Name: Biliyer odaklı Karaciğer Rejenerasyon Eğitim Zebra balığı hepatosite özgü Ablasyon (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: Öğrenin, zebrafish hepatosit ablasyonu ile safra yolu kaynaklı karaciğer rejenerasyonunu incelemeyi. Metronidazol ile transgenik larvaları tedavi ederek karaciğer biyolojisindeki kritik sorulara yanıt bulun.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar tartışmaları için Dr. Hukriede ve Tsang'a teşekkür eder. M.K., NIH eğitim bursu (T32EB001026) ile desteklendi. Bu çalışma kısmen Amerikan Karaciğer Vakfı, March of Dimes Vakfı (5-FY12-39) ve NIH'den (DK101426) DS'ye verilen hibelerle desteklenmiştir.

Zebra balığı, standart prosedüre göre kaldırdı ve yetiştirilen; Deneyler Pittsburgh Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu Üniversitesi tarafından onaylanmıştır. Embriyolar / larva hazırlanması 1. <ol><li> Zamanlanmış çiftleşmelerin kurmak yetişkin erkek ve bayan Tg (fabp10a: CFP-NTR) yürütmek için s931 hemizigot veya homozigot balıklar O / N ve aralarında bir bölücü yerleştirin. Çiftleşme istendiğinde bu bölücü ertesi sabah çıkarın. Ince plastik örgü süzgeç kullanarak suyun süzme ile embriyolar toplayın. </li><li> Baş aşağı süzgeci çevirin ve bir sıkmak şişe dağıtılan yumurta su ince bir dere ile örgü yüzeyi durulayın. Yumurta 25 ml su ile birlikte 100 mm petri kabı içine 100 embriyolar aktarın. Petri başına en fazla 100 embriyolar tutun ve 28 ° C&#39;de onları yükseltmek. </li><li> Pigmentasyon inhibe etmek için, 10 saat sonrası fertilizasyon (hpf) öncesinde petri kutularının içine feniltiyoüre (PTU) ekleyin ve e yükseltmek80 hpf kadar mbryos / larva. PTU nihai konsantrasyonu 0.2 mM&#39;dir. DİKKAT: PTU zehirlidir. Uygun kullanım talimatlarına uygun olarak kullanın. </li><li> Petri tabaklara, 0.016% bir nihai konsantrasyonda, 3-amino-benzoik asit etil ester (Tricaine) eklenerek larvaları anestezisi. Sonra bir Epifloresans mikroskop, sıralama CFP-pozitif larvaları kullanılarak. Benzer bir karaciğer boyutu ile larvaları kullanın ve daha küçük veya daha büyük karaciğer olanlar atın. NOT: hemizigot ve homozigoz larvaları arasındaki hepatosit ablasyon ölçüde bir fark yoktur, çünkü herhangi bir CFP pozitif larvaları, bağımsız olarak yoğunluğu, kullanılabilir. DİKKAT: tricaine toksiktir. Uygun kullanım talimatlarına uygun olarak kullanın. </li><li> Tricaine içeren yumurta suyu çıkarın ve 0.2 mM PTU ile desteklenmiş yumurta su ekleyin. 28 ° C embriyolar / larva tutun. </li></ol> 2. Mtz Tedavisi <ol><li> In 1 Mtz tozu 0.171 g çözülmesiyle taze 10 mM Mtz çözeltisi hazırlayın00 ml yumurta su% 0.2 DMSO ve 0.2 mM PTU ile desteklenmiş. Tamamen MTZ çözünmesi için 20-30 dakika süreyle hızlı bir şekilde karıştırılarak oda sıcaklığında çözelti karıştırılır. MTZ hazırlarken MTZ çözünür yardımcı olmak ve larva haline Mtz nüfuz artırmak için, DMSO ekleyin. DİKKAT: Uzun süreli maruz kalma veya MTZ artan konsantrasyon zehirlidir. Uygun kullanım talimatlarına uygun olarak kullanın. </li><li> İki farklı 100 mm petri veya çok plaka içine larva istenen sayıda transfer ederek kontrolü ve deneysel gruba larvaları ayırın. Deney grubunda, 10 mM Mtz çözeltisi içinde larvaları tutmak; Kontrol grubu için,% 0.2 DMSO içeren yumurta su saklayın. </li><li> Plakaları veya MTZ foto etkisiz hale getirilmesinin önlenmesi için alüminyum folyo ile Mtz çözeltisi ihtiva eden petri çanakları Kapak, ve 28 ° C&#39;de inkübe edilir. Mtz tedavi süresi larva aşamasında ve transjenik hattı bağlıdır. </li><li> Benzer şiddetli hepatosit ablasyonu gözlemlemek için <em&gt; Tg (fabp10a: CFP-NTR) hattı, (36 saat süreyle) ya da 5 dpf&#39;e itibaren (24 saat süreyle) ya 3.5 gün sonrası fertilizasyon (dpf) den Mtz çözümü ile larva davranın. </li></ol> Safra odaklı Karaciğer Yenilenme 3. Analiz <ol><li> Ablasyon süresinin sonunda, plakalardan Mtz uzaklaştırın. Yumurta 25 ml su ekleyerek Mtz ile tedavi edilen larvalar yıkayın. Yumurta su atılmadan önce larva yıkamak için plaka 2-3 kez girdap. Üç kez tekrarlayın ve sonra bir kez daha yumurta suya larva batırmayın. Larva hareketsiz hale getirmek için,% 0.008 bir nihai konsantrasyonda, Tricaine daha düşük bir konsantrasyonda ekleyin Mtz-, muamele edilmiş larvalarda, kalp ödem ve larva ölümü önlemek için. </li><li> Karaciğer analizi için, OBP filtreli bir Epifloresans mikroskop altında Mtz tedavi edilen larvaların karaciğer boyutunu incelemek. Göreceli karaciğer boyutuna göre hepatosit ablasyon düzeylerini değerlendirmek: Büyük (non-ablasyon;% 0-10 larva), orta (kısmen ablasyon; 02/10% 0), ve tam ablasyon (çok küçük;% 80-90). </li><li> Olmayan ablasyon veya kısmen ablazeydi karaciğerler ile larva çıkarın. Sadece şiddetli hepatosit ablasyon göstergesidir küçük bir karaciğer ile larva tutmak. Rejenerasyon 0 saat zaman noktasında (R0h) karaciğer analizi için, Mtz arınma ve OBP sıralama sonra larva hasat. Aksi takdirde, hasat için hazır olana kadar 0.2 mM PTU ile desteklenmiş yumurta su sıralanır larva tutun. </li><li> 1.5 ml mikrosantrifüj tüp içine hasat larvaları aktarın ve PEM tamponunda% 3 formaldehit tespit çözeltisi ile yumurta suyu değiştirin. Çevirici göre O / N 4 ° C&#39;de inkübe edin tüpü. </li><li> PBSDT 1 ml sabitleme çözeltisi yerine ve 5 dakika rotator larvaları içeren tüp döndürün. </li><li> Elle mikroskop altında yumurta sarısı ve göğüs yüzgeçleri kaldırmak, bir 100 mm petri PBSDT içeren ve forseps kullanarak içine sabit larva aktarın. 1.5 ml tüp içine 20 disseke larva tp kadar aktarın. </li> &lt;li&gt; bloke çözeltinin 1 ml&#39;si ile PBSDT çözeltisi yerine ve 2 saat boyunca oda sıcaklığında, bir döndürücü üzerinde tüp sallayın. </li><li> Primer antikorları içeren çözüm engelleme 100 ul ile çözüm engelleme değiştirin. Yavaş yavaş bir döndürücü göre O / N 4 ° C&#39;de tüpü sallayın. </li><li> 10 dakika, her seferinde 5 kez birincil antikor çözeltisi çıkarın ve PBSDT ile yıkayın. Daha sonra ikincil antikorlar ihtiva eden ve 2 st için oda sıcaklığında, bir döndürücü üzerine kaya bloke etme çözeltisi 100 ul ilave edin. </li><li> Bir karıştırıcı üzerine sallanarak, oda sıcaklığında 10 dakika, her seferinde PBSDT ile 5 kez yıkayın. </li><li> Bir mikroskop lamı üzerine yanal olarak larvaları Doğu ve montaj ortamı bir damla ekleyin. Dikkatlice bir cam kapak ile onları karşılamak ve bir çivi parlatıcı ile cam kapak mühür. Şimdi, konfokal mikroskopi için hazır hale gelir. </li></ol>

<ol><li>Riehle, K. J., Dan, Y. Y., Campbell, J. S., Fausto, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+concepts+in+liver+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gastroen+Hepatol%22%5BJournal%5D)">New concepts in liver regeneration.</a> J Gastroen Hepatol. 26, 203-212 (2011).</li>
<li>Fausto, N., Campbell, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+hepatocytes+and+oval+cells+in+liver+regeneration+and+repopulation%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Development%22%5BJournal%5D)">The role of hepatocytes and oval cells in liver regeneration and repopulation.</a> Mechanisms of Development. 120, 117-130 (2003).</li>
<li>Duncan, A. W., Dorrell, C., Grompe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+Cells+and+Liver+Regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Stem Cells and Liver Regeneration.</a> Gastroenterology. 137, 466-481 (2009).</li>
<li>Michalopoulos, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+regeneration%3A+Alternative+epithelial+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biochem+Cell+B%22%5BJournal%5D)">Liver regeneration: Alternative epithelial pathways.</a> Int J Biochem Cell B. 43, 173-179 (2011).</li>
<li>Falkowski, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+hepatocyte+%27buds%27+in+cirrhosis+from+intrabiliary+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+hepatology%22%5BJournal%5D)">Regeneration of hepatocyte 'buds' in cirrhosis from intrabiliary stem cells.</a> Journal of hepatology. 39, 357-364 (2003).</li>
<li>Yoon, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+Cell+Adhesion+Molecule+%28EpCAM%29+Marks+Hepatocytes+Newly+Derived+from+Stem%2FProgenitor+Cells+in+Humans%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Epithelial Cell Adhesion Molecule (EpCAM) Marks Hepatocytes Newly Derived from Stem/Progenitor Cells in Humans.</a> Hepatology. 53, 964-973 (2011).</li>
<li>Michalopoulos, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Liver regeneration.</a> J Cell Physiol. 213, 286-300 (2007).</li>
<li>Michalopoulos, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+Regeneration+after+Partial+Hepatectomy+Critical+Analysis+of+Mechanistic+Dilemmas%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Liver Regeneration after Partial Hepatectomy Critical Analysis of Mechanistic Dilemmas.</a> Am J Pathol. 176, 2-13 (2010).</li>
<li>Yanger, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+hepatocytes+are+generated+by+self-duplication+rather+than+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">Adult hepatocytes are generated by self-duplication rather than stem cell differentiation.</a> Cell stem cell. 15, 340-349 (2014).</li>
<li>Schaub, J. R., Malato, Y., Gormond, C., Willenbring, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+against+a+Stem+Cell+Origin+of+New+Hepatocytes+in+a+Common+Mouse+Model+of+Chronic+Liver+Injury%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+reports%22%5BJournal%5D)">Evidence against a Stem Cell Origin of New Hepatocytes in a Common Mouse Model of Chronic Liver Injury.</a> Cell reports. 8, 933-939 (2014).</li>
<li>Dovey, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topoisomerase+II+alpha+is+required+for+embryonic+development+and+liver+regeneration+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+cellular+biology%22%5BJournal%5D)">Topoisomerase II alpha is required for embryonic development and liver regeneration in zebrafish.</a> Molecular and cellular biology. 29, 3746-3753 (2009).</li>
<li>Goessling, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((APC+mutant+zebrafish+uncover+a+changing+temporal+requirement+for+wnt+signaling+in+liver+development%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">APC mutant zebrafish uncover a changing temporal requirement for wnt signaling in liver development.</a> Developmental Biology. 320, 161-174 (2008).</li>
<li>Sadler, K. C., Krahn, K. N., Gaur, N. A., Ukomadu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+growth+in+the+embryo+and+during+liver+regeneration+in+zebrafish+requires+the+cell+cycle+regulator%2C+uhrf1%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Liver growth in the embryo and during liver regeneration in zebrafish requires the cell cycle regulator, uhrf1.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 1570-1575 (2007).</li>
<li>Cox, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((S-nitrosothiol+signaling+regulates+liver+development+and+improves+outcome+following+toxic+liver+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+reports%22%5BJournal%5D)">S-nitrosothiol signaling regulates liver development and improves outcome following toxic liver injury.</a> Cell reports. 6, 56-69 (2014).</li>
<li>North, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PGE2-regulated+wnt+signaling+and+N-acetylcysteine+are+synergistically+hepatoprotective+in+zebrafish+acetaminophen+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">PGE2-regulated wnt signaling and N-acetylcysteine are synergistically hepatoprotective in zebrafish acetaminophen injury.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 17315-17320 (2010).</li>
<li>Curado, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+targeted+cell+ablation+in+zebrafish%3A+A+new+tool+for+regeneration+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Conditional targeted cell ablation in zebrafish: A new tool for regeneration studies.</a> Developmental Dynamics. 236, 1025-1035 (2007).</li>
<li>Pisharath, H., Rhee, J. M., Swanson, M. A., Leach, S. D., Parsons, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+ablation+of+beta+cells+in+the+embryonic+zebrafish+pancreas+using+E.+coli+nitroreductase%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">Targeted ablation of beta cells in the embryonic zebrafish pancreas using E. coli nitroreductase.</a> Mech Dev. 124, 218-229 (2007).</li>
<li>Curado, S., Stainier, D. Y. R., Anderson, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitroreductase-mediated+cell%2Ftissue+ablation+in+zebrafish%3A+a+spatially+and+temporally+controlled+ablation+method+with+applications+in+developmental+and+regeneration+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Nitroreductase-mediated cell/tissue ablation in zebrafish: a spatially and temporally controlled ablation method with applications in developmental and regeneration studies.</a> Nat Protoc. 3, 948-954 (2008).</li>
<li>Choi, T. Y., Ninov, N., Stainier, D. Y., Shin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensive+conversion+of+hepatic+biliary+epithelial+cells+to+hepatocytes+after+near+total+loss+of+hepatocytes+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Extensive conversion of hepatic biliary epithelial cells to hepatocytes after near total loss of hepatocytes in zebrafish.</a> Gastroenterology. 146, 776-788 (2014).</li>
<li>Huang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antagonistic+interaction+between+Wnt+and+Notch+activity+modulates+the+regenerative+capacity+of+a+zebrafish+fibrotic+liver+model%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Antagonistic interaction between Wnt and Notch activity modulates the regenerative capacity of a zebrafish fibrotic liver model.</a> Hepatology. , (2014).</li>
<li>He, J., Lu, H., Zou, Q., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+liver+after+extreme+hepatocyte+loss+occurs+mainly+via+biliary+transdifferentiation+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Regeneration of liver after extreme hepatocyte loss occurs mainly via biliary transdifferentiation in zebrafish.</a> Gastroenterology. 146, 789-800 (2014).</li>
<li>Sakaguchi, T. F., Sadler, K. C., Crosnier, C., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+signals+modulate+hepatocyte+apicobasal+polarization+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Endothelial signals modulate hepatocyte apicobasal polarization in zebrafish.</a> Curr Biol. 18, 1565-1571 (2008).</li>
<li>Ninov, N., Borius, M., Stainier, D. Y. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+levels+of+Notch+signaling+regulate+quiescence%2C+renewal+and+differentiation+in+pancreatic+endocrine+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Different levels of Notch signaling regulate quiescence, renewal and differentiation in pancreatic endocrine progenitors.</a> Development. 139, 1557-1567 (2012).</li>
<li>Lorent, K., Moore, J. C., Siekmann, A. F., Lawson, N., Pack, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reiterative+use+of+the+notch+signal+during+zebrafish+intrahepatic+biliary+development%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+dynamics+%3A+an+official+publication+of+the+American+Association+of+Anatomists%22%5BJournal%5D)">Reiterative use of the notch signal during zebrafish intrahepatic biliary development.</a> Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 239, 855-864 (2010).</li>
<li>Itoh, T., Miyajima, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+Regeneration+by+Stem%2FProgenitor+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Liver Regeneration by Stem/Progenitor Cells.</a> Hepatology. 59, 1617-1626 (2014).</li>
<li>Mathias, J. R., Zhang, Z., Saxena, M. T., Mumm, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+cell-specific+ablation+in+zebrafish+using+a+triple+mutant+of+Escherichia+coli+nitroreductase%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Enhanced cell-specific ablation in zebrafish using a triple mutant of Escherichia coli nitroreductase.</a> Zebrafish. 11, 85-97 (2014).</li>
<li>Stueck, A. E., Wanless, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regression+of+cirrhosis%3A+The+maturation+sequence+of+buds+arising+from+hepatocyte+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Regression of cirrhosis: The maturation sequence of buds arising from hepatocyte progenitor cells.</a> Hepatology. 58, 235A(2013).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarını olduğunu beyan ederim.

Şiddetli, ama hafif değil, hepatosit ablasyon safra odaklı karaciğer rejenerasyonu ortaya çıkarır. CFP-NTR transgen: Bu nedenle, Mtz tedavi ve annma süresini takiben, bu fabp10a gelen iç CFP floresan tespit edilebilir Mtz-, muamele edilmiş larvalarda, karaciğer boyutu incelenmesi önemlidir. Olmayan ablasyon (% 0-5) ya da kısmen (% 10-20) karaciğerler kesilip gösterecektir Mtz ile tedavi edilen larvalar küçük bir yüzdesi için, bu sıralamak ve sadece çok küçük bir karaciğer ile larvaları analiz için gere...

Karaciğer oldukça rejeneratif organdır. Karaciğer rejenerasyon sırasında, hepatositler yenileyici, karaciğer parenşimal hücrelerinin, önceden mevcut olan hepatositler (hepatosit güdümlü karaciğer rejenerasyonu) ya da becs (safra güdümlü karaciğer rejenerasyonu) 1,2 elde edilir. Karaciğer hasarı genellikle önceden varolan hepatositlerin çoğalmasını ortaya çıkarır; hepatosit çoğalması tehlikeye ancak, BECS 2-4, hepatositlerin katkıda bulunabilir. Karaciğer rejenerasyon bu iki mod klinik olarak anlamlı olan. (Nedeniyle karaciğer tümörü veya canlı donörlerde örneğin,), insan karaciğer bir kısmının cerrahi olarak çıkarılmasından sonra, geri kalan karaciğerde hepatositler kayıp karaciğer kütlesinin kurtarmak için çoğalır. BECS veya karaciğer progenitör hücrelerin (LPCs) yenileyici hepatositlere 5,6 katkıda görünecek şekilde tersine, ciddi karaciğer hastalığı olan hastalarda, hepatosit proliferasyonu büyük ölçüde tehlikeye düşer. kemirgen 2/3 kısmi hepatektomi modeli, hangihepatositler kayıp karaciğer kitle kurtarmak için çoğalırlar, önemli ölçüde hepatosit odaklı karaciğer rejenerasyonu 7,8 güncel anlayışına katkıda bulunmuştur. Ancak, yenileyici hepatositlerde ağırlıklı BECS türetilmiş olan hiçbir geçerli kemirgen modeli yoktur. Bazı kemirgen karaciğer toksini modelleri safra odaklı karaciğer rejenerasyon 2-4 belirlenmesine yol açmıştır, ancak fareler son soyu takip çalışmalar, bu modellerde 9,10 hepatositleri rejenere etmek BECS asgari bir katkı göstermektedir. Parsiyel hepatektomide 11-13 ve Acetaminophen-induced karaciğer hasarı 14,15 dahil olmak üzere, kemirgen karaciğer zedelenmesi modelleri, bazı zebra balığı uygulanır ve karaciğer rejenerasyonunda oynayan yeni genler veya yolların tespit edilmesine neden olmuştur. Ancak, hepatosit odaklı, ama BEC odaklı değil, karaciğer rejenerasyonu bu Zebra balığı karaciğer hasarı modellerinde oluşur. Bu nedenle, yeni bir karaciğer zedelenme modeli, burada BECS yoğun REGENERAT katkıdahepatositleri ing BEC odaklı karaciğer rejenerasyon daha iyi anlaşılması için gereklidir. hepatosit ablasyon modelinin genel amaçları (1) BECS yoğun yenileyici hepatositlere katkıda ve (2) BEC odaklı karaciğer rejenerasyonu altında yatan moleküler ve hücresel mekanizmaları aydınlatmak olduğu bir karaciğer hasarı modeli oluşturmak için vardır Burada anlatılan. Biz yaralanmanın şiddeti karaciğer rejenerasyonu modunu belirler hipotezi; Böylece, biz safra odaklı karaciğer rejenerasyonu ağır hepatosit hasarı üzerine başlatmak olacağını öngördü. Bu hipotezi test etmek için, bir transgen doğru, üreten bir zebra balığı karaciğer hasarı modeli geliştirdik, Tg (fabp10a: CFP-NTR) s931, son derece hepatosit özgü fabp10a altında mavi floresan proteinin (CFP) ile birleştirilmiş bakteriyel nitroredüktaz (NTR) eksprese promoteri. NTR bir sitotoksik ilaç haline toksik olmayan ön ilacı, metronidazol (Mtz) dönüştürür olduğundan, sadece amaçlanan ablates NTR-Bu durumda, hücreler 16-18 ifade hepatositler. Mtz tedavi süresini işleyerek, hepatosit ablasyon miktarı kontrol edilebilir. Bu modeli kullanarak, son zamanlarda ciddi hepatosit kaybı üzerine, BECS yoğun daha diğer iki bağımsız çalışmalarla 20,21 tarafından doğrulandı yenileyici hepatositlere 19, yol bildirdi. Bu nedenle, yukarıda belirtilen kemirgen ve Zebra balığı karaciğer hasarı modellere kıyasla, bizim hepatosit ablasyon modeli BEC odaklı karaciğer rejenerasyonu incelemek için daha avantajlıdır. Bu protokol zebrabalıkları hepatosit ablasyon modeli kullanılarak karaciğer rejenerasyonu deneyler prosedürünü tanımlamaktadır. Bu model safra güdümlü karaciğer rejenerasyonu yatan mekanizmaları belirlemek için kimyasal ekranlar bastırmak veya karaciğer rejenerasyonu artırabilir küçük molekülleri tanımlamak için uygun olacaktır.

<table><tbody><tr><td>3-amino benzoik asit etil ester (Trikain) tozu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5040</td>% <td>0.4 (15 mM) trikain stoğu yapın: Yumurta suyu ile 100 mL'ye 0.4 g trikama getirin. pH 7'ye ayarlayın.</td></tr><tr><td>Dimetil sülfoksit (DMSO)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>Metronidazol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1547</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8532</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>252549</td><td></td></tr><tr><td>Kalsiyum sülfat dihidrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3771</td><td></td></tr><tr><td>N-Feniltiüre (PTU)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>P7629</td><td></td></tr><tr><td>Montaj ortamı (Vectashield)</td><td>Vektör Laboratuvarları</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>100 x 15 mm petri kabı&nbsp;</td><td>Denville Bilimsel A.Ş.</td><td>M5300</td><td></td></tr><tr><td>şeffaf oje</td><td>Fisher Scientific</td><td>50949071</td><td></td></tr><tr><td>ince forseps</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>11251-20</td><td>Dumont #5&nbsp;</td></tr><tr><td>cam slayt</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-1</td><td></td></tr><tr><td>cam lamel</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-540-A ve 12-542-A</td><td>18 x 18 mm</td></tr><tr><td>zn-5 (fare anti-Alcam)</td><td>ZIRC</td><td>zn-5</td><td>1:10 seyreltme</td></tr><tr><td>keçi anti-Hnf4a</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-6556 (C-19)</td><td>1:50 seyreltme</td></tr><tr><td>sıçan anti-RFP</td><td>Alel Biyoteknoloji</td><td>ACT-CM-MRRFP10</td><td>1:300 seyreltme</td></tr><tr><td>AlexaFluor 647 AffiniPure Eşek Anti-keçi IgG (H + L)</td> <td>Jackson laboratuvarları</td><td>705-605-147</td><td>1:500 seyreltme</td></tr><tr><td>AlexaFluor 647 AffiniPure Goat Anti-fare IgG (H + L)</td> <td>Invitrogen</td><td>A21240</td><td>1:500 seyreltme</td></tr><tr><td>Cy3 eşek anti-sıçan IgG</td><td>Jackson laboratuvarları</td><td>712-165-150</td><td>1:500 seyreltme</td></tr><tr><td>diseksiyon mikroskobu</td><td>Leica Microsystems</td><td>S6F</td><td></td></tr><tr><td>epifloresan mikroskobu</td><td>Leica Microsystems</td><td>M205FA</td><td></td></tr><tr><td>konfokal mikroskop</td><td>Carl Zeiss</td><td>LSM700</td><td></td></tr><tr><td>yumurta suyu</td><td></td><td></td><td>0.3 g/L deniz tuzu ' Anında Okyanus' ve 0,5 mM CaSO4 damıtılmış su. 
&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; </td></tr><tr><td colspan="4">[başlık]</td></tr><tr><td>10X PBS</td><td></td><td></td><td>25.6 g Na2HPO4&orta nokta; 7H2O, 80 g NaCl, 2 g KCl, 2 g KH2PO4.&nbsp; Damıtılmış su ile 1 L'ye getirin. PH değerini ayarlayın 7.&nbsp; 121 ° C'de 20 dakika boyunca otoklav</td></tr>.<tr><td>1 x PBS'de 1X PBSDT</td><td></td><td></td><td>, %0.2 Triton X-100 ve %0.2 DMSO.</td></tr><tr><td>PEM tamponu</td><td></td><td></td><td>30.2 g BORULAR, 761 mg EGTA, 1 mM MgSO4.&nbsp; Damıtılmış su ile 1 L'ye getirin. PH 7'yi ayarlayın.</td></tr><tr><td>Bloke edici çözelti</td><td></td><td></td><td>: 1 ml ısıyla inaktive edilmiş at serumunu 9 ml 1X PBSDT ile karıştırın.</td></tr></tbody></table>

biliyer odaklı karaciğer rejenerasyon eğitim zebra balığı hepatosite özgü ablasyon

Hepatocyte-specific Ablation in Zebrafish to Study Biliary-driven Liver Regeneration

Karaciğer yenilemek için büyük bir kapasiteye sahiptir. Hepatocyte- veya safra odaklı karaciğer rejenerasyonu: Hepatositler, karaciğer parankim hücreleri, iki yoldan biriyle yeniden olabilir. Safra odaklı rejenerasyonunda, rejenere hepatositler safra epitel hücreleri (BECS) elde edilir, buna karşın, hepatosit odaklı karaciğer rejenerasyon olarak, rejenere hepatositler, önceden var olan hepatositler elde edilir. Hepatosit odaklı karaciğer rejenerasyonu için, önemli ölçüde karaciğer rejenerasyonu güncel anlayışa katkıda bulunan mükemmel kemirgen modelleri vardır. Ancak, bu tür kemirgen modeli safra odaklı karaciğer rejenerasyonu için var. Biz son zamanlarda BECS yoğun şiddetli hepatosit kaybı üzerine hepatositlere doğuran hangi bir zebrabalıkları karaciğer yaralanması modelinde bildirdi. Bu modelde, hepatositler, özellikle bir farmakogenetik ile hassa bir şekilde çıkartılır. Burada hepatositlerini aşındırılması için ve BEC odaklı karaciğer rejenerasyon süreci analiz etme yöntemlerini detaylı olarak sunuyoruz.Bu hepatosit özgü ablasyon modeli daha safra odaklı karaciğer rejenerasyon altında yatan moleküler ve hücresel mekanizmalar keşfetmek için kullanılabilir. Dahası, bu yöntemler, arttırmak ya da karaciğer rejenerasyonu bastırmak küçük molekülleri tanımlamak için kimyasal ekranlar uygulanabilir.

3.5 dpf 5 dramatik azalma karaciğer boyutu (Şekil 1B) 36 saat (A36h, A ablasyon anlamına gelmektedir) için Mtz tedavisi. CFP-NTR ve fabp10a: Mtz arınma sonra, karaciğer rejenerasyonu (R), güçlü fabp10a başlangıcı olarak kabul DsRed ifadesi 30 saat (Şekil 1B) içinde göründü. intrahepatik safra ağı BECS 22 zarda mevcut olan ALCAM ifadesi ile değerlendirildiği gibi, başlangıçta çöktü, ancak 54 saat sonra-arınma (R54h) (Şekil 1C) yeniden kurulmu...

Zebra balığı safra güdümlü karaciğer rejenerasyonunun altında yatan moleküler mekanizmaları değerlendirmeye yardımcı olmak için, nitroredüktaz eksprese eden hepatositlerin metronidazol tedavisi üzerine genetik olarak ablasyon edildiği bir karaciğer hasarı modeli oluşturduk. Bu protokolde, hepatosit ablasyonunun ve biliyer güdümlü karaciğer rejenerasyonunun nasıl ustaca manipüle edileceğini, izleneceğini ve analiz edileceğini açıklıyoruz.

Biliyer odaklı Karaciğer Rejenerasyon Eğitim Zebra balığı hepatosite özgü Ablasyon

The liver has a great capacity to regenerate. Hepatocytes, the parenchymal cells of the liver, can regenerate in one of two ways: hepatocyte- or ...

Bu prosedürün genel amacı, safra yolları kaynaklı karaciğer rejenerasyonunun analizi için zebrafishlerde hepatosit ablasyonu indüklemektir. Bu işlem, öncelikle hepatositlerinde nitro redüktaz eksprese eden transgenik larvaların metronidazol veya MTZ'ye maruz bırakılmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adımda, hepatosit ablasyon seviyesi karaciğerin göreceli boyutuna göre değerlendirilir.Son aşamadaki MTZ uygulamasının ardından, küçük bir karaciğere sahip olan ve karaciğeri ablate edilmiş bully larvaları toplanır ve nihayetinde karaciğer boyutu ile rejenerasyon halindeki karaciğerdeki karaciğer belirteçlerinin ekspresyonu, sırasıyla epi-floresan ve konfokal mikroskopi ile ölçülür. Bu tekniğin, kemirgen oval hücre aktivasyon modelleri gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, bu teknikle rejeneratif hepatositlerin ağırlıklı olarak biliyer epitel hücrelerinden türemesidir. Bu yöntem, biliyer veya karaciğer progenitör hücrelerinin karaciğer rejenerasyonuna nasıl katkıda bulunduğu gibi, karaciğer rejenerasyonu alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Genel olarak, bu yöntemi ilk kez kullanacak kişiler, ablate edilmiş ve rejenerasyon halindeki larvalarda karaciğer boyutunun değişken olması nedeniyle zorluk yaşayabilirler.Zaman ayarlı çiftleşmeler gerçekleştirmek için, yetişkin erkek ve dişi hemizigot veya homozigot balıkları aralarına bir ayırıcı koyarak gece boyunca hazırlayın. Çiftleşmenin gerçekleşmesini istediğiniz ertesi sabah ayırıcıyı kaldırın; embriyoları toplamak için ince plastik bir süzgeç kullanın, süzgeci ters çevirin ve bir sıkma şişesi yardımıyla süzgeç yüzeyini ince bir yumurta suyu akımıyla durulayın. Ardından, 100 adet kadar embriyoyu 25 milliliters yumurta suyu içeren 100 milimetrelik bir Petri kabına aktarın ve pigmentasyonu önlemek için kabı 28 degrees Celsius sıcaklıkta bekletin.Kültüre 10 saate kadar PTU ekleyin. Döllenmeden 80 saat sonrasını bekleyin. Kişiselleştirme sonrası, larvaları trica ile anestezi edin ve benzer büyüklükte karaciğerlere sahip hayvanları seçerek CFP pozitif larvaları toplamak için bir epi-floresan mikroskop kullanın.Ardından, trica yumurta suyunu PTU ile desteklenmiş taze yumurta suyu ile değiştirin ve CFP pozitif zebrafish larvalarını 28 °C'lik inkübatöre geri koyun. Zebrafish larvalarını MTZ ile işleme tabi tutmak için öncelikle uygun sayıda larvayı iki farklı kültür kabına ayırın. Deneysel larva grubunu taze hazırlanmış MTZ çözeltisinde, kontrol grubunu ise yumurta suyunda tutun.DMSO ile takviye edilmiştir. MTZ'nin foto-inaktivasyonunu önlemek için deney grubunu alüminyum folyo ile kapatın ve ablasyon süresinin sonunda her iki zebrafish larva grubunu 28 °C'de inkübe edin. Plakalardaki MTZ solüsyonunu uzaklaştırın ve MTZ ile işlem görmüş larvaları, her yıkamanın ardından yumurta suyunu dairesel hareketlerle boşaltarak 25 ml yumurta suyu ile iki ila üç kez yıkayın.Son yıkamadan sonra, MTZ ile işlem görmüş larvalarda kalp ödemi ve ölümü önlemek için önceden kullanılan trica konsantrasyonunun yarısıyla larvaları immobilize edin. Ardından, MTZ ile işlem görmüş larvaların göreceli karaciğer boyutuna dayanarak hepatosit ablasyon seviyelerini değerlendirmek için bir epi floresan mikroskobunda CFP filtresini kullanın. Larvaların %0 ila %5'ini temsil eden büyük karaciğerli zebra balıklarını ablasyon gerçekleşmemiş olarak değerlendirin.Larvaların %10 ila %20'sini oluşturan orta büyüklükte karaciğere sahip olanlar kısmi ablasyonlu, larvaların %80 ila %90'ını oluşturan çok küçük karaciğere sahip olanlar ise tam ablasyonlu olarak kabul edilir. Tüm hayvanlar sınıflandırıldıktan sonra, ablasyon uygulanmamış veya kısmi ablasyonlu karaciğerlere sahip larvalar ayıklanır ve karaciğer analizi için yalnızca şiddetli hepatosit ablasyonunu gösteren çok küçük karaciğerli zebra balıkları tutulur. Rejenerasyonun sıfırıncı saat zaman noktasında, larvalar 1.5 mL'lik bir mikro santrifüj tüpüne aktarılır.MTZ yıkama ve CFP kaynaklandırma işleminin hemen ardından, yumurta suyunu %3 formaldehit içeren MPEM tamponu ile değiştirerek dört °C'lik bir rotorda gece boyunca fikse edin. Ertesi sabah, fikse çözeltisini 1 mL PBS-T ile değiştirin ve larvaları beş dakika daha döndürün. Ardından, fikse edilmiş tüm larvaları bir diseksiyon mikroskobu altında taze PBS-T içeren 100 mm'lik bir Petri kabına aktarın ve tüm larvaların kliplenme işlemi tamamlandığında, yumurta sarısını ve pektoral yüzgeçleri manuel olarak çıkarmak için pens kullanın.En fazla 20 hayvanı 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarın ve P-B-S-D-T'yi bir mililitre bloklama çözeltisi ile değiştirin. Oda sıcaklığında rotatör üzerinde iki saat beklettikten sonra, bloklama çözeltisini 4 °C'de gece boyu inkübasyon için 100 mikrolitre primer antikor kokteyli ile değiştirin. Ertesi gün sallayarak primer antikor çözeltisini uzaklaştırın ve zebra balıklarını P-B-S-D-T ile beş kez 10 dakika boyunca yıkayın.Son yıkamanın ardından, oda sıcaklığında, sallantılı inkübatörde iki saatlik inkübasyon için 100 µL sekonder antikor ekleyin. Son olarak, larvaları az önce gösterildiği gibi beş kez P-B-S-D-T ile yıkayın. Larvaları bir mikroskop lamı üzerine yan şekilde yerleştirin ve bir damla montaj medyumu ekleyin.Ardından, her bir zebra balığını dikkatlice bir lamelles ile örtün ve lamelles'i oje ile mühürleyin. Döllenmeden sonraki 3,5 ile beşinci günler arasında 36 saat boyunca uygulanan MTZ tedavisi, karaciğer boyutunu önemli ölçüde azaltır. MTZ yıkanmasının ardından, safra epitel hücrelerinin membranındaki LCAM ekspresyonu ile değerlendirildiği üzere, 30 saat içinde güçlü bir CFP ve kırmızı ekspresyon yeniden ortaya çıkar.İntrahepatik safra ağı başlangıçta çökmektedir, ancak yıkama işleminden 54 saat sonra yeniden tesis edilmektedir; bu durum hızlı bir karaciğer rejenerasyonunu ve iyileşmeyi göstermektedir. Bu görüntülerde, karaciğerin safra epitel hücrelerinde özel olarak ifade edilen nükleer kırmızı floresan protein için transgenik olan rejenerasyon aşamasındaki hepatositler gösterilmiştir; rejenerasyondaki bu H2B-mCherry pozitif hücrelerin çoğu, rejenerasyonun 0. saatinde ve 48. saatinde HNF4α eksprese etmektedir. MTZ ile işlem görmüş CFP pozitif hepatositler, H2B-mCherry ekspresyonlarını hâlâ korumaktadır; bu durum, şiddetli hepatosit kaybı üzerine safra epitel hücrelerinin hepatositlere dönüştüğünü göstermektedir.Bu prosedürü uygularken, MTT tedavisi sonrası gerçekleşecek karaciğer rejenerasyonu için lizis işlemi geliştirildikten sonra tamamen ablate edilmiş olanları seçmeyi hatırlamak önemlidir. Bu teknik, karaciğer rejenerasyonu alanındaki araştırmacıların, karaciğer progenitör hücre kaynaklı karaciğer rejenerasyonunun altında yatan mekanizmaları keşfetmelerine yol açmıştır. Bu videoyu izledikten sonra, biliyer kaynaklı karaciğer dejenerasyonu çalışmaları için bu hepatosit spesifik operasyon modelinin nasıl kullanılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

hepatocyte-specific-ablation-zebrafish-to-study-biliary-driven-liver

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Makale, transgenik zebra balığı larvalarında metronidazol ile hepatosit ölümünü indüklemek için bir yöntem olan hedeflenen karaciğer ablasyonunu açıklamaktadır. Örnek protokol, zebra balıklarında hedeflenen karaciğer ablasyonunun oluşturulması, manipüle edilmesi ve değerlendirilmesi sürecini açıklar.

Hedeflenen Karaciğer Ablasyonu: Transgenik Zebra Balığı Larvalarında Metronidazol ile Hepatosit Ölümünün İndüklenmesi

Aşırı ekstraselüler matriks proteinlerinin birikmesi ile sürekli fibroz siroza yol açar. Alkol kötüye kullanımı, ciddi karaciğer hastalığının ana nedenlerinden biridir. Alkolün neden olduğu yaralanma üzerine hepatosit rejenerasyonunu teşvik etme mekanizmalarını ve stratejilerini incelemek için etanolün neden olduğu bir zebra balığı fibrotik karaciğer modeli oluşturduk.

Zebra balığı bir Etanol kaynaklı Fibrotik Karaciğer Modelinin Geliştirilmesi progenitör hücre-aracılı Hepatosit Rejenerasyon Eğitim

Bu protokol 24 saat boyunca% 2 etanol ile işlenmiş zebrafish larva karaciğerlerinin histolojik analizlerini tanımlamaktadır. Böyle akut etanol tedavisi hepatik steatoz ve hepatik vaskülatürün şişmesi ile sonuçlanır.

Zebra balığıda Akut Alkollü Karaciğer Hasarının Histolojik Analizi

Ribozom afinite saflaştırmanın (TRAP) çevirisi hücre tipine özgü translating mRNA'nın hızlı ve etkin bir şekilde izole edilmesini sağlar. Burada, karaciğer repopülasyonu ve TRAP bir fare modelinde hidrodinamik kuyruk-ven enjeksiyonu birleştiren bir yöntem göstermek hepatositlerin ifade profilini incelemek için.

Fare Karaciğerinde Hücre Tipine Özgü Gen Ekspresyonu Profiloluşturma

Burada larva zebra balığında karaciğer boyutunu ölçmek için bir yöntem göstermek, karaciğer büyümesi ve gelişimi üzerinde genetik ve farmakolojik manipülasyonetkilerini değerlendirmek için bir yol sağlar.

Brightfield Mikroskobu Kullanan Larva Zebrabalığında Karaciğer Boyutunun Ölçülmesi

Bu protokol, karaciğer yenilenmesinin incelenmesini sağlamak için yetişkin zebra balıklarında karaciğerin ventral lobunun çıkarılması prosedürünü açıklar.

Yetişkin Zebra Balıklarında Kısmi Hepatektomi

Burada, kolesterol fazlasının karaciğer mikroçevresi ve bağışıklık hücresi manzarası üzerindeki etkisini incelemek için alkolsüz yağlı karaciğer hastalığı (NAFLD) ile ilişkili Hepatosellüler Karsinom (HCC) zebra balığı modelinin nasıl üretileceğini sunuyoruz.

Zebra Balığında Alkolsüz Yağlı Karaciğer Hastalığına Bağlı Hepatosellüler Karsinomun Erken İlerlemesi Sırasında Karaciğer Mikroçevresinin Analizi

Burada, gentamisin enjeksiyonu ile akut böbrek hasarını indükleyerek erişkin böbrek rejenerasyonunu incelemek için güvenilir bir yöntem sunuyoruz. Yaralanmanın gentamisin dozajına ve çevre sıcaklığına bağlı olduğunu, lhx1a+'yı etiketlemek için yerinde hibridizasyon kullanarak, yeni nefronlar geliştirdiğini gösterdik.

Gentamisin Kaynaklı Sakatlık tarafından Yetişkin Zebra balığı Böbrek Rejenerasyon

Burada, yetişkin yenilenen zebra balığı kuyruk yüzgecinde dokuya özgü gen ekspresyonu elde etmek için TetON sistemini kullanmak için iş akışını özetliyoruz.

Teton Sisteminin Kullanımı Moleküler Mekanizmalar Zebra balığı Yenilenme Eğitim için

Bu protokol sürekli çevredeki dokulara bozmadan planarian gözleri (optik bardak) çıkarılması için nasıl gösterir. ya bir ensülin iğne ve şırınga kullanılarak, ya da her iki gözü göz rejenerasyon, görsel yenilenme evrimi, ve ışık kaynaklı bir davranışın temel düzenleyici mekanizmalarının soruşturma kolaylaştırmak için kesilip edilebilir.

Cerrahi Ablasyon Tahlili Planaryalar Göz Rejenerasyon incelenmesi için

Öğrenin, zebrafish hepatosit ablasyonu ile safra yolu kaynaklı karaciğer rejenerasyonunu incelemeyi. Metronidazol ile transgenik larvaları tedavi ederek karaciğer biyolojisindeki kritik sorulara yanıt bulun.

Biliyer odaklı Karaciğer Rejenerasyon Eğitim Zebra balığı hepatosite özgü Ablasyon

Daha fazla video keşfet