Jiang, T., Zhao, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+an+Arthrobacter+sp.+Strain+HB-5+that+Transforms+Atrazine%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Geochem+Hlth%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of an Arthrobacter sp. Strain HB-5 that Transforms Atrazine.</a> Environ Geochem Hlth. 33, 259-266 (2011).</li>
<li>Mages, I. S., Frodl, R., Bernard, K. A., Funke, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identities+of+Arthrobacter+spp.+And+Arthrobacter-Like+Bacteria+Encountered+in+Human+Clinical+Specimens%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Identities of Arthrobacter spp. And Arthrobacter-Like Bacteria Encountered in Human Clinical Specimens.</a> J Clin Microbiol. 46 (9), 2980-2986 (2008).</li>
<li>Brown, D. R., Holt, J. G., Pattee, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Characterization+of+Arthrobacter+Bacteriophages+and+Their+Application+to+Phage+Typing+of+Soil+Arthrobacters%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Isolation and Characterization of Arthrobacter Bacteriophages and Their Application to Phage Typing of Soil Arthrobacters.</a> Appl Environ Microbiol. 35 (1), 185-191 (1978).</li>
<li>Petrovski, S., Seviour, R. J., Tillett, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevention+of+Gordonia+and+Nocardia+Stabilized+Foam+Formation+by+Using+Bacteriophage+GTE7%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Prevention of Gordonia and Nocardia Stabilized Foam Formation by Using Bacteriophage GTE7.</a> Appl Environ Microbiol. 77 (21), 7864-7867 (2011).</li>
<li>Le Marrec, C., Moreau, S., Loury, S., Blanco, C., Trautwetter, a <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+Characterization+of+Site-specific+Integration+Functions+of+phi+AAU2+infecting+%E2%80%9CArthrobacter+aureus%E2%80%9D+C70%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Genetic Characterization of Site-specific Integration Functions of phi AAU2 infecting “Arthrobacter aureus” C70.</a> J Bacteriology. 178 (7), 1996-2004 (1996).</li>
<li>Casida, L. E., Liu, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arthrobacter+globiformis+and+Its+Bacteriophage+in+Soil%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Arthrobacter globiformis and Its Bacteriophage in Soil.</a> J Appl Microbiol. 28 (6), 951-959 (1974).</li>
<li>Einck, K. H., Pattee, P. A., Holt, J. G., Hagedorn, C., Miller, J. A., Berryhill, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Characterization+of+a+Bacteriophage+of+Arthrobacter+globiformis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Isolation and Characterization of a Bacteriophage of Arthrobacter globiformis.</a> J Virol. 12 (5), 1031-1033 (1973).</li>
<li>Twest, R., Kropinski, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacteriophage+Enrichment+from+Soil+and+Water%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Bio%22%5BJournal%5D)">Bacteriophage Enrichment from Soil and Water.</a> Methods Mol Bio. 501, 15-21 (2009).</li>
<li>Fullner, K. J., Hatfull, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycobacteriophage+L5+Infection+of+Mycobacterium+bovis+BCG%3A+Implications+for+Phage+Genetics+in+the+Slow-growing+Mycobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Mycobacteriophage L5 Infection of Mycobacterium bovis BCG: Implications for Phage Genetics in the Slow-growing Mycobacteria.</a> Mol Microbiol. 26 (4), 755-766 (1997).</li>
<li>Robb, S. M., Woods, D. R., Robb, F. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phage+Growth+Characteristics+on+Stationary+Phase+Achromobacter+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Virol%22%5BJournal%5D)">Phage Growth Characteristics on Stationary Phase Achromobacter cells.</a> J Gen Virol. 41 (2), 265-272 (1978).</li>
<li>Bolger-Munro, M., Cheung, K., Fang, A., Wang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T4+Bacteriophage+Average+Burst+Size+Varies+with+Escherichia+coli+B23+Cell+Culture+Age%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Microbiology+and+Immunology%22%5BJournal%5D)">T4 Bacteriophage Average Burst Size Varies with Escherichia coli B23 Cell Culture Age.</a> Journal of Experimental Microbiology and Immunology. 17, 115-119 (2013).</li>
<li>MacWilliams, M. P., Liao, M. K. Luria Broth (LB) and Luria Agar, Media and Their Uses Protocol. ASM MicrobeLibrary. , Available from:
 
 <a target="_blank" href="http://www.microbelibrary.org/library/laboratory-test/3020-luria-broth-lb-and-luria-agar-la-media-and-their-uses-escherichia-coli">http://www.microbelibrary.org/library/laboratory-test/3020-luria-broth-lb-and-luria-agar-la-media-and-their-uses-escherichia-coli</a> (2013).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarını beyan ederim.

Birçok önceki girişimleri Arthrobacter ana enfekte edebilen fajları izole etmek rağmen, biz standart zenginleştirme prosedürleri kullanarak küçük bir başarı vardı. geliştirilmiş ve çevresel örneklerden fajları zenginleştirmek için van Twest ve Kropinski 10 tarafından uyarlanan bakteriyel zenginleşme genelleştirilmiş yöntem zenginleştirme prosedürleri çoğunluğu için temel kalır. Önceki çalışmalarda elde edilen kanıtlar doğrudan kaplama yöntemleri izolasyonu 5 çok düşük başarı oranları ile o...

Toprak ortamlarında Arthrobacter türlerinin yaygınlığı konak bakteri bu türün izole edilebilen fajların geniş bir dizi ve çeşitlilik sunuyor. Acintobacteriaceae ailesinin Bakteriyel üyeleri atrazin ve diğer çeşitli pestisitler ve herbisitler 1,2,3 gibi inatçı bileşiklerin aşağılayıcı onların katabolik yollar için en önemli olan. Çoğu araştırma Arthrobacter çevresel suşları kullanılarak yapılmıştır olsa, bu cinsin klinik izolatları kan, idrar, göz, ve tüm filogenetik heterojeniteye 4 görüntülendiği diğer birçok insan kaynaklar bulunur. Arthrobacter bakteriler üzerine bir araştırma oldukça geniş gövde varken, sadece bir kaç çalışmalar bu farklı cinsin üyelerine enfekte edebilen fajlarla rapor. İlginçtir ama, Arthrobacter daha önce yapılan çalışmalar &lt;tür toprak yazarak gibi çeşitli anahtar farklı konularda dokunur Enterobacteria fajıem&gt; Arthrobacter türleri aktif çamur arıtma tesislerinde 6 zararlı köpük azaltılması, ve şantiye özgü rekombinasyon ve integraz genleri 7 vurgulayarak amacıyla 5, endüstriyel kullanımlar. Çeşitli zenginleştirme tekniği protokolleri saf faj Arthrobacter türlerinde izolatlarının oluşturmak için istihdam edilmiştir. Erken prosedürler sadece enfekte A. yeteneğine fajlarla 8 yıl bir aşkın veren yükseliş dönemleri için nikotin tuzları gibi ilave toksik ajanlar ile toprak inkubasyon dahil globiformis. Kararsız organik plak tahlil teknikleri ile tespit fajları üretmek için ortaya ile toprak kullanılarak yapılan çalışmalar uzun kuluçka dönemleri 8 atlayarak, percolated. İlginçtir ama, direkt kaplama benzeyen bir teknik düşük başarı oranları ile geçmiş çalışmaları gerekçe, hala araştırmacılar 5 tarafından özellikle düşük başarı oranına sahip olurken birkaç fajlarla sebebiyet veren geçmişte kullanılan <s&gt; 8 kadar. Genel olarak, geçmişte kullanılan izolasyon teknikleri, en sık aerobik toprak temsil Arthrobacter cins rağmen pratikte çok az etkinlik olması için önemli olan doğada 4,9 yılında izole, su ve topraktan fajları izole Van Twest ve Kropinski 10 mevcut zenginleştirme yöntemleri Çevre bakteriyel izolatları ancak bu zenginleştirme teknikleri zenginleştirmek için kullanılan teknikler daha önceki adapte Arthrobacter fajları izole verimsiz kanıtladı. Burada anlatılan yöntemin amacı, erken zenginleştirme yöntemleri tutarlı ve etkin bir şekilde bu bakteriyel cinsten fajları izole ilişkili önceki teknik zorlukların üstesinden, Arthrobacter fajları izole adapte edilebilir &quot;kavramının kanıtı&quot; göstermektir.

<table><tbody><tr><td>LB Et suyu tozu</td><td>Fisher</td><td>BP9722-2</td><td>Bunları toplu olarak sipariş etmek en iyisidir.</td></tr><tr><td>Granül Agar</td><td>Fisher</td><td>BP1423-2</td><td>Bunları toplu olarak sipariş etmek en iyisidir.</td></tr><tr><td>0.22 um şırınga filtreleri</td><td>Fisher</td><td>09-719A</td><td></td></tr><tr><td>0.22 um buchner filtreleri</td><td>Fisher</td><td>430320</td><td>Alıcı tüpün dikkatlice değiştirilmesiyle 50 ml'den fazla sıvı elde edilebilir.</td></tr><tr><td>Eppendorf Tüpleri</td><td>Fisher</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>5 ml pipetler ayrı</td><td>Fisher</td><td>13-678-11D</td><td></td></tr><tr><td>50 ml konik tüpler</td><td>Fisher</td><td>76002844</td><td></td></tr><tr><td>15 ml konik tüpler</td><td>Fisher</td><td>76002845</td><td></td></tr><tr><td>10 ml pipetler ayrı</td><td>Fisher</td><td>13-676-10J</td><td></td></tr><tr><td>25 ml pipetler ayrı</td><td>Fisher</td><td>13-676-10K</td><td></td></tr><tr><td>Whatman kalitatif filtre kağıdı</td><td>Fisher</td><td>1001-824</td><td></td></tr></tbody></table>

yalıtım için bir optimize zenginleştirme tekniği<em&gt; arthrobacter</em&gt; bakteriyofaj türlerinin toprak numune İzolatlarının gelen

An Optimized Enrichment Technique for the Isolation of Arthrobacter Bacteriophage Species from Soil Sample Isolates

Çevresel örneklerden bakteriyofaj izolasyonu, mikrobiyolojinin öncüleri tarafından ortaya konan ilkeler kullanılarak onlarca yıldır gerçekleştirilmektedir. Arthrobacter konakçılarını enfekte eden fajların izolasyonu, belki de önceki birçok izolasyon tekniğinin düşük başarı oranı nedeniyle sınırlı kalmıştır ve bu da çalışma için yeterince temsil edilmeyen bir Arthrobacter faj grubu ile sonuçlanmıştır. Burada açıklanan zenginleştirme tekniği, diğerlerinden farklı olarak, indikatör bakteri büyümesinin temeli olarak kirletici bakteri içermeyen filtrelenmiş bir ekstrakt kullanır, Arthrobactersp. Özellikle KY3901. İlk olarak toprak bakterilerini uzaklaştırarak, hedef fajlar, ilk toprak örneklerinde bulunan doğal toprak bakterileri ile rekabet tarafından engellenmez. Bu zenginleştirme yöntemi, birkaç farklı toprak tipinden düzinelerce benzersiz faj ile sonuçlanmış ve hatta aynı zenginleştirilmiş toprak örneği izolatından farklı tipte fajlar üretmiştir. Bu prosedürün kullanımı, çok çeşitli ilginç konakçı bakterilerde fajların izolasyonu için besin açısından zengin aerobik ortamların çoğuna genişletilebilir.

Arthrobacter fajlar için geliştirilmiş zenginleştirme tekniği tekrarlanabilirlik göstermek için, 30 farklı toprak örnekleri eşsiz Arthrobacter fajlar, bu zenginleştirme kullanılarak toplanan toprak örneklerinin 22 elde edilen bu 30 toprak örneklerinin Of 2014 yılı ilkbahar ve yaz aylarında farklı zamanlarda ve yerlerde kullanılan prosedür. Standart zenginleştirme işlemi aynı toprak örneklerinin 3 benzersiz fajları vermiştir. Zenginleştirme örnekleri plaklar veya plaklar başarılı bir şekilde saptanması ...

Arthrobacter cinsindeki bakterileri enfekte eden bakteriyofajların izolasyonu için bir zenginleştirme protokolü sunuyoruz. Bu zenginleştirme protokolü, Arthrobacter fajlarının toprak izolatlarından izolasyonu ve amplifikasyonu için hızlı ve tekrarlanabilir sonuçlar üretir.

Yalıtım için bir optimize Zenginleştirme Tekniği<em&gt; Arthrobacter</em&gt; Bakteriyofaj Türlerinin Toprak Numune İzolatlarının gelen

Bacteriophage isolation from environmental samples has been performed for decades using principles set forth by pioneers in microbiology. The isolation of ...

Bu prosedürün genel amacı, bir zenginleştirme protokolü kullanarak toprak örneklerinden arthrobacter bakteri fajlarını izole etmektir. Bu işlem, öncelikle toprak örneklerinin toplanması ve kontamine toprak mikroorganizmalarından canlı faj partiküllerinin izole edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım ise, izole edilen faj partikülleri ile konakçı arthrobacter bakteri hücrelerinin enfekte edilmesidir.Ardından, plak oluşumuyla kanıtlanan fajları belirlemek için enfekte olmuş bakteri hücreleri agar plaklara ekilir. Son adım, çizgi ekim yöntemi kullanılarak belirgin şekilde izole edilmiş plaklardan istenen fajların saflaştırılmasıdır. Nihayetinde bu zenginleştirme tekniği, arthrobacter türü KY 3 9 0 1'den arthrobacter fajlarının nispeten kolay izolasyonu için optimize edilmiştir.Bu tekniğin mevcut zenginleştirme yöntemlerine göre temel avantajı, rakip bakterilerin büyümesini önlemek için ince filtrelenmiş bir toprak örneğinin, konakçı bakterilerin saf kültürüne eklenmesidir. Bu yöntemin arthrobacter fajlarının izolasyonunda etkili olduğu kanıtlanmış olsa da, diğer bakteri konakçılarından faj izolasyonu için de uygulanabilir olmalıdır. Bu yönteme dair ilk fikri, diğer araştırmacıların arthrobacter fajlarını bulmakta zorlandıklarını öğrendiğimizde geliştirdik.Geleneksel zenginleştirme teknikleriyle. Öğrencilerim, arthrobacter fajlarını başarıyla izole etmek için kullanılan teknikleri uygulamalı olarak gösterecekler. Arthrobacter hücreleri, bir LB agar plağına ekilen kolonilerden kültüre edilir ve iki ila üç gün boyunca 30 °C'de inkübe edilir.Steril bir öze kullanarak bir koloni alın ve 50 mililitre lb broth içerisine ekleyin. Çalkalamalı inkübatörde, baffled kültür flaskı içerisinde 30 degrees Celsius sıcaklıkta ve 225 RPM hızda yaklaşık 24 saat boyunca inkübe edin. Bu işlem, faj enfeksiyon deneyleri için eksponansiyel veya erken stasyoner faz hücreleri elde etmek amacıyla yapılır.Hücrelerin orta ila geç stasyoner büyüme evresine girmesini önlemek için bakteriyel büyüme durumunu yakından izleyin. Faj izolasyonu için ideal OD 600 değeri 0,5 ile 0,7 arasındadır. Arthrobacter cinsindeki bakteriler yaygın toprak bakterileri olduğundan, hem bu bakteriler hem de onlara enfekte olan fajlar çoğu toprak türünde bulunabilir.İstenilen konumdan 200 ila 400 gram toprak toplayın. Yeterince büyük beherlere alınan toprağa, süpernatantta en az 200 mililitre faj tamponu kalacak ve bu kısmın ekstrakte edilebilecek şekilde olması için en az 400 mililitre faj tamponu ekleyin; toprak süspande olana kadar nazikçe karıştırarak veya çalkalayarak karıştırın ve toprak sedimentinin genellikle 30 dakika boyunca çökmesini bekleyin. Ardından, toprak ekstraktını vakum filtrasyonu ile filtre kağıdından geçirerek toprak sediment kalıntılarını uzaklaştırın.Süzülmüş toprak ekstraktının 200 mililitresine dört gram LB tozu ekleyin ve %2'lik bir çözelti hazırlamak için karıştırın. Steril bir filtrat elde etmek için çözeltiyi vakum filtrasyonu ile 0,22 mikronluk bir filtreden geçirin. Mümkünse, hemen bir sonraki adıma geçin.Yine de, gerekirse filtreli örnekler, işleme devam etmeden önce dört °C'de bir haftaya kadar saklanabilir. Ancak, canlı faj partikülleri sayısının azalacağı göz önünde bulundurulmalıdır. Aseptik teknikler kullanarak, filtre sterilize edilmiş LB toprak özütü karışımını, her biri 50 mL olacak şekilde tekil 250 mL'lik steril, çalkalamalı, baffelli kültür erlenlerine paylaştırın. Nihai istenen konsantrasyonlara ulaşmak için steril 2.0 M kalsiyum klorür çözeltisi ekleyin.Farklı arthrobacter fajları farklı kalsiyum klorür koşulları altında optimal şekilde büyüdüğünden, bu prosedüre filtre sterilize edilmiş LB toprak özütü karışımı içeren her bir erlene 1 ila 2,5 mililitre geç eksponansiyel veya erken stasyoner faz bakteri kültürü ekleyerek başlayın. Kültürün OD 600 değeri 0,5 ila 0,7 arasındaysa 1 mililitre kullanın. OD 600 değeri 0,7'den yüksekse 2,5 mililitre kullanın.Erlenmayerleri bir çalkalayıcı inkübatörde 30 °C'de, yaklaşık 24 saat boyunca 250 RPM hızında çalkalayın. 24 saatlik inkübasyon süresinin ardından, zenginleştirme erlenmayerlerini çalkalayıcı inkübatörden çıkarın. Zenginleştirme örneklerini faj tamponu ile on kat seyreltin.Kültür tüplerini 0,5 milliliters geç eksponansiyel veya erken stasyoner faz bakteri kültürü ile hazırlayın. Dilüe edilmiş zenginleştirme kültüründen 5 microliters ile 500 microliters arasında değişen miktarları kültür tüplerine ekleyin.Kültür tüplerine, beş mililitredeki son konsantrasyon orijinal zenginleştirme balonundaki konsantrasyona eşit olacak şekilde kalsiyum klorür ekleyin. Farklı kalsiyum klorür bağımlılıklarına sahip birçok fajı seçmek için çeşitli kalsiyum klorür konsantrasyonları kullanın. Her kültür tüpüne 4,5 mililitre LB üst agar ekleyin ve karışımı bir LB agar plakasına dökün.Plaka üzerine eşit şekilde dağılması için hafifçe çalkalayın ve üst agar tabakasının yaklaşık 15 dakika boyunca katılaşmasını bekleyin. Plakaları ters çevirin ve 30 °C'de gece boyunca veya 48 saate kadar inkübe edin. Mevcut fajlar için optimize etmek amacıyla inkübasyon sürelerini değiştirin; 24 saatlik inkübasyonun ardından plakalarda plak oluşumunu kontrol edin.İzole edilen fajların çoğu, 24 saatlik bir inkübasyon süresinin ardından 1 ila 2,5 milimolar kalsiyum klorür konsantrasyonunda 30 derece Celsius'ta inkübe edilen plakalardan elde edilir; istenen fajların belirgin şekilde izole edilmiş plaklardan ahşap bir çubuk kullanılarak saflaştırılması bu prosedürün en zor kısmıdır. Plakları, homojen bir çizgi ekim plakası oluşturmak için agar plakı üzerinde nazikçe yaymak için teknik uzmanlık gereklidir. Ahşap bir çubuğu alevden geçirerek ve soğumasını sağlayarak sterilize edin.Steril ahşap çubukla bir plağa hafifçe dokunun ve çubuğu, gösterildiği gibi nazik hareketlerle auger plakası üzerinde gezdirin. Her geçiş için temiz bir çubuk kullanarak bu işlemi tekrarlayın. LB auger plakası en az üç kez çizildikten sonra, varsayılan fage partiküllerinin en düşük konsantrasyona sahip olduğu alanı işaretleyin.İşaretli bölgeye nazikçe 0.5 milliliters arthrobacter ve 4.5 milliliters ergimiş LB üst agar uygulayın ve plaka üzerine eşit şekilde yayılmasını sağlayın. Üst agarın katılaşması için en az bir saat bekleyin; plaka katılaştığında ters çevirin ve gece boyunca inkübe edin. Saf bir faj türünün izole edildiğinden emin olmak için çizgili plak tekniğini en az üç kez tekrarlayın.Plaklar, çizgileme işlemleri arasında ihtiyaç duyulduğunda, faj canlılığında belirgin bir kayıp olmadan dört derece Celsius'ta bir haftaya kadar saklanabilir. İstenen plaklar son çizgileme plağında büyütülüp izole edildikten sonra, iyi izole edilmiş bir plağa mikropipet ucuyla dokunup 100 microliters faj tamponunda yeniden süspande edin. Numuneden 20 microliters'ı 180 microliters taze faj tamponuna aktararak bu çözeltiyi 10 to the minus eighth dilüsyonuna kadar seri olarak seyreltin. Her dilüsyondan 10 microliters'ı, bir kültür tüpündeki 0.5 milliliters büyütülmüş arthrobacter'e ekleyip oda sıcaklığında beş ila 10 dakika bekletin.Ardından, enfekte bakterileri, orijinal toprak örneğinden fajı izole etmek için kullanılan kalsiyum klorür konsantrasyonuyla aynı konsantrasyona sahip 4,5 mililitre eritilmiş LB üst agar ile karıştırarak plaklara ekin. Plakları gece boyunca inkübe edin. Hazırlanan tüm dilüsyonları ertesi güne kadar dört derece Celsius'ta saklayın.Geleneksel plak titrasyon testi kullanarak ağ deseni oluşturmak için gereken fago tahıl seyreltmesini belirleyin. Ağ deseni plakasını, çoğunlukla bakteriden arınmış ancak henüz fago tarafından etkilenmemiş bakteri kalıntıları içeren plaka olarak tanımlayın. Steril 50 mililitrelik bir kültür balonuna beş mililitre geç eksponansiyel veya erken stasyoner evredeki arthrobacter kültürü ekleyin.Arthrobacter kültürüne, ağ yapısı veren dilüsyondan 100 µL ekleyin ve fajların bakteri hücrelerini 5 ila 10 dakika boyunca enfekte etmesine izin verin. Oda sıcaklığında, eriyik LB üst agar içeren balona, faj plakasını başlangıçta tanımlamak için kullanılanla aynı konsantrasyonda kalsiyum klorür ekleyin. Bu karışımdan 5 mL'yi 10 adet taze LB plakasının her birine dökün.Üst agar tabakasının katılaşmasına izin verdikten sonra, plakaları ters çevirip 30 °C'de gece boyunca inkübe edin; ertesi gün, ağ yapılı plakaların her birini beş mL fago tamponu ile doldurun ve gece boyunca 4 °C'de saklayın. Fago lizatını 0,22 µm'lik bir şırınga filtresinden süzün. Bu nihai fago stokunu uzun süreli saklama için 4 °C'de muhafaza edin.Bu videoda gösterilen zenginleştirme prosedüründe, stok arşivleme için eşit miktarda faj lizatını küçük viallerdeki steril gliserole ekleyin; başlangıç zenginleştirmesi ve LB agar üzerine ekimden sonra saf faj popülasyonlarını izole etmek için kullanılan plak çizgi yöntemi gösterilmiştir. Oda sıcaklığında, 30 °C ve 37 °C'de faj DI için plakların izolasyonundan elde edilen temsili sonuçlar sunulmuştur. İki plaktaki kırmızı daireler, net bir şekilde izole edilmiş plakları çevrelemektedir. Faj Dylan, üç farklı sıcaklıkta benzer plaklar oluşturur.Alternatif olarak, saf bir faj izolatı elde etmek için geleneksel standart plak titrasyon testi kullanılabilir. Bu test, burada faj titrasyon sayılarını ve bir plak üzerinde ağ şeklinde bir örüntü oluşturmak için gerekli plak oluşum birimi sayısını ampirik olarak belirlemek amacıyla kullanılmıştır. Faj banana için hazırlanan bir seri dilüsyon seti, uygun bir ağ örüntüsünün nasıl görünmesi gerektiğine dair bir örnekle birlikte gösterilmiştir.Bunlar, zenginleştirme tekniği kullanılarak izole edilen 20 arthrobacter fajının elektron mikrograf görüntüleri olup; şu an izole edilmiş olan 25 fajdan 23'ü oldukça uzun kuyruklu sifovirüslerdir. İzole edilen fajlardan ikisi ise baş çapları kuyruk uzunluklarına benzer olan miyovirüslerdir.Zenginleştirme plaklama yöntemi uzmanlaşmış olduğunda, çeşitli toprak örneklerinden arthrobacter fajlarının başarılı bir şekilde izole edilmesini sağlamalıdır. Bu videoyu izledikten sonra, çevresel bir toprak örneğinden çizgi ekim yöntemi kullanılarak fajların nasıl saflaştırılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

an-optimized-enrichment-technique-for-isolation-arthrobacter

Research

JoVE Journal

Environment

Çevre

Kaynak: Watson, DC, et.al. Escherichia coli ve Diğer Bakterilerden Hücre Dışı Veziküllerin Ölçeklenebilir İzolasyonu ve Saflaştırılması. J. Vis. Uzm. (2021)Bu video, genetiği değiştirilmiş bakterilerin dış zarından türetilen hücre dışı veziküllerin (EV'ler) izolasyonunu ve konsantrasyonunu göstermektedir. İşlem, EV'leri serbest bırakmak için bakterilerin kültürlenmesini, ardından hücreleri ve kalıntıları uzaklaştırmak için sıralı santrifüjleme ve filtreleme adımlarını içerir. Son olarak,...

Dış Zar Kaynaklı Hücre Dışı Veziküllerin Bakterilerden İzolasyonu ve Zenginleştirilmesi

Kaynak: Cross, T. ve ark., Arthrobacter bakteriofag türlerinin toprak örnek izolatlarından izolasyonu için optimize edilmiş zenginleştirme tekniği. J. Vis. Exp.(2015)Bu video, bakteriyofaj üretimi için bakteriyel kültürün hazırlanmasını göstermektedir. Bu aşama, bir toprak bakterisinin şaşkın bir şişeye aşılanması, havalandırma ve sallanma yoluyla eşit büyümeyi teşvik etme ve optik yoğunluk ölçümleriyle hücre yoğunluğunu izleme adımlarını kapsar. Kültür optimal büyüme aşamasına ulaştığında,...

Bakteriyofaj Enfeksiyonu İçin Toprak Bakteriyel Kültürü Hazırlanıyor

Source: Cross, T., et al. An Optimized Enrichment Technique for the Isolation of Arthrobacter Bacteriophage Species from Soil Sample Isolates. J. Vis. Exp.(2015)This video demonstrates the isolation of bacteriophages from a soil sample. A soil sample is collected and suspended in a phage buffer and allowed to settle the sediment. The extract is filtered, and nutrients are added. A vacuum filtration is done to remove microbial contaminants. The filtrate with phages is aliquoted into flasks, and...

Isolation of Bacteriophages from a Soil Sample

Source: Cross, T., et al. An Optimized Enrichment Technique for the Isolation of Arthrobacter Bacteriophage Species from Soil Sample Isolates. J. Vis. Exp. (2015).This video demonstrates the isolation of Arthrobacter bacteriophages from a soil sample using enrichment and plaque assay techniques. It highlights the infection, amplification, and visualization of phages as clear lysis zones formed on a bacterial lawn.

Isolation of Arthrobacter Bacteriophages from a Soil Sample

Bu doğal sularda da uygulanabilir magnetotactic bakteriler (MTB) toplamak için bir yöntem göstermektedir. MTB izole ve bakteri doğal manyetizma yararlanır nispeten basit bir kurulumu kullanarak sediment örneklerinin zenginleştirilebilir. İzole MTB sonra ışık ve elektron mikroskobu kullanarak hem ayrıntılı olarak incelenebilir.

Doğal Çevre gelen Magnetotactic Bakteri meydana gelen toplanması, İzolasyon ve Zenginleştirme

Bakteriler, biyoaktif biyolojik moleküller taşıyan nanometre boyutunda hücre dışı veziküller (EV'ler) salgılarlar. EV araştırması, biyogenezlerini, mikrop-mikrop ve konakçı-mikrop etkileşimlerindeki rollerini ve bunların potansiyel terapötik uygulamalarını anlamaya odaklanmaktadır. EV araştırmalarının standardizasyonunu kolaylaştırmak için EV'lerin çeşitli bakterilerden ölçeklenebilir izolasyonu için bir iş akışı sunulmaktadır.

Ölçeklenebilir İzolasyon ve Escherichia coli ve Diğer Bakterilerden Hücre Dışı Veziküllerin Saflaştırılması

Entomopatojenik mantar kolonileri, Tenebrio yemi, Galleria yemi ve seçici yapay ortam, yani kloramfenikol, tiyabendazol ve sikloheksimid (CTC ortamı) ile desteklenmiş maya özü ile zenginleştirilmiş patates dekstroz agarı kullanılarak tropikal toprak örneklerinden izole edilir.

Entomopatojenik mantarları toprak örneklerinden izole etme yöntemlerinin karşılaştırılması

Ağır metale dayanıklı mikropların jeotermal kaynaklardan izole edilmesi, biyoremediasyon ve çevresel izleme biyosistemlerinin geliştirilmesi için sıcak bir konudur. Bu çalışma, kaplıcalardan ağır metal toleranslı bakterilerin izole edilmesi ve tanımlanması için metodolojik bir yaklaşım sunmaktadır.

Çevre Kirliliğini Ele Almak için Ekstremofilik Mikroorganizmaların Biyoprospektifi

Burada, düşük moleküler ağırlıklı hücre dışı DNA oranını artırarak çevresel antimikrobiyal direnci (AMR) değerlendirmek için basit bir teknik sunuyoruz. % 20 -% 30 PEG ve 1.2 M NaCl ile önceki tedavi, hem genomik hem de yatay olarak transfer edilen AMR genlerinin saptanmasına izin verir. Protokol, ek optimizasyon ile kitsiz bir sürece uygundur.

Antimikrobiyal Direncin Kapsamlı Değerlendirmesi için Atık Sudan Düşük Moleküler Ağırlıklı DNA'nın Gelişmiş Ekstraksiyonu 

Burada, siyanofajları (ve konakçılarını) izole etmek için deniz ve tatlı su ekosistemlerinin öfotik bölgelerinden örnekleme yöntemlerini ve tek genotipleri zenginleştiren ve virüs-konak etkileşim dinamiklerini karakterize eden örnekleme sonrası süreçleri açıklıyoruz.

Fotosentetik Mikropların ve Virüslerinin Çevresel Örneklemesi: Tarladan Laboratuvara

Keşfedin Arthrobacter bakteriyofajlarını toprak örneklerinden izole etmek için optimize edilmiş bir zenginleştirme protokolü. Bu yöntem, mikrobiyoloji ve faj tedavisi araştırmalarında hızlı ve tekrarlanabilir sonuçlar sağlar.

Yalıtım için bir optimize Zenginleştirme Tekniği

Daha fazla video keşfet