Yalıtım için bir optimize Zenginleştirme Tekniği Arthrobacter Bakteriyofaj Türlerinin Toprak Numune İzolatlarının gelen

Bu prosedürün genel amacı, bir zenginleştirme protokolü kullanarak toprak örneklerinden artrobakter bakteri fazlarını izole etmektir. Bu, önce toprak örneklerinin toplanması ve canlı faj parçacıklarının kirletici toprak mikroorganizmalarından izole edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, konakçı artrobakter bakteri hücrelerini izole edilen faj partikülleri ile enfekte etmektir.

Daha sonra enfekte olmuş bakteri hücreleri, plak oluşumu ile kanıtlandığı gibi fajı tanımlamak için burgu plakaları üzerine kaplanır. Son adım, çizgi plakası yöntemini kullanarak istenen fajları açıkça izole edilmiş plaklardan saflaştırmaktır. Sonuç olarak, bu zenginleştirme tekniği, arthrobacter fajlarının arthrobacter türlerinden KY 3 9 0 1'den nispeten kolay izolasyonu için optimize edilmiştir.

Bu tekniğin mevcut zenginleştirme yöntemlerine göre ana avantajı, rakip bakterilerin büyümesini önlemek için saf bir konakçı bakteri kültürüne ince filtrelenmiş bir toprak örneğinin eklenmesidir. Bu yöntemin arthrobacter fajlarının izolasyonu için etkili olduğu kanıtlanmış olsa da, fajların diğer bakteri konakçılarından izolasyonu için uygulanabilir olmalıdır. Bu yöntem için ilk olarak, diğer araştırmacıların arthrobacter fajlarını bulmakta zorluk çektiğini öğrendiğimizde aklımıza geldi.

Geleneksel zenginleştirme teknikleri ile. Öğrencilerim, arthrobacter fajlarını başarılı bir şekilde izole etmek için kullanılan teknikleri gösterecekler. Arthrobacter hücreleri, bir LB burgu plakası üzerine çizilmiş kolonilerden kültürlenir ve iki ila üç gün boyunca 30 santigrat derecede inkübe edilir.

Bir koloni seçmek için steril bir halka kullanın ve 50 mililitre lb et suyuna ekleyin. Şaşkın bir kültürde, şişeyi yaklaşık 24 saat boyunca 30 santigrat derecede 225 RPM'de çalkalanan bir inkübatörde inkübe edin. Faj enfeksiyonu deneyleri için üstel veya erken durağan faz hücreleri elde etmek.

Hücrelerin orta ila geç durağan büyümeye girmesini önlemek için bakteri üreme durumunu yakından izleyin. Devlet. Faj izolasyonu için ideal OD 600 0,5 ile 0,7 arasındadır. Arthrobacter cinsindeki bakteriler yaygın toprak bakterileri olduğundan, bunlar ve onları enfekte eden fajlar çoğu toprak türünde bulunabilir.

İstenilen yerden 200 ila 400 gram toprak toplayın. Yeterince büyük bir beherde toprağa en az 400 mililitre faj tamponu ekleyin, böylece en az 200 mililitre faj tamponu süpernatantta olur ve toprak askıya alınana kadar hafifçe karıştırılarak veya döndürülerek ekstrakte edilebilir, toprak askıya alınır ve toprak tortusunun tipik olarak 30 dakika boyunca çökelmesine izin verir. Daha sonra, toprak ekstraktını vakumlu filtrasyon ile bir filtre kağıdından geçirerek toprak tortusu kalıntılarını temizleyin.

200 mililitre filtrelenmiş toprak ekstraktına dört gram LB tozu ekleyin ve% 2'lik bir çözelti elde etmek için karıştırın. Steril bir filtrat elde etmek için çözeltiyi vakum filtrasyonu ile 0.22 mikronluk bir filtreden geçirin. Mümkünse hemen bir sonraki adıma geçin.

Bununla birlikte, gerekirse, filtrelenmiş numuneler, devam etmeden önce bir haftaya kadar dört santigrat derecede saklanabilir. Bununla birlikte, canlı faj parçacıklarının sayısı, filtrenin sterilize edilmiş LB toprak özü karışımının 50 mililitrelik çoklu kısımlarını ayrı ayrı 250 mililitreye septik teknikler kullanılarak azaltılacaktır. Sterilize edilmiş çalkalama, şaşkın kültür şişeleri, istenen nihai konsantrasyonlara steril 2.0 molar kalsiyum klorür çözeltisi ekler.

Farklı artrobakter fajları farklı kalsiyum klorür koşulları altında en iyi şekilde büyüdüğünden, filtre ile sterilize edilmiş LB toprak özü karışımı içeren şişelerin her birine bir ila 2,5 mililitre geç üstel veya erken durağan faz bakteri kültürü ekleyerek bu işleme başlayın. Kültürün OD 600'ü 0,5 ila 0,7 ise, bir mililitre kullanın. OD 600 0,7'den yüksekse, 2,5 mililitre kullanın.

Şişeleri çalkalama inkübatöründe yaklaşık 24 saat boyunca 30 santigrat derecede 250 RPM'de çalkalayın. 24 saatlik inkübasyon süresinden sonra, zenginleştirme şişelerini çalkalama inkübatöründen çıkarın. Zenginleştirme örneklerini faj tamponunda on kat seyreltin.

0,5 mililitre geç üstel veya erken sabit olan kültür tüplerini ayarlayın. Faz bakteri kültürü. Seyreltilmiş zenginleştirme kültüründen beş mikrolitreden 500 mikrolitreye kadar çeşitli miktarlarda kültür tüplerine ekleyin.

Orijinal zenginleştirme şişesinde bulunan konsantrasyona eşit beş mililitrede nihai bir konsantrasyon elde etmek için kültür tüplerine kalsiyum klorür ekleyin. Farklı kalsiyum klorür bağımlılıklarına sahip birçok faj seçmek için bir dizi farklı kalsiyum klorür konsantrasyonu kullanın. Her kültür tüpüne 4,5 mililitre LB üst burgu ekleyin ve karışımı bir LB burgu plakasına dökün.

Plakaya eşit olarak dağıtmak için hafifçe döndürün ve üst burgunun yaklaşık 15 dakika katılaşmasına izin verin. Plakaları ters çevirin ve gece boyunca 30 santigrat derecede 48 saate kadar inkübe edin. 24 saatlik bir inkübasyondan sonra mevcut fajları optimize etmek için inkübasyon sürelerini değiştirin, plakalarda plak oluşumunu kontrol edin.

İzole edilmiş fajların çoğu, 24 saatlik bir inkübasyon süresinden sonra bir ila 2.5 milimolar kalsiyum klorür konsantrasyonunda 30 santigrat derecede inkübe edilen plakalardan gelir, Bu prosedürün en zorlu kısmı olarak tahta bir çubuk kullanarak istenen fajları açıkça izole edilmiş plaklardan arındırır. Düzgün bir çizgi plakası üretmek için plakaları burgu plakası boyunca nazikçe yaymak için teknik uzmanlık gereklidir. Tahta bir çubuğu alevden geçirerek ve soğumaya bırakarak sterilize edin.

Steril tahta çubukla bir plağa kısa bir süre dokunun ve çubuğu gösterildiği gibi yumuşak hareketlerle burgu plakasına sürün. Her geçiş için temiz bir çubuk kullanarak bunu tekrarlayın. LB burgu plakası en az üç kez çizildikten sonra, varsayılan faj parçacıklarının en düşük konsantrasyonuna sahip alanı işaretleyin.

İşaretli alana 0,5 mililitre arthrobacter ve 4,5 mililitre erimiş LB üst burgu uygulayın ve plakaya eşit şekilde yayılmasına izin verin. Plaka katılaştığında üst burgunun en az bir saat katılaşmasına izin verin, ters çevirin ve gece boyunca inkübe edin. Saf bir faj türünün izole edildiğinden emin olmak için çizgi plak tekniğini en az üç yineleme boyunca tekrarlayın.

Plakalar, önemli bir faj canlılığı kaybı olmadan, çizgiler arasında gerektiği gibi bir haftaya kadar dört santigrat derecede saklanabilir. İstenilen plaklar büyütüldükten ve son çizgi plakasında izole edildikten sonra, iyi izole edilmiş bir plağa bir mikro pipet ucuyla dokunun ve 100 mikrolitre faj tamponunda seri olarak yeniden süspanse edin Bu çözeltiyi, numunenin 20 mikrolitresini 180 mikrolitre taze faj tamponuna geçirerek 10 ila eksi sekizinci seyreltmeye kadar seyreltin. Oda sıcaklığında beş ila 10 dakika boyunca bir kültür tüpünde 0.5 mililitre büyümüş arthrobacter'e her seyreltmeden 10 mikrolitre ekleyin.

Daha sonra, enfekte olmuş bakterileri, fajı orijinal toprak örneğinden izole etmek için kullanılan aynı konsantrasyonda kalsiyum klorür içeren 4.5 mililitre erimiş LB üst burgu ile karıştırarak plakalayın. Plakaları gece boyunca inkübe edin. Dört santigrat derecede yapılan tüm seyreltmeyi ertesi güne kadar saklayın.

Geleneksel plak titresi tahlilini kullanarak bir ağ deseni oluşturmak için gereken faj tahıl seyreltmesini belirleyin. Çoğunlukla bakteri içermeyen, ancak henüz fajlar tarafından bağlanmamış bakteri kalıntıları içeren bir ağ deseni plakasını tanımlayın. Steril 50 mililitrelik bir kültür şişesine beş mililitre geç üstel veya erken durağan artrobakter kültürü ekleyin.

Arthrobacter kültürüne bir ağ deseni veren 100 mikrolitre seyreltme ekleyin ve fajların bakteri hücrelerini beş ila 10 dakika boyunca enfekte etmesine izin verin. Oda sıcaklığında, başlangıçta faj plakasını tanımlamak için kullanılanla aynı konsantrasyonda kalsiyum klorür içeren şişeye erimiş lb üst burgu ekleyin. Bu karışımdan beş mililitre, 10 taze LB plakasının her birine.

Üst burgunun ertesi gün gece boyunca plakaları 30 santigrat derecede katılaşmasına, ters çevirmesine ve kuluçkaya yatırmasına izin verdikten sonra, ağ desen plakalarını plaka başına beş mililitre faj tamponu ile doldurun ve gece boyunca dört santigrat derecede saklayın. Faj lizatını 0.22 mikronluk bir şırınga filtresinden süzün. Bu son faj stoğunu uzun süreli depolama için dört santigrat derecede saklayın.

Eksi 80 santigrat derecede stok arşivleme için küçük şişelerde steril gliserole eşit miktarda faj lizatı ekleyin Bu videoda gösterilen zenginleştirme prosedüründe, ilk zenginleştirmeden sonra saf faj popülasyonlarını izole etmek için plak çizgi yöntemi ve LB burgu üzerinde kaplama, oda sıcaklığında faj DI için plakların izolasyonundan elde edilen temsili sonuçlardır, 30 santigrat derece ve 37 santigrat derece. Plakaların ikisindeki kırmızı daireler, açıkça izole edilmiş plakları çevrelemektedir. Faj Dylan, üç farklı sıcaklıkta benzer plaklar üretir.

Alternatif olarak, saf bir faj izolatını izole etmek için geleneksel bir standart plak titresi testi kullanılabilir. Bu tahlil burada, bir plaka üzerinde bir dokuma deseni oluşturmak için faj titresi sayılarını ve plak oluşturan birimlerin sayısını ampirik olarak belirlemek için kullanıldı. Faj muzu için bir dizi seri seyreltme, iyi bir web deseninin nasıl görünmesi gerektiğine dair bir örnekle gösterilmiştir.

Bunlar, zenginleştirme tekniği kullanılarak izole edilen 20 artrobakter fajının elektron mikrografik görüntüleridir. Şu anda izole edilmiş 25 fajdan 23'ü oldukça uzun kuyruklu cifo virüsleridir. İzole edilen fajlardan ikisi, kuyruklarınınkine benzer uzunlukta kafa çapları içeren myo virüsleridir.

Bir kez ustalaştıktan sonra, zenginleştirme kaplaması, arthrobacter fajlarının çeşitli toprak örneklerinden başarılı bir şekilde izole edilmesine izin vermelidir. Bu videoyu izledikten sonra, çevresel bir toprak örneğinden çizgi boya yönteminde kullanılan fajın nasıl saflaştırılacağını iyi anlamış olmalısınız.