Biliyer odaklı Karaciğer Rejenerasyon Eğitim Zebra balığı hepatosite özgü Ablasyon

Bu prosedürün genel amacı, biliyer güdümlü karaciğer rejenerasyonunun analizi için zebra balığında hepatosit ablasyonunu indüklemektir. Bu, ilk önce hepatositlerinde nitro redüktaz eksprese eden transgenik larvaların metrona veya MTZ'ye maruz bırakılmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adımda, hepatosit ablasyon seviyesi, karaciğerin nispi boyutuna göre değerlendirilir.

Son aşamada MTZ tedavisinden sonra, küçük bir karaciğere sahip kabadayı ablasyonlu larvalar toplanır, sonuçta karaciğerin boyutu ve rejenere karaciğerdeki karaciğer belirteçlerinin ekspresyonu sırasıyla epi floresan ve konfokal mikroskopi ile ölçülür. Bu tekniğin kemirgen oval hücre aktivasyon modelleri gibi mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, bu teknikle rejeneratif hepatositlerin esas olarak biliyer epitel hücrelerinden türetilmesidir. Bu yöntem, karaciğer rejenerasyonu alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir, örneğin safra veya karaciğer progenatör hücresinin karaciğer rejenerasyonuna nasıl katkıda bulunduğu gibi Karaciğer Rejenerasyonuna nasıl katkıda bulunur Genellikle bu yönteme yeni olan kişiden kişiye mücadele edecektir, çünkü kurşun ve dejenere laboratuvardaki karaciğer boyutu değişkendir.

Zamanlanmış çiftleşmeleri gerçekleştirmek için, yetişkin erkek ve dişi hemizigot veya homozigot balıkları gece boyunca aralarında bir bölücü olacak şekilde ayarlayın. Ertesi sabah, çiftleşme istendiğinde, embriyoları hasat etmek için ince bir plastik gözenekli süzgeç kullanarak bölücüyü çıkarın, süzgeci ters çevirin ve ağ yüzeyini ince bir yumurta suyu akışıyla durulamak için bir sıkma şişesi kullanın. Daha sonra 100'e kadar embriyoyu 25 mililitre yumurta suyu içeren 100 milimetrelik bir Petri kabına aktarın ve pigmentasyonu engellemek için kabı 28 santigrat dereceye yerleştirin.

Kültüre 10 saate kadar PTU ekleyin. 80 saatte döllenme sonrası. Kişiselleştirme sonrası, larvaları trica ile uyuşturun ve CFP pozitif larvaları toplamak için bir epi floresan mikroskobu kullanın, sadece benzer büyüklükte karaciğerleri olan hayvanları tutun.

Daha sonra trica yumurta suyunu PTU ile takviye edilmiş taze yumurta suyu ile değiştirin ve CFP pozitif zebra balığı larvalarını 28 santigrat derece kuluçka makinesine geri koyun. Zebra balığı larvalarını önce MTZ ile tedavi etmek için uygun sayıda larvayı iki farklı kültür kabına bölün. Deney larva grubunu taze hazırlanmış MTZ çözeltisinde ve kontrol grubunu yumurta suyunda tutun.

DMSO ile desteklenmiştir. MTZ'nin foto inaktivasyonunu önlemek için deney grubunu alüminyum folyo ile örtün ve ablasyon süresinin sonunda her iki zebra balığı larva grubunu 28 santigrat derecede inkübe edin. MTZ solüsyonunu plakalardan çıkarın ve MTZ ile muamele edilmiş larvaları 25 mililitre yumurta suyu ile iki ila üç kez yıkayın ve her yıkamadan sonra yumurta suyunu atarak

Son yıkamadan sonra, MTZ ile tedavi edilen larvalarda kalp ödemi ve ölümü önlemek için daha önce kullanılan trica konsantrasyonunun yarısı ile larvaları hareketsiz hale getirin. Daha sonra, MTZ ile tedavi edilen larvaların nispi karaciğer boyutuna dayalı olarak hepatosit ablasyon seviyelerini değerlendirmek için bir epi floresan mikroskobunda CFP filtresini kullanın. Larvaların %sıfır ila %5'ini temsil eden büyük karaciğerlere sahip zebra balıklarının ablasyonsuz olduğunu düşünün.

Larvaların %10 ila 20'sini temsil eden orta büyüklükte karaciğere sahip olanlar kısmen ablasyona tabi tutulur ve larvaların %80 ila 90'ını temsil eden çok küçük karaciğere sahip olanlar tamamen ablasyona tabi tutulur. Tüm hayvanları sınıflandırdıktan sonra, ablasyonsuz veya kısmen ablasyonlu karaciğerleri olan larvaları keşfedin, sadece zebra balıklarını karaciğer analizi için ciddi bir hepatosit ablasyonunu gösteren küçük karaciğerlerle tutun. Rejenerasyon sıfır saatlik zaman noktasında, larvaları 1.5 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpüne aktarın.

MTZ yıkamasından ve CFP kaynağından hemen sonra, dört santigrat derecelik bir rotor üzerinde gece boyunca sabitleme için yumurta suyunu %3 formaldehit MPEM tamponu ile değiştirin. Ertesi sabah, fiksasyon solüsyonunu bir mililitre P-B-S-D-T ile değiştirin ve larvaları beş dakika daha döndürün. Daha sonra, tüm sabit larvaları diseksiyon mikroskobu altında taze P-B-S-D-T içeren 100 milimetrelik bir Petri kabına koyun ve tüm larvalar kırpıldığında yumurta sarısını ve göğüs yüzgeçlerini manuel olarak çıkarmak için forseps kullanın.

20'ye kadar hayvanı 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarın ve P-B-S-D-T'yi bir mililitre bloke edici solüsyonla değiştirin. Oda sıcaklığında döndürücüde iki saat geçirdikten sonra, dört santigrat derecede bir gece inkübasyon için bloke edici çözeltiyi 100 mikrolitre birincil antikor kokteyli ile değiştirin. Ertesi gün sallanırken, birincil antikor solüsyonunu çıkarın ve zebra balığını 10 dakikalık beş yıkama için P-B-S-D-T ile yıkayın.

Son yıkamadan sonra, oda sıcaklığında sallanma ile iki saatlik bir inkübasyon için 100 mikrolitre ikincil antikor ekleyin. Son olarak, larvaları az önce gösterildiği gibi P-B-S-D-T'de beş kez yıkayın. Larvaları bir mikroskop lamı üzerinde yanal olarak yönlendirin ve bir damla montaj ortamı ekleyin.

Daha sonra her bir zebra balığını dikkatlice bir kapak camı ile örtün ve kapak camını oje ile kapatın. Döllenmeden 3,5 ila beş gün sonra 36 saat boyunca MTZ tedavisi, karaciğer boyutunu önemli ölçüde azaltır. MTZ yıkamasından sonra, biliyer epitel hücrelerinin zarındaki LCAM ekspresyonu ile değerlendirildiği gibi, güçlü bir CFP ve kırmızı ekspresyon 30 saat içinde yeniden ortaya çıkar.

İntrahepatik safra ağı başlangıçta çöker, ancak daha sonra hızlı bir karaciğer yenilenmesi ve iyileşmesini gösteren yıkamadan 54 saat sonra yeniden kurulur. Bu görüntülerde, sadece karaciğerin biliyer epitel hücrelerinde eksprese edilen bir nükleer kırmızı floresan proteini için transgenik rejenerik hepatositlerin çoğu gösterilmektedir: bunların çoğu, rejenere karaciğerde H, iki BM, kiraz pozitif hücreler, rejenerasyonda HNF dört alfa eksprese eder, rejenerasyon saatinde sıfır saat, dört C sekiz. MTZ ile tedavi edilen CFP pozitif hepatositler, ciddi hepatosit kaybı üzerine biliyer epitel hücrelerinin hepatositlere dönüşümünü gösteren H iki BM kiraz ekspresyonunu hala korurlar.

Bu prosedürü denerken, gelişiminden sonra lizis Eyleminde sonraki karaciğer rejenerasyonu için MTT tedavisinden sonra tamamen ablasyonlu seçmeyi unutmamak önemlidir. Bu teknik, karaciğer rejenerasyonu alanındaki araştırmacıların, karaciğer progenitörü olan hücre güdümlü karaciğer rejenerasyonunun altında yatan mekanizmaları keşfetmelerinin yolunu açtı. Bu videoyu izledikten sonra, bilio güdümlü karaciğer dejenerasyonu çalışmaları için bu coğrafyaya özgü operasyon modelinin nasıl kullanılacağını iyi anlamış olmalısınız.