İyon seçici Kendinden referans Mikroelektrod Tekniği Ekstraselüler Ion eriticiler Ölçümü

Bu prosedürün genel amacı, iyon seçici kendi referanslı mikro elektrot tekniğini kullanarak in vivo hücre dışı iyon akılarını ölçmektir. Bu işlem, öncelikle iyon seçici ve referans mikro elektrotların monte edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım ise iyon seçici kendi referanslı mikro elektrotların kalibre edilmesi ve doğrulanmasıdır.

Ardından, biyolojik örnek üzerinde iyon spesifik akış ölçümleri voltaj kayıtları şeklinde yapılır. Son olarak, voltaj kaydı iyon akışına dönüştürülür. Nihayetinde bu teknik, canlı hücrelerde veya dokularda spesifik hücre dışı iyon akışlarının invaziv olmayan şekilde doğru ölçülmesine olanak tanır.

Bu yöntem, rejenerasyon veya patolojinin yanı sıra fizyoloji veya yaşlanma ile ilgili temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Örneğin bu yöntem, doku morfogenezi büyümesi veya diferansiyasyonu gibi biyolojik süreçleri kontrol eden spesifik iyon akışlarının tanımlanmasını sağlar. Bu prosedürü, doktora sonrası araştırmacı Dr. Gim Ardi ve Dr. Benjas laboratuvarı gerçekleştirecektir. Elektrot kalibrasyonundan önce, bir milimetrelik altın erkek konnektör ve gümüş klorür kaplı gümüş tele sahip bir mikro elektrot tutucuya önceden doldurulmuş bir iyon seçici elektrot yerleştirin.

Ardından, mikro elektrot tutucusunu üç eksenli bilgisayar kontrollü elektronik bir mikro konumlandırıcıya takın. İyon seçici elektrodun kendisi, elektroliti ve ilgilenilen iyonlara yönelik iyonfor kokteyl çözeltisini önceden içermelidir. Montaj tamamlandıktan sonra elektrot, bir milimolar potasyum klorür içeren bir çözeltiye daldırılmalıdır.

Ek olarak, agar içinde üç molar tuz çözeltisi, gümüş klorür kaplı bir gümüş pelet ve referans elektrot için iki milimetrelik altın erkek konnektör içeren düz bir mikro elektrot tutucuya referans elektrodu yerleştirin. Tuz çözeltisinin seçimi, ölçülecek iyon türüne bağlıdır. Referans elektrot hazırlandıktan sonra, elektrot tutucusunu manyetik bir stand üzerine önceden monte edilmiş manuel bir mikro konumlandırıcıya takın.

Montaj tamamlandıktan sonra, elektrot bir millimolar potasyum klorür içeren bir çözeltiye daldırılmalıdır. Başlamadan önce, iyon seçici elektrot düzeneği için ilgilenilen iyonları içeren bir elektrolit kalibrasyon standartları dilüsyon serisi hazırlanmalıdır. Örneğin, potasyum katyonlarının yaklaşık bir millimolar düzeyindeki fizyolojik konsantrasyonda tespit edilmesi isteniyorsa; 10, 1 ve 0,1 millimolar değerlerinde üç logaritmik seriden oluşan potasyum klorür çözeltileri hazırlayın.

Bu durum, analiz için gerekli olan tespit dinamik aralığını maksimize eder. İyon seçici elektrodu kalibre etmek için, hem iyon seçici hem de referans elektrotları, bu durumda 0.1 millimolar olan en düşük konsantrasyonlu kalibrasyon çözeltisine daldırarak başlayın. Oda sıcaklığında bir ila üç dakikalık kısa bir stabilizasyon süresinden sonra, kararlı durum voltajını ölçün ve kaydedin.

Voltaj ölçümlerini geri kalan kalibrasyon standartları için tekrarlayın ve ölçülen voltajları molar iyon konsantrasyonlarının logaritmasına karşı grafiğe dökün. Her bir standart çözelti için, kalibrasyon eğrisinin N eğimi, kesim noktası ve kareli değerlerini belirlemek amacıyla doğrusal regresyon uygulayın. Nernst eğimini hesaplamak için, ölçülen voltajları voltaj amplifikatörünün toplam kazancına bölmeyi unutmayın.

Ölçüm protokolünü göstermek için, perforize edilmiş bir kurbağa oositiyle potasyum iyon akısı, potasyum duyarlı bir mikroelektrot kullanılarak karakterize edilecektir. İyon seçici elektrot kurulumuna başlamadan önce, 800 mikronluk naylon bir ağdan bir santimetrelik bir parça kesin ve bunu plastik bir Petri kabına yapıştırın. Ayrıca, şu formülasyona sahip Mark modifiyeli Ringer çözeltisini önceden hazırlayın: 100 millimolar sodyum klorür, iki molar potasyum klorür, iki millimolar kalsiyum klorür, bir millimolar magnezyum klorür ve beş millimolar HEPES. Tamponun pH değerini sodyum hidroksit ile 7.5'e ayarlayın ve hazırlanan tampondan bir alikotu Petri kabına ekleyin.

Kurbağa hücresini, iyon seçici elektrodu ve referans elektrodu dikkatlice Petri kabına yerleştirin. Ardından hücreyi perforaj yapın ve iyon seçici elektrot örneğe yaklaşık 10 mikron uzaklıkta olacak şekilde mikro konumlandırıcıyı çalıştırın. Terminoloji açısından, örnek ile elektrot arasındaki mevcut mesafe "yakın konum" olarak adlandırılacaktır.

Ardından, iyon seçici elektrodun 10 mikronluk yakın konumdan 100 mikronluk daha uzak bir konuma periyodik olarak geçmesini ve ardından 0,3 hertz hızla, yani her 10 saniyede üç tam tur yapacak şekilde yakın konuma geri dönmesini sağlayacak şekilde mikro konumlandırıcıyı çalıştırın. Mikro konumlandırıcı aktivasyonu sırasında, elektrodun hareketinin hücrenin yaralı teğetsel yüzeyine gerçekten dik olduğunu doğrulayın ve voltaj ölçüm ve kayıt yazılımını etkinleştirin. Mikro konumlandırıcı, voltaj verileri toplanırken yakın ve uzak konumlarda kısa süreliğine duraklayacak şekilde programlanmıştır.

Oosit yara iyileşmesi sırasında veriler sürekli olarak kaydedilir; bu işlem, opus iribaş kuyruk rejenerasyonu sırasındaki çok günlük süreçlerin gözlemlenmesi gibi daha uzun süreli deneylerde yaklaşık 15 dakika sürerken, ölçümler farklı zaman noktalarında iki dakika boyunca kaydedilir. Örneğin; 1, 3, 6, 12 ve 24. saatlerde. Deney tamamlandığında, voltaj verilerini bir metin dosyası olarak dışa aktarın ve değerleri bir hesap tablosuna kopyalayın.

Ölçülen voltaj değerlerini karşılık gelen iyon konsantrasyonlarına dönüştürmek için önceden belirlenmiş kalibrasyon eğrisini kullanın. Ekstrapole edilen iyon konsantrasyonlarını, biyolojik örnekten olan uzaklığın bir fonksiyonu olarak grafiğe dökün. Son olarak, sabit difüzyon yasasını kullanarak iyon akısını hesaplayın.

Burada C çözeltideki iyon konsantrasyonu, MU iyon mobilitesi ve DC DX ise dx mesafesindeki konsantrasyon farkıdır. Biyolojik deneylerden önce, NER eğim kesişim değeri ve iyon seçici elektrot için kalibrasyon eğrisinin tamamı, bir Petri kabına yerleştirilmiş bir molar iyon kaynağından üretilen yapay bir iyon gradyanı ile valide edilebilir. Potasyum iyonu konsantrasyonlarındaki değişimler, yara bölgesine yakın veya uzak bir mesafede grafiğe döküldüğünde.

Veriler, hücresel yaralanmanın başlangıcında kitlesel bir potasyum akış olayının meydana geldiğini ve yara iyileşmesi ilerledikçe, potasyum akışının yaranın tamamen iyileştiği 15 dakika sonra kademeli olarak sükunet seviyelerine geri döndüğünü göstermektedir. Ayrıca, ölçülen potasyum iyon konsantrasyonları iyon akışına dönüştürüldüğünde, yaralanma sonrası potasyum akışındaki ani artış ve kademeli azalış, bozulmamış bir kontrol oosit ile karşılaştırıldığında istatistiksel olarak anlamlı bir etki olarak görünmektedir. Bu prosedürün ardından, hücreler arası ve hücre altı iyon akışlarının özelliklerine ilişkin ek soruları yanıtlamak amacıyla floresan biyoelektrik etiketleme gibi diğer yöntemler uygulanabilir.