Name: Histolojik Analiz kas cryosections Hazırlanmasında Yapılması ve Yapılmaması Gerekenler (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 27 s
Description: Öğrenin kas biyopsilerinden dondurulmuş kesitler hazırlarken donma artefaktlarını önleme yöntemlerini. Hızlı dondurma, OCT ile gömme ve yedi mikron kesit alma teknikleri kullanılarak iyi korunmuş doku histolojisi elde edilir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

El yazması revizyonları için Alex Miller'a teşekkür ederiz. Bu çalışma, Cure CMD, Muscular Dystrophy ile Mücadele (SAM) ve Muscular Dystrophy Association'dan (218938) M.G.'ye verilen araştırma hibeleri ile desteklenmiştir.

1. Doku Hasat ve kas Dokuların Donma <ol><li> Izofluran (2-kloro-2- (diflorometoksi) -1,1,1-trifloro-etan) aşırı dozda fare öldürülür. Davlumbaz bu adımı gerçekleştirin ve böyle bir kurutucuda veya izofluran batırılmış bir pamuklu çubuk içeren bir fanus gibi bir ikincil çevreleme yöntemini kullanın. </li><li> Sıkıca Kapkaççı sıkarak ölümü onaylayın. Böyle servikal dislokasyon olarak ötenazi ikincil yöntemi kullanın. </li><li> Kaslar gevşek saç tellerinin yapışmasını azaltmak için% 70 alkol ile kürk ıslatın. Böyle 5. olarak ince bir forseps kullanarak uzuv kapalı cilt soyma. </li><li> Dikkatle, altından kemiklerden (bu durumda tibialis anterior (TA)) ilgi kas ayrı tendonu başlayarak çıkarın. </li><li> , Kas tüketim OCT (Optimum Kesme Sıcaklığı bileşik) onu karşılamak ve etiketli atılabilir dondurma kalıp üzerinde düz yatıyordu. Kas tai için normal fizyolojik oryantasyon (başında olduğundan emin olungermeden l). Alternatif olarak, küçük strafor karelere kas dondurmak ve kasların doğru uzunluğunu sağlamak için böcek işaretçilerine kullanarak pin. </li><li> Sıvı azot kullanılarak çelik beherglasta 2-metilbütan (izopentan) soğutun. 5 dakika - Bu ortalama 3 alır. Beyaz çökeltiler beher alt ve duvarlarında oluşturmak başlayana kadar aralıklı karıştırarak tutun. NOT: Bu durumda, izopentan uygun donma sıcaklığına ulaşmıştır (-150 ° C) </li><li> Soğutulmuş 2-metilbütana kasları içeren kalıpları batırın. 20 sn - 15 gastroknemius soleus (GS) ve triceps gibi 12 sn ve daha büyük kaslar - Böyle diyafram ve ekstansör digitorum longus 6 (EDL) gibi küçük kasları dondurun. Çok uzun bu çatlama neden olabileceğinden için kasları donma yok. </li><li> Kuru buz üzerinde donmuş dokuları aktarın ve izopentan buharlaşması (bu işlem etrafında ortalama 15 alır unutmayın - 20 dakika) izin verin. Alüminyum folyo dokuları sarın ve u saklayınlökotrien antagonistlerinin düşük sıcaklık kesit kadar (-70 ° C ila -80 ° C). </li></ol> 2. Doku Blok Hazırlanır OCT Dokuları katıştırma <ol><li> Kuru buz üzerinde Taşımacılık dokuları çözülme önlemek için cyrostat için. Doku transferi ve bunları, 30 dakika için dengelenmeye bırakın (doku tam çözülme önlemek için -20 -24 ° C&#39;ye ayarlanmış) bölme kriostada. </li><li> Peltier defne soğutma açın. Kriyostat bu soğutma yoksa, hızlı OCT dondurmak için aerosol soğutma sprey kullanın. Bu donma hasara yol açabilir olarak gömme sırasında herhangi bir noktada kas çözülme izin vermeyin. </li><li> Örnek diskte Ekim düzgün bir ince katman ekleyin ve soğumaya bırakın. OCT en durumdayken sıvı üst alt donmuş zaman, (boyuna kesitler için OCT enine kesitler ve paralel için OCT dik) doğru yönde de doku yerleştirin. Hızlı OCT dondurmak için aerosol soğutma sprey kullanın. Isı ext ile doku unembeded bölümünü dokununreaktöre verilmiş ve 45 saniye bekleyin. </li><li> , Kas çevresinde Ekim başka ince bir tabaka ekleyin aerosol soğutma sprey ile sprey ve bir önceki adımda olduğu gibi ısı ayıklayın. </li><li> Bütün kas kaplıdır kadar sprey ve ısı çıkarıcı soğutma aerosol bir arada kullanarak Ekim dondurmak hızla küçük artışlarla Ekim ekleyerek tutun. </li><li> Doku bloğun üstünde ısı çıkarıcı koyun ve 5 dakika bekleyin. </li></ol> 3. Bölüm hazırlanması ve Kasların Orta göbek Bölgesi&#39;nden Bölümler belirlenmesi <ol><li> Numune kafasına örnek monte edin. Diski sabitlemek için topuzu sıkın. Numune disk numune kafası ile iyi temas halinde olduğundan emin olun. </li><li> ° -21 ila -24 ° C&#39;ye odası sıcaklığını ayarlamak ve ayarlanan sıcaklık elde edilene kadar bekleyin. </li><li> Kalınlık ayarlarını (7 mikron) ayarlayın; ilerleyen ya da kaba ve ince ayarlarını kullanarak bloğu geri çekilmeden tarafından blok kırpın. </li><li> Bölümleri toplayınüzerinde slayt kesme bölümlerinin yapışmasını kolaylaştırmak için zıt ücretleri arasındaki cazibe kullanarak bölümleri üzerine slayt üst basarak pozitif yüklü mikroskop slaytlar önceden ısıtılmış. </li><li> Bölümlerin enine kesit alanı (CSA) ölçerek orta göbek bölümleri tanımlamak. Mikroskop bağlı olduğu bilgisayarda bu kullanarak görüntüleme yazılımı yapın. NOT: Faz kontrastlı görüntüler alınır ve tüm kas çevresi yazılım programına bir izleme fonksiyonu üzerinden ölçülür. Bu, her iki CSA ve asgari gelincik çapı ölçümleri (bir tanecik karşıt taraflarında iki paralel teğet arasındaki en küçük mesafe olarak ifade edilir lif enine kesit boyutunun ölçü) ürün elde edilir. Not: CSA ve minimum gelincik çap ölçümleri plato başladığınızda, orta göbek ulaşıldı. </li><li> Envanter gelecekteki boyama -80 ° C&#39;de slaytlar arşivlemek ve. NOT: lekelenme için Ekim öncesinde kaldırılması gerekmezg işlemleri. Slaytlar kaplandı sonra, hemen boyanabilir hazırız. </li></ol> 4. Boyama NOT: Ayrıntılı adım adım prosedürleri ürün veri sayfasında bulunabilir ve boyama işlemleri için takip edilmesi gerekirken, kişisel optimizasyon optimum boyama elde etmek için gerekli olabilir. <ol><li> Ortam (tabloya bakınız), montaj, su ile karışmayan olduğu için, (% 70,% 95 ve% 100 etanol içinde 2 dk) alkol artan sınıflar üzerinde kaydığı dihidrat ve ksilen (5 dakika için% 100) sağlamak için bunları temizlemek slaytlar zamanla opak olmazlar. </li><li> Bölümleri lamel ve kurumaya bırakın. Mikroskop ile görüntü görüntüleme yazılımı ile donatılmış. </li></ol>

<ol><li>Bonnemann, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostic+approach+to+the+congenital+muscular+dystrophies%5BTitle%5D)+AND+%22Neuromuscular+disorders+%3A+NMD%22%5BJournal%5D)">Diagnostic approach to the congenital muscular dystrophies.</a> Neuromuscular disorders : NMD. 24, 289-311 (2014).</li>
<li>Caughey, J. E., Pachomov, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+diaphragm+in+dystrophia+myotonica%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurol+Neurosurg+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">The diaphragm in dystrophia myotonica.</a> J Neurol Neurosurg Psychiatry. 22, 311-313 (1959).</li>
<li>Fetterman, G. H., Wratney, M. J., Donaldson, J. S., Danowski, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscular+dystrophy.+I.+History%2C+clinical+status%2C+muscle+strength%2C+and+biopsy+findings%5BTitle%5D)+AND+%22AMA+J+Dis+Child%22%5BJournal%5D)">Muscular dystrophy. I. History, clinical status, muscle strength, and biopsy findings.</a> AMA J Dis Child. 91, 326-338 (1956).</li>
<li>Platzer, A. C., Chase, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histologic+Alterations+in+Preclinical+Mouse+Muscular+Dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+journal+of+pathology%22%5BJournal%5D)">Histologic Alterations in Preclinical Mouse Muscular Dystrophy.</a> The American journal of pathology. 44, 931-946 (1964).</li>
<li>Mercuri, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+magnetic+resonance+imaging+involvement+in+muscular+dystrophies+with+rigidity+of+the+spine%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Neurol%22%5BJournal%5D)">Muscle magnetic resonance imaging involvement in muscular dystrophies with rigidity of the spine.</a> Ann Neurol. 67, 201-208 (2010).</li>
<li>Tasca, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+molecular+signatures+in+magnetic+resonance+imaging-staged+facioscapulohumeral+muscular+dystrophy+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Different molecular signatures in magnetic resonance imaging-staged facioscapulohumeral muscular dystrophy muscles.</a> PloS one. 7, e38779(2012).</li>
<li>Girgenrath, M., Dominov, J. A., Kostek, C. A., Miller, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+apoptosis+improves+outcome+in+a+model+of+congenital+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+clinical+investigation%22%5BJournal%5D)">Inhibition of apoptosis improves outcome in a model of congenital muscular dystrophy.</a> The Journal of clinical investigation. 114, 1635-1639 (2004).</li>
<li>Kumar, A., Yamauchi, J., Girgenrath, T., Girgenrath, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle-specific+expression+of+insulin-like+growth+factor+1+improves+outcome+in+Lama2Dy-w+mice%2C+a+model+for+congenital+muscular+dystrophy+type+1A%5BTitle%5D)+AND+%22Human+molecular+genetics%22%5BJournal%5D)">Muscle-specific expression of insulin-like growth factor 1 improves outcome in Lama2Dy-w mice, a model for congenital muscular dystrophy type 1A.</a> Human molecular genetics. 20, 2333-2343 (2011).</li>
<li>Mehuron, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysregulation+of+matricellular+proteins+is+an+early+signature+of+pathology+in+laminin-deficient+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Skeletal+muscle%22%5BJournal%5D)">Dysregulation of matricellular proteins is an early signature of pathology in laminin-deficient muscular dystrophy.</a> Skeletal muscle. 4, 14(2014).</li>
<li>Yamauchi, J., Kumar, A., Duarte, L., Mehuron, T., Girgenrath, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triggering+regeneration+and+tackling+apoptosis%3A+a+combinatorial+approach+to+treating+congenital+muscular+dystrophy+type+1+A%5BTitle%5D)+AND+%22Human+molecular+genetics%22%5BJournal%5D)">Triggering regeneration and tackling apoptosis: a combinatorial approach to treating congenital muscular dystrophy type 1 A.</a> Human molecular genetics. 22, 4306-4317 (2013).</li>
<li>Sheriffs, I. N., Rampling, D., Smith, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paraffin+wax+embedded+muscle+is+suitable+for+the+diagnosis+of+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+clinical+pathology%22%5BJournal%5D)">Paraffin wax embedded muscle is suitable for the diagnosis of muscular dystrophy.</a> Journal of clinical pathology. 54, 517-520 (2001).</li>
<li>Fox, C. H., Johnson, F. B., Whiting, J., Roller, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formaldehyde+fixation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+%26+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Formaldehyde fixation.</a> Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 33, 845-853 (1985).</li>
<li>Maccarty, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Diagnostic+Reliability+of+Frozen+Sections%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+journal+of+pathology%22%5BJournal%5D)">The Diagnostic Reliability of Frozen Sections.</a> The American journal of pathology. 5, 377-380 (1929).</li>
<li>Shi, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+value+of+frozen+tissue+section+used+as+%27gold+standard%27+for+immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Clin+Pathol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the value of frozen tissue section used as 'gold standard' for immunohistochemistry.</a> Am J Clin Pathol. 129, 358-366 (2008).</li>
<li>Turan, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accuracy+of+frozen+sections+for+intraoperative+diagnosis+of+complex+atypical+endometrial+hyperplasia%5BTitle%5D)+AND+%22Asian+Pacific+journal+of+cancer+prevention+%3A+APJCP%22%5BJournal%5D)">Accuracy of frozen sections for intraoperative diagnosis of complex atypical endometrial hyperplasia.</a> Asian Pacific journal of cancer prevention : APJCP. 13, 1953-1956 (2012).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Histoloji ve immünohistokimya çeşitli nöromüsküler bozukluklar tezahürü ve patoloji ilerlemesini anlamada anahtar bir araç olarak kullanılmıştır. Klasik kas biyopsileri ilk formaldehit sabit ve daha sonra parafin mumu ile gömüldü. Formaldehit tespit mimari dokusu koruyan ve oda sıcaklığında doku depolama ve taşıma izin verirken, aynı zamanda doğru immün elde etmek için daha ileri adımlar gerektiren enzimler ve çapraz bağlarının proteinleri inaktive eder. Bu sorun donmuş kesitlerin kullanımı ile elimine edilir ancak bu y...

Kas histoloji incelenmesi nöromüsküler bozuklukların 1-4 farklı anlamada kritik bir rol oynamaktadır. Diğer tekniklerle birlikte, bu araştırmacıların patoloji tezahürü ve ilerlemesinin daha iyi bir fikir almak için ve aynı zamanda bir terapötik müdahale 5-10 etkinliğini değerlendirmek için gerekli olabilir izin verir. Eksizyon hemen önce fizyolojik durumunu korumak amacıyla Ancak, doğru olması için, dokular uygun şekilde korunması gerekir. Bu kaldırma, koruma, kesit ve boyama esnasında büyük dikkat gerektirir. Dokular, ışık mikroskobu çalışma için iki farklı yolla hazırlanabilirler. (FFPE) bölümleri, gömülü ilk yöntem, formalin sabit parafin dokularının parafin mumu 11,12 ile gömülü önce% 10 doğal tamponlu formaldehit sabit gerektirir. tespit aşaması aynı zamanda çapraz bağlantılar endojen pr daha iyi morfolojisi korumak için yardımcı oluroteins böylece immün için karmaşık antijen alma prosedürleri gerektiren ve bu bölümlerde 12 enzimatik boyama olasılığını ortadan kaldırır. Dondurulmuş kesitler, diğer taraftan, önceden sabit veya işlenmesine gerek yoktur; Bu nedenle, proteinler doğal biyolojik konformasyonlar 13,14 muhafaza edebiliyoruz. Bundan başka, dondurulmuş kesitler de bazen sarkomlar ve diğer cerrahi biyopsi 15, ameliyat tanısında, örneğin gerekli olan hızlı gerçekleştirme süresi, izin verir. Düzgün yapılmazsa Ancak, bu yöntem histolojik inceleme için bölümler elverişsiz hale kas mimarisi değişiklikleri tanıtır zararı, don eğilimli. Bu kağıt düzgün muayene için en uygun boyama elde etmek için kas biyopsi hazırlamak için en etkili yöntem açıklayacağım.

<table><tbody><tr><td>Kriyostat</td><td>Leica CM 1850</td><td>Leica Mikrosistemler A.Ş.</td><td>Buffalo Grove, IL 60089 ABD, ofis telefonu 1-800-248-0123 Alternatif: Richard Allen Scientific</td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Nikon Eclipse 50i</td><td>Nikon Instruments Inc.</td><td>1300 Walt Whitman Road, Melville, N.Y. 11747-3064 ABD, Telefon: 1-631-547-8500 Alternatif: Olympus</td></tr><tr><td>Görüntü analiz yazılımı</td><td>Nikon Görüntüleme Yazılımı Temel Araştırma</td><td>Nikon Instruments Inc.</td><td>1300 Walt Whitman Yolu, Melville, NY 11747-3064, ABD, Telefon: 1-631-547-8500 Alternatifler: Görüntü J, Metamorf</td></tr><tr><td>İzofluran</td><td>14043-220-05</td><td>JD Tıbbi Dist. Co., Inc.</td><td>1923 West Peoria Bulvarı, Phoenix, AZ 85029 ABD</td></tr><tr><td>EKİM</td><td>4583</td><td>Sakura A.Ş.</td><td>Torrence, CA 90501 U.S.A. Alternatif kaynak: Leica Microsystem</td></tr><tr><td>Freeze It</td><td>23-022524</td><td>Thermofisher</td><td>790 Memorial Dr, Cambridge, MA, 02139 U.S.A. Alternatif kaynak: VWR Scientific</td></tr><tr><td>Tek kullanımlık doku kalıbı</td><td>22-363-554</td><td>Thermofisher</td><td>790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Alternatif kaynak: VWR Scientific</td></tr><tr><td>Colorfrost plus slaytlar</td><td>9991001</td><td>Thermofisher</td><td>790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Alternatif kaynak: VWR Scientific</td></tr><tr><td>Aseton</td><td>650501-4L</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3050 Ladin Caddesi, St. Louis, MO 63103 U.S.A. Alternatif kaynak: VWR Scientific</td></tr><tr><td>Etil alkol</td><td>HC-1300-1GL</td><td>Thermofisher</td><td>790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Alternatif kaynak: VWR Scientific</td></tr><tr><td>2-metil bütan</td><td>M 32631-SL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3050 Ladin Caddesi, St. Louis, MO 63103 U.S.A. Alternatif kaynak: VWR Scientific</td></tr><tr><td>Xylene</td><td>HC-7001GA</td><td>Thermofisher</td><td>790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Alternatif kaynak: VWR Scientific</td></tr><tr><td>Cytoseal 280</td><td>8311-4</td><td>Thermofisher</td><td>790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Alternatif kaynak: VWR Scientific</td></tr><tr><td>Hematoxylin Gill #3</td><td>CS402-1D</td><td>Thermofisher</td><td>790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Alternatif kaynak: VWR Scientific</td></tr><tr><td>Eosin</td><td>6766007</td><td>Thermofisher</td><td>790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Alternatif kaynak: VWR Scientific</td></tr></tbody></table>

histolojik analiz kas cryosections hazırlanmasında yapılması ve yapılmaması gerekenler

Do's and Don'ts in the Preparation of Muscle Cryosections for Histological Analysis

Kas biyopsi histolojik değerlendirilmesi nöromüsküler bozuklukların patoloji gelişimi ve ilerlemesinde anlamada vazgeçilmez bir araç olarak hizmet vermiştir. Ancak, bunu yapmak için, uygun bakım eksize ve optimum boyama elde etmek için dokular korunması sırasında alınması gerekir. Doku koruma yöntemlerinden biri parafin mumu ile gömerek sonra formaldehit dokuları tamir ve kapsar. Bu yöntem de morfoloji koruyan ve oda sıcaklığında uzun süreli depolama için izin verir, ancak hantal ve toksik kimyasalların kullanımını gerektirir. Bundan başka, etkili bir immün için antijen alma protokolleri gerektiren antijeni çapraz bağlayabilen, formaldehit tespit sonuçları. Aksine, dondurulmuş kesit tespiti gerektiren ve bu nedenle, biyolojik antijen yapısını muhafaza etmez. Bu yöntem aynı zamanda intraopera gibi hızlı histolojik değerlendirme gerektiren durumlarda özellikle yararlıdır hale sefer hızlı sırayla ayrı bir avantaj sağlarCerrahi biyopsi tive. Burada farklı histolojik ve immünolojik lekeleri ile görselleştirme için kas biyopsisi hazırlamak en etkili yöntem tarif.

hasat ve dokuların dondurulması için set-up Şekil 1&#39;de görülebilir. Kesilen dokular kurutma (Şekil 1A) önlemek için PBS batırılmış bir gazlı bez üzerine saklanmalıdır. Dokular da doğru morfolojisi (Şekil 1B) sağlamak için Ekim batırılmış ve cryo kalıp düzenlendiği doğru yönde ve mümkün olduğunca fizyolojik uzunluğuna yakın olmalıdır histolojik analiz için kullanılmak üzere seçildiğinde. Bir doku dondurma için müsait izopentan Çamur daha sonra sıvı azot içinde izopen...

Burada, artefaktların donmasını önlemek için kas biyopsilerinin dondurulması, gömülmesi, kriyoseksiyonu ve boyanması için en etkili yöntemleri gösteriyoruz.

Histolojik Analiz kas cryosections Hazırlanmasında Yapılması ve Yapılmaması Gerekenler

Histological evaluation of muscle biopsies has served as an indispensable tool in the understanding of the development and progression of pathology of ...

Bu prosedürün genel amacı, kas biyopsilerinden dondurulmuş kesitler hazırlarken dondurma artefaktları oluşturmak gibi hatalardan kaçınmaktır. Bu işlem, öncelikle kasın sıvı azot ile soğutulmuş iki metil bütan içerisinde hızla dondurulmasıyla gerçekleştirilir. Kas biyopsileri kriyostat içerisinde dengelendikten sonra, aerosol soğutma ve ısı ekstraksiyonu kullanılarak hızlı dondurma işlemiyle, oda sıcaklığındaki optimum kesme sıcaklığı (OCT) ortamına küçük artışlarla gömülürler.Ardından yedi mikronluk kesitler alınır ve sıcak, pozitif yüklü cam lamlara aktarılır. Son adım, doku histolojisini değerlendirmek için ihtiyaç duyulan doku kesitlerinin boyanmasıdır. Nihayetinde, doğru şekilde hazırlanmış kas biyopsileri, dondurma artefaktları olmaksızın iyi korunmuş doku histolojisi ile sonuçlanır.Bu tekniğin parafin gömülü doku kesit alma gibi mevcut diğer yöntemlere göre temel avantajı, çok hızlı olması ve endojen antijen yapısını veya fonksiyonunu değiştirmemesidir. Bu yöntem; büyüme, rejenerasyon, inflamasyon, fibrozis ve nekroz gibi kas biyolojisinin sağlık ve hastalık durumlarındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin etkileri, sağlıklı ve hastalıklı kasların durumunun belirlenmesine olanak tanıdığı için kas bozukluklarının tedavisine veya teşhisine kadar uzanmaktadır.Bu yöntem farklı kas distrofisi formları hakkında bilgiler sağlayabilse de, kanserin ve AIDS'in terminal evreleri ile ilişkili kaşeksi ve yaşlı popülasyonlardaki kas kaybı gibi diğer sistemlere de uygulanabilir. Bir çeker ocak altında ve cam fanus gibi ikincil bir koruma düzeneği içerisinde, fareyi aşırı doz isoflurane ile ötanazi yaparak işleme başlayın. Hayvanın ölümünü, ayak tabanını sıkıca sıkarak onaylayın.Şimdi, kürkü %70 alkol ile ıslatın. Bu, gevşek tüy tellerinin kaslara yapışmasını önler. Beş numara ince pens kullanarak deriyi uzuvdan soyup çıkararak işleme devam edin.İlgili kası, tendondan başlayarak kemikten dikkatlice ayırın. Bu örnekte, tibialis anterior izole edilmiştir. Kas çıkarıldıktan sonra, OCT ile kaplayın ve etiketlenmiş tek kullanımlık bir dondurma kalıbına düz bir şekilde yerleştirin.Dilimleme öncesinde daha sonra daha fazla OCT eklenecektir. Kasın, baş-kuyruk ekseni boyunca normal fizyolojik oryantasyonunda olduğundan ve kasın gerilmediğinden emin olun. Şimdi soğutun.Sıvı azot kullanarak çelik bir beher içinde bir miktar izopentan bulundurun. Üç ila beş dakika boyunca plastik bir spatula ile ara ara karıştırın. Beyaz bir çökelek oluştuğunda izopentan optimal sıcaklığına ulaşmış demektir; bu noktada, doldurulmuş kalıpları çözeltiye daldırın.Diyafram ve extensor digitorum longus gibi küçük kaslar altı ila 12 saniye gerektirir. Daha büyük kaslar 15 ila 20 saniye gerektirir; aşırı dondurma çatlamalara yol açabilir. Bir sonraki adım, kalıntı isopentanın buharlaşmasını sağlamak için dondurulmuş dokuları kuru buz üzerine yerleştirmektir ve bu işlem yaklaşık 15 ila 20 dakika sürer.Doku kuruduktan sonra folyoya sarın ve kesit alınana kadar -80 °C dondurucuda saklayın. Kesit alma işlemi öncesinde, dondurulmuş dokuları kuru buz üzerinde kriyostata taşıyın.Dokuyu -24 ile -20 °C arasında ayarlanmış bir kriyostat haznesine aktarın ve 30 dakika boyunca dengelenmeye bırakın. Dokular bu sıcaklıkta tamamen çözülmeyecektir. Ardından, önce dokuyu gömün.Varsa, Peltier Bay soğutmayı açın. İkinci olarak, numune diskine ince ve homojen bir OCT tabakası uygulayın ve soğumasını bekleyin. Üçüncü olarak, OCT alt kısımda donmuş ancak üst kısımda hala sıvı haldeyken dokuyu yerleştirin; transvers kesitler için dokuyu OCT'ye dik, longitudinal kesitler için ise OCT'ye paralel olarak yönlendirin.Şimdi OCT'yi hızla dondurmak için bir aerosol soğutma spreyi kullanın. Ardından, dokunun dondurulmamış kısmına bir ısı çekici ile dokunun ve 45 saniye boyunca doku üzerinde tutun. Bu işlemin hiçbir aşamasında kasın çözülmesine izin vermeyin.Kriyostat peltier bay soğutma özelliğine sahip değilse, doku etrafındaki OCT'yi hızlıca dondurmak için aerosol soğutma kullanın. Şimdi, kasın etrafına bir ince katman daha OCT ekleyin, aerosol soğutma spreyi ile püskürtün ve önceki adımda olduğu gibi ısıyı dışarı atın. Tüm kas kaplanana kadar, küçük miktarlarda OCT eklemeye devam edin ve aerosol soğutma spreyi ile ısı çıkarıcının bir kombinasyonunu kullanarak OCT'yi hızlıca dondurun.Ardından ısı çıkarıcıyı doku bloğunun üzerine yerleştirin ve kesme işlemine geçmeden önce beş dakika bekleyin. Örnek artık örnek başlığına monte edilmeye hazırdır. İlk olarak, diski sabitlemek için düğmeyi sıkın.Oda sıcaklığı -24 ile -20 °C arasına gelirken numune diskinin numune başlığıyla iyi temas ettiğinden emin olun. Oda hedef sıcaklığa ulaştığında dilim kalınlığını 7 µm olarak ayarlayın ve blok tıraşlamaya başlayın. Bloğu hareket ettirmek için kaba ve ince ayar düğmelerini kullanın.Kesitler toplamaya hazır olduğunda, üst yüzeylerini lamba ile ısıtılmış pozitif yüklü lamların üzerine bastırın. Doğru şekilde dondurulmuşsa, doku yüzeyi tebeşir beyazı renginde olmalıdır. Ancak, hatalı dondurulmuş veya montaj işlemi sırasında çözülmüş bir doku, kırmızıdan pembeye kadar farklı renklerde görünecektir.Slaytlar, gelecekteki analizler için derin dondurucuda saklanabilir. Dokunun orta karın bölümü, bir görüntüleme yazılım paketinin izleme işlevi kullanılarak faz kontrast görüntülerinden kesit alanı ölçülerek belirlenebilir. Bu analiz hem alan hem de minimum ferret çapı ölçümlerini sağlar.Bu ölçümler düzeneğe girdiğinde, orta karın bölgesine ulaşılmış demektir. Üreticiler çoğu boyama protokolü için adım adım talimatlar sağlasa da, ideal boyama yoğunluklarını elde etmek için kişisel optimizasyon gerekebilir. OCT'nin çıkarılmasına gerek yoktur.Boyama için, optimal immün boyama elde etmek adına nemlendirilmiş bir hazne kullandığınızdan emin olun. Kesişlerin kurumasını önlemek için hazne, ıslak bir kağıt havlu üzerine yerleştirilmiş parafilm ile kapatılmalı ve küçük bir kutu içinde mühürlenmelidir. İmmün boyama yapılmayan kalıcı montajlı lamlar için boyama işlemi sırasında, boyama protokolünü takip ederek lamları artan alkol dereceleriyleyerekyelemasyon yapın.Kapatma medyası suyla karışmadığı için, lamları %100 ksilen içinde beş dakikalık bir banyoyla temizleyin. Bu işlem, lamların zamanla opaklaşmamasını sağlar. Ardından, boyanan tibialis anterior kaslarının orta karın bölgesinden alınan kesitlerin kapatılması ve görüntülenmesi işlemine geçin.Hematin ve eozin kullanılarak. Doğru şekilde işlenmiş kesitler, tutarlı bir morfolojiye ve genelinde homojen boyanmaya sahip olacaktır; dondurma hasarı görmüş veya erken çözülmüş olan hatalı işlenmiş kaslar ise morfolojide çok sayıda kopuş sergiler ve parçalanmış buğday görünümündedir.Bu kesitler üzerinde immünohistokimya da gerçekleştirilmiştir. Bu boyamalar tatmin ediciydi. Fibronectin yeşil renge boyanmış olup dappy mavi renkte görülmektedir.Bu videoyu izledikten sonra, kas mimarisinin değerlendirilmesi için kas biyopsilerinden nasıl kaliteli donmuş kesit hazırlanacağı konusunda kapsamlı bir anlayış kazanmış olmalısınız. Bu teknikte uzmanlaşıldığında, tüm adımlar doğru şekilde uygulandığı takdirde işlem yaklaşık dört ila beş saatte tamamlanabilir. Bu prosedürü uygularken, işlem sonrasında kasların çözülmesini önlemenin önemli olduğunu unutmamak gerekir.Büyüme ve rejenerasyon gibi ek soruları yanıtlamak için immün boyama ve in situ hibridizasyon gibi diğer yöntemler uygulanabilir.

do-s-don-ts-preparation-muscle-cryosections-for-histological

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Bu video flaş fare embriyonik beyin dokusu dondurma ve kesit alma teknikleri vardır gösterdi. Ortaya çıkan doku bölümleri çatlak ve diğer çarpıtmalar olduğundan emin olmak için kesim sırasında kullanılabilir sorun giderme yöntemleri de dahil olmak üzere, Kriyostat kullanmak için yararlı ipuçları verilmiştir.

Flaş Dondurma ve E12.5 Fare Beyin Cryosectioning

Bu videoda, kas dokusunun dondurulması ve ince kesitlerinin elde edilmesi prosedürü açıklanmaktadır. Teknik, kolon kanseri fare modellerinde kansere bağlı kaşeksi çalışmasına yardımcı olabilir.

Kesit için kas dokusunun hızlı dondurulması: hızla donmuş murin kas dokusunun ultra ince kesitlerini elde etmek için bir protokol

Yapısal, fonksiyonel ve biyokimyasal özellikleri belirlemek için iskelet kası dokularının analizi, uygun hazırlık ile büyük ölçüde kolaylaştırılmıştır.  Bu protokol, iskelet kası dokusunu çok çeşitli fenotipleme çalışmaları için hazırlamak için uygun yöntemleri açıklar.

Doku Triyaj ve İskelet Kası Hastalıkları Modeller için Donma

Bu el yazmasında, mineralize dokuların donmuş kesitleri üzerinde birkaç tur floresan görüntülemeden çoklu yanıt ölçümlerinin hizalanmış kompozit görüntülerini üretmek için yüksek verimli, yarı otomatik bir kriyohistoloji platformu sunuyoruz.

Yüksek Verim, Mineralize Dokuların Çoklu Resim Cryohistology

Bu yazıda, yetişkin farelerde ve diseksiyon olarak kasların sonraki manipülasyonlar, dondurma, kesme, rutin boyama ve myofiber kesit alanı analizi akut iskelet kas yenilenmesini meydana ayrıntılı bir protokol açıklamaktadır.

Cardiotoxin Enjeksiyonu ile Akut İskelet Kası Regeneration indüksiyon

Ardışık kriyo-bölümleri tek bir fare iskelet kası, bitişik bölgeleri kullanılarak gen ekspresyonu ölçümleri için histolojik uygulamalar ve RNA zenginleştirme sağlamak için toplanır. doğrudan uygulamalar arasında karşılaştırılmıştır toplanmış cryosections ve ölçümlerin 30 mg - Yüksek kaliteli RNA 20 elde edilir.

Gen İfade ve histolojik Analizler Tek Fare İskelet Kası bitişik Bölgeler Cryosectioning

Bu protokol, doğrudan sıvı azot içine sokulup çıkartılarak kas dokuları dondurarak için bir prosedür tarif eder. Bu protokol, aynı zamanda, azot gazı "battaniye etkisi" önlemek yeni cryovial vurguladığında sıvı azot temas bir numunenin doku yüzeyi.

Kas Dokular doğrudan sıvı azot içine girdikleri zaman Artifacts Donma bir çoklu-delikli dondurarak saklamaya uygun vialler ortadan kaldırır

Aktif otofaji, Kas Kök Hücresi (MuSC) aktivasyonu için gerekli olan üretken kas rejenerasyonu ile ilişkilidir. Burada, LC3'ün in situ tespiti için bir protokol sunuyoruz, kontrol ve yaralı farelerdeki kas dokusu bölümlerinin MyoD pozitif MuSC'lerinde bir otofaji markörü.

Otofajinin Kas Hücrelerinde Yerinde İmmunofloresan Boyanması

Burada açıklanan kas kriyokesitlerinde nekrotik miyofiberlerin doğrudan immünolabelling için bir protokoldür. Nekrotik hücreler immünglobulin G (IgG) dahil olmak üzere serum proteinlerine geçirilebilir. Miyofiberler tarafından IgG alımının ortaya çıkması, kas durumuna bakılmaksızın nekroz geçiren miyoliflerin tanımlanmasını ve ölçülmesine olanak sağlar.

Kas Biyopsilerinde İmmünlabelling Miyofiber Dejenerasyon

Bu protokol, histokimyasal nöromüsküler çalışma için sıçan vokal kıvrımları hazırlamak için kullanılan yöntemleri açıklar.

Nöromüsküler Analizler için Sıçan Vokal Kıvrımının Hazırlanması

Artan kanıtlar, iskelet kası içindeki lipitlerin aşırı infiltrasyonunun lipotoksisite ve diyabet ile sonuçlandığını göstermektedir. Burada, lipit damlacıklarının boyutunu, yoğunluğunu ve hücre altı dağılımını lif tipine özgü bir şekilde ölçmek için doku işleme, Bodipy ile boyama, görüntü elde etme ve analiz dahil olmak üzere eksiksiz bir protokol sunuyoruz.

İskelet Kasında Lipid Damlacık İçeriğinin Lif Tipi ve Subhücresel-Spesifik Analizi

Öğrenin kas biyopsilerinden dondurulmuş kesitler hazırlarken donma artefaktlarını önleme yöntemlerini. Hızlı dondurma, OCT ile gömme ve yedi mikron kesit alma teknikleri kullanılarak iyi korunmuş doku histolojisi elde edilir.

Histolojik Analiz kas cryosections Hazırlanmasında Yapılması ve Yapılmaması Gerekenler

Daha fazla video keşfet